practica 3 de microbiologia animal
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CURSO : Microbiología Animal
PROFESOR : TAFUR ZEVALLOS, Lizandro
ALUMNA : BONIFACIO ESPINOZA, Jherson
CICLO : 2014 - I
TINGO MARIA – 2014
I. INTRODUCCION
El imperceptible tamaño de las bacterias y otros microorganismos así como la
dificultad para observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la
falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente
transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan métodos para
poder apreciarlas, siendo “los métodos más sencillos el de fijación y tinción,
iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, los que permitieron a los
microbiólogos distinguir muchas características estructurales normalmente
vistas” así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el
contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir entre distintos tipos de células
o para apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas
celulares, etc.
Existen numerosos colorantes, y en su mayoría son compuestos orgánicos
naturales que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los componentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes
son moléculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con los
elementos celulares cargados positivamente, como son las proteínas (Eosina,
la fucsina ácida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado
por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipídicos de la célula, usándose generalmente para revelar la
localización de los depósitos de grasa (negro de Sudán).
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el
laboratorio de microbiología. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en
el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular
bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos fig1) se basan
precisamente en la tinción de GRAM.
OBJETIVOS:
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o
Gram negativas de acuerdo a esta tinción.
II. REVISION BIBLIOGRAFICA.
2.1. TINCIÓN
Es el proceso por el cual las moléculas de un color ante se adsorben a
una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observar se
claramente sin algún tratamiento previo.
De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
2.1. Tinción simple
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología
celular.
2.1. Tinción diferencial
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre
células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas
técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.
Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen , etc.
2.2. TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian
Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
2.3. CULTIVO.
En biología, y específicamente en microbiología, un cultivo es un método
para la multiplicación de células o microorganismos, o para el
crecimiento de tejidos en el que se prepara un medio óptimo para
favorecer el proceso deseado; es empleado como un método
fundamental para el estudio de las bacterias.
Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio líquido o en la superficie
de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas
como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar
una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos
tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las
células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos
ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria
una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de
células similares a la original.
2.4. COLORACION GRAM
Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la
microscopía de luz, diferentes técnicas de tinción se han desarrollado
para visualizarlas. La más útil es la tinción de Gram, que separa los
organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
Esta tinción también permite que el clínico pueda determinar si el
organismo es redondo o
en forma de varilla, etc.
Las cadenas de amino-ácidos del peptidoglicano se unen covalentemente a
otros aminoácidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable
estructura reticulada. La enzima que cataliza la formación de esta unión Se
llama transpeptidasa y está situado en el interior citoplásmica
membrana. El antibiótico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta
razón, la enzima es
también llamada proteína de unión a la penicilina.
La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico
de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden
detectarse con este método. Las únicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las
células huésped (p. ej., clamidias).
Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el
microscopio óptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los
colorantes (p. ej., mycobacterias).
2.5. FACTORES QUE CONSIDERAR EN LA TINCIÓN DE GRAM
No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o
totalmente de color rosa.
Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el
rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los Gram positivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse Gram positivos al aumentar la alcalinidad.
III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Lugar y Fecha.
La presente práctica se desarrolló en el laboratorio de SANIDAD
ANIMAL de la Facultad de Zootecnia, de La Universidad Nacional
Agraria de la Selva el día jueves 05 de Junio del presente año a horas
de 10 a 12 A.M., en la ciudad de Tingo María, Provincia de Leoncio
Prado, Departamento de Huánuco a coordenadas geográficas: Latitud
Sur: 9º17’08”, Longitud Oeste: 75º59’52”, a 660 m.s.n.m, con un
temperatura promedia de 27º C aproximadamente.
3.2. Materiales y Métodos
3.2.1. Materiales.
Lamina porta y cubre objeto.
Estufa. Para el secado de las muestras.
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Muestras bacterianas de origen natural, Sarro Dental, etc.
Palillos
Microscopios
Soporte de Tinciones
Goteros
Gasas
3.2.2. Reactivos
Cristal violeta
Solución de lugol
Alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersión
3.2.3. Métodos
Desarrollar la práctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:
Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.
Colocar una gota de agua destilada o solución salina sobre el
porta objetos y luego esterilizar el asa bacteriológica.
Tomar una pequeña muestra de la cepa y diluirla en el porta
objetos y posteriormente esterilizar el asa.
Fijar la muestra al calor flameándola en el mechero, cuidando
no quemar la muestra. Colocar el portaobjetos sobre un
soporte.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1
minuto escurrir y enjuagar.
Cubrir la muestra con solución de lugol y esperar que
transcurra 1 minuto . Escurrir y enjuagar.
Después hecharle alcohol acetona dejarlo reposar 30
segundos y enjuagar
Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1
minuto. Escurrir y enjuagar.
Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de
inmersión y observar en el microscopio a 10X, 100x, etc.
IV. RESULTADOS
V. DISCUSION
los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente
importante para el diagnóstico y buen tratamiento de la patología relacionada
microorganismos es necesario saber cómo influyen en las manifestaciones
clínicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas en su detección y en el tratamiento.
Porque existen componentes de la pared celular que contribuyen a la virulencia
de las bacterias protegiéndolas de las respuestas inmunitarias.
En el laboratorio se desearía eliminar de forma selectiva las bacterias Gram
positivas de una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La tinción de Gram no es una prueba fiable de tinción de bacterias en medios
de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria)
o tratados con antibióticos debido a la degradación del peptidoglicano por parte
de estos fármacos.
VI. CONCLUSION
La tinción de Gram es una herramienta muy útil en el laboratorio de
microbiología así como en los análisis clínicos y diagnostico medico siendo
ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una
correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram
positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes
celulares tendrán o no propiedades patológicas diferentes.
Se pudo utilizar y conocer la función de la safranina y el cristal de violeta.
VII. RECOMENDACIÓN
Se necesita saber con mucha anticipación que materiales
vamos a usar para no tener que acoplarnos o reemplazar
aquellos que no tenemos como el caso del aceite de
inmersión.
Se necesitaba más orden en laboratorio al momento de usar
los reactivos, ya que por tener limitados uno se atrasaba más
que el otro. Provocando así errores en la muestra.
VIII. BIBLIOGRAFIA
Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory
Manual in General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown
Company Publishers. Dubuque, lowa
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual
de Métodos Generales (segunda edición). Facultad de Farmacia.
Universidad Central de Venezuela.
Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology.
Fourth edition. Mc Graw-Hill Book Company.
Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en acción. Manual de
Laboratorio para Microbiología. Editorial Blume. Madrid-España.
Tortora, Funke and Case. Introducción a la Microbiología. 9na
Edición 2007. Editorial Médica Panamericana.