ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 09Recuento e Identificación de

Staphylococcus aureus

ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 28 de febrero de 2008.

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PRÁCTICA Nº 09RECUENTO E IDENTIFICACION DE

Staphylococcus aureus

I. Introducción:

La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, no exigentes, catalasa positivos, con agrupación en racimos, aerobios o anaerobios facultativos.De los tres géneros que la integran, Micrococcus, Planococcus y Staphylococcus, este último es el único de importancia médica. Se caracteriza por ser aerobio - anaerobio facultativo, capaz de fermentar la glucosa en anaerobiosis; poseer ácidos teicoicos en su pared, y ser sensible a la enzima lisostafina.Dentro del género Staphylococcus se conocen más de 20 especies, de las cuales S. aureus es la más importante. Otras especies como S. epidermidis y S. saprophyticus son actualmente reconocidas como capaces de actuar como patógenos bajo determinadas circunstancias.La infección estafilocóccica es conocida desde la antigüedad. En la actualidad el género Staphylococcus y, en especial, la especie tipo S. aureus tiene una alta incidencia como agente de infección, tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. Es la primera como agente de infecciones, desde superficiales como el forúnculo, a profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial se destaca como primer agente de infección de heridas operatorias y de prótesis. Asimismo, S. aureus es capaz de causar cuadros TÓXICOS por producción de potentes exotoxinas tales como intoxicación alimentaria, síndrome de piel escaldada y shock tóxico. Además cabe destacar la gran capacidad de adaptación y supervivencia de esta bacteria, su aumento progresivo de resistencia a los antimicrobianos, en especial en el medio hospitalario, que plantea serios problemas epidemiológicos y terapéuticos.Del punto de vista de sus factores de virulencia, tanto bioquímicos como estructurales, se lo puede definir como un "patógeno perfecto", magníficamente equipado para colonizar, invadir, diseminarse y causar enfermedad grave. No obstante, normalmente convive en armonía con el huésped humano o animal, formando parte de su flora sin causar daño. Inclusive en algunos casos se encuentran personas sanas pesadamente colonizadas, definiéndose como "portadores" y pudiendo en ocasiones ser reservorio y fuente de infección.

II. Objetivos:

- Realizar el recuento de colonias de Staphylococcus aureus de muestras de queso fresco artesanal.

- Familiarizarse con el método de detección y recuento para S. aureus y conocer su importancia en los alimentos.

III. Materiales:

- Muestra: Queso fresco artesanal- Frascos estériles- Tubos de dilución- Pipetas de 1 y 10 mL

- Asas bacteriológicas- Espátulas de Drigalsky- Agar Baird Parker- Huevos criollos

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- Diluyente: agua peptonada con 2% de citrato de sodio.

- Plasma sanguíneo (para prueba de coagulasa)

- Gradillas- Mechero Bunsen- Placas de Petri

IV. Procedimiento:

- Preparamos la muestra. En esterilidad pesamos 3 g de la muestra (queso).- Luego agregamos 27 ml del diluyente (agua peptonada + 2% de citrato de

sodio), ésta será la primera dilución (10-1).- Luego, homogenizamos la muestra. Agitamos la muestra hasta que se

desmenuce por si solo (se verá un líquido lechoso).- Luego preparamos las demás diluciones (10-2, 10-3).

- Pasado el tiempo de incubación, leemos las placas. Se buscan colonias características (colonias negras, medianas, brillantes y con un halo blanco).

- Se hace el conteo de las colonias características.- De las colonias sospechosas (presuntamente S. aureus), se siembra en un tubo

con caldo nutritivo y lo incubamos a 37 ºC por 24 h. El caldo obtenido servirá para realizar la prueba de coagulasa, confirmativa para S. aureus.

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10-1 10-2 10-3

Diluciones

3 g de muestra+

27 mL agua pept. con 2% de citrato de Na

9 mL diluyente

9 mL diluyente

Agar Baird Parker

0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL

Incubar a 35 – 37 ºC por 24 h

Sembrar con espátula de Drigalsky

V. Resultados:

- Después de la siembra en el agar PB se obtuvo lo sgte:

10 -1 A 10 -1 B

10 -2 A 10 -2 B 10 -3 A 10 -3 B

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- Se obtuvo el sgte. recuento:

DILUCIONES10-1 10-2 10-3

A B A B A BNN NN 1148 1320 572 372

- De las colonias obtenidas se realizó la prueba de la coagulasa, obteniéndose el sgte. resultado:

- Entonces, las colonias obtenidas son coagulasa positiva, lo que quiere decir que lo más seguro es que sean S. aureus positiva

VI. Preguntas:

- Fundamentar la prueba de la termonucleasa.La detección de la desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa) en los alimentos, se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, así como de la posible formación de enterotoxina estafilocócica. La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 ºC por 16,6 min.) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus. Esta relación ha motivado el desarrollo de diferentes métodos para detectar esta enzima en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos susceptibles a la contaminación de S. aureus. El azul de toluidina (0.1 M) presente en el medio vira a rosa por acción del pH formado por la enzima endonucleasa.

- ¿Qué otros medios medios se usan para recuento y aislamiento de S. aureus?o Agar Vogel-Johnsono Agar yema de huevo azida

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o Agar yema de huevo salo Agar sangreo Agar yema de huevo telurito polimixina

- ¿Cómo se obtiene la toxina estafilocócica?o Las primeras investigaciones comenzaron a principios de la década del

60 y se purificaron diferentes serotipos toxigénicos a partir de cepas productoras de enterotoxinas, mediante varias combinaciones de cromatografía de intercambio iónico y filtración sobre gel, las primeras purificaciones empleaban un largo tiempo, y se hacían en 4 ó 5 etapas, pero se obtenía un bajo recobrado. En estudios realizados por Bécquer et al. en la obtención y purificación de la enterotoxina de serotipo B, se emplearon 3 pasos de purificación fundamentados en la utilización de Amberlite IRC-50 (H), carboximetilcelulosa (CM-321) y Sephadex G-75, y se obtuvo un recobrado total del 15 % y un alto grado de pureza. Resultados más alentadores se presentaron posteriormente en el aislamiento y purificación de la enterotoxina E, cuando se obtuvieron 89,72 mg de enterotoxina y un recobrado total del 17,67 %. Se ha logrado purificar toxinas estafilocócicas en 1 y 2 pasos. El primer paso utiliza la cromatografía de afinidad con rojo de triazina para la purificación de la enterotoxina A, y el segundo consiste en un intercambio iónico sobre carboximetil celulosa y un enfocamiento cromático para las enterotoxinas de los serotipos A, B y C donde demuestran una pureza de 72 a 92 %, según un densitograma de poliacrilamida.

- ¿Cuál es la composición del agar BP y cual es el fundamento de la formación característica del halo?

Agar Baird ParkerExtracto de carne 5 gPeptona de caseína 10 gExtracto de levadura 1 gPiruvato sódico 10 gGlicocola 12 gCloruro de litio 5 gAgar 15 gAgua destilada 1 000 mL

o En los medios a base de yema de huevo S. aureus utiliza la lipovitelina (una lipoproteína presente en la yema de huevo) lo que se manifiesta por la aparición de áreas debajo y alrededor de las colonias. La aparición de zonas aclaradas o parcialmente aclaradas de un precipitado blanco procede de la formación de sales de calcio y magnesio de los ácidos grasos liberados. Estas dos características representa la llamada “reacción de la yema de huevo”.

VII. Referencias:

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- CHANS R., G. (2002). Estafilococos. Obtenido el 22 de febrero de 2008 en http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf

- BECQUER L., A. y otros (1996). Detección de la desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) directamente del alimento. Obtenido el 22 de febrero de 2008 en http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol10_2_96/ali05296.htm

- FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Investigación y Recuento de Staphylococcus aureus. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.

RESULTADOS FINALES

- Recuento de colonias:

En el recuento de colonias de las diluciones realizadas nos dio los sgtes. resultados:

Diluciones # de colonias Promedio 10-1 A Incontables10-1 B Incontables

Incont.

10-2 A 1148

10-2 B 13201234

10-3 A 572

10-3 B 372472

Dividimos los promedios de las diluciones 10-2 y 10-3 y obtenemos los sgtes. resultados:

10-2 → 123410-3 → 472

= 2.6

El resultado es mayor de 2. Entonces tomamos la menor dilución como el valor para el conteo de colonias. Entonces, el resultado para el conteo de colonias será:

47.2 x 10-4 ufc/gr

La cantidad de S. aureus (expresado en ufc) en la muestra de queso artesanal recogido en el Mercado Modelo de Lambayeque es de 47.2 x 10-4 ufc/gr.

- Prueba de termonucleasa:

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De las colonias positivas para la prueba de coagulasa, se les pasó a realizar la prueba de termonucleasa. Para esto se emplea agar DNasa, al cual, después de servir en placas de Petri y dejar solidificar, se les hace dos agujeros en la parte media y separados uno del otro.Luego, de la cepa de S. aureus, a la cual hemos sembrado en caldo nutritivo previamente, se pone en agua hervida por 5 min. , luego lo ponemos a enfriar en agua. Después, inoculamos en los orificios hechos en el agar pequeñas cantidades del caldo con S. aureus de tal manera que quede de forma convexa. Luego ponemos a incubar la placa a 37 ºC por 2-4 h. Pasado el tiempo leemos las placas. Una coloración rosada a guinda en la zona de la inoculación es una reacción positiva para la prueba.

Pasado el tiempo de espera las oquedades en las que sembramos no mostraron ningún cambio, como se puede mostrar en la fotografía adjunta.

Por lo tanto, la prueba de termonucleasa es negativa. Si la prueba de coagulasa es positiva y la prueba de termonucleasa es negativa se podría suponer que la cepa aislada no es S. aureus, pero dado el caso que el medio ADNasa usado es un medio con un tiempo bastante largo de conservación puede que no estén (sus componentes) en todo su poder de uso. La literatura señala que la prueba de termonucleasa es confirmativa para S. aureus patógeno, pero en este caso, ya que el medio usado nos da un resultado dudoso (ya que además de las cuatro grupos que aislaron S. aureus coagulasa positiva, a ninguno le dio positivo la prueba de termonucleasa), se puede decir que la cepa aislada sí es S. aureus y ésta fue aislada de una muestra de queso artesanal colectada en el Mercado Modelo de Lambayeque.

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