caracterización de aislamientos staphylococcus aureus

128
Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en Suramérica Olga Maritza Berrio Pérez Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Bogotá, Colombia 2018

Upload: others

Post on 30-Apr-2022

4 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Olga Maritza Berrio Pérez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia

2018

Page 2: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus
Page 3: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Olga Maritza Berrio Pérez

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias: Microbiología

Director: Dr. César Augusto Arias MD, MSc, Ph.D

Codirectora: Dra. María Teresa Reguero Reza. Q.F., MSc

Línea de Investigación:

Resistencia antimicrobiana en enterococos y estafilococos

Grupo de Investigación:

Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana (UGRA) – Universidad el Bosque

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia

2018

Page 4: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus
Page 5: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

V

Dedicatoria

A Dios que en su infinita misericordia,

siempre me ha sostenido y me tiene aquí

para cumplir sus planes… señor eres mi

estandarte, mi escudo y mi todo.

Dios es amor. El que permanece en amor,

permanece en Dios, y Dios en él. 1 Juan 4,

16

A mis padres:

Luisa y Alfredo, quienes siempre han sido mi

apoyo incondicional, mi madre sigue aquí… y

sé que mi padre desde el cielo me apoya,

Papi… aquí estoy terminando nuestro

sueño…

A todas las personas que han sufrido esta

patología… se puede seguir, luchar día a día

para continuar, a pesar de los altibajos, se

pueden cumplir sueños que murieron en las

crisis.

La mente es una gran bendición, pero puede

ser nuestra peor enemiga si lo permitimos,

está en nosotros hacerla nuestra aliada.

Page 6: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

VI

Agradecimientos

Primero que todo a papá Dios, porque es su infinita bondad me permitió terminar este

proceso - sueño y puso en mi camino a tantas personas que con amor y buena

disposición me han ayudado en este proceso, Dios gracias porque siempre cumples tus

promesas y esta es una de ellas; así mismo, porque este escalón me ha llevado al

crecimiento personal, espiritual y académico.

¡A mi familia! por su amoroso e incondicional apoyo: mami, papi, Janneth, Alejo, Juan Da,

Angie y Poliita. Gracias por alegrar mi vida, ¡sin ustedes no hubiera podido superar todo

lo que he afrontado! Y probablemente no estaría aquí todavía. Son los amores de mi

vida y no pude ser más bendecida con una familia tan bonita, con tanto amor, confianza,

y soporte. Papi, sé que en donde estas, estas feliz de que alcance esta meta.

A todos los miembros del equipo de la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana

(UGRA) de la Universidad del Bosque, que es un grupo sólido y ejemplo de trabajo en

equipo; de todos ustedes he aprendido que con disciplina, constancia, organización,

esfuerzo y amor a la academia, se puede aportar al conocimiento científico de este país y

del mundo: gracias Dr. Cesar Arias, Dra. Jinnethe Reyes, Dra. Lorena Díaz, Dra. Sandra

Rincón, Dra. Diana Panesso, Dra. Paola Carvajal, mi infinito y amoroso agradecimiento

por su apoyo constante durante este largo… proceso. Eduardo, Aura, Paolita, Rafael y

Javier mil gracias por su colaboración y buena disposición, para explicarme y resolver

mis dudas.

A Jinn por ser mi codirectora extraoficial, infinitas gracias por tu tiempo, paciencia,

disposición, confianza y apoyo constante; a Lore, por tu apoyo, tiempo, paciencia,

explicaciones y disposición; no tengo como agradecer a ustedes dos, todo lo que han

hecho por mí en estos años de trabajo, y en los últimos meses aun más; al Dr. Arias por

darme esta nueva oportunidad, y por ser un ejemplo de lo que es un verdadero líder

académico, y excelente ser humano. ¡Gracias a todos! Sin ustedes no hubiera podido

culminar este sueño de tantos años.

A la Dra. Martha Fontanilla, quien me ha demostrado que se puede lograr lo que cada

uno se proponga, que con trabajo y perseverancia se puede aportar para construir país.

A Socorrito mil gracias por tu apoyo durante todos estos años, tu paciencia y tu

Page 7: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Dedicatoria y agradecimientos VII

disposición de ayuda. A ambas, muchas gracias por su apoyo, paciencia y

direccionamiento, sin ustedes no hubiera podido retomar este sueño.

A la profesora María Teresa Reguero, por su apoyo, tiempo, dedicación, y nueva

oportunidad en este largo proceso, profesora a quien admiro y respeto, por ser un

excelente ser humano y un ejemplo de ser una buena maestra. Muchas gracias

¡A Diani, por tu apoyo!, y también el préstamo de las asas de vidrio, cajas de agar sangre

y las fotos. A María Carlina, por su tiempo y generosidad, en los análisis iniciales que

realizamos. A Sandra García por la traducción del resumen y revisión.

A la Universidad Nacional de Colombia, que me ha permitido retomar este sueño y

continuar con mi proceso académico a feliz término, Institución que admiro

profundamente, que apoya a la construcción del país desde la academia y brinda

oportunidades reales a personas que no pueden ni soñar con ellas. Me siento orgullosa y

feliz de haber podido cursar estudios en su claustro. Al Instituto Nacional de Salud, que

como institución pública, me ha enseñado que se aporta desde el conocimiento

epidemiológico a la construcción del país, y que podemos aportar una semilla para

mejorar nuestra nación.

A la Universidad el Bosque que me proporcionó mis primeros trabajos, y en donde pasé

años de aprendizaje académico y personal, así como por la financiación de este trabajo.

Parte de la presente investigación fue financiada mediante la convocatoria interna de

investigación de la Universidad el Bosque, proyecto: “Caracterización de fenotipos de

resistencia a vancomicina (VISA - h-VISA) en aislamientos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina (MRSA) en tres países Latinoamericanos”, código PCI 2009-07.

La secuenciación completa del genoma fue solventada con recursos de proyectos

financiados por Colciencias (códigos 906-2015 y 705-2016), aprobados al Centro

Internacional de Genómica Microbiana (CIGM) y de la Unidad de Genética y Resistencia

Antimicrobiana (UGRA), de la Universidad el Bosque.

Por último, quiero agradecer a todas las personas que Dios ha permitido se cruzaran en

mi vida, de todas he aprendido, en este proceso de crecimiento individual en el que todos

los seres humanos estamos, cada uno ha sido valioso para mí. Finalmente, ¡gracias a

todos y mil bendiciones!

Page 8: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

VIII Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Page 9: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Resumen y Abstract IX

Resumen

La vancomicina es el antibiótico utilizado para el tratamiento de infecciones complicadas

por Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA); sin embargo, con el paso del

tiempo han aparecido aislamientos con susceptibilidad reducida a vancomicina. El

mecanismo que causa bajos niveles de resistencia a vancomicina en S. aureus no ha

sido completamente elucidado, no obstante, se han encontrado mutaciones y

acumulación de las mismas, en genes que controlan el metabolismo de este tipo de

aislamientos.

En el presente estudio se realizó perfil de análisis de poblaciones- área bajo la curva

(PAP-AUC), para confirmar el fenotipo de resistencia intermedia heterogénea a la

vancomicina (hVISA), posteriormente se realizó caracterización molecular mediante

electroforesis de campo pulsado (PFGE), secuenciación completa del genoma (MiSeqTM

System, Illumina) y análisis in silico.

De los nueve aislamientos MRSA (originarios de Colombia, Ecuador y Perú), tres fueron

confirmados con el fenotipo hVISA, uno procedía de Ecuador (ST228) y dos de Perú

(ST5); los tres aislamientos pertenecen al complejo clonal 5, son PVL negativos,

SCCmec I y agr II. Los tres hVISA son aislamientos multirresistentes a antibióticos, se

halló correlación entre los genes de resistencia y los resultados de las pruebas de

susceptibilidad a betalactámicos, aminoglicósidos, fluoroquinolonas y macrólidos.

Los alineamientos de las secuencias de aminoácidos permitieron detectar cambios en

residuos de aminoácidos en proteínas que han sido relacionados previamente al fenotipo

hVISA/VISA.

Los resultados de tipificación molecular, sugieren que los aislamientos procedentes de

Perú, tienen características similares con el MRSA-I-ST5, que se denomina clon

chileno/cordobés que ha circulado en la región. Los tres aislamientos adquirieron el

fenotipo de susceptibilidad disminuida a vancomicina, probablemente por acumulación de

mutaciones que alteran la regulación de vías de síntesis de envoltura celular.

Palabras clave: Staphylococcus aureus, vancomicina, resistencia bacteriana, hVISA

Page 10: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

X Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Abstract Vancomycin is the antibiotic used for the treatment of Methicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA) complicated infections; however, isolates with reduced susceptibility to

this antibiotic have appeared over time. The mechanism that causes low resistance levels

to vancomycin in S. aureus has not been fully elucidated, though, mutations and their

accumulations have been found in genes controlling the metabolism of this type of

isolates.

In the present study, a population analysis profile - area under the curve (PAP-AUC) was

performed to confirm heterogeneous intermediate resistance to vancomycin (hVISA).

Afterwards, molecular characterization was performed by pulsed-field gel electrophoresis

(PFGE), whole genome sequencing (MiSeqTM System, Illumina) and in silico analysis.

From the nine MRSA isolates (from Colombia, Ecuador and Peru), three were confirmed

with hVISA phenotype, one from Ecuador (ST228) and two from Peru (ST5). The three

isolates belong to the clonal complex 5, they are PVL negatives, SCCmec I and agr II.

The three hVISA isolates are multi-drug an resistant bacteria; correlation was found

between resistance genes and antibiotic susceptibility tests results to beta-lactams,

aminoglycosides, fluoroquinolones and macrolides.

Alignment of amino acid sequences allowed detecting amino acid residues changes in

proteins that have been previously related to the hVISA / VISA phenotype.

Molecular typing results suggest that isolates from Peru have similar characteristics with

MRSA-I-ST5, called the Cordobes/Chilean clone that has circulated in the region. The

three isolates acquire the reduced susceptibility to vancomycin phenotype, probably due

to the accumulation of changes that alter the regulation of cellular envelope synthesis

pathways.

Key words: Staphylococcus aureus, vancomycin, bacterial resistance, reduced

vancomycin susceptibility S. aureus.

Page 11: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Contenido XI

Contenido

Pág.

Lista de figuras ............................................................................................................. XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XIV

Lista de anexos ............................................................................................................ XV

Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XVI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Capítulo 1. Marco Teórico ........................................................................................ 5 1.1 Staphyloccocus aureus .................................................................................... 5 1.2 Sistemas reguladores de dos componentes y genes relacionados al fenotipo hVISA/VISA ................................................................................................................ 7

1.2.1 Sistema Accesorio Regulador Agr ......................................................... 8 1.2.2 Sistema de dos componentes WalKR ................................................... 9 1.2.3 Sistema de dos componentes VraSR .................................................. 10 1.2.4 Sistema GraSR ................................................................................... 11 1.2.5 Gen tcaA ............................................................................................. 11 1.2.6 Gen atl ................................................................................................ 12 1.2.7 Gen rpoB ............................................................................................. 12

1.3 Pared Celular ................................................................................................. 13 1.4 Glicopéptidos: generalidades y mecanismo de acción ................................... 15

1.4.1 Vancomicina: generalidades y estructura química ............................... 15 1.5 Resistencia a los glicopéptidos en S. aureus ................................................. 17

1.5.1 Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (SARV o VRSA) ..... 18 1.5.2 S. aureus con bajos niveles de resistencia a vancomicina (VISA o hVISA) 20

1.6 Mecanismos de resistencia a vancomicina en S. aureus ............................... 21 1.6.1 Mecanismo de resistencia con altos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus (VRSA) ......................................................................................... 21 1.6.2 Mecanismo de bajos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus (VISA y hVISA) .................................................................................................. 22

1.7 Epidemiología de VISA y hVISA .................................................................... 26 1.8 Métodos para la detección de aislamientos con sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/ VISA) ...................................................................................... 29

2. Capítulo 2. Objetivos .............................................................................................. 33 Objetivo General ...................................................................................................... 33 Objetivos específicos ............................................................................................... 33

3. Capítulo 3. Metodología ......................................................................................... 35 3.1 Esquema Metodológico General .................................................................... 35 3.2 Cepas bacterianas ......................................................................................... 36 3.3 Perfil de análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC) ............... 39

Page 12: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

XII Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

3.4 Electroforesis en campo pulsado (PFGE) .......................................................40 3.5 Secuenciación ................................................................................................42

Extracción de ADN genómico y verificación de calidad ......................................42 Preparación de las librerías genómicas .............................................................42

3.6 Análisis in sílico ..............................................................................................44 3.6.1 Tipificación de Secuencias de Múltiples Locus (MLST) ........................44 3.6.2 Detección de cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el fenotipo VISA/hVISA ......................................44 3.6.3 Detección tipo de grupo agr, PVL, SCCmec ........................................45 3.6.4 Tipificación de spa y resistoma ............................................................46 3.6.5 Detección de expresión de delta hemolisina ........................................46

4. Capítulo 4. Resultados ...........................................................................................49 4.1 Resultados objetivo 1. Confirmación de fenotipo hVISA/VISA por perfil de análisis de poblaciones (PAPs) .................................................................................49 4.2 Resultados objetivo 2. Epidemiología molecular de aislamientos hVISA, PFGE, MLST ............................................................................................................51

4.2.1 Resultados de PFGE ...........................................................................51 4.2.2 Resultados de secuenciación, ensamblaje y anotación genómica .......52 4.2.3 Resultados de MLST ...........................................................................53

4.3 Resultados Objetivo 3. Tipo agr en aislamientos confirmados como hVISA y detección fenotípica de hemolisina delta ...................................................................54 4.4 Resultados adicionales: tipo spa, PVL, resistoma y mutaciones de genoma relacionadas con el fenotipo hVISA ..........................................................................57

4.4.1 Resistoma ............................................................................................57 4.4.2 Tipificación de spa ...............................................................................59 4.4.3 Cambios en proteínas asociadas con el fenotipo hVISA/VISA .............59 4.4.4 Resumen de análisis adicionales a los objetivos planteados ...............64

5. Capítulo 5. Discusión ..............................................................................................65

6. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................79 6.1 Conclusiones ......................................................................................................79 6.2 Recomendaciones ..............................................................................................80

Anexos ............................................................................................................................81

7. Bibliografía ..............................................................................................................87

Page 13: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág. Figura 1-1 Regulación del Sistema agr ............................................................................ 9

Figura 1-2 Síntesis de monómero de mureina y ensamblaje del peptidoglicano. ........... 14

Figura 1-3 Estructura química de la vancomicina .......................................................... 16

Figura 1-4 Tipo de resistencia a vancomicina y resultados de MIC en S. aureus (CLSI:

Clinical and laboratory Standars Institute, 2012) ............................................................. 18

Figura 1-5 VanA que confiere resistencia a vancomicina ............................................... 22

Figura 1-7 Generación y pérdida del fenotipo hVISA/VISA/VSSA .................................. 25

Figura 3-1 Metodología establecida para el cumplimiento de los objetivos específicos.

*Análisis adicionales realizados, que no estaban en los objetivos específicos planteados

en el proyecto inicial ....................................................................................................... 36

Figura 3-2 Interpretación de resultados ensayo hemólisis ............................................. 47

Figura 4-1 Perfil de análisis de poblaciones de los aislamientos hVISA ......................... 50

Figura 4-2 Resultados de PFGE .................................................................................... 52

Figura 4-3 Tipificación agr II aislamientos hVISA ........................................................... 56

Figura 4-4 Ensayo de δ hemolisina. ............................................................................... 57

Figura 4-5 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK ............... 61

Figura 4-6 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de Atl ................... 61

Figura 4-7 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de TcaA ............... 62

Figura 4-8 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de de RpoB. ......... 63

Page 14: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

XIV Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1-1 Variaciones en los criterios para definición del nivel de sensibilidad a

vancomicina de S. aureus, CLSI, 2012. .......................................................................... 30

Tabla 3-1 Lista de cepas de S. aureus utilizados en este estudio. .................................. 38

Tabla 3-2 Criterios de interpretación del PAP-AUC ........................................................ 39

Tabla 3-3 Secuencias de iniciadores para detección de grupo agr ................................. 45

Tabla 3-4 Iniciadores para detección de tipo de SCCmec .............................................. 46

Tabla 4-1 Resultados de PAP-AUC en los nueve aislamientos evaluados. .................... 49

Tabla 4-2 Porcentaje de aislamientos confirmado como hVISA, discriminado por país. 51

Tabla 4-3 Resultados generales del proceso de secuenciación de los aislamientos ....... 53

Tabla 4-4 Perfil alélico de los aislamientos hVISA .......................................................... 53

Tabla 4-5 Aislamientos hVISA con agr II......................................................................... 54

Tabla 4-6 Resistoma y MIC para los aislamientos hVISA ............................................... 58

Tabla 4-7 Tipificación de spa en los aislamientos hVISA ................................................ 59

Tabla 4-8 Resumen de hallazgos de sustituciones de residuos de aminoácidos en

proteínas previamente relacionadas con hVISA/VISA ..................................................... 63

Tabla 4-9 Principales hallazgos a nivel de análisis de genoma de los aislamientos hVISA

....................................................................................................................................... 64

Page 15: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Contenido XV

Lista de anexos

…………………………………………………………………………….……………….....…Pág. Anexo A. Alineamientos de otras secuencias de aminoácidos conservadas………...…81 Anexo B. Presentaciones en eventos científicos……………………………………….….83

Page 16: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

XVI Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

ADN Ácido desoxirribonucleico

Agr Gen accesorio regulador

AIP Péptido Autoinductor

ARN Ácido ribonucleico

AT Ácidos teicoicos

ATP Trifosfato de adenosina

BHIA Agar infusión cerebro corazón (del inglés brain hearth infusion)

CAMP Péptidos antimicrobianos catiónicos

CC Complejo clonal

CDC Centro para el Control y la Prevención de enfermedades (del inglés

Center for Disease Control and Prevention)

CLSI Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (del inglés Clinical and

Laboratory Standard Institute)

CoNS estafilococos coagulasa negativos

Da Daltons

EUCAST Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (del

inglés European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)

FDA Administración de Alimentos y Medicamentos (del inglés Food and Drug

Administration)

GISA S. aureus con resistencia intermedia a glicopéptidos

GlcNac N-acetilglucosamina

GRD Detección de Resistencia a Glicopéptidos (del inglés glycopeptide

resistance detection)

HK Histidin Kinasa

hVISA Staphylococcus aureus con resistencia intermedia heterogénea a la

vancomicina (del inglés heterogeneous Vancomycin-intermediate S.

aureus)

MGE Elemento genético móvil

MHA Agar Mueller Hinton

MIC Concentración inhibitoria mínima

MLST Tipificación de secuencias multilocus (del inglés multilocus sequence

typing)

MRSA S. aureus resistente a la meticilina (del inglés Methicillin-resistant S.

aureus)

MRSA-AC S. aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad (del

inglés Community associatted Methicillin-resistant S. aureus)

Page 17: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Dedicatoria y agradecimientos XVII

MRSA-AH S. aureus resistente a la meticilina adquirido en ambiente hospitalario

(del inglés hospital-adquired Methicillin-resistant S. aureus)

MSCRAMM Componentes de la superficie bacteriana que reconocen las moléculas

de adhesión de la matriz extracelular

MSSA S. aureus sensible a meticilina

MurNac Ácido N-acetilmurámico

PAP-AUC Perfil de análisis de poblaciones-área bajo la curva

PAP Perfil de análisis de poblaciones

PBP Proteína de unión a penicilina (del inglés penicilin binding protein)

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PFGE Electroforesis en campo pulsado (del inglés pulsed field gel

electrophoresis)

PGN Peptidoglicano

PSMs Modulinas fenol solubles

PVL Leucocidina de Panton Valentine (del inglés Panton Valentine

Leukocidin)

SNP Polimorfismos de un solo nucleotido

spa Gen que codifica para la proteína A

ST Secuencia tipo

TCS Sistema de transducción de señales de dos componentes (del inglés

two-component systems)

TEI Teicoplanina

TSST1 Toxina del síndrome de shock tóxico

UFC Unidades formadoras de colonia

VAN Vancomicina

VISA S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (del inglés

Vancomycin-intermediate S. aureus)

VRSA S. aureus con altos niveles de resistencia a vancomicina (del inglés

Vancomycin-resistant S. aureus)

VSSA S. aureus sensible a la vancomicina (del inglés Vancomycin-susceptible

S. aureus-VSSA)

Page 18: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus
Page 19: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Introducción

El descubrimiento y la comercialización de los antimicrobianos ha revolucionado la

medicina, y se convirtió en una importante herramienta para intervenciones médicas

complicadas, tales como la terapia del cáncer, trasplante de órganos, y manejo de los

pacientes que presentan enfermedades complejas (Munita, Bayer & Arias, 2015); sin

embargo, el extenso uso de antibióticos (que se estimó en alrededor de 100.000-200.000

toneladas por año en el mundo en 2002 y que suman más de 1 millón de toneladas

desde 1940), ha generado un dramático incremento en las estadísticas de patógenos

resistentes a antibióticos, lo que indica sobre la probable pérdida de opciones

terapéuticas para el tratamiento de estos microorganismos (Andersson & Hughes, 2010).

La aparición de aislamientos clínicos resistentes a múltiples antibióticos

(multirresistentes), reduce drásticamente la posibilidad de tratar infecciones con eficacia y

aumenta el riesgo de complicaciones que incluso pueden llevar a la muerte del paciente

(Andersson & Hughes, 2010). Inicialmente, las infecciones producidas por bacterias

resistentes a antibióticos ocurrían en hospitales, donde el uso de antimicrobianos es más

amplio; sin embargo, desde hace algunos años también se han descrito bacterias

resistentes a antimicrobianos relacionadas con la comunidad (Furuya & Lowy, 2006);

desafortunadamente, debido a la transferencia de genes de resistencia a antibióticos,

estas bacterias han logrado sobrevivir y tienen la capacidad de diseminarse a otros

individuos, ya sea por medio del personal de salud o por omisión de las medidas de

asepsia adecuadas.

Algunos estudios muestran que entre los microorganismos Gram positivos más

frecuentemente aislados a nivel de infecciones hospitalarias se encuentran, estafilococos

coagulasa negativos (CoNS), Staphylococcus aureus y enterococos, usualmente

Page 20: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

2 Introducción

causando infecciones severas como bacteriemias, endocarditis o infecciones de piel y

tejidos blandos, entre otras (Lowy, 1998).

S. aureus puede hacer parte de la microbiota normal, sin generar ningún daño, pero en

ocasiones puede poner en peligro la vida de los pacientes, debido a su habilidad para

evadir el sistema inmunológico, su fenotipo de resistencia a múltiples antimicrobianos,

hace que sea una de las bacterias patógenas más difíciles de tratar (Hiramatsu et al.,

2014a). S. aureus inicialmente presentó resistencia a penicilina mediante la producción

de betalactamasas, más adelante se describió la resistencia a penicilinas semisintéticas,

generando aislamientos conocidos como S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), que

ha sido descrito a nivel hospitalario (MRSA-AH) y también en infecciones asociadas a la

comunidad (MRSA-AC), convirtiéndose en un problema global debido al aumento de sus

prevalencias.

Los MRSA se asocian con aumento en la morbilidad, mortalidad, tiempo de estancia

hospitalaria y costos asociados a tratamientos (Shorr, 2007). Se estima que S. aureus

produce alrededor de 12 millones de visitas ambulatorias y 292.000 hospitalizaciones

anualmente en Estados Unidos, de las cuales 126.000 son producidas por MRSA (Lo,

Lai, Liu, Gallo, & Huang, 2011). Se estima que las infecciones por MRSA causan

alrededor de 19.000 muertes por año en Estados Unidos y adicional a la alta tasa de

mortalidad, las infecciones por este patógeno generan costos adicionales al sistema de

salud de entre 3 a 4 mil millones de dólares por año (Fischbach & Walsh, 2009). De

acuerdo a los datos de incidencias de MRSA en Estados Unidos para 2005, y a las

proyecciones realizadas al respecto, se estima que el número de muertes asociadas a

MRSA excedia el número de muertes atribuidas a la infección con HIV y SIDA en 2005

en dicho país (Rehm & Tice, 2010).

Los glicopéptidos y especialmente la vancomicina, han sido considerados como el

fármaco de elección para el tratamiento de bacteriemias y sepsis causadas por MRSA, la

alta prevalencia de infecciones por este patógeno llevó a un incremento del uso de

vancomicina en pacientes crónicos y seriamente enfermos (Rehm & Tice, 2010). Durante

muchos años no hubo sospechas de problemas de resistencia a vancomicina en S.

aureus (Howden, Davies, Johnson, Stinear, & Grayson, 2010). Por lo tanto, los informes

iniciales de la susceptibilidad reducida a vancomicina en los aislamientos clínicos de S.

Page 21: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Introducción 3

aureus, generaron una preocupación importante en la comunidad médica (Howden et al.,

2010).

Infortunadamente el incremento de las infecciones nosocomiales con MRSA y la

exposición a vancomicina, ha llevado al desarrollo de cepas, con varios grados de

resistencia a este antibiótico (Hu et al., 2013).

En 1997 se realizaron los primeros reportes en Japón, de pacientes con aislamientos de

MRSA con susceptibilidad disminuida a vancomicina (VISA) (Hiramatsu, et al., 1997a) y

luego se reportaron aislamientos con resistencia intermedia heterogénea a la

vancomicina (hVISA) en este mismo país (Hiramatsu et al., 1997b); posteriormente en

2002, se hizo el primer reporte de S. aureus resistente a vancomicina (VRSA), en un

paciente en Michigan, Estados Unidos (Center for Disease Control & Prevention, 2002a).

Desde el primer reporte de los aislamientos con susceptibilidad disminuida a vancomicina

hVISA (Mu3) o VISA (Mu50), se ha documentado su aparición en diferentes países, entre

ellos: Australia (Gosbell, Mitchell, Ziochos, & Ward, 2003; Murray, Sieunarine, Ward, &

Pearman, 2004) Canadá (Adam et al., 2010), China (Hu et al., 2013; Sun et al., 2009),

Estados Unidos (Casapao et al., 2013; Richter et al., 2011; Sader et al., 2009a), Francia

(Garnier et al., 2006), Hungría (Toth et al., 2008), Israel (Maor et al., 2014), Italia

(Campanile et al., 2010), Corea (Song et al., 2004), Reino Unido (Kirby et al., 2010;

Wootton et al., 2001), Singapur (Fong, Low, Koh, & Kurup, 2009).

En Colombia se han realizado estudios epidemiológicos de resistencia a antibióticos, uno

de ellos desarrollado en 14 instituciones de Bogotá, entre 2001 y 2003, en el cual se

analizaron 84.664 aislamientos, hallando que los patógenos más frecuentes fueron

Escherichia coli (20,05%), S. aureus (15,53%), estafilococos coagulasa negativos

(9,77%), Klebsiella pneumoniae (5,71%) y Pseudomonas aeruginosa (5,69%), así mismo,

encontraron entre 41% y 48% de MRSA (Leal, Eslava-Schmalbach, Alvarez, Buitrago, &

Mendez, 2006).

Otras investigaciones buscaban establecer las tasas de resistencia en Gram positivos,

como el estudio multicéntrico realizado por Arias et al. (2003) que se desarrolló en 15

centros hospitalarios, entre 2001 y 2002 (597 muestras de estafilococos y enterococos)

encontrando 29,6% de CoNS, 20,8% de enterococos, 49,6% de S. aureus, y 52% de

Page 22: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

4 Introducción

estos fueron MRSA, siendo esta última, una prevalencia de resistencia importante a

dicho antibiótico (Arias et al., 2003).

Entre 2006 y 2008 se realizó una nueva vigilancia que incluía aislamientos de S. aureus y

enterococos de 4 países de Latinoamérica, Perú, Ecuador, Venezuela y Colombia,

obteniendo 1.570 cepas de S. aureus, de los cuales 651 (41%) fueron MRSA. Aquellos

aislamientos de S. aureus que tuvieron MIC ≥1µg/mL, fueron evaluados con 3 tipos agar

suplementado con antibiótico (BHIA con 4 y 6 μg/mL de vancomicina y MHA con 5 μg/mL

de teicoplanina) y se analizaron con 2 tipos de E test, macrométodo y Detección de

Resistencia a Glicopéptidos (GRD), encontrando nueve aislamientos que se podrían

categorizar como probables VISA (6 de Perú, 2 de Colombia, y 1 de Ecuador) (Reyes et

al., 2009).

El objetivo del presente trabajo fue confirmar el fenotipo VISA o hVISA de estos

aislamientos, mediante perfil de análisis de poblaciones-área bajo la curva, luego de lo

cual, se realizó electroforesis en campo pulsado (PFGE) y mediante secuenciación de

genoma completo se realizó caracterización genómica, tipificación de SCCmec, spa, agr,

MLST, y detección de cambios en residuos aminoácidos de proteínas relacionadas

previamente al fenotipo hVISA/VISA.

Tres aislamientos fueron confirmados con hVISA, todos pertenecen a CC5, el procedente

de Ecuador presentó ST228, los dos de Perú ST5, los tres aislamientos fueron SCCmec

I, agr II y en los aislamientos se hallaron diferentes sustituciones en residuos de

aminoácidos de las secuencias de RpoB, TcaA, WalK y Atl. Este es el primer estudio que

referencia aislamientos hVISA confirmados por PAP-AUC con caracterización genómica

de los mismos, en cepas procedentes de estos países.

Page 23: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 5

1. Capítulo 1. Marco Teórico

1.1 Staphyloccocus aureus

Staphylococcus aureus fue descubierto por Alexander Ogston en 1880, en un paciente que

presentaba un absceso lleno de pus (Larkin, Carman, Krakauer, & Stiles, 2009). Desde su

descripción hasta el dia de hoy, se reconoce por ser un agente infeccioso importante debido

a los mecanismos de patogenicidad y desarrollo de resistencia a varios antibióticos.

El S. aureus es un coco Gram positivo de proximadamente 0,5-1,5 µm de diámetro,

pertenece a la familia Micrococcaceae, usualmente se agrupa en “racimos de uvas”,

aunque también pueden estar solos o en pares; no es móvil, no es formador de esporas y

es anaerobio facultativo, generalmente forma colonias de color amarillo dorado, produce

catalasa, fermenta glucosa, fermenta manitol en condiciones anaerobias y resiste a altas

concentraciones de cloruro de sodio, de hasta 10% (Lowy, 1998).

S. aureus produce coagulasa (causando que el plasma se coagule), la cual sirve para

distinguir S. aureus de otros miembros del género, que se denominan estafilococos

coagulasa negativos (Plata, Rosato, & Wegrzyn, 2009).

El genoma de S. aureus consiste en un cromosoma circular de aproximadamente 2,8 Mpb y

se ha propuesto que está compuesto de un genoma central, componentes accesorios y

genes foráneos. Alrededor de 75% de los genes de S. aureus son compartidos por más de

95% de las cepas y, por tanto, puede ser considerado el “núcleo del genoma” (core) de la

especie (Grumann, Nubel, & Broker, 2014). La organización de los componentes del core

es altamente conservada y la mayoría de estos, están asociados con funciones esenciales

y de metabolismo (Plata, Rosato, & Wegrzyn, 2009).

Page 24: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

6 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Los componentes accesorios son usualmente elementos genéticos móviles, que tienen o

tuvieron capacidad de transferencia horizontal entre aislamientos, estos elementos incluyen

islas de patogenicidad, profágos, casetes cromosomales, plásmidos y transposones (Lowy,

1998; Plata, et al., 2009).

La patogénesis de las infecciones por S. aureus depende de la producción de proteínas de

superficie que median la adherencia bacteriana a los tejidos del huésped, la secreción de

una serie de toxinas extracelulares y enzimas que destruyen las células y tejidos del

huésped, previniendo o incapacitando sus defensas, lo que favorece su propagación (Kong,

Neoh & Nathan, 2016) S. aureus en general puede expresar diversos factores de virulencia,

entre ellos:

El peptidoglicano (PGN): componente de la pared celular, que puede tener

actividad de endotoxina al estimular la liberación de citocinas por los macrófagos,

activar el complemento y producir agregación plaquetaria (Lowy, 1998).

El ácido teicóico (AT): otro componente de la pared, puede servir como factor de

anclaje para bacteriófagos y como factor de virulencia, al unirse a la mucosa del

huésped y a estructuras como catéteres (Lowy, 1998).

La proteína A: es característica de S. aureus y es codificada por los genes spa; es

una proteína asociada a la pared celular, que se une a la fracción Fc, de la

inmunoglobulina tipo IgG, facilitando la colonización de los tejidos, esta afinidad le

permite inhibir la opsonización y la fagocitosis (Morell & Balkin, 2010).

Las Moléculas de Unión a Matriz Extracelular: son componentes de la superficie

que reconocen las moléculas de adhesión de la matriz extracelular (MSCRAMM),

facilitando la adhesión del microorganismo al tejido colonizado (Gordon & Lowy,

2008).

Toxinas: una de las características importantes de S. aureus, es su capacidad de

secretar toxinas para lesionar membranas (Plata, et al., 2009). Estas toxinas le

proporcionan características patogénicas desde producir infección in situ hasta

Page 25: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 7

síndromes tóxicos sistémicos sin necesidad de haber diseminación general de la

bacteria (Lowy, 1998).

Hemolisinas: son toxinas que lisan los glóbulos rojos y su acción es mediada

usualmente por el receptor; hay varias clases de hemolisinas incluyendo las α, β, γ,

δ (Kong, et al., 2016).

Leucocidina de Panton Valentine (PVL): es una toxina citolítica, compuesta por 2

componentes LukF-PV y LukS-PV, estas subunidades son codificadas por un

elemento genético móvil (MGE). Las subunidades de PVL se ensamblan en un

octámero formando poro en la membrana plasmática de las células mieloides. La

exotoxina, forma poro e induce la lisis de leucocitos humanos, principalmente en

neutrófilos; la PVL se ha relacionado con infecciones de piel, forúnculos, abscesos

subcutáneos e incluso neumonías necrotizante (Gordon & Lowy, 2008; Meyer,

Girardot, Piemont, Prevost, & Colin, 2009).

Modulinas fenol solubles (PSMs): son una clase de péptidos que reciben este

nombre de acuerdo a su comportamiento durante la extracción con fenol caliente

(Otto, 2010). Estudios han demostrado que S. aureus secreta péptidos similares a

PSM, cuatro cortos (de alrededor de 20 aminoácidos, definidos como tipo α) y dos

largos (de alrededor de 40 aminoácidos, definidos como tipo β) (Wang et al., 2007).

1.2 Sistemas reguladores de dos componentes y genes

relacionados al fenotipo hVISA/VISA

S. aureus es un microorganismo versátil, lo cual se atribuye en gran parte a su capacidad

para expresar coordinadamente factores de virulencia que varían de acuerdo a los

estímulos ambientales, dichos cambios son controlados principalmente por sistemas

reguladores de dos componentes (TCS de sus siglas en inglés) (Ji et al., 2016).

Un sistema regulador de dos componentes, es un sistema de transducción de señales que

consiste en una proteína sensora que detecta y responde a una señal externa, y que actúa

Page 26: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

8 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

sobre una proteína reguladora de respuesta, que transmite la señal a otros componentes de

la célula bacteriana (Hughes, 2003).

Entre los 16 sistemas TCS presentes en S. aureus SaeSR y AgrCA juegan papeles

importantes en el control de la virulencia; genes de evasión del sistema inmune y el sistema

WalKR controla el metabolismo de la pared celular, este último es esencial para la

viabilidad de la célula (Delaune et al., 2012). A continuación se presentan algunos operones

o genes, en los que han sido descritas algunas mutaciones específicas, relacionadas con el

fenotipo hVISA/VISA.

1.2.1 Sistema Accesorio Regulador Agr

El locus agr es parte del núcleo del genoma de S. aureus y es un TCS (Yarwood &

Schlievert, 2003), agr es un regulador global que regula la producción de factores de

virulencia de S. aureus (Kong et al., 2016). La producción de toxinas vitales para S. aureus

tales como α, β, γ hemolisina, toxina del síndrome de shock tóxico (TSST-1), enterotoxinas

B, D y C, exfoliatina A y B y PVL son reguladas positivamente por el sistema agr; en este

sentido se ha demostrado que se requiere de un sistema agr funcional para la expresión

máxima y la secreción de varias enzimas tales como la serina proteasa, proteasa V8,

estafiloquinasa, glicerol éster hidrolasa, nucleasas, lipasas, fosfolipasas y fibrinolisina

(Kong, et al., 2016).

La expresión de proteínas de virulencia está bajo el control del ARN III, un transcrito

regulador del gen accesorio regulador agr; el ARN III se activa por el sistema regulador de 2

componentes (AgrC, AgrA) codificado por agr. El locus agr comprende dos unidades

transcripcionales divergentes, bajo el control de promotores P2 (ARN II) y P3 (ARN III). El

operón P2 regula un sistema de transducción de señales de dos componentes (AgrC es el

receptor transmembranal histidina kinasa y AgrA el regulador citoplasmático), un propéptido

(AgrD) y una proteína integral de membrana (AgrB), que está implicada en el

procesamiento y la secreción del péptido, resultando un péptido autoinducido maduro (AIP)

que se acumula en el ambiente extracelular durante el crecimiento de la bacteria (Gilot,

Lina, Cochard, & Poutrel, 2002; Thoendel & Horswill, 2009); la concentración de este

péptido depende de la densidad celular, y cuando se alcanza una concentración umbral, se

Page 27: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 9

une a AgrC (quorum sensing), y se activa el TCS por fosforilación. El sensor AgrA

fosforilado, regula positivamente la transcripción del promotor P2, amplificando la

respuesta, e inicia la transcripción del promotor P3, el ARN III, regula positivamente la

secreción de factores de virulencia y regula negativamente la producción de proteínas de

superficie, el proceso se muestra en la figura 1-1 (Gilot et al., 2002; Kong et al., 2016). Se

ha descrito que los AIP producidos por S. aureus activan el locus agr en algunas cepas,

mientras que inhiben su expresión en otras.

Ha sido descrito un polimorfismo en una región variable de agr, que comprende secuencias

de nucleótidos entre AgrD, parte del C-terminal de AgrB y una porción del N-terminal de

AgrC (Ji, Beavis, & Novick, 1997), este polimorfismo en agr, permite clasificarlo en cuatro

tipos I, II, III, IV (Gilot et al., 2002).

Figura 1-1 Regulación del Sistema agr

1.2.2 Sistema de dos componentes WalKR

El TCS WalKR (se conoce también como YycFG, Vick y MicAB), es el único sistema de

transducción de señales esencial para el crecimiento de S. aureus (Haag & Bagnoli, 2016),

se expresa durante la fase exponencial y se apaga cuando entra en fase estacionaria, esto

Hemolisina

delta

Page 28: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

10 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

sugiere que este sistema esta activo y es necesario durante el crecimiento exponencial

(Dubrac & Msadek, 2004).

En S. aureus WalK es el sensor histidin kinasa y posee tres dominios funcionales: la kinasa

intracelular, las hélices transmembranales, y el dominio extracelular del receptor (Ji et al.,

2016). WalR es el regulador de respuesta, con un receptor dominio N-terminal y un dominio

de unión a ADN C-terminal (Dubrac & Msadek, 2004; Dubrac & Msadek, 2008; Haag &

Bagnoli, 2016).

El TCS se activa a través de la fosforilación del regulador de respuesta WalR, por la

histidina kinasa de WalK, llevando a un incremento en la expresión de genes importantes

involucrados en la degradación y renovación de la pared celular (Haag & Bagnoli, 2016).

WalKR controla positivamente la actividad autolítica, particularmente de las dos autolisinas

principales de S. aureus, Atl y LytM; así mismo WalKR, regula la transcripción de 13 genes

implicados en el metabolismo y degradación de la pared celular, la reducción de los niveles

de WalKR en la célula bacteriana produce un aumento de la resistencia a Tritón X-100 y la

lisis celular inducida por lisostáfina (Haag & Bagnoli, 2016).

1.2.3 Sistema de dos componentes VraSR

VraSR es un sistema de dos componentes típico, compuesto por VraS y VraR, que puede

sensar y transmitir señales de estrés, que son producidas desde la pared celular; como

factor de trascripción, VraR (regulador de respuesta) activa la expresión de los genes

necesarios para la síntesis de la pared celular, VraS (sensor histidina kinasa) regula la

actividad de unión de VraR al ADN, mediante la fosforilación y polimerización de la misma

(Chen et al., 2016).

Cuando S. aureus es expuesto a una amplia gama de agentes que dañan la pared celular,

el TCS VraSR controla la inducción de un estimulón de estrés de pared celular (CWSS del

inglés: cell wall stress stimulon) (McCallum, Meier, Heusser, & Berger-Bachi, 2011). Es

importante mencionar que en algunos aislamientos con fenotipo hVISA, ha sido descrita

sobre expresión de vraS (McCallum et al., 2011).

Page 29: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 11

1.2.4 Sistema GraSR

El TCS se ha asociado a la Resistencia a glicopéptidos (graSR), controla la resistencia a los

péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMP) en S. aureus; así mismo, se comprobó que

graX, esta implicado en la resisitencia a CAMP y co-transcribe con graRS regulando un co-

factor de regulación de la vía de señalización graSR, formando un sistema de tres

componentes (Falord, Mader, Hiron, Debarbouille, & Msadek, 2011). El dominio sensor

GraS, es más pequeño que los típicos sensores histidina kinasa (Meehl, Herbert, Gotz, &

Cheung, 2007).

Analisis de trasncriptoma de GraSR evidenció que este regulador global controla 248

generes. GraSR tiene un papel intermedio con otros reguladores globales (Agr, MgrA, Rot,

y SarA), puede regular la expresión de adhesinas, exoproteínas, toxinas e inclusive

inclusive se ha planteado que GraSR esté envuelto en el establecimiento de infecciones

persistentes por S. aureus por la regulación de factores de colonización (Herbert et al.,

2007).

El sistema graSR desempeña un papel en la patogénesis de S. aureus y está vinculado con

el péptido AgrCA del sistema de “quórum sensing” controlando la expresión de genes de

virulencia; el TCS GraSR también está implicado con el control de respuesta al estrés y en

vías de transducción de señales para el metabolismo de pared celular, compartiendo un

solapamiento con el regulón WalKR (Falord et al., 2011).

1.2.5 Gen tcaA

El gen tcaA codifica para una proteína transmembranal (predicha) y es uno de los

miembros del core del estimulón del estrés de pared celular en S. aureus. El gen tcaA hace

parte del operón tcaRAB (tcaR-tcaA-tcaB), y este ha sido asociado a teicoplanina, existen

publicaciones que relacionan la deleción completa del operón o que tan sólo la inactivación

de tcaA, puede llevar al incremento de la resistencia a teicoplanina (Brandenberger,

Tschierske, Giachino, Wada, & Berger-Bachi, 2000). La inducción de la expresión de tcaA

es completamente dependiente de VraSR (Chen et al., 2016).

Page 30: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

12 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Un estudio reciente que evaluó mutaciones en varios genes relacionados al fenotipo VSSA

y VISA, evidenció presencia de mutaciones en los genes tcaA y tcaB, entre otros (Yoo et

al., 2013).

1.2.6 Gen atl

El gen atl codifica para una de las principales autolisinas de S. aureus, el producto de este

gen es una proteína bi-funcional que tiene un dominio amidasa y un dominio

glucosaminidasa (Oshida, Takano, Sugai, Suginaka, & Matsushita, 1998); las autolisinas

del PGN (hidrolasas) catalizan la degradación o recambio del PGN en la bacteria

(Takahashi et al., 2002). El gen atl se ha relacionado con participar en división celular,

formación de biofilm, recambio de peptidoglicano y autolisis (Cafiso et al., 2012a; Wootton,

Bennett, MacGowan, & Walsh, 2005). La actividad de atl es controlada por el TCS WalKR

(Haag & Bagnoli, 2016). Se ha descrito una disminución de la expresión de atl en

aislamientos hVISA/VISA comparada con la expresión en VSSA (Wootton et al., 2005).

1.2.7 Gen rpoB

La ARN polimerasa es una enzima clave de la transcripción, que en procariotas está

compuesta de cinco subunidades (α I, α II, β, β´, δ) (Borukhov & Nudler, 2003). El gen rpoB,

codifica para la subunidad β de la ARN polimerasa (RpoB) que en S. aureus es una

proteína de 1.182 aminoácidos (Aboshkiwa, Rowland, & Coleman, 1995).

Mutaciones en el gen rpoB, se han asociado a resistencia a rifampicina, inicialmente en

otras especies bacterianas y también en S. aureus (Aubry-Damon, Soussy, & Courvalin,

1998; O'Neill, Huovinen, Fishwick, & Chopra, 2006); por otro lado, mutaciones en rpoB han

sido descritas por jugar un rol importante en aislamientos con reducida susceptibilidad a

vancomicina de S. aureus (Hafer, Lin, Kornblum, Lowy, & Uhlemann, 2012; Katayama,

Sekine, Hishinuma, Aiba, & Hiramatsu, 2016; Matsuo et al., 2011) y resistencia a

daptomicina (Cui et al., 2010).

Page 31: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 13

1.3 Pared Celular

El principal componente de la pared celular es el peptidoglicano (PGN), esta capa es similar

en todas las bacterias, con algunas diferencias entre Gram positivos y Gram negativos

(Arias, 2000); en Gram positivas es una red compleja, compuesta principalmente de PGN y

ácidos teicoicos (AT), ambos esenciales para el mantenimiento de la integridad y forma de

la célula bacteriana (Atilano et al., 2010).

El ciclo de replicación de S. aureus requiere la síntesis y la remodelación de su capa de

PGN, mientras se mantiene la presión de turgencia, con el fin de conservar su forma cocos

(Haag & Bagnoli, 2016).

El peptidoglicano de S. aureus típicamente tiene un grosor de 20–30 nm, sirve como una

barrera de protección, así como un andamio para la unión de proteínas de superficie y

matriz extracelular, que son necesarias para la morfogénesis, división celular, y patogénesis

(Sharif, Singh, Kim, & Schaefer, 2009).

1.3.1 Síntesis de Pared Celular

El peptidoglicano es un polímero heterogéneo de cadenas de glicano entrecruzado por

péptidos cortos de longitud variable, el PGN está compuesto de subunidades de N-acetil

glucosamina (GlcNac) alternadas por N-acetil murámico (MurNac) (Atilano et al., 2010).

Cada unidad de ácido murámico, inicialmente porta un peptapéptido compuesto por L-

alanina, D-ácido glutámico, L-lisina, D-alanina, D-alanina; la rigidez de la pared celular se

da por el entrecruzamiento que ocurre entre el tercer aminoácido y el penúltimo de la

cadena adyacente, con la pérdida del aminoácido terminal D-alanina (Avison, Bennett,

Howe, & Walsh, 2002).

El proceso de síntesis de pared inicia con la producción del ácido N-acetilmurámico, el cual

se deriva de la N-acetilglucosamina por la adición de un ácido láctico sustituyente derivado

del fosfoenol piruvato. Los primeros 3 aminoácidos de la cadena de pentapéptidos (L Ala, D

Glu- L Lis) son adicionados al ácido murámico secuencialmente (enzimas MurC, MurD y

MurE); las D-alanina, D-alanina terminales, se adiciona como una unidad (DdlA y MurF); en

el citoplasma una racemasa convierte una L-alanina en D-alanina (D-Ala), luego las

Page 32: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

14 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

moléculas de D-ala son unidas por una ligasa, formando un dipéptido D-ala D-ala, el cual es

adicionado al uracil difosfato N-acetil muramil tripéptido, para formar uracil difosfato N-

acetilmuramil pentapéptido (L-Ala-D-Gln,-L-Lys-D-Ala-D-Ala), este se une al undecaprenol,

lípido I del transportador de la membrana de peptidoglicano (reacción catalizada por la

enzima MraY), entonces la molécula de N-acetil glucosamina es adicionada, (enzima MurG)

como se muestra en la figura 1-2. (Arias, 2000; Avison et al., 2002; Courvalin, 2006;

Hiramatsu, 2001; Rodriguez & Vesga, 2005).

Figura 1-2 Síntesis de monómero de mureina y ensamblaje del peptidoglicano.

NAG: N-Acetilglucosamina; NAM: N-Acetilmuramico. Circulos grises corresponden a la cadena de pentapetido conformada por L-alanina, D-ácido glutámico, L-lisina, D-alanina, D-alanina. Circulos azules: corresponden a la cadena de penta-glicinas.

La unidad completa es transferida a través de la membrana celular, traslocando el

precursor a la superficie externa de la membrana citoplasmática, el N-acetilmuramil

pentapéptido se incorpora al PGN naciente, por transglicosilación (Hiramatsu, 2001);

posteriormente la transpeptidasa conocida como proteína de unión a la penicilina (PBP de

su nombre en inglés), une la cadena de PGN recién formada, a las cadenas existentes de

PGN; para este paso las PBPs reconocen el extremo D-ala D-ala del monómero de mureina

y cortan entre estos dos péptidos, y ligan la penúltima D-ala con la cadena de penta-glicinas

de la capa de PGN preexistente, cuando se realiza el entrecruzamiento, la D-ala terminal

Page 33: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 15

del monómero de mureina se elimina del PGN terminado. Cerca de un 20% de los residuos

de D-Ala D-Ala no son entrecruzados (Courvalin, 2006; Hiramatsu, 2001).

1.4 Glicopéptidos: generalidades y mecanismo de acción

Los antibióticos glicopéptidos son esenciales para el control de infecciones causadas por

bacterias patógenas Gram positivas (Yim, Thaker, Koteva, & Wright, 2014), su modo de

acción es mediante la inhibición de la síntesis de peptidoglicano en la pared celular del

microorganismo.

Los glicopéptidos tienen efecto bactericida, se unen con alta afinidad a los extremos D-Ala-

D-Ala del PGN y su precursor el Lípido II; esta unión secuestra el sustrato para dos

enzimas indispensables para la síntesis de la pared celular, generando una inhibición física

en las transglicosilasas que transfieren las subunidades de pentapéptidos GlcNac MurNac

de Lípido II anclado a la pared celular, evitando el crecimiento de la cadena de PGN y las

D, D- transpeptidasas que entrecruzan el peptidoglicano (Yim et al., 2014).

La vancomicina y la teicoplanina, representan la primera generación de este grupo de

antibióticos; la teicoplanina es producida por el Actinoplanes teichomyceticus, fue reportada

por primera vez en 1967 y se introdujo para uso clínico en Europa y Japón en 1988 y 1998

respectivamente (Binda, Marinelli, & Marcone, 2014; Yim et al., 2014).

1.4.1 Vancomicina: generalidades y estructura química

En 1952, de una muestra de Streptomyces orientalis, se derivó el componente 05865,

conocido ahora como vancomicina (de la raíz 'vencer”); este fármaco fue utilizado contra

diferentes microorganismos incluidos estafilococos resistentes a penicilina y algunos

anaerobios incluido Clostridium spp., que resultaron susceptibles a este (Levine, 2006). En

1958 su uso fue aprobado por la Administración Federal de Alimentos y Drogas de Estados

Unidos (FDA) (Castellano & Perozo-Mena, 2010).

Page 34: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

16 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Figura 1-3 Estructura química de la vancomicina

Wikimedia Commons contributors, 2015. Dominio público. Imagen tomada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vancomycin.svg

La estructura central de la vancomicina es un heptapéptido, que contiene cuatro

aminoácidos C-terminales (3,5-dihidroxifenilglicina, β-hidroxitirosina, ρ-hidroxifenilglicina, y

ρ-hidroxifenilglicina), y se diferencia de la teicoplanina, en los tres aminoácidos N

terminales, que para la vancomicina son: asparagina-β-hidroxitirosina-leucina (figura 1-3)

(Pootoolal, Neu, & Wright, 2002).

La absorción oral de la vancomicina es escasa, razón por la cual es administrada por vía

intravenosa (Rybak, 2006). El problema más común asociado con el uso de vancomicina es

la flebitis en el sitio de infusión; también la fiebre y erupción maculopapular, que ocurren en

aproximadamente 1% a 3% de los pacientes tratados. Se ha reportado también

ototoxicidad, aunque es poco común (Faber, 1984).

Así mismo, la administración de vancomicina se ha relacionado con reacciones de

hipersensibilidad incluyendo anafilaxia y el “síndrome del hombre rojo”, caracterizado por

eritema, prurito e hipotensión, cuya incidencia varía entre 3,7% y 47%, aunque las

Page 35: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 17

reacciones más severas se presentan en pacientes menores de 40 años (Kollef, 2007;

Rybak, 2006).

Se pensaba que la nefrotoxicidad de la vancomicina se debía en gran medida a impurezas,

pero incluso vancomicina purificada puede ser nefrotóxica especialmente a dosis altas

(Jones, Vasileff, & Hewton, 2012; Kollef, 2007).

1.5 Resistencia a los glicopéptidos en S. aureus

Para la descripción y mención de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina

se han utilizado diferentes términos, especialmente en los primeros años de su aparición, lo

que pudo haber resultado confuso en algunas oportunidades, por la heterogeneidad de

términos utilizados para referirse a estos aislamientos; sin embargo, desde hace algunos

años esta terminología ha sido un poco más homogénea.

Para indicar un aislamiento de S. aureus, con resistencia intermedia a glicopéptidos (GISA)

y con resistencia intermedia a la vancomicina (VISA) se han utilizado en la literatura las

siglas GISA y VISA, dependiendo del país en que se referencia el aislamiento.

Cabe aclarar, que la susceptibilidad reducida teicoplanina puede estar presente en S.

aureus sin reducción de la susceptibilidad a la vancomicina, mientras que por el contrario

las cepas VISA han demostrado reducida susceptibilidad a la teicoplanina (Hiramatsu et al.,

2001; Howden et al., 2010; Howden, Peleg, & Stinear, 2014).

Se han descrito 2 formas de resistencia a glicopéptidos, que se diferencian por el resultado

de las MIC y por el mecanismo de resistencia a vancomicina: la primera forma la

constituyen los S. aureus con altos niveles de resistencia a vancomicina, usualmente

presentan MIC 16 g/mL (VRSA); la segunda es la denominada S. aureus con bajos

niveles de resistencia a vancomicina, en donde se agrupan S. aureus con dos fenotipos:

aquellos con resistencia intermedia (VISA) que usualmente presentan resultados de MIC

entre 4-8 g/mL o con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina (hVISA) que

puede tener resultados ≤2 g/mL, pero contener subpoblaciones con fenotipo VISA (figura

1-4) (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2012).

Page 36: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

18 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Figura 1-4 Tipo de resistencia a vancomicina y resultados de MIC en S. aureus (CLSI: Clinical and laboratory Standars Institute, 2012)

1.5.1 Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (SARV o VRSA)

En 2002 en Michigan Estados Unidos, se realizó el primer reporte de un aislamiento VRSA,

que provenía de un paciente diabético con una úlcera crónica tratada con múltiples

antibióticos, incluido vancomicina; de la úlcera infectada se obtuvieron aislamientos de

VRSA, Enterococcus faecalis resistente a vancomicina y Klebsiella oxytoca; el VRSA

presentó MIC para vancomicina >128 µg/mL, y contenía el gen de resistencia a

vancomicina vanA del enterococo y el gen mecA (Centers for Disease Control & Prevention,

2002a). Posteriormente, en Pensilvania se reportó una segunda cepa VRSA (MIC 32

µg/mL) en un paciente de 70 años, que presentaba una úlcera crónica en el tobillo, de la

cual se había aislado previamente MRSA y ERV (Centers for Disease Control & Prevention,

2002b). El tercer caso de una cepa VRSA se reportó en 2004 en un paciente hospitalizado

en Nueva York (MIC > 256 μg/mL) (Centers for Disease Control & Prevention, 2004).

Page 37: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 19

Hasta mayo de 2015 en Estados Unidos, se habían reportado en total 13 infecciones con

VRSA, ocho de los diez VRSA documentados entre 2002-2009, se produjeron en pacientes

de Michigan y las infecciones con VRSA reportadas a partir de 2010, se produjeron

Delaware (Finks et al., 2009; Sievert et al., 2008; Walters et al., 2015).

En 2013, se reportó el primer caso de VRSA en un paciente de Lisboa Portugal, el

aislamiento presentaba una MIC para vancomicina de 1024 μg/mL y también portaba el gen

vanA (Friaes et al., 2015).

El primer VRSA en América Latina fue reportado por el laboratorio de microbiología del

“Hospital de Clínicas, Universidad de São Paulo Brasil”, este aislamiento correspodió a un

MRSA aislado en un hemocultivo, obtenido de un paciente de 35 años (Panesso et al.,

2015; Rossi et al., 2014).

Se han descrito aproximadamente 35 cepas de VRSA incluyendo cinco en Pakistán, tres en

Irán, 14 en Estados Unidos, 11 en India, una en Portugal y una en Brasil; aunque no todas

los reportes indican haber realizado PCR para confirmar la presencia del gen vanA; sin

embargo, a la fecha no se ha detectado transmisión de VRSA, más allá de los pacientes

relacionados en los casos mencionados (Aligholi et al., 2008; Azimian et al., 2012; Friaes et

al., 2015; Liaqat et al., 2015; Limbago et al., 2014; Panesso et al., 2015; Rossi et al., 2014;

Saha, Singh, Ghosh, & Bal, 2008; Sambandam, Rohinikumar, Gul, & Mounasamy, 2016;

Thati, Shivannavar, & Gaddad, 2011; Tiwari & Sen, 2006; Walters et al., 2015).

Según describe la literatura, las cepas VRSA adquieren resistencia a vancomicina como

resultado de la adquisición del Tn1546 (que le transfierere vanA) de enterococos, durante el

curso de la infección; llama la atención, que la mayor parte de los Tn1546 fueron adquiridos

de Enterococcus faecalis, (dado que es más frecuente en Enterococcus faecium resistente

a vancomicina); los VRSA de EEUU se agrupan dentro del linaje genético de cepas

hospitalarias conocido como complejo clonal 5 (CC5); por el contrario, el aislamiento

MRSA-VRSA reportado en Brasil se clasificó dentro del linaje de cepas comunitarias clon

USA300-ST8 del complejo clonal 8 (CC8) (Kos et al., 2012; Rincón et al., 2014; Rossi et al.,

2014).

Page 38: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

20 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

1.5.2 S. aureus con bajos niveles de resistencia a vancomicina (VISA o hVISA)

S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (VISA)

El primer aislamiento VISA fue reportado en 1997 en Japón, en un paciente de 4 meses de

edad, tras desarrollar una infección quirúrgica con un MRSA y recibir tratamiento con

vancomicina por 29 días, la MIC fue de 8 µg/mL, y este aislamiento se denominó Mu50

(Hiramatsu et al., 1997a).

Desde el primer reporte de VISA, se han documentado este tipo de aislamientos en

diferentes países como: Australia, Bélgica, Corea, China, España, Estados Unidos, Francia,

India, Japón, Polonia, Suiza, Tailandia, Taiwán, entre otros (Canton et al., 1999; Chen, Liu,

Sun, Chen, & Wang, 2011; Denis et al., 2002; Gowrishankar, Thenmozhi, Balaji, & Pandian,

2013; Hanaki et al., 2007; Kim, Hwang, Pyo, Mun, & Pai, 2002; Lulitanond et al., 2009;

Mlynarczyk, Mlynarczyk, & Luczak, 2003; Robert, Bismuth, & Jarlier, 2006; Rybak et al.,

2008; Tenover, Biddle, & Lancaster, 2001; Van Hal & Paterson, 2011; Vaudaux et al., 2012;

Wang, Lee, Chiueh, & Lu, 2009; Zhang, Sun, Chang, Dai, & Ma, 2015).

S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la

vancomicina (hVISA)

S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina (hVISA), es un fenotipo

que en pruebas de susceptibilidad a vancomicina realizadas in vitro se comporta como

susceptible; sin embargo, tiene poblaciones minoritarias de S. aureus con resistencia

intermedia a vancomicina (VISA), y dicha población resistente está presente en una

frecuencia de ≤105 a 106 (Chaudhari et al., 2015).

Este fenotipo fue descrito por primera vez en Japón, en un paciente de sexo masculino, de

64 años, que presentaba neumonía por MRSA y quien después de una cirugía por cáncer

de pulmón, fue tratado con vancomicina por 12 días; luego de ello, de una muestra de

esputo del paciente, se aisló un S. aureus con una MIC de 3 µg/mL para vancomicina, que

además contenía subpoblaciones capaces de crecer entre concentraciones de 5-9 µg/mL

de vancomicina, dicho aislamiento se denominó Mu3 (Hiramatsu et al., 1997b).

Page 39: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 21

Desde entonces aislamientos de fenotipo hVISA han sido descritos en varios países, entre

ellos Argentina, Australia, Canadá, Chile, China, Corea, Estados Unidos, Francia, Hungría,

India, Irlanda, Israel, Italia, Japón, Malasia, México, Reino Unido, Singapur, Taiwán (Adam

et al., 2010; Campanile et al., 2010; Casapao et al., 2013; Chaudhari et al., 2015; Delgado

et al., 2007; Di Gregorio et al., 2015; Fitzgibbon, Rossney, & O'Connell, 2007; Fong et al.,

2009; Garnier et al., 2006; Gosbell et al., 2003; Hu et al., 2013; Kirby et al., 2010; Maor et

al., 2014; Murray et al., 2004; Ramli, Neoh, Aziz, & Hussin, 2012; Richter et al., 2011; Sader

et al., 2009a; Song et al., 2004; Sun et al., 2009; Toth et al., 2008; Vega et al., 2015; Wang

et al., 2009; Wootton et al., 2001).

1.6 Mecanismos de resistencia a vancomicina en S. aureus

1.6.1 Mecanismo de resistencia con altos niveles resistencia a

vancomicina en S. aureus (VRSA)

La resistencia de tipo vanA, se caracteriza por altos niveles de resistencia a vancomicina y

teicoplanina, está mediada por el transposón Tn1546 y elementos estrechamente

relacionados con este. El transposón codifica una deshidrogenasa (VanH), que reduce el

piruvato a D-Lac, y la ligasa VanA, que cataliza la formación de un enlace éster entre D-Ala

y D-Lac. El dipéptido d-Ala-D-Lac resultante reemplaza el dipéptido D-Ala-D-Ala en la

síntesis del peptidoglicano, cuya sustitución disminuye la afinidad de la molécula de

glicopéptidos (Courvalin, 2006).

El operón vanA está compuesto por siete genes, vanRSHAXYZ, cuya expresión es

inducible por los glicopéptidos, vancomicina y teicoplanina. Tres de estos genes (vanHAX)

son necesarios para la producción de la D-Ala-D-Lac de los precursores del peptidoglicano,

que genera la resistencia a glicopéptidos; VanS es un sensor asociado a la membrana que

controla el nivel de fosforilación de VanR. VanR es un activador de la transcripción del

operón codificando VanH, VanA y VanX. VanH es una deshidrogenasa (reduce el piruvato a

D-Lac), y VanA es una ligasa que cataliza la formación de un enlace éster entre D-Ala y D-

Lac, este cambio genera que la vancomicina no se una a D-Ala-D-Lac. VanX es una

Page 40: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

22 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

dipeptidasa que hidroliza el componente normal de peptidoglicano D-Ala-D-Ala, lo que

impide que sea sensible a vancomicina. VanY es una D, D-carboxipeptidasa que hidroliza el

residuo terminal D-Ala de los precursores del peptidoglicano, que se producen si la

eliminación de D-Ala-D-Ala por VanX no se produce por completo. Por lo tanto, D-Ala-D-Lac

reemplaza el dipéptido normal D-Ala-D-Ala en la síntesis de peptidoglicano, que lleva a

resistencia a la vancomicina, como se observa en la figura 1-5. VanZ confiere resistencia a

la teicoplanina por un mecanismo desconocido (Hughes, 2003; Qureshi, Yin, & Boyle-

Vavra, 2014).

Figura 1-5 VanA que confiere resistencia a vancomicina

Sistema regulador dos componentes VanR-VanS, que regulan la resistencia a vancomicina en ERV y VRSA

1.6.2 Mecanismo de bajos niveles resistencia a vancomicina en S.

aureus (VISA y hVISA)

Se ha descrito que hVISA puede producir espontáneamente, dentro de su población celular

células VISA con una frecuencia de 106 o mayor (Matsuo, Cui, Kim, & Hiramatsu, 2013).

Aunque el mecanismo que genera bajos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus,

(VISA o hVISA), no ha sido comprendido completamente, se han planteado hipótesis de

varios cambios genéticos o bioquímicos responsables de la susceptibilidad disminuida a

vancomicina (Saito et al., 2014).

Page 41: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 23

A pesar de no comprender los determinantes moleculares de hVISA y VISA, recientemente

se han hecho avances significativos en este campo, debido a la disponibilidad actual de

tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento, que permiten la comparación de

los genomas de pares de cepas de S. aureus isogénicas o series de hVISA obtenidas in

vivo, o inducidas in vitro (Howden, et al., 2014); algunos de estos estudios han encontrado

que la conversión de hVISA a VISA puede ocurrir por una mutación o mutaciones

combinadas en varios genes individuales (Saito et al., 2014).

Una de las primeras hipótesis para explicar el aumento de niveles de resistencia a

vancomicina en estos aislamientos, fue el incremento de residuos D-Ala-D-Ala generados,

debido a la disminución del entrecruzamiento del peptidoglicano, lo que produce que estos

residuos atrapen más eficientemente el antibiótico (Hiramatsu, 2001).

Otro estudio evidenció una difusión anómala de VAN a través de la pared celular de VISA,

generada por la obstrucción de la pared con el antibiótico; así mismo, que el engrosamiento

de la pared celular protege la biosíntesis del PGN en curso (en la membrana

citoplasmática), de la inhibición por VAN, permitiendo que se siga produciendo PGN en la

pared celular naciente, llevando la obstrucción y el engrosamiento la pared celular, que en

conjunto, evitan que la VAN alcance la membrana citoplasmática en el fenotipo VISA (Cui et

al., 2006; Cui et al., 2003).

Otros estudios han asociado mutaciones en el TCS graSR al fenotipo hVISA/VISA; por

ejemplo, una sustitución de seis nucleótidos, que afecta el sensor HK graS, generando la

sustitución T136I (Howden et al., 2008); por otro lado, Neoh et al. (2008) secuenciaron y

compararon el genoma de Mu3, Mu50 y N315 (VSSA), encontrando una mutación en el

regulador de respuesta del TCS graSR en VISA, además encontraron 16 SNP (Neoh et al.,

2008). En ese mismo sentido, en ensayos con microarreglos encontraron que una sola

mutación en vraS o graR, altera la expresión de más de 100 genes, lo que llevó a una

perturbación de la homeostasis en células de Mu3 y Mu50, favoreciendo la generación del

fenotipo VISA (Neoh et al., 2008).

También se ha descrito que una expresión alterada del TCS agr, puede conducir al fenotipo

VISA, un estudio realizado por Moise-Broder mostró mayor porcentaje de polimorfismos del

grupo II en el locus agr, asociados a falla terapéutica en el tratamiento con vancomicina y

con aislamientos VISA (Moise-Broder et al., 2004); en otros aislamientos, se ha vinculado la

Page 42: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

24 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

pérdida de función del agr, con la disminución en la eficacia del tratamiento con VAN

(Sakoulas, Moellering, & Eliopoulos, 2006; Tsuji, Rybak, Lau, & Sakoulas, 2007).

Otro de los TCS que han sido asociados al fenotipo hVISA/VISA es walKR (Hafer et al.,

2012; Howden et al., 2011; Howden, et al., 2014; McEvoy et al., 2013; Shoji et al., 2011);

Howden et al. (2014) han descrito que “probablemente no todas las SNPs produzcan

impacto funcional, pero la secuencia de ADN de walKR, es altamente conservada, lo que

puede apoyar el impacto funcional de estos cambios” (Howden, et al., 2014). En algunas de

sus publicaciones tambien muestran gráficamente la presencia de algunas sustituciones de

residuos de aminoácidos en WalKR, asociadas al fenotipo VISA, cinco en WalR (K208R,

A96T, V113A, entre ellas) y 26 en WalK entre ellas G223D, ΔQ371, L14F (Howden et al.,

2011; Howden et al., 2014).

Un estudio realizado por Matsuo et al. (2013), en 45 cepas VISA derivadas de Mu3,

expuestas a vancomicina, encontraron que las 45 cepas portaban entre 1 y 4 mutaciones

probables (que afectaban la expresión de 48 genes) y 32 cepas presentaban una mutación

(en un único gen); los genes afectados más frecuentemente fueron el cmK, (citidilato

kinasa), seguido por rpoB; en este estudio, se encontró que la alteración funcional de genes

en múltiples vías metabólicas, además de los que tienen función reguladora (rpoB, rpoC,

rpoA, rpoD, etc.) puede llevar la conversión fenotípica de hVISA a VISA (Matsuo et al.,

2013).

Otros estudios realizados han evidenciado diferentes genes involucrados; se postuló que la

inactivación del gen tcaA, juega un rol relevante en la resistencia a glicopéptidos (Maki,

McCallum, Bischoff, Wada, & Berger-Bachi, 2004).

En este mismo sentido, se ha descrito asociación entre mutaciones específicas en S.

aureus y el aumento gradual en la MIC para vancomicina, un estudio colectó

secuencialmente aislamientos provenientes de un paciente expuesto a varios días de

tratamiento con VAN, hallando 35 puntos de mutación en estos aislamientos VISA, además

la disminución de 100 veces su sensibilidad a daptomicina, a pesar de no haber sido

tratado con este último antibiótico (Mwangi et al., 2007).

Page 43: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 25

Estudios sobre los mecanismos genéticos de resistencia intermedia a vancomicina en S.

aureus sugieren que esta se adquiere a través de múltiples pasos de mutaciones de genes

involucrados en la regulación de la fisiología celular (Katayama et al., 2016).

Fenotípicamente las cepas hVISA/VISA exhiben características metabólicas distintas, entre

ellas: “(i) aumento del uso de fructosa, (ii) metabolismo incrementado de ácidos grasos, (iii)

alteración del metabolismo de etilo y ciclo del ácido tricarboxílico, (iv) disminución de la

disponibilidad de glutamato, y (iv) aumento de la expresión de genes de la síntesis de la

pared celular”; estos cambios homeostáticos globales parecen conducir a una reducción de

la actividad autolítica, engrosamiento de la pared celular, aumento de la cantidad de

dipéptidos D-Ala-D-Ala libres y disminución en el entrecruzamiento del PGN (Gardete &

Tomasz, 2014; Howden et al., 2010; Munita & Arias, 2016)

A pesar de las mutaciones asociadas al fenotipo VISA y hVISA, este ha sido descrito como

un fenotipo inestable (Hiramatsu, 2001). Howden, Peleg y Stinear (2014) relacionan que

“algunos estudios han descrito la reversión de las cepas de fenotipo VISA a VSSA después

de largos periodos de almacenamiento de las mismas, durante los cuales no hubo sobre

estas exposición a presión dada por el antibiótico, o luego de pasajes (Howden et al., 2014)

(figura 1-6).

Figura 1-6 Generación y pérdida del fenotipo hVISA/VISA/VSSA

Los mecanismo que llevan al fenotipo hVISA/VISA no se han entendido completamente,

aun ahora; sin embargo, la evidencia científica si ha permitido observar que la evolución al

Page 44: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

26 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

fenotipo VISA puede producirse por varias mutaciones únicas, que se van acumulando con

el tiempo y que llevan a adquirir resistencia (Di Gregorio et al., 2017; Howden, et al., 2014;

Mwangi et al., 2007; Shoji et al., 2011), mientras que en otros casos, una única mutación es

suficiente para producir resistencia (Cameron et al., 2012; Howden et al., 2011; Howden et

al., 2014).

1.7 Epidemiología de VISA y hVISA

Los estafilococos, en general tienen una gran capacidad para adaptarse rápidamente a la

presión de selección dada por los antibióticos, con el consiguiente desarrollo de cepas

resistentes (Appelbaum, 2007). Las infecciones producidas por S. aureus, esencialmente

las producidas por MRSA han sido tratadas durante más de medio siglo, principalmente con

glicopéptidos como vancomicina (Hu et al., 2013); sin embargo, debido al dramático

aumento las infecciones por MRSA y el uso generalizado de vancomicina, surgieron cepas

de MRSA con susceptibilidad disminuida a vancomicina (Pitz et al., 2011).

El fenotipo VISA/VISA por lo general se presenta in vivo en pacientes con infecciones

invasivas por estafilococos, que recibieron tratamiento prolongado con vancomicina (Munita

et al., 2015),

La falta de criterios estandarizados para denominar estos aislamientos y el uso de

diferentes metodologías para detectar los hVISA/VISA, dificultan considerablemente la

revisión de la literatura, con el fin de establecer prevalencias que sean comparables, sobre

todo para los primeros años en que fueron reportados; sin embargo, las tasas de

hVISA/VISA varían a nivel mundial (Howden et al., 2010).

Aunque la prevalencia de hVISA/VISA ha aumentado en los últimos años, se cree que ha

sido seriamente subestimada (Zhang et al., 2015), a pesar de que se han presentado casos

en países de todos los continentes; en general la prevalencia de hVISA es superior,

comparada con la de VISA.

Page 45: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 27

En Estados Unidos, se han desarrollado varios trabajos para establecer presencia de

aislamientos con reducida sensibilidad a VAN; uno de ellos realizado entre 1999 y 2000,

encontró 4 infecciones causadas por VISA y 15 por hVISA (denominados en ese momento

non-VISA SA-RVS) en una muestra de 100 S. aureus (Fridkin et al., 2003). Otro estudio

desarrollado en Nebraska, entre 2000 y 2008, encontró una incidencia de 1,2% de hVISA,

confirmados por PAP-AUC (Pitz et al., 2011). Mientras que otra investigación realizada en

2009 (en 43 centros médicos de ese país), encontró una prevalencia de 0,3% de hVISA

(Richter et al., 2011).

En China entre 2007 y 2011, en 757 aislamientos de S. aureus, se encontró 10% de hVISA

y 0,5% de VISA, en este estudio también se observó un incremento en la incidencia año por

año, pasando de 1,2% en 2007 a 7,2% en 2010, 80% de estos aislamientos presentaban

agr II (Hu et al., 2013).

Un estudio realizado en Taipéi (Taiwán), en 1500 MRSA, halló 43 (2,8%) aislamientos

VISA, todos eran SCCmec III, agr I, PVL negativos y la tipificación molecular por PFGE

reveló que todos los aislamientos pertenecían al pulso tipo A, (con similaridad ≥80%), lo que

indicaba diseminación clonal de los aislamientos de VISA en este caso, lo cual es llamativo,

dado que rara vez se ha informado de diseminación clonal de hVISA/VISA en hospitales

(Hsueh, Lee, Perng, Chang, & Lu, 2010).

Por otro lado, una vigilancia más reciente, realizada entre 2012 y 2013, también en Taiwán,

en 622 asilamientos MRSA que presentaban MIC para vancomicina de 1µg/mL o mayores,

halló una prevalencia de 10% y 2,7% de hVISA y VISA respectivamente; este dato llama la

atención debido al incremento de la prevalencia de cepas con reducida susceptibilidad a

glicopéptidos, cuando se compara con los resultados de un estudio publicado en 2003

(0,7% de hVISA y 0,2% de VISA) (Huang et al., 2015).

Con respecto a estudios realizados en Europa, en Liverpool (Reino Unido), se desarrolló un

estudio entre 2004 y 2006, en un total de 2.550 MRSA, en el que se encontró que 3,4% de

los pacientes colonizados y 2,5% de pacientes con bacteriemia por MRSA presentaban

aislamientos hGISA (Kirby et al., 2010); en Italia se publicó un estudio basado en 128 S.

aureus, de pacientes con endocarditis infecciosa, encontrando 19,5% de hVISA, con una

frecuencia similar en MRSA y SASM (Campanile et al., 2012); otro estudio realizado en

Page 46: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

28 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Irlanda, con 3.189 aislamientos MRSA, colectados entre 1999 y 2004, halló 5,6% de

aislamientos hGISA (hVISA) (Fitzgibbon et al., 2007).

Con respecto a datos de América Latina, se han presentado reportes de aislamientos

hVISA en tres países: el primero fue en México, un aislamiento proveniente de una muestra

de esputo, (Delgado et al., 2007); otro caso se reportó en Chile, el aislamiento presentó una

“secuencia tipo (ST) ST267, ST no descrita previamente, que pertenece al complejo clonal

CC5” (Vega et al., 2015). En Argentina se han reportado cuatro aislamientos hVISA,

primero se reportó el caso de un MRSA-AC hVISA en un paciente con una endocarditis

infecciosa, en 2011 (Sola et al., 2011) y posteriormente en 2015 se reportaron 3 (3,3%)

aislamientos hVISA provenientes de pacientes con bacteriemias, al análisis molecular el

primero (ST5, SCCmec I, agr II, luk-PV negativo) fue caracterizado como spa t149-pulsotipo

D, un subtipo del clon cordobés, el segundo (ST100-SCCmec IV, -agr II, luk-PV negativo)

fue spa t002-pulsotipo B, relacionado con el clon pediátrico argentino y el tercero fue un

SASM spa t267 y pertenecía a una secuencia tipo predominante en bovinos con mastitis y

descrita en Argentina por causar osteomielitis (Di Gregorio et al., 2015).

Se han realizado algunas revisiones sistemáticas de prevalencia de VISA y hVISA, una de

ellas realizada por Van Hal y Paterson (2011), con información obtenida de la base de

datos Medline, entre 2006 y 2010, encontró una prevalencia 1,3% de hVISA, en un total de

82.698 MRSA. La segunda revisión fue desarrollada por Zhang et al. (2015), con 91

artículos incluidos (39 de Asia, 28 de Europa, 21 de América y 3 de Australia), en la cual se

halló una prevalencia de 6,05% de hVISA y 3,01% de VISA (con un total de 99.042 y

68.792 MRSA para hVISA y VISA respectivamente), en este estudio se observa igualmente

el incremento en la prevalencia de hVISA que era de 4,68% antes de 2006, 5,38% entre

2006 y 2009 y 7,01 entre 2010 y 2014, con resultados similares en VISA que fueron de

2,05%, 2,63% y 7,93% para los mismos periodos (Zhang et al., 2015).

En algunos de los primeros estudios de VISA/hVISA, se utilizaba electroforesis en campo

pulsado (del inglés Pulsed field gel electrophoresis PFGE) y tipificación de secuencias

multilocus (del inglés Multilocus sequence typing, MLST), para evaluar relación clonal entre

los asilamientos y se demostró que las cepas VISA no eran clonales (Fridkin et al., 2003);

sin embargo existe un reporte de un estudio realizado en Taiwán que indica relación clonal

entre los aislamientos VISA encontrados en su hospital (Hsueh et al., 2010).

Page 47: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 29

La mayoría de hVISA y VISA se presentan en cepas relacionadas al ambiente hospitalario,

en lugar de asociadas a la comunidad (Howden et al., 2014), sin embargo, existen algunos

estudios que relacionan presencia de aislamientos VISA/hVISA vinculados con la

comunidad: uno fue reportado en San Francisco (EEUU), causado por un MRSA USA 300

asociado a la comunidad (Graber et al., 2007); otro aislamiento reportado en Corea como

un MRSA con SCCmec IV y ST72, que es el genotipo comunitario frecuente de Corea

(Chung et al., 2012); y un tercer caso reportado en Argentina, de un MRSA, SCCmec IV,

PVL negativo, ST5, patrón de PFGE subtipo I2, con relación con el clon MRSA-AC

(pulsotipo I) epidémico en dicho país (Sola et al., 2011).

1.8 Métodos para la detección de aislamientos con

sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/ VISA)

Se han utilizado varios procedimientos de tamizaje en aislamientos clínicos, para detección

de cepas de S. aureus con reducida sensibilidad a VAN (VISA y hVISA), pero el método

óptimo para realizar su detección no se ha definido claramente (Khatib et al., 2015).

Se reconoce al fenotipo hVISA, por ser aislamientos de S. aureus que presentan resultados

de pruebas de susceptibilidad para VAN en un rango sensible, pero que a su vez poseen

una subpoblación celular con resistencia intermedia a VAN (VISA), que se presenta con

una frecuencia de 105 o 106 (Chaudhari et al., 2015), lo que dificulta considerablemente su

detección con las pruebas de susceptibilidad a antibióticos utilizadas convencionalmente.

En la práctica clínica se utilizan metodologías de análisis microbiológico automatizado o en

algunos casos se realizan análisis manuales, pero estas técnicas no tienen suficiente

sensibilidad para detectar cepas VISA o hVISA (debido a que las plataformas de pruebas

de susceptibilidad comerciales, utilizan inóculos más bajos que los requeridos para su

detección), lo cual puede tener implicaciones en la eficiencia del tratamiento con

vancomicina (Tenover & Moellering, 2007). Adicionalmente, al aplicar pruebas de

susceptibilidad estándar a los aislamientos hVISA, presentan MIC dentro del rango

establecido como sensible.

Sumado a esto, desde hace varios años se empezó a utilizar un término “arrastre de la

MIC” (del inglés MIC creep), que algunos autores definen como “el aumento gradual en la

Page 48: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

30 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

tendencia central de la MIC de vancomicina, para la población dominante de tipo salvaje

(del inglés wild-type), causada por el uso prolongado de la vancomicina” (Sader et al.,

2009b), es decir estos aislamientos presentan aumento en la MIC, fenómeno que se ha

observado desde hace varios años.

Como resultado de la “MIC creep”, y debido a reportes de fallas en el tratamiento con

vancomicina en pacientes con infecciones con S. aureus que presentaban MIC ≥4 µg/mL,

en 2006 CLSI redujo los puntos de corte (Diaz et al., 2017) y modificó los criterios de

interpretación para pruebas de resistencia a vancomicina en S. aureus, los VSSA se

categorizan con una MIC ≤2 µg/mL, los VISA entre 4 µg/mL y 8 µg/mL y los VRSA ≥16

µg/mL (tabla 1-1); pero los métodos de tamizaje del CLSI (MIC por dilución en caldo o

difusión en agar), tampoco son útiles para la detección del fenotipo hVISA, debido a la

concentración de inóculo que se utiliza (5x105 o 5x104 UFC, respectivamente) (Chaudhari et

al., 2015; Tenover & Moellering, 2007).

Tabla 1-1 Variaciones en los criterios para definición del nivel de sensibilidad a vancomicina

de S. aureus, CLSI, 2012.

Fenotipo de

sensibilidad a VAN en

S. aureus

CLSI antes de 2006

(µg/mL)

CLSI después de 2006

(µg/mL)

VSSA ≤ 4 ≤ 2

VISA 8-32 4 – 8

VRSA ≥ 32 ≥16

CLSI: Clinical and laboratory standard Institute de EEUU; VAN: vancomicina

Sin embargo, de acuerdo a los criterios de interpretación establecidos por el Comité

Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana -EUCAST (2017) (del inglés

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) solo se tienen dos criterios de

interpretación para la MIC: sensible cuando el punto de corte de la MIC es ≤2 mg/L y

resistente cuando presenta una MIC >2 mg/L, de acuerdo a las tablas de punto de corte de

2017, no se maneja la interpretación de la MIC de resistencia intermedia a vancomicina.

Dada la dificultad que se presenta para la detección de aislamientos con reducida

susceptibilidad a vancomicina, con el paso del tiempo se han descrito algunas técnicas de

Page 49: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 1 31

laboratorio para el evaluar la sensibilidad de aislamientos VISA/hVISA a VAN, algunas

pruebas se realizan en platos de agar infusión cerebro corazón (BHIA: brain hearth infusion,

por su sigla en inglés) o agar Müeller Hinton (MHA), con adición de diferentes

concentraciones de antibiótico: 4 µg/mL (BHIA4V) y 6 µg/mL (BHIA6V) de VAN o con 5

µg/mL de TEI (MHA5T), incubados por períodos de 24 y 48 horas; sin embargo, los

resultados obtenidos no fueron tan sensibles, ni específicos y mostraron variaciones de

acuerdo a los diferentes estudios publicados (Fitzgibbon et al., 2007; Hubert et al., 1999;

Wootton, MacGowan, Walsh, & Howe, 2007). De manera semejante, se ha descrito

recientemente, un tamizaje con BHIA suplementado con 3 µg/mL de VAN (BHIAV3), que

reporta una sensibilidad de 100% y especificidad de 65% (Burnham, Weber, & Dunne,

2010); hay que mencionar además que recientemente se planteó un nuevo tamizaje por

duplicado, en BHIA suplementado con 3 µg/mL y 4 µg/mL de VAN para detectar VISA y

hVISA, respectivamente, el crecimiento por duplicado de 2 UFC se consideró como positivo,

los autores plantean resultados de sensibilidad y especificidad superiores a 98% y 93%

respectivamente; sin embargo no existen publicaciones adicionales que relacionen la

utilización de este nuevo método y no se ha difundido su uso (Khatib et al., 2015).

Otra metodología de tamizaje utilizada es el E test, que incluye un gradiente del antibiótico

en diferentes concentraciones, en una tirilla; estos se prueban con un inóculo bacteriano de

concentración específica sobre un medio enriquecido, y se incuban entre 24 y 48 horas;

otros métodos funcionan de forma similar, como el E test macrométodo que utiliza tirillas de

VAN y TEI ubicadas en direcciones opuestas (200µL de inóculo bacteriano a una

concentración 2,0 McFarland) o el GRD (sigla del inglés glycopeptide resistance detection),

que utiliza doble tirilla para evaluar tanto VAN como TEI al mismo tiempo. Estos tres

métodos se han probado obteniendo una mejor sensibilidad y especificidad, comparada con

los métodos de medio enriquecidos con antibiótico, sin embargo, tampoco pueden aplicarse

en la práctica clínica debido a los altos costos (Fitzgibbon et al., 2007; Leonard, Rossi,

Newton, & Rybak, 2009; Riederer et al., 2011; Yusof et al., 2008).

El método más exacto y reproducible para la detección de estos fenotipos, es el perfil de

análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC), que se considera como estándar

de oro para la confirmación; consiste en evaluar un aislamiento a concentraciones

crecientes de antibiótico y diferentes diluciones de inóculo bacteriano, realizando conteo de

unidades formadoras de colonias (UFC), posteriormente se grafican los resultados del

Page 50: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

32 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

número de UFC viables, frente a la concentración de VAN y se realiza un cálculo de la

proporción del valor obtenido de AUC, entre la cepa evaluada, contra la cepa de referencia

(Mu3), resultados ≥0,9 confirman que el aislamiento es un hVISA; sin embargo, la demanda

técnica de esta metodología hace que sea imposible su implementación en el tamizaje de

rutina de los laboratorios de microbiología clínica, dado que requiere de una fuerte inversión

de tiempo y recursos económicos, además de lo dispendiosa que resulta la aplicación de la

misma (Chaudhari et al., 2015; Van Hal & Paterson, 2011; Wootton et al., 2001).

Page 51: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 2 33

2. Capítulo 2. Objetivos

Objetivo General

Caracterizar fenotípica y molecularmente aislamientos MRSA con susceptibilidad reducida a vancomicina en aislamientos clínicos, provenientes de 3 países en Suramérica.

Objetivos específicos

Realizar la confirmación del fenotipo de susceptibilidad reducida a la vancomicina en 9 aislamientos VISA, provenientes de 3 países en Suramérica por medio del perfil de análisis de poblaciones (PAPs).

Establecer la epidemiología molecular de los aislamientos que sean confirmados como VISA/hVISA, por medio de electroforesis en campo pulsado (PFGE) y secuenciación de múltiples locus (MLST).

Determinar el tipo de sistema accesorio regulatorio (Agr) en los aislamientos que sean confirmados como VISA/hVISA, provenientes de tres países en Suramérica y realizar detección fenotípica de hemolisina delta.

Page 52: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

34 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Page 53: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 35

3. Capítulo 3. Metodología

En el presente estudio se realizó confirmación del fenotipo hVISA/VISA en aislamientos

caracterizados previamente como probables VISA, obtenidos en el estudio “Vigilancia de

resistencia a agentes antimicrobianos de Staphylococcus aureus y enterococci

provenientes de hospitales en Colombia, Ecuador, Venezuela y Perú”, desarrollado por la

Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana de la Universidad El Bosque” entre

2006 y 2009; en dicho estudio retrospectivo que incluyó 32 hospitales de 4 países, se

identificaron 651 MRSA que fueron tamizados mediante el uso de tres agares

suplementados con glicopéptidos, posteriormente mediante la aplicación de E test

macrométodo se obtuvieron 49 aislamientos sugestivos del fenotipo VISA (≥ 8 µg/mL

vancomicina) los cuales fueron probados con E test GRD, procedimiento luego del cual

se obtuvieron nueve aislamientos probables VISA (Reyes et al., 2009), que son las cepas

utilizadas para los análisis en el presente estudio.

3.1 Esquema Metodológico General

Se realizaron una serie de procedimientos para dar cumplimiento al objetivo general y los

objetivos específicos figura 3-1. El estudio incluía caracterización de fenotipo y tipificación

molecular.

Page 54: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

36 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Figura 3-1 Metodología establecida para el cumplimiento de los objetivos específicos. *Análisis adicionales realizados, que no estaban en los objetivos específicos planteados

en el proyecto inicial

3.2 Cepas bacterianas

Para el desarrollo de este estudio se utilizaron nueve aislamientos MRSA, con probable

susceptibilidad disminuida a vancomicina, obtenidos en un estudio multicéntrico

desarrollado en cuatro países (Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela), en el que se

colectaron 1.570 S. aureus y de ellos 651 eran MRSA (Reyes et al., 2009).

Aquellos aislamientos MRSA que tuvieron MICs ≥1 µg/mL, fueron tamizados por técnicas

para evaluar susceptibilidad a vancomicina, en primer lugar se probaron con tres tipos

agar enriquecido con vancomicina (BHIA con 4 6 μg/mL y 6 μg/mL de VAN y MHA con 5

μg/mL de TEI) y se analizaron con 2 tipos de E test, (macrométodo y Detección de

Resistencia a Glicopéptidos -GRD), luego de lo cual nueve fueron encontrados como

Aislamientos probables

VISA/hVISA

Caracterización fenotipica

Perfil de analisis de poblaciones - área bajo la curva (PAP-

AUC)

Hemolisina Delta

Tipificación molecular

Electroforesis en Campo Pulsado

(PFGE)

*Secuenciación de Genoma Completo

Tipificación: MLST, *spa

, *SCCmec, *PVL

Tipo agr

*Resistoma

*Cambios en proteinas asociadas al fenotipo

VISA/ hVISA

Page 55: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 37

presuntos aislamientos con susceptibilidad intermedia a vancomicina (6 de Perú, 2 de

Colombia y 1 de Ecuador).

Estos nueve aislamientos, presuntos VISA fueron el objetivo del presente trabajo, que

buscaba realizar la confirmación fenotípica y caracterización genotípica de los mismos.

Las cepas que se utilizaron como control para los ensayos de PAPs (Population Analysis

Profiles) fueron: S. aureus susceptible a meticilina y vancomicina, (ATCC 29213) y el

primer aislamiento reportado como hVISA (Mu3) con resistencia intermedia heterogénea

a la vancomicina (Hiramatsu et al., 1997b; Wootton et al., 2001). Como controles en la

PFGE se utilizaron las cepas USA300, USA600, el clon chileno/cordobés, el aislamiento

con susceptibilidad intermedia a vancomicina VISA (Mu50). El aislamiento RN4220 se

utilizó como control en la detección de producción de delta hemolisina, en la tabla 3-1 se

incluye información relevante de los aislamientos y controles utilizados.

Page 56: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

38 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Tabla 3-1 Lista de cepas de S. aureus utilizados en este estudio.

Código o

nombre

de la cepa

Características relevantes / origen de la

muestra

MICa

VAN

µg/mL

Referencia

C329 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 1 (Reyes et al., 2009)

C591 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 1 (Reyes et al., 2009)

E987 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 2 (Reyes et al., 2009)

P1108 Aislamiento MRSA proveniente de herida

quirúrgica

1 (Reyes et al., 2009)

P1112 Aislamiento MRSA proveniente de lavado

bronco alveolar

1 (Reyes et al., 2009)

P1209 Aislamiento MRSA proveniente de aspirado

Bronquial

1 (Reyes et al., 2009)

P1215 Aislamiento MRSA proveniente de líquido

pleural

1 (Reyes et al., 2009)

P1233 Aislamiento MRSA proveniente de líquido

pleural

1 (Reyes et al., 2009)

P1923 Aislamiento MRSA proveniente de líquido

pleural aspirado bronquial

1 (Reyes et al., 2009)

Mu3 Cepa de referencia, MRSA con resistencia

intermedia heterogénea a la vancomicina. PAP-

AUC, ensayos de δ hemolisina, PFGE

NA (Hiramatsu et al.,

1997b; Wootton et al.,

2001)

Mu50 Cepa de referencia, MRSA con resistencia

intermedia a vancomicina. Ensayos de δ

hemolisina, PFGE.

NA (Sakoulas et al., 2002)

ATCC

29213

Cepa de referencia, MSSA sensible a

vancomicina. PAP-AUC, ensayos de δ

hemolisina, PFGE

NA (Yusof et al., 2008)

USA300 Control PFGE NA (McDougal et al., 2003;

Reyes et al., 2009)

USA600 Control PFGE NA (McDougal et al., 2003;

Reyes et al., 2009)

Clon

chileno

Control PFGE NA (Cruz et al., 2005)

RN4220 Aislamiento productor de β hemolisina, ensayos

de δ hemolisina

NA (Cafiso et al., 2012b;

Sakoulas et al., 2002) a

Resultados de la MIC para vancomicina, de los aislamientos de S. aureus utilizados en el presente estudio, tomada de la información de tamizaje realizada a los aislamientos en el estudio previo realizado por Reyes et al. (2009); NA: no aplica resultado de MIC dado que son cepas control.

Page 57: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 39

3.3 Perfil de análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC)

Se realizó como lo describieron previamente Wootton et al. (2001), con algunas

modificaciones. Se descongelaron los aislamientos a evaluar, haciendo un pasaje en

agar infusión cerebro corazón (BHIA), después de 24 horas de incubación a 35°C, se

realizó pase de 1 y/o 2 colonias en 10 mL de caldo tripticasa soya (Biomedics) y se

incubó a 35°C por 24 horas; empleando un inóculo de 108 UFC/mL de los aislamientos y

controles, se realizaron diluciones seriadas en base 10 (4.500 µL de solución salina

estéril y 500 µL del inóculo bacteriano), luego de ello 200 µL de cada una de las

diluciones fueron plaqueadas con asa de Driglasky estéril en cajas de BHIA (Biomedics),

preparado previamente con concentraciones de 0, 0.5, 1, 1,5 2, 3, 4, 6 y 8 µg/mL de

vancomicina. Después de 48 horas de incubación a 35°C, se realizó recuento de

unidades formadoras de colonias. El número de UFC/mL se graficó contra la

concentración de vancomicina. Los PAPs se inspeccionaron visualmente y los datos se

analizaron (Hiramatsu et al., 1997b). Todas las pruebas se realizaron usando como

controles Mu3 (hVISA) y Staphylococcus aureus sensible a meticilina ATCC 29213.

PAP-AUC: Se determinó el radio del área bajo la curva (AUC) como lo describen Wootton

et al. (2001), para los análisis se utilizó el software GraphPad Prims 7 (GraphPad

Software, Inc), con la versión de prueba que tiene el mismo; posteriormente, se

determinó el producto del AUC, para lo cual se dividió el valor obtenido de AUC para

cada aislamiento sobre el valor obtenido de AUC en el control hVISA-Mu3.

La interpretación de resultados, se realizó de acuerdo a los parámetros reportados por

Wootton et al. (2001), como se describe en la tabla 3-2 (Wootton et al., 2001).

Tabla 3-2 Criterios de interpretación del PAP-AUC

Fenotipo de resistencia a

Vancomicina en S. aureus Resultado PAP-AUC

VSSA < 0,9

hVISA 0,9 - 1,3

VISA > 1,3

Criterios de interpretación del PAP- AUC, (Wootton et al., 2001)

De cada experimento se realizaron tres réplicas biológicas, en caso de discrepancias se

tomó el resultado prevalente en dos de los tres ensayos. Se obtuvieron promedios.

Page 58: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

40 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

3.4 Electroforesis en campo pulsado (PFGE)

La electroforesis en campo pulsado, es útil para comparar cepas bacterianas, dado que

el ADN es embebido en gel de agarosa, digerido con endonucleasas de restricción de

corte infrecuente (Tenover et al., 1995), luego de lo cual el ADN es sometido a corrido

electroforético, en un equipo que hace que la corriente eléctrica sea pulsada

alternativamente, reorientando la dirección de la misma de acuerdo a los parámetros

establecidos (Schwartz & Cantor, 1984), generando separación de ADN de alto peso

molecular, y a su vez un patrón de bandas que permite comparar el perfil genético entre

aislamientos, para evaluar su relación.

Los nueve aislamientos probables hVISA, fueron sometidos a este procedimiento y se

utilizaron como patrones de comparación los aislamientos VISA (Mu50) y hVISA (Mu3), y

representativos de los clones USA300, USA600 y clon chileno/cordobés, a fin de evaluar

posibles relaciones clonales.

Esta técnica se realizó de acuerdo a las recomendaciones de Murray et al. (1990) con

modificaciones y de acuerdo al protocolo estandarizado en la Unidad de Genética y

Resistencia Antimicrobiana -UGRA (Arias et al., 2003; Murray et al., 1990; Panesso et al.,

2002; Reyes et al., 2009) se inoculó una colonia de cada una de las cepas evaluadas en

15mL de caldo BHIA (oxoid LTD, Hampdhire, England), se incubó a 37°C, durante toda la

noche en agitación constante. El tubo con el inóculo bacteriano fue centrifugado a 4°C

por 5 minutos a 5000 rpm; se descartó el sobrenadante y se recuperó el botón en el

fondo que contenía las células bacterianas, las cuales se resuspendieron en 2 mL de

buffer PIV (tris-HCl pH 7,6 10mM y NaCl 1 M). Se realizó una mezcla de 150µL de la

suspensión bacteriana con el mismo volumen de agarosa de bajo punto de fusión al 1%

(Bio Rad Laboratories Inc. United Satates), posteriormente se dispensó en los moldes y

se dejó solidificar. Los bloques de inóculo embebido en la agarosa se incubaron en buffer

de lisis (Tris-HCl 6 mM -pH 7,6, NacL 1M, EDTA 100mM, Brij-58 0,5%, deoxicolato de

sodio al 0,2%, sarkosyl 0,5% (N-Lauroilsarcosina sódica), RNasa 25 μg/mL y lisostafina

10 μg/mL) a 37°C por 5 horas. Pasado este tiempo se descartó el buffer de lisis y los

Page 59: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 41

bloques con el inóculo se incubaron en solución ESP (EDTA 0,5 M pH 9.5, sarkosil al 1 %

y proteinasa K 50 μg/mL) a 50°C toda la noche; luego de ello, se realizaron tres lavados

con buffer TE pH 8 (tris-HCl 10 mM pH 7,5 y EDTA 1 mM pH 7,5) a temperatura

ambiente (cada lavado se hizo con incubación de una hora en agitación constante) (

Murray, Singh, Heath, Sharma, & Weinstock, 1990; Reyes, 2014).

El ADN fue digerido con de la enzima de restricción SmaI a una concentración de 20

U/µL (Promega Corporation) a 25°C con buffer J (tris HCL 10mM, MgCl 7mM, KCl 50

mM), BSA 1X y agua destilada des ionizada estéril; para detener la reacción enzimática,

se incubó con buffer TE a 37°C por 30 minutos. Después de realizar digestión, el ADN de

los aislamientos fue separado por electroforesis en gel de agarosa “Seakem gold” al

1,6% (Cambrex Bio Science Rockland INC) con Buffer TBE 0,5 X (Tris borato 44,5 mM,

ácido bórico 44,5 mM y EDTA 1 mM pH 8,0), utilizando el equipo CHEF-DRIII (Bio-Rad

laboratorios Inc Richmond, CA).

Se utilizaron los siguientes parámetros para la corrida electroforética, gradiente de voltaje

6,0 v/cm, pulso inicial 5 segundos, pulso final 40 segundos, con un tiempo de corrida de

24 horas. A continuación, se procedió a colorear el gel con bromuro de etidio a 0,5 µg/mL

(Promega Corporation) por 30 minutos, luego de lo cual se visualizó con luz ultra violeta

(UV).

Para realizar análisis de la información, primero se realizó una revisión manual de las

bandas, de acuerdo a los criterios de Tenover (Tenover et al., 1995) y posteriormente se

realizó análisis del archivo digital en el software Gel Compare II 6.5 (Applied Maths

Software, Biomerieux Company, Bélgica). Se construyó el dendograma con los siguientes

parámetros: se analizaron los patrones de bandas mediante el coeficiente de Dice, se

establecieron los conglomerados (clusters) mediante agrupamiento apareado UPGMA

(del inglés Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages), con una tolerancia

de 1,5% y un valor de corte (threshold cutoff value) de 75%.

Posteriormente los resultados se validaron luego de comparar los resultados obtenidos

en la revisión manual y los obtenidos por el software.

Page 60: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

42 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

3.5 Secuenciación

Extracción de ADN genómico y verificación de calidad

A partir de cultivos bacterianos en caldo BHIA se obtuvieron los extractos celulares que

fueron sometidos a un tratamiento de pre-lisis con lisostafina (80 µg/mL), para la

posterior extracción y purificación de ADN genómico, la cual se realizó empleando el kit

comercial DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen Group), de acuerdo a las instrucciones

establecidas por el fabricante. Luego de la purificación en columna, el ADN fue

resuspendido en 50µL de agua ultra pura libre de ARNsas y ADNsas y almacenado a -

20ºC para su uso posterior. Una alícuota de 10µL fue empleada para verificar la calidad

de ADN obtenido.

La verificación de pureza se realizó mediante la determinación del radio de las lecturas

de cada muestra (Nanodrop ratio) a una longitud de onda de 260 nm (cantidad de ADN) y

280nm, (cantidad de proteínas), cuyo resultado debía ser mayor a 1,8. Así mismo, se

comprobó la integridad del ADN mediante visualización de la migración en gel de

agarosa, y se generó el electroferograma, se determinó el tamaño promedio de los

fragmentos y concentración de ADN. La cuantificación de ADN genómico, se realizó por

fluorometría en el Qubit® 2.0 (Invitrogen), utilizando el estuche comercial Qubit dsDNA

BR (Thermo Fisher Scientific Inc).

Preparación de las librerías genómicas

Con el fin de preparar las librerías para el procedimiento de secuenciación completa del

genoma, luego de cuantificar el ADN genómico, las librerías fueron preparadas

empleando el kit Nextera XT DNA sample preparation (Illumina®, San Diego CA), de

acuerdo a las recomendaciones del fabricante. En resumen, en primera instancia se

realizó tagmentación del ADN (En esta fase se unieron los fragmentos de ADN genómico

a los adaptadores Illumina), a continuación se realizó el proceso de amplificación por

PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en este paso se realizó amplificación de los

fragmentos de ADN con los adaptadores específicos de Illumina, los cuales incluyen los

pares de índices específicos (Illumina Inc., 2012). Posteriormente, se realizó el proceso

de limpieza, de los productos (amplicones) obtenidos, para ello se utilizarón perlas

Page 61: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 43

Ampure XP (Angencourt Bioscience corporation, MA, USA), y las librerías se diluyeron en

el buffer de resuspensión. Las librerías fueron almacenadas a -20°C para su posterior

uso y una alícuota de 5uL fue empleada para la cuantificación y la caracterización de

fragmentos de ADN, como se describe más adelante.

La cuantificación de las librerías se realizó mediante fluorometría en el Qubit® 2.0

(Invitrogen®) utilizando el estuche comercial Qubit HS-DNA (Thermo Fisher Scientific

Inc). Posteriormente se realizó la caracterización de cada librería empleando el

bioanalizador agilent 2100 Bioanalyzer con el High sensitivity DNA chip, con el objetivo

de determinar la distribución de tamaño de los fragmentos. Finalmente, de acuerdo a la

concentración nM teórica, cada librería fue ajustada a una concentración de 4nM y fueron

combinadas para su posterior secuenciación.

El “pool” de librerías fue denaturado mediante el uso de NaOH y diluido con agua esteril

grado PCR, a una concentración de 12pM. Para el proceso de secuenciación se utilizó el

kit V2 500 cycles (Illumina Inc. San Diego CA) compatible con el secuenciador MiSeqTM

System (Illumina Inc. San Diego CA), en donde se llevó a cabo el proceso de

secuenciación para obtener lecturas pareadas de 250 bp (250PE).

Ensamblaje y anotación genómica

A partir de las lecturas pareadas obtenidas en el secuenciador MiSeqTM System (Illumina

Inc. San Diego CA), se realizó la verificación de calidad y la limpieza empleando un

índice de Phred de 20, se eliminaron secuencias contaminantes que correspondieran a la

presencia de adaptadores.

A partir de las secuencias (reads), limpias de adaptadores, se realizaron ensamblajes de

novo (sin usar secuencia de referencia) para la obtención de contings mediante

alineamiento y astringencia media, con tamaños de palabra y de burbuja estimados

automáticamente y una longitud mínima de contig de 400 con un re mapeo, de reads

para corregir errores de ensamblaje, este se realizó empleando el programa CLC

Genomics Workbench 8.5.

A partir de los genomas ensamblados en “contigs” se realizó anotación empleando el

servidor RAST versión 2.0 (Rapid annotation using subsystem Tecnology) (Aziz et al.,

Page 62: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

44 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

2008). El proyecto de secuenciación de los genomas de los tres aislamientos se identificó

en la base de datos de Bioproject con el número PRJNA393041. Las secuencias fueron

depositadas en Genbank, bajo los siguientes números de acceso: P1209

(NMOP00000000), P1108 (NMOQ00000000), E987 (NMOR00000000).

3.6 Análisis in sílico

3.6.1 Tipificación de Secuencias de Múltiples Locus (MLST)

La tipificación de secuencias multilocus se basa en el polimorfismo de siete genes

“housekeeping” y sus resultados permiten definir linajes clonales, complejos clonales y

dar información de la evolución del microorganismo (Mehraj et al., 2016). La MLST

identifica secuencias internas de alrededor de 400 a 500 nucleótidos en los genes

“housekeeping”, las secuencias de fragmentos de estos genes permiten la asignación de

siete alelos (identificados por números), que llevan a la asignación de una secuencia tipo

ó ST (del inglés sequence type) (Larsen et al., 2012) De acuerdo a lo descrito en

literatura, los siete genes “housekeeping” utilizados para realizar la MLST de S. aureus,

fueron carbamato kinasa, (arcC), siquimato deshidrogenasa (aroE), glicerín kinasa (glp),

guanilato kinasa (gmk), fosfato acetil tranferasa (pta), trifosfato isomerasa (tpi) y acetil

coenzima A acetiltransferasa (yqiL) (Enright, Day, Davies, Peacock, & Spratt, 2000).

La determinación de secuencia tipo (ST) se realizó empleando el servidor del centro de

epidemiología genómica de Dinamarca, (Center for Genomic Epidemiology)

(http://www.genomicepidemiology.org/), con el MLST 1.8 (MultiLocus Sequence Typing)

(Larsen et al., 2012).

3.6.2 Detección de cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el fenotipo VISA/hVISA

Con el fin de determinar si los aislamientos que fueron confirmados, presentaban

cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el

fenotipo de sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/VISA), se efectuaron

alineamientos de las secuencias predichas de aminoácidos de cada uno de los genomas

de los tres aislamientos hVISA confirmados en este estudio y se compararon con las

Page 63: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 45

secuencias de los genomas de referencia de Mu3 (GenBank: NC_009782.1), Mu50

(GenBank: NC_002758.2) y N315 (GenBank: BA000018.3).

Para realizar estos alineamientos se tomaron como base proteínas previamente

reportadas en la literatura, con cambios en residuos de aminoácidos: VraR, VraR, GraS,

GraR, WalK, WalR, Atl, TcaA, RpoB. Para realizar el alineamiento se utilizó el software

en la página web http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ (Corpet, 1988).

3.6.3 Detección tipo de grupo agr, PVL, SCCmec

Mediante PCR in silico, y de acuerdo a secuencias de iniciadores reportados previamente

se realizó detección del tipo de grupo agr, tipo de SCCmec, (del inglés staphylococcal

cassette chromosome mec) y PVL, para lo cual se utilizó el programa blastn® 2.5.0

(Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) en el servidor NCBI (National

Center for Biotechnology Information). Para estos análisis in silico se utilizaron

secuencias de iniciadores reportados previamente en literatura (Gilot et al., 2002;

Oliveira, 2002; Strommenger, Cuny, Werner, & Witte, 2004), los cuales se relacionan a

continuación en las tablas 3-3 y 3-4:

Tabla 3-3 Secuencias de iniciadores para detección de grupo agr

Nombre Secuencia de iniciadores Referencia

Pan 5´-ATG CAC ATG GTG CAC ATG C-3´

(Gilot et al. 2002)

agr1 5´-GTC ACA AGT ACT ATA AGC TGC GAT-3´

agr2 5´-TAT TAC TAA TTG AAA AGT GGC CAT AGC-3´

agr3 5´-GTA ATG TAA TAG CTT GTATAA TAA TAC CCA G-3´

agr4 5´-CGA TAA TGC CGT AAT ACC CG-3´

agr1 F: 5´-CAC TTA TCA TCA AAG AGC C-3´ (Strommenger, et

al., 2004)

R: 5´-CCA CTA ATT ATA GCT GG-3´

agr2 F: 5´-GTA GAG CCG TAT TGA TTC-3´

R: 5´-GTA TTT CAT CTC TTT AAG G-3´

agr3 F: 5´-CAA GCT ATT ACA TTA CTA CCA-3´

R: 5´-AAT GCT TCC ACT TAC TATC-3´

agr4 F: 5´-GCT CAA TTC ATG CAA TTA-3´

R: 5´-ATG GTA CTG TAA ACA TTA-3´

F: iniciador forward; R: iniciador reverse

Page 64: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

46 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Tabla 3-4 Iniciadores para detección de tipo de SCCmec

Locus Secuencia de iniciadores (5´–3´) Especificidad

tipo de SCCmec Referencia

CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG I

Oliveira, 2002

CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC

KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC II

KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG

MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC II, III

MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC

DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC I, II, IV

DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG

MECA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG Control interno

MECA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG

Los iniciadores utilizados para este análisis se tomaron de Oliveira, 2002.

Para la detección de la Leucocidina de Panton Valentine (PVL), se utilizó la secuencia de

nucleotidos de PVL reportada para el aislamiento de referencia USA300 (secuencia en

Genbank CP000255), y se comparó con la información contenida en los genomas de los

tres aislamientos hVISA (formato fasta), para lo cual se utilizó la herramienta tblastn 2.5.0

en el servidor NCBI (Altschul et al., 1997).

3.6.4 Tipificación de spa y resistoma

Para la tipificación de spa se usó el programa spaTyper 1.0. (Bartels et al., 2014), para la

detección de genes de resistencia a antibióticos se utilizó ResFinder 2.1 (Zankari et al.,

2012), ambos programas están en el servidor del Centro de Epidemiología Genómica de

Dinamarca, Center for Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org/).

3.6.5 Detección de expresión de delta hemolisina

La detección de la expresión de δ hemolisina, se realizó teniendo en cuenta lo descrito

por Sakoulas et al. (2002), dado que se ha reportado disminución de la funcionalidad de

agr en aislamientos hVISA y VISA, que ha sido evaluada mediante la disminución de la

producción de δ hemolisina (Sakoulas et al., 2002). Para este ensayo se utilizó una cepa

fuerte productora de β hemolisina, (en nuestro caso utilizamos el S. aureus RN4220), que

Page 65: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 3 47

fue sembrado en una línea vertical, los aislamientos a evaluar y controles, se sembraron

en líneas perpendiculares junto a este (líneas horizontales); la hemólisis β generada por

el aislamiento RN4220 produce una zona turbia que rodea la siembra vertical que se

realizó; dado que la hemólisis β y δ actúan sinérgicamente, se produce una hemólisis

clara en la intersección de las dos líneas de siembra cuando la hemolisina δ está

presente (Adhikari, Arvidson, & Novick, 2007; Nielsen et al., 2013). Luego de realizar la

siembra, las cajas de agar se incubaron a 37°C por 24 horas, luego de lo cual se revisó la

producción de hemólisis, como se observa en la figura 3-2.

Figura 3-2 Interpretación de resultados ensayo hemólisis

Figura tomadas de Adhikari, Arvidson, y Novick, 2007. Esquema de la actividad hemolítica en sangre de cordero. Las bacterias a probar (rayas negras horizontales) se siembran en ángulo recto al aislamiento RN4220 (raya negra vertical). La beta hemólisis produce una zona turbia alrededor de RN4220. La δ hemólisis y β hemólisis son sinérgicas y producen una zona clara de hemólisis (Adhikari, et al., 2007).

Page 66: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus
Page 67: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 49

4. Capítulo 4. Resultados

Los resultados se presentan de acuerdo a los tres objetivos específicos planteados en el

presente trabajo y posteriormente se relacionan los resultados adicionales.

4.1 Resultados objetivo 1. Confirmación de fenotipo

hVISA/VISA por perfil de análisis de poblaciones

(PAPs)

De los nueve aislamientos que fueron evaluados por la metodología de perfil de análisis

de poblaciones-área bajo la curva, tres fueron confirmados con fenotipo hVISA, los seis

aislamientos restantes fueron confirmados como VSSA, no se halló ningún aislamiento

VISA, como se observa en la tabla 4-1. En caso de discrepancias, los resultados de

caracterización se realizaron basándose en el resultado obtenido en dos de los tres

ensayos.

Tabla 4-1 Resultados de PAP-AUC en los nueve aislamientos evaluados.

Aislamiento

Resultado AUC aislamiento/AUC Mu3 Promedio PAP/AUC

Fenotipo de resistencia

a vancomicina

Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3

E987 1,15 1,21 1,10 1,15 h-VISA

P1108 1,52 0,65 1,15 1,11 h-VISA

P1209 1,60 1,00 0,97 1,19 h-VISA

P1112 0,62 0,69 0,74 0,68 VSSA

P1923 1,08 0,87 0,73 0,89 VSSA

P1933 0,86 0,84 0,74 0,81 VSSA

P1215 0,84 0,98 0,80 0,87 VSSA

C591 0,69 1,12 0,65 0,82 VSSA

C329 0,53 0,50 0,62 0,55 VSSA

Page 68: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

50 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Tres aislamientos E987, P1108, P1209, fueron confirmados como hVISA, mediante PAP-

AUC; en cada montaje se utilizó un control sensible a vancomicina (ATCC 29213) y el

control Mu3 que corresponde al control positivo utilizado en PAP-AUC, que proviene del

primer aislamiento hVISA reportado (Hiramatsu et al., 1997b; Wootton et al., 2001), como

se observa en la figura 4-1.

A B

C

Figura 4-1 Perfil de análisis de poblaciones de los aislamientos hVISA

Los hallazgos obtenidos en el presente estudio muestran una prevalencia de 0,52% de

hVISA, con respecto al total de MRSA colectados en el estudio previo realizado por la

Unidad de Genetica y Resistencia Antimicrobiana- UGRA (Reyes et al., 2009); el fenotipo

hVISA estaba presente en aislamientos procedentes de dos países, uno (1,15%) de

Ecuador y dos (1,13%) de Perú. Los dos aislamientos colectados en Colombia resultaron

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8

Lo

g10 d

e U

FC

/mL

PAP E987

ATCC 29213

E987

Mu3

Concentración de Vancomicina en ug/mL

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8

Lo

g 1

0 U

FC

/mL

Concentración de Vancomicina en ug/mL

PAP P1108

ATCC 29213

P1108

Mu3

0

2

4

6

8

10

0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8

Lo

g 1

0 U

FC

/mL

Concentración de Vancomicina en ug/mL

PAP P1209

ATCC 29213

P1108

Mu3

Page 69: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 51

negativos para dicho fenotipo, como se observa en la tabla 4-2. Con respeto al tipo de

muestra de donde fueron recuperados los aislamientos hVISA, E987 fue colectada en

hemocultivo, P1108 de herida quirúrgica y P1209 de aspirado bronquial.

Tabla 4-2 Porcentaje de aislamientos confirmado como hVISA, discriminado por país.

País de procedencia No. Aislamientos

MRSA*

No. Aislamiento

hVISA

% de casos

hVISA

Colombia 318* 0 -

Ecuador 87* 1 1,15

Perú 177* 2 1,13

Total 582** 3 0,52**

*Los datos del número total se MRSA colectados por país que se utilizaron para los cálculos fueron tomados del estudio multicéntrico desarrollado por Reyes y colaboradores, entre 2006 y 2008, en donde se obtuvieron los nueve aislamientos que fueron tamizados como probables VISA, y que en el presente estudio fueron sometidos a prueba confirmatoria mediante PAP-AUC (Reyes et al., 2009).

**Los cálculos se realizaron solamente para los tres países incluidos en el presente estudio, por lo cual se excluyó Venezuela, que tenía 69 MRSA, de los cuales ninguno resultó hVISA, si se incluyera, el porcentaje calculado de hVISA para los cuatro países sería de 0,46%.

4.2 Resultados objetivo 2. Epidemiología molecular de

aislamientos hVISA, PFGE, MLST

4.2.1 Resultados de PFGE

Con respecto a la PFGE, se realizó inspección manual del gel y posteriormente se realizó

el análisis con el programa GelCompar II® (Applied Maths), con una tolerancia de 1,5%,

y un coeficiente de similaridad de 75%; se determinó que ocho de los aislamientos se

relacionan con el clon chileno/cordobés (incluidos los tres aislamientos confirmados como

hVISA), como se observa en el dendograma (figura 4-2).

Por otro lado, el aislamiento C329 (VSSA) no presenta relación clonal con ningún otro

aislamiento o control utilizado en este gel de PFGE.

Page 70: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

52 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Figura 4-2 Resultados de PFGE

4.2.2 Resultados de secuenciación, ensamblaje y anotación genómica

Con los reads crudos obtenidos, se realizó un control de calidad inicial para eliminar las

bases de baja calidad (probabilidad de error de 0,01 según el índice de Phred), las

secuencias con menos de 60 bases de longitud fueron removidas para evitar errores. Los

reads que cumplieron con los parámetros de calidad se utilizaron para el ensamblaje de

novo y anotación a través de la página web del National Microbial Pathogen Data

Resourse http://www.nmpdr.org/FIG/wiki/view.cgi; mediante RAST (Aziz et al., 2008),

luego de lo cual se obtuvieron los genomas de los tres aislamientos hVISA ensamblados

en formato fasta, los datos generales obtenidos de este proceso, se resumen en la tabla

4-3.

Page 71: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 53

Tabla 4-3 Resultados generales del proceso de secuenciación de los aislamientos

Aislamiento Longitud del

ensamblaje

Número de

lecturas

(reads)

Número

de

contigs

%GC Cobertura Número de acceso en Genbank

E987 2.829.559 1.662.996 492 32,8 109X NMOR00000000

P1108 2.914.702 1.647.012 496 32,8 104X NMOQ00000000

P1209 2.977.935 1.733.500 345 32,9 127X NMOP00000000

Estos datos fueron obtenidos del proceso de secuenciación, ensamblaje y anotación.

4.2.3 Resultados de MLST

En cuanto a las secuencias tipo (ST) obtenidas por MLST, los dos aislamientos hVISA

procedentes de Perú presentan una ST5, mientras que el aislamiento hVISA de Ecuador

tiene una ST 228; la identidad fue de 100%, en todos los casos, los detalles se presentan

en la tabla 4-4.

Tabla 4-4 Perfil alélico de los aislamientos hVISA

%Ident: porcentaje de identidad; *ST: Secuencia tipo; long: longitud

Aislamiento E987 P1108 P1209

Locus

%

Iden

t

Long

HSP

Long

alelo Gaps Alelo

%

Ident

long

HSP

Lon

g

alelo

Gaps Alelo %

Ident

Long

HSP

Long

Alelo Gaps Alelo

Arc 100. 456 456 0 arcc_1 100. 456 456 0 arcc_1 100 456 456 0 arcc_1

Aroe 100. 456 456 0 aroe_4 100. 456 456 0 aroe_4 100 456 456 0 aroe_4

Glpf 100. 465 465 0 glpf_1 100. 465 465 0 glpf_1 100 465 465 0 glpf_1

Gmk 100. 417 417 0 gmk_4 100. 417 417 0 gmk_4 100 417 417 0 gmk_4

Pta 100. 474 474 0 pta_12 100. 474 474 0 pta_12 100 474 474 0 pta_12

Tpi 100. 402 402 0 tpi_24 100. 402 402 0 tpi_1 100 402 402 0 tpi_1

Yqil 100. 516 516 0 yqil_29 100. 516 516 0 yqil_10 100 516 516 0 yqil_10

*ST ST 228 ST 5 ST 5

Page 72: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

54 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

4.3 Resultados Objetivo 3. Tipo agr en aislamientos

confirmados como hVISA y detección fenotípica de

hemolisina delta

Para la tipificación del agr de los tres aislamientos hVISA, se utilizaron dos juegos de

iniciadores reportados en literatura, que permiten identificar los cuatro tipos de agr (Gilot

et al., 2002; Strommenger et al., 2004), los análisis se realizaron con la herramienta

blastn.

Los resultados obtenidos in silico, evidencian que los tres aislamientos hVISA presentan

agr II; con ambos juegos de iniciadores se obtuvo una identidad de 100%, alineamiento

completo de los iniciadores, no se presentaron mismatch o gaps, y el e-value evidencia

significancia, como se observa en la tabla 4-5 y figura 4-3. Con los iniciadores reportados

por Strommenger et al. (2004), se genera un producto de amplificación de 428 pb,

(Strommenger et al., 2004).

Tabla 4-5 Aislamientos hVISA con agr II

hVISA Contig

Referencia iniciadores probados

agr

% iden

Long

alin

No. Mismatc

h

No. Gap

Inicio en contig

Final en contig

e-value Bitscor

e Referencia

E987

106 agr2 100.0 27 0 0 2664 2690 6,00E-10 51.0 Gilot, 2002

106 agr2

Forward 100.0 18 0 0 2800 2817 6,00E-05 34.4 Strommeng

er et al., 2004 106

agr2 Reverse

100.0 19 0 0 3245 3263 2,00E-05 36.2

P1108

49 agr2 100.0 27 0 0 858 884 2,00E-09 54.0 Gilot, 2002

49 agr2

Forward 100.0 18 0 0 994 1011 2,00E-04 36.2

Strommenger et al., 2004

49 agr2

Reverse 100.0 19 0 0 1439 1457 7,00E-05 38.2

P1209

85 agr2 100.0 27 0 0 28632 28658 2,00E-09 54.0 Gilot, 2002

85 agr2

Forward 100.0 18 0 0 28505 28522 2,00E-04 36.2

Strommenger, 2004 85

agr2

Reverse 100.0 19 0 0 28059 28077 7,00E-05 38.2

% iden: porcentaje de identidad; long alin: Longitud del alineamiento; Finaliz. Contig: finalización en contig

Page 73: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 55

Page 74: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

56 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Figura 4-3 Tipificación agr II aislamientos hVISA

En la figura, se presentan los alineamientos por blastn, de las secuencias del genoma completo

de los aislamientos hVISA en formato fasta, con la secuencia de los iniciadores descritos

previamente para detección del tipo agr; A. aislamiento E987; B. aislamiento P1108; C.

aislamiento P1209

Por otro lado, debido a los reportes de disminución de la funcionalidad de agr en

aislamientos hVISA y VISA, se evaluó la producción de δ en agar sangre de cordero. En

los casos en que se produce delta hemolisina, se genera una zona de hemólisis

mejorada en las zonas donde esta se solapa con la zona de beta hemólisis producida por

el aislamiento de S. aureus RN4220. Para este ensayo se utilizaron cajas de agar sangre

de cordero, en las cuales realizó siembra de una línea vertical del aislamiento RN4220 y

posteriormente los aislamientos evaluados controles (Mu3, Mu50 y ATCC 29213) se

sembraron en líneas perpendiculares.

Como se observa en la figura 4-4, los aislamientos ATCC 29213 (control aislamiento

MSSA) y el aislamiento P1108 (hVISA), presentan incremento de la hemólisis en donde

se solapa con la hemólisis de RN4220 (intersección), evidenciando hemólisis δ; por el

Page 75: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 57

contrario se observa disminución de la actividad hemolítica en la intersección con los

aislamientos E987 y P1209 (ambos hVISA), lo que demuestra una actividad disminuida

de la hemolisina δ en estos aislamientos y los controles Mu3 y Mu50.

Figura 4-4 Ensayo de δ hemolisina.

Ensayo de δ hemólisis realizado en agar sangre. A. Cepa RN4220 aislamiento productor de β hemolisina; B. Aislamiento ATCC 29213; C. aislamiento E987; D. Aislamiento P1108. E. Mu3 resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina hVISA; F. Mu50 con resistencia intermedia a vancomicina VISA; G. Aislamiento P1209.

4.4 Resultados adicionales: tipo spa, PVL, resistoma y mutaciones de genoma relacionadas con el fenotipo hVISA

4.4.1 Resistoma

De acuerdo a los análisis realizados de resistoma, fue común para los tres

aislamientos la presencia del gen blaZ, que en S. aureus codifica para la producción

de betalactamasas que le confieren resistencia a penicilina (Pereira, Harnett, Hodge,

Cattell, & Speers, 2014).

Si bien en este trabajo no se realizaron perfiles de resistencia a antibióticos a estos

aislamientos, en la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana-UGRA

(Universidad el Bosque), se les había realizado previamente MIC para diferentes

Page 76: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

58 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

antibióticos, en el marco de la vigilancia en que fueron colectados (Reyes et al., 2009)

y dado que se tenía disponible dicha información, se analizaron los resultados de MIC

obtenidos previamente, con los de resistoma obtenidos en el presente estudio.

Se observaron coincidencia en los resultados obtenidos de resistoma (detección de

genes de resistencia a antibióticos), con respecto a los hallazgos previos en las MIC:

los tres aislamientos fueron resistentes a oxacilina, ciprofloxacina y eritromicina y a su

vez, todos los aislamientos presentan los genes mecA, norA y ermA que les confiere

resistencia a betalactámicos, fluoroquinolonas y macrólidos respectivamente; con

respecto a los aminoglicósidos, dos de los aislamientos presentan resistencia a

gentamicina, mientras que P1108 presenta una MIC intermedia, lo cual es coherente,

dado que los tres portan diferentes genes de resistencia a aminoglicósidos (tabla 4-6)

Tabla 4-6 Resistoma y MIC para los aislamientos hVISA

Cepa Antibiótico Genes de resistencia a antibióticos presentes en los aislamientos y resultados de

MIC

Betalactámicos Aminoglicósidos Fluoroquinolonas Macrólidos Fenicol

Gen / MIC Oxacilina BlaZ Gentamicina Ciprofloxacina Eritromicina Cloranfenicol

E987 genes mecA blaZ

aac (6´)

norA ermA ---- aph(2´´)

Spc

ant(6)-la

MIC >64 (R) ___ 32 (R) >32 (R) >64 (R) 8 (S)

P1108 genes mecA blaZ

aph(3´´)

norA ermA cat(pC221) Spc

ant(6)-la

MIC >64 (R) ___ 8 (I) 32 (R) >64 (R) 64 (R)

P1209 genes mecA blaZ

aph(3´III)

norA ermA ---- ant(6)-la

Spc

MIC >64 (R) ___ >64 (R) 16 (R) >64 (R) 8 (S)

Nota: la Información contenida en esta tabla respecto a Concentraciones Mínimas Inhibitorias, fue

suministrada cordialmente por la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana UGRA- Dra.

Jinnethe Reyes, de trabajos previos realizados por el grupo. En rosado resultado de MIC:

resistente (R), intermedio (I).

Page 77: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 59

4.4.2 Tipificación de spa

Durante la última década, la tipificación de spa se basó en los polimorfismos de la X-

región del gen spa (región con un número variable de repeticiones en tándem),

convirtiéndose en una herramienta de tipificación utilizada frecuentemente (Mehraj et al.,

2016); En los aislamientos hVISA, se detectaron tres tipos de spa diferentes, E987 fue

spa t001 y P1108 fue t149, tabla 4-7; sin embargo, el aislamiento P1209 (de Perú), tiene

un tipo de spa que no ha sido reportado en la base de datos de Spa Finder.

Tabla 4-7 Tipificación de spa en los aislamientos hVISA

Aislamiento Tipo spa Repeticiones Contig Posición Orientación

E987 t001 26-30-17-34-17-20-17-12-17-

16 contig_78 1833-2113 Negativa

P1108 t149 14-44-12-17-23-18-17-17-17-

17-17-17-17-17-23-24 contig_93 2165-2493 Positiva

P1209 Desconocido NA NA NA NA

4.4.3 Cambios en proteínas asociadas con el fenotipo hVISA/VISA

Luego de realizar alineamientos de proteínas de genes y operones que en la literatura

habían sido relacionados con el fenotipo hVISA/VISA, se encontraron algunos residuos

de aminoácidos que previamente han sido descritos en cepas con fenotipo VISA. A partir

de alineamiento de las secuencias predichas de proteínas en los genomas ensamblados,

para cada uno de los genomas de los tres aislamientos hVISA (E987, P1108, P1209), y

se compararon con las secuencias de los aislamientos de referencia Mu50 (VISA), Mu3

(hVISA) y N315 (VSSA); en total se hallaron cinco sustituciones en residuos de

aminoácidos, en cuatro de las proteínas evaluadas con asociación a fenotipo

Page 78: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

60 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

hVISA/VISA, algunas de ellas están presentes en los tres aislamientos, como se resumen

en la tabla 4-8:

WalK: el alineamiento con la secuencia de WalK de las cepas de referencia, mostró

dos sustituciones en residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK (sensor

histidina kinasa del TCS WalKR); la primera en el aislamiento de Perú P1108, en el

que se halló la sustitución L14I (cambio de una leucina por isoleucina). En el

aislamiento E987 se encontró la sustitución G233D (cambio de una glicina por

aspartato) como se observa en la figura 4-5. Estos cambios de residuo en las dos

posiciones mencionadas son cambios frente al aislamiento sensible N315, sin

embargo, la secuencia consenso se mantuvo en las tres cepas de referencia hVISA

Mu3, VISA Mu50 y en la cepa sensible N315.

Page 79: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 61

Figura 4-5 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK

Atl: se halló también la presencia de sustitución de un residuo de aminoácido de la

proteína Atl, producto del gen atl, (una de las principales autolisinas de S. aureus); el

alineamiento de las secuencias de aminoácidos mostró la sustitución del residuo

Y814H, que produjo cambio de una tirosina por histidina en los dos aislamientos de

Perú P1108 y P1209 (figura 4-6), frente al aminoácido presente en N315 (sensible a

VAN). Sin embargo, la secuencia consenso para este residuo se mantuvo en las

cepas de referencia hVISA Mu3, VISA Mu50 y en la cepa sensible N315 al igual que

para el aislamiento estudiado E987.

Figura 4-6 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de Atl

Page 80: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

62 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

TcaA: es una proteína transmembranal codificada por el gen tcaA (que ha sido

asociado cambios en los niveles de resistencia a glicopéptidos). El alineamiento de

las secuencias de aminoácidos de TcaA mostró que los tres aislamientos E987,

P1108 y P1209, presentaban una sustitución en el residuo de aminoácido L218P,

cambio de leucina por prolina (figura 4-7). Este es un cambio de residuo frente a la

cepa sensible N315, sin embargo, la secuencia consenso está presente en N315,

hVISA Mu3, VISA Mu50.

Figura 4-7 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de TcaA

RpoB: la subunidad β de la ARN polimerasa es codificada por el gen rpoB; algunos

reportes de literatura refieren cambios en residuos de aminoácidos en RpoB

asociados a cepas hVISA/VISA, por esta razón se alinearon las secuencias predichas

de proteínas de los aislamientos con las cepas de referencia. En el aislamiento E987

se encontró sustitución en el residuo de aminoácido H481N, (histidina por

asparagina) y el aislamiento Mu50 presenta cambio de un residuo de aminoácido en

la misma posición H481Y, con sustitución de histidina por tirosina (figura 4-8); esta es

una sustitución que llama la atención, dado que es una sustitución frente a la

secuencia de N315 y Mu50 cepa VISA presenta cambio de residuo en la misma

posición, aunque por un aminoácido diferente.

Page 81: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 4 63

Figura 4-8 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de de RpoB.

Tabla 4-8 Resumen de hallazgos de sustituciones de residuos de aminoácidos en proteínas previamente relacionadas con hVISA/VISA

Proteína Aislamiento

Sustitución

encontrada en

aminoácidos

Sustitución en

aminoácidos reportada

en literatura / (fenotipo)

Referencia

WalK E987 Gly 233 Asp Gly 223 Asp (VISA)

1

Howden et al., 2011

P1108 Leu 14 Ile Leu 14 Phe (VISA) Howden et al.,

2011

RpoB E987 His 481 Asn His 481 Asn (hVISA/VISA)

His 481 Phe (Mu50)

Hafer et al., 2011; Hiramatsu et al.,

2014b; Howden et al., 2011

TcaA E987, P1108

P1209 Leu 218 Pro Leu 218 Pro (hVISA)

Yoo et al., 2013; Bakthavatchalam

et al., 2017

Atl E987, P1108

P1209 Tyr 814 His -- --

Códigos de aminoácidos de tres letras. Gly: glicina, Asp: aspartato, Leu: leucina, Ile: isoleucina, Phe:

fenilalanina, His: histidina, Asn: asparagina, Pro: prolina, Tyr: tirosina.

Secuencias conservadas en otras proteínas

Por el contrario, los tres aislamientos hVISA presentan las secuencias de aminoácidos

conservadas en VraS, VraR, GraS, GraR, WalR, no presentaron cambios de residuos de

aminoácidos frente a la secuencia de aminoácidos de la cepa sensible N315 o de las

cepas Mu3, Mu50, luego de realizar los alineamientos con proteínas predichas de

genomas de los aislamientos de referencia (anexo A).

Page 82: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

64 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

4.4.4 Resumen de análisis adicionales a los objetivos planteados

De acuerdo a los análisis de las secuencias del genoma de los tres aislamientos hVISA,

estos fueron categorizados en el complejo clonal CC5, dado que las dos secuencias tipo

encontradas (ST5 y ST228) pertenecen a este complejo (Monecke et al., 2011). De otro

lado, los tres aislamientos fueron PVL negativos. La siguiente tabla 4-8 resume, los

principales hallazgos moleculares de los tres aislamientos.

Tabla 4-9 Principales hallazgos a nivel de análisis de genoma de los aislamientos hVISA

hVISA País SCCmec PVL Tipo de

spa Tipo agr

MLST

Sustituciones en

secuencia de aminoácidos

Aminoácido cambiado*

E987 Ecuador I Neg. t001 II ST-228 WalK G233D

TcaA L218P

RpoB H481N

P1108 Perú I Neg. t149 II ST-5 WalK L14I

Atl Y814H

TcaA L218P

P1209 Perú I Neg. - II ST-5 Atl Y814H

TcaA L218P

Sustituciones de un residuo de aminoácido, identificados en proteínas relacionadas previamente al fenotipo

hVISA/VISA; Neg.: negativo

Page 83: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 65

5. Capítulo 5. Discusión

El Staphylococcus aureus es un microorganismo muy exitoso porque puede actuar como

comensal o patógeno, debido a que se adapta fácilmente a las presiones selectivas que

se le imponen (Malachowa & DeLeo, 2010); S. aureus es un comensal, hace parte de la

microbiota normal de piel y mucosas, y puede encontrarse también en las fosas nasales,

piel axilas, perineo y faringe (Lin et al., 2016), es uno de los principales patógenos

nosocomiales y adquiridos en la comunidad (Zhang et al., 2015).

Se estima que entre 20 y 30% de la población general, es portadora sana de S. aureus

(Gosbell & Van Hal, 2013), lo cual se ha asociado a mayor riesgo de infecciones por este

microorganismo; por ejemplo, la colonización nasal se ha relacionado a mayor riesgo de

bacteriemia nosocomial, que aumenta en 3 y 19 veces, en portadores nasales de MSSA

y MRSA respectivamente (Marzec & Bessesen, 2016).

Con el paso del tiempo S. aureus, ha adquirido resistencia a diferentes tipos de

antibióticos, sin embargo, la resistencia a meticilina y a vancomicina (VRSA, VISA,

hVISA) son las más notables (Hiramatsu et al., 2014b). Tanta es su importancia, que la

Organización Mundial de la Salud lo incluye en la primera lista de 12 familias de

patógenos prioritarios para investigación y desarrollo de nuevos antibióticos publicada en

2017, ubicándolo en el nivel “prioridad 2- elevada” (World Health Organization, 2017).

El problema de la resistencia antimicrobiana en los aislamientos de MRSA-HA está

acompañado de alta morbilidad y mortalidad (Ragbetli, Parlak, Bayram, Guducuoglu, &

Ceylan, 2016). El CDC desarrolló una vigilancia entre 2009 y 2010, evaluando patógenos

resistentes a antimicrobianos en infecciones asociadas al cuidado de la salud,

encontrando que S. aureus fue el patógeno más prevalente en neumonías asociadas al

ventilador e infecciones de sitio quirúrgico (24,1% y 30,4% respectivamente) (Sievert et

al., 2013).

Page 84: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

66 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Un estudio colaborativo internacional de endocarditis infecciosa (EI), realizado en 58

hospitales de 25 países (América del Norte, América del Sur, Europa y otros países), con

una muestra de 2.781 pacientes, encontró S. aureus en 31% de las infecciones (Murdoch

et al., 2009). Otro estudio, realizado en EEUU, entre 1998 y 2009, halló que S. aureus es

el agente infeccioso más prevalente en EI, pasando de 37,6% a 49,3% entre 1998 y

2009, 53,3% de estas infecciones fueron caudas por MRSA (Bor, Woolhandler, Nardin,

Brusch, & Himmelstein, 2013).

La primera opción para tratar infecciones invasivas con MRSA es la vancomicina (Diaz et

al., 2017) y sigue siendo el antibiótico de elección para tratamiento de pacientes con

bacteriemias por MRSA y endocarditis en aislamientos con MIC ≤2 µg/mL (Choo &

Chambers, 2016); sin embargo, en los últimos 20 años, han aparecido reportes de

aislamientos con reducida susceptibilidad a la vancomicina, e incluso de resistencia a la

misma (Hiramatsu et al., 1997a; Hiramatsu et al., 1997b).

Desde el primer reporte de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina

hVISA/VISA (en 1996), este tipo de cepas han sido recuperadas de diversas patologías

infecciosas como endocarditis, bacteriemias, neumonías, entre otras (Bae et al., 2009;

Chen et al., 2013; Chung et al., 2012; Da Costa et al., 2016; Howden, Johnson, Ward,

Stinear, & Davies, 2006); estudios recientes no evidencian aumento en la mortalidad en

pacientes infectados con VISA/hVISA; sin embargo, sí se observa que la infección con

este, lleva a fallas en el tratamiento con vancomicina generando tiempos de infección,

tratamiento y hospitalización más largos (Burnham, Burnham, Warren, & Kollef, 2016;

Chong et al., 2015; Howden et al., 2014)

En América Latina también se han reportado investigaciones, en particular el estudio

multicéntrico del área Andina, que detectó nueve aislamientos probables hVISA/VISA

(Reyes et al., 2009), sobre el cual se desarrolló el presente trabajo que efectuó

confirmación de fenotipo hVISA/VISA en los aislamientos mencionados, que procedían

de Colombia, Ecuador y Perú (mediante PAP-AUC) y a su vez se realizó tipificación

molecular de aquellos aislamientos que resultaron confirmados como hVISA.

La prevalencia general de hVISA en el presente estudio fue de 0,52% en aislamientos

MRSA de tres países de la región, 1,15% para Ecuador y 1,13% en Perú; es importante

Page 85: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 67

mencionar que una investigación realizada en un hospital de Lima Perú en 2008,

relacionaba que no había riesgo de aparición de cepas se S. aureus resistentes a

vancomicina, para ese momento (Alvarado-Gamarra, Alcalá-Marcos, Alvarado-Gamarra,

& Champi Merino, 2011).

Estos hallazgos son similares a los reportados en países de Norteamérica, como México

que reportó un caso (Delgado et al., 2007), y en Sur América en Chile (Vega et al., 2015)

y Argentina en donde se reportaron cuatro aislamientos provenientes de dos estudios,

uno de los cuales relaciona una prevalencia de 3,3% de hVISA (Di Gregorio et al., 2015;

Sola et al., 2011); sin embargo, nuestros hallazgos son inferiores a los reportados en

Brasil, en donde identificaron y confirmaron 12 hVISA que fueron descritos en el sur del

país (Silveira, Cunha, Caierao, Cordova, & d'Azevedo, 2015) y en un estudio más

reciente, realizado en pacientes con bacteriemias, se halló un aislamiento hVISA

confirmado por PAP-AUC y seis aislamientos VISA confirmados mediante microdilución

en caldo con una MIC de 4 µg/mL (Da Costa et al., 2016).

La prevalencia de hVISA a nivel mundial es heterogénea, un estudio realizado en EEUU

muestra el ascenso pasando de 2,2 a 8,3% entre 1986 y 2007 (Rybak et al., 2008); en

Corea se referencia una prevalencia de hasta 38% (Chong et al., 2015; Park et al., 2012),

en Japón varía entre 0 y 6,51% (Hanaki et al., 2014; Ike et al., 2001), en Europa hay

reportes que oscilan entre 0% a 18% (Aucken et al., 2000; Lewis, Chaudhry, Nightingale,

Lambert, & Das, 2011); un estudio realizado entre 1996 y 2008 en Australia, encontró

11,8% de hVISA y otro realizado en 2005 halló 47,9% de hVISA (Horne et al., 2009; Van

Hal, Jones, Gosbell, & Paterson, 2011); estos reportes dan cuenta de lo heterogénea que

es la prevalencia de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina en

diferentes áreas del mundo y que ha tendido al ascenso en algunos países; la

heterogeneidad en estas cifras podría estar relacionada con la dificultad para la detección

de estos aislamientos con las pruebas de tamizaje utilizadas en la rutina clínica y con las

diferentes técnicas que se han utilizado para su confirmación a lo largo del tiempo, así

como el hecho de que la técnica estándar de oro para confirmación de estos fenotipos

(hVISA/VISA) el PAP-AUC es demasiado dispendiosa, requiere una inversión importante

de tiempo y recursos económicos, lo que hace que no sea aplicable en el quehacer diario

de los laboratorios clínicos. Estos hechos anteriormente mencionados, podrían generar

Page 86: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

68 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

en países en desarrollo como el nuestro, pudieran presentarse aislamientos hVISA no

detectados con las pruebas de laboratorio utilizadas convencionalmente, sin embargo,

esto es sólo una hipótesis.

Por otra parte, de los nueve MRSA caracterizados previamente como probables VISA

(Reyes et al., 2009), solamente tres presentaron el fenotipo hVISA, luego de ser

confirmados mediante PAP-AUC en el presente trabajo, dato similar a lo reportado en

otro estudio en donde aproximadamente una tercera parte de los aislamientos

previamente caracterizados por otras técnicas de cribado, fueron confirmados como

hVISA mediante PAP-AUC (Pitz et al., 2011).

Dado que las muestras de los tres aislamientos hVISA, fueron colectadas en un estudio

multicéntrico colaborativo latinoamericano, no tenemos trazabilidad de algunos aspectos

del tratamiento clínico, presencia de infecciones a repetición o tratamiento antibiótico

prolongado que hubiese hecho surgir este fenotipo; sin embargo, sabemos que el

aislamiento de Ecuador procedía de una muestra de sangre y los dos hVISA de Perú

fueron colectados uno de una herida quirúrgica y otro de aspirado bronquial; aunque no

hay muchos estudios que evalúen hVISA de acuerdo a tipo de muestra colectada, una

revisión sistemática halló 9,81% de hVISA recuperados de sangre, cifra

significativamente más alta comparada con los otros tipos de muestras clínicas, de

acuerdo a lo que describen los autores (Zhang et al., 2015).

La ausencia de aislamientos hVISA en Colombia, es coherente con datos de vigilancia

rutinaria publicados por el Grupo para el Control de la Resistencia Antimicrobiana en

Bogotá (GREBO), en donde relacionan que no hay resistencia a vancomicina, a pesar de

que las cifras de MRSA no han descendido con un 23,4% y 23,1% en 2013 y 2014

respectivamente (Leal & Ovalle, 2015); lo cual, pudiera deberse a la implementación de

las recomendaciones dadas a nivel local para la contención de MRSA, como son el

aislamiento de contacto de estos pacientes, lavado de manos y uso restringido de

vancomicina (Leal & Ovalle, 2015)

La detección de cepas con bajos niveles de resistencia a vancomicina hVISA/VISA es

compleja, y esto se extrapola a laboratorios clínicos y de referencia, como se observa en

los resultados del programa Latinoamericano de Control de Calidad en Bacteriología y

Page 87: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 69

Resistencia a los Antimicrobianos (LA-EQAS), que incluyó la remisión de un aislamiento

VISA (OPS-165) en uno de sus paneles; en este control de calidad participaron 17

Laboratorios Nacionales de Referencia, que obtuvieron una concordancia en la MIC de

66,7% (Corso et al., 2011), lo que ratifica la dificultad de la detección de hVISA, aun para

laboratorios de referencia nacionales, que supervisan los laboratorios clínicos de su país.

En el presente estudio, los tres aislamientos confirmados como hVISA presentan agr II y

aunque las primeras publicaciones mostraban relación entre este tipo agr y los

aislamientos con reducida susceptibilidad a la vancomicina (Sakoulas et al., 2003),

estudios posteriores han evidenciado la presencia de los otros tipos de agr en

aislamientos hVISA/ VISA (Cazares-Dominguez et al., 2015; Hu et al., 2015a; Maor et al.,

2009). Hay que mencionar además que agr controla la virulencia y múltiples vías

metabólicas del estafilococo, algunos estudios relacionan la disfunción en agr con

bacteriemias persistentes, disminución en la actividad bactericida de la vancomicina,

resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina y desarrollo del fenotipo VISA (Hu et

al., 2015a); inclusive se ha sugerido que S. aureus con disfunción en agr pudiera tener

ventajas intrínsecas para sobrevivir bajo presiones selectivas de vancomicina y más aún

si se presentan altas concentraciones de inóculo bacteriano (Tsuji, Harigaya, Lesse,

Sakoulas, & Mylotte, 2009; Tsuji et al., 2007).

La producción δ hemolisina ha sido utilizada para evaluar la expresión o funcionalidad del

operón agr, (dado que el gen estructural que codifica para la δ hemolisina hld, es

regulado por el ARNIII) (Burnside et al., 2010; Traber et al., 2008), para lo cual se han

utilizado diferentes técnicas (Cafiso et al., 2012b; Harigaya, Ngo, Lesse, Huang, & Tsuji,

2011; Sakoulas et al., 2002); en nuestro estudio, dos de los aislamientos hVISA (E987 y

P1209) evidencian una reducción en la producción de δ hemolisina, (lo que pudiera

sugerir una reducida expresión de agr), mientras que el aislamiento P1108 mostró

producción de δ hemolisina, lo que podría indicar una expresión normal de agr, sin

embargo esta es una prueba que ha sido descrita en literatura, pero que es cualitativa y

que por el momento no permite concluir sobre la funcionalidad de expresión de agr, con

estos datos solamente. Sin embargo, actualmente se han desarrollado otro tipo de

técnicas para evaluar la expresión de agr, que no estaban planteadas en el presente

estudio y que a futuro podrían aplicarse a estos aislamientos para poder cuantificar dicha

Page 88: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

70 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

expresión, entre ellas la RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) (Dai et al., 2017; Thanert et al.,

2017).

Estos hallazgos son similares a los reportados por Harigaya et al. (2011), quienes

hallaron arg disfuncional en 58% de los aislamientos hVISA, cifra significativa comparada

con los resultados de VSSA evaluados en dicho estudio (Harigaya et al., 2011).

Sin embargo, el mecanismo de reducida expresión de agr en aislamientos VISA es

desconocido, dado que muchas de estas cepas, no tienen mutaciones en agr que

expliquen la disminución en su expresión (Howden et al., 2014). En el presente estudio,

solo se realizó una prueba cualitativa sencilla para evaluar la expresión de δ hemolisina;

sin embargo, no se evaluó molecularmente dicha expresión o con otro tipo de técnica

fenotípica.

Los tres hVISA del presente trabajo pertenecen al complejo clonal 5 (CC5), los dos

aislamientos peruanos (P1108 y P1209) presentan SCCmec I, ST5, agr II, (P1108

presentó spa t149); estos hallazgos son coherentes con lo reportado en otros estudios;

en Perú entre 2008 y 2009, García et al. (2012), hallaron 81% de MRSA que pertenecían

al CC5 y 68,8% tenían SCCmec I y spa t149 (aislamientos de sangre), evidenciando la

circulación del clon chileno/cordobés en este país (Garcia et al., 2012); en este mismo

sentido, este autor realizó un estudio posterior en Lima (entre 2009-2010) en portadores

nasales asociados al cuidado de la salud y pacientes con bacteriemia, obteniendo

resultados similares, los genotipos más frecuentemente detectados fueron cepas multi-

resistentes con SCCmec I, spa t149 y otro grupo con SCCmec que no fue posible

tipificar, ST72, spa148 (García et al., 2016); así mismo, estos hallazgos coinciden con lo

descrito por nuestro grupo, que da cuenta de la circulación de aislamientos MRSA-AH en

Perú (Reyes et al., 2009). Es importante resaltar que la caracterización genómica del

aislamiento P1108 es similar a lo descrito por Di Gregorio et al. (2015) para uno de los

aislamientos hVISA reportados en Argentina (Di Gregorio et al., 2015), lo que da cuenta

de la circulación en la región de aislamientos de este grupo clonal. Por otro lado, el tipo

spa en P1209 no pudo ser determinado debido a que la secuencia de nucleótidos no

contaba con el gen spa.

El aislamiento ecuatoriano E987 presentó una ST228, SCCmec I, agr II, spa t001; el

MRSA-I ST228 se ha denominado clon epidémico del Sur de Alemania o clon italiano, es

Page 89: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 71

un MRSA nosocomial, descrito como prevalente en países de Europa central (Alemania,

Italia, Hungría, Eslovenia, Austria y Suiza,) e incluso ha sido asociado a brotes (Cafiso et

al., 2012; Campanile et al., 2012; Francois et al., 2008; Layer, Ghebremedhin, Konig, &

Konig, 2006; Mato et al., 2004); La característica nosocomial de dicho aislamiento

contrasta con publicaciones previas: la primera halló que 74% de los MRSA de Ecuador

estaban relacionados con MRSA-AC USA300 (específicamente la variante

Latinoamericana USA300-LV) y 4% con el clon Brasil MRSA-AH, que fueron los clones

predominantes descritos en Ecuador (Planet et al., 2015; Reyes et al., 2009). Sin

embargo, un estudio realizado en Quito entre 2005 y 2013, identificó que los S. aureus

circulantes en dicho país, pertenecían en un 41,6% a la ST8, SCCmec IV (excepto uno

que no tuvo el mismo SCCmec), 7,5% fueron ST239, SCCmec III, (relacionados con el

clon Brasil), y 7,5% fueron ST5 (Zurita, Barba, Ortega-Paredes, Mora, & Rivadeneira,

2016); es importante subrayar que entre las 18 ST reportadas, ninguna corresponde a la

ST228 hallada en nuestro estudio, lo que puede indicar que este es el primer reporte de

esta secuencia tipo en Ecuador.

Las pruebas PFGE y MLST utilizadas inicialmente para evaluar clonalidad de cepas con

reducida susceptibilidad a vancomicina, demuestran que los aislamientos VISA no son

clonales, lo cual es coherente en los resultados del presente trabajo, que evidencian que

los tres aislamientos hVISA no son clonales.

De acuerdo a Howden et al. (2014) “Algunos reportes de hVISA y VISA refieren con más

frecuencia aislamientos de los complejos clonales 5 u 8, en particular ST5 (CC5) y ST239

(CC8), reflejando el éxito de la adaptación de los clones de MRSA hospitalarios” (Hafer et

al., 2012; Howden et al., 2014) y que coincide con lo hallado en nuestros tres hVISA que

pertenecen al CC5.

En el mismo sentido, a pesar de que los dos aislamientos procedentes de Colombia

resultaron VSSA, uno de ellos presentó relación con el clon chileno/cordobés y el otro

C329, no presentó relación clonal con ninguno de los controles utilizados; en este sentido

coincidiría con uno de los clones reportados en los últimos veinte años en Colombia: el

clon chileno/cordobés que fue reportado entre 2001 y 2003, (Cruz et al., 2005),

remplazando al clon pediátrico que circulo inicialmente (entre 1996 y 1998) (Gomes,

Page 90: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

72 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

Sanches, Aires de Sousa, Castaneda, & de Lencastre, 2001), y más recientemente se

describió relación entre aislamientos colectados en Colombia con el clon relacionado con

la comunidad USA300 y USA300- LV (Alvarez et al., 2009; Planet et al., 2015; Reyes et

al., 2009), incluso se han reportado aislamientos SASM relacionados con el clon USA300

(Escobar-Perez et al., 2014).

Los análisis de resistoma de los tres aislamientos hVISA muestran la presencia de genes

de resistencia a aminoglicósidos (aac(6´), aph(2´´), aph(3´´), aph(3´III), spc, ant(6)-la),

macrólidos (ermA) y fluoroquinolonas (norA) evidenciando que son multirresistentes a

antibióticos, lo que es coherente con los resultados en las MIC (resistentes a oxacilina,

eritromicina, clindamicina, ciprofloxacina, gentamicina) que se obtuvieron previamente

por nuestro grupo (UGRA); estos perfiles de resistencia a antibióticos, son similares a los

descritos para otros aislamientos ST5, t149 procedentes de Perú, que también resultaron

multirresistentes (García et al., 2016).

Se ha descrito también, por ejemplo que la inhibición de VraSR (un modulador de

síntesis de pared celular, identificado inicialmente como un factor que afecta la

resistencia bacteriana a vancomicina), puede conducir a la disminución de la resistencia

a inhibidores pared celular como betalactámicos, vancomicina, teicoplanina, y fosfomicina

(Gardete, Wu, Gill, & Tomasz, 2006; Yoshida et al., 2011). Gardete et al. (2006)

evidenciaron que la inactivación de vraS bloquea esta respuesta transcripcional y puede

generar reducción en los niveles de resistencia a antibióticos betalactámicos y a

vancomicina.

Inclusive existen reportes en S. aureus que vinculan el fenotipo VISA y la no

susceptibilidad a daptomicina, que es otro antibiótico activo en la superficie, con diferente

mecanismo de acción (Howden et al., 2011).

La secuencia de ADN de los tres aislamientos del presente estudio reveló puntos de

mutaciones correspondientes a cambios de residuos de aminoácidos en walK (E987 y

P1108), rpoB (E987), tcaA (en los tres aislamientos), atl (sólo en P1108, P1209). Cada

aislamiento, presentó por lo menos dos sustituciones de residuos de aminoácidos que

correspondían a proteínas que previamente habían sido relacionados a aislamientos

hVISA/VISA.

Page 91: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 73

El operón walKR es un sistema importante en el metabolismo de pared celular, en el

aislamiento E987 se halló la sustitución de un residuo de aminoácido G233D en WalK

(codifica para el sensor histidina kinasa), este cambio de residuo de aminoácido es

diferente al encontrado en la cepa de referencia sensible N315, pero todos los

aislamientos incluido N315, E987 y las otras cepas de referencia VISA y hVISA

presentaron la secuencia consenso en ese residuo de aminoácido; una sustitución de los

mismos residuos de aminoácidos, en una posición cercana fue descrita previamente en

WalK (G223D) en un aislamiento de Nueva Zelanda y de la cual se confirmó que puede

generar el paso de fenotipo VSSA a VISA (Howden et al., 2011). Otro estudio en el que

se realizó secuenciación del genoma completo a aislamientos VISA, derivados de

aislamientos VSSA expuestos a concentraciones ascendentes de VAN, postula que el

cambio en el residuo de aminoácido G223D disminuye la autofosforilación de WalK,

reduciendo la fosforilación del regulador de respuesta WalR, lo que genera disminución

en la capacidad de unión de WalR al promotor atlA; esta reducción en la fosforilación

ocasiona disminución en la expresión de genes asociados al metabolismo de pared

celular, disminución de la actividad autolítica, engrosamiento de la pared celular y

reducción de la susceptibilidad a vancomicina (Hu, Zhang, Liu, Chen, & Sun, 2015b).

Si bien la sustitución en el residuo de aminoácido hallada en E987 (G233D) y la

sustitución en G223D, no están exactamente en la misma posición, si están muy cerca, a

10 aminoácidos de diferencia y, ambas están ubicadas en el dominio altamente

conservado HAMP del sensor proteína kinasa WalK, el cual conecta el dominio sensor

extracelular con el dominio de señalización intracelular, por lo cual Hu et al. (2015)

plantean como hipótesis que “la sustitución en G223D causa un cambio funcional en el

dominio HAMP que afecta la actividad kinasa de WalK” (Hu et al., 2015b). Teniendo en

cuenta lo anterior y el hecho de que en ambos aislamientos se produjo la misma

sustitución por el mismo aminoácido, queda la incógnita sobre ¿qué impacto puede tener

la sustitución del residuo de aminoácido hallada en el presente trabajo y si esta tenga un

efecto similar en WalK al que produce la sustitución en G223D?, que ha sido estudiada

con mayor detalle, sin embargo, este tema pudiera estudiarse más a fondo en un estudio

posterior.

Page 92: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

74 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

El aislamiento hVISA de Perú (P1108), presenta la sustitución en el residuo de

aminoácido L14I, produciendo el cambio de una leucina por isoleucina, y este es

diferente al aminoácido que tiene en esta posición el aislamiento N315 (sensible); es

importante mencionar que un estudio previo, describió la sustitución del residuo de

aminoácido L14F (sustitución en la misma posición que la hallada en P1108) que genera

el cambio de leucina por fenilalanina y que había sido relacionada a aislamientos con el

fenotipo VISA (Howden et al., 2011).

Por otro lado, McEvoy et al. (2013) demostraron que la inserción de IS256 en walKR,

puede jugar un rol importante en la aparición del fenotipo VISA, mediante la reducción de

la expresión en WalKR. Más recientemente, otros investigadores describieron un papel

importante de las proteínas YycH and YycI en la generación del fenotipo de reducida

susceptibilidad a vancomicina, ya sea por mutaciones en yycH que impactan en la

interacción con walK, y deleción en yycH/yycI, que genera reducción en la expresión de

genes bajo su control, indicando un papel positivo de las proteínas YycHI en la regulación

de WalKR en S. aureus (Cameron, Jiang, Kostoulias, Foxwell, & Peleg, 2016).

Otros estudios han descrito diferentes mutaciones en walK, Shoji et al. (2011) hallaron

61,5% de aislamientos VISA con mutaciones en walK, así mismo Hiramatsu et al.

(2014b) describen 54,5% de mutaciones en walK en 33 aislamientos VISA evaluados.

Teniendo en cuenta los estudios anteriores, se observa la importancia de mutaciones en

el TCS WalKR, que pueden aportar para generar el fenotipo VISA/hVISA y que pudiera

ser uno de los factores que impacto en la producción del fenotipo hVISA en el aislamiento

E987.

Este mismo aislamiento E987, (hVISA de Ecuador), presentó una sustitución en un

residuo de aminoácido en RpoB, generando cambio de una histidina por una asparagina

en la posición 481 (H481N), aminoácido diferente al que se observa en el aislamiento

sensible a VAN N315; hay que mencionar, además que el gen rpoB codifica para la

subunidad β de la ARN polimerasa. Es importante resaltar, que la misma sustitución de

H481N había sido relacionada previamente, por Hafer et al. (2012) en una cepa hVISA

procedente de EEUU, que además presentaba resistencia a rifampicina (Hafer et al.,

2012); así mismo, Hiramatsu et al. (2014b) reportaron esta misma sustitución en

aislamientos VISA de Tailandia (Hiramatsu et al., 2014b); en este mismo sentido, se

Page 93: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 75

describió una mutación en la misma posición, pero con cambio por otro aminoácido

(polar) H481Y (histidina 481 tirosina) en el aislamiento VISA Mu50 (Katayama et al.,

2016), mutación que ha sido relacionada a la resistencia rifampicina en S. aureus (Aubry-

Damon et al., 1998). Incluso, un estudio reciente da cuenta de un aislamiento de MRSA

que luego de tratamiento con teicoplanina, presentó reducida susceptibilidad a

vancomicina, resistencia a daptomicina, y que también presenta la misma sustitución de

aminoácidos H481Y (Capone et al., 2016). En el gen rpoB se han reportado otras

mutaciones, con sustitución de aminoácidos, asociadas al fenotipo hVISA/VISA (Chen, et

al., 2014), que no fueron halladas en ninguno de los aislamientos hVISA del presente

estudio; dada la importancia que tiene rpoB, Hiramatsu et al. (2014b) plantean que

mutaciones en este, podrían generar cambios drásticos en el perfil transcripcional, y

consideran que esta pudiera considerarse una “mutación reguladora” (Hiramatsu et al.,

2014b).

En los tres aislamientos hVISA (E987, P1108, P1109) se halló la sustitución del residuo

de aminoácido L218P (cambio de leucina por prolina) en TcaA, si bien es diferente al

residuo de aminoácido de la cepa sensible N315; esta misma sustitución fue reportada

en aislamientos VISA de Corea (Yoo et al., 2013) y también fue descrita recientemente

en aislamientos hVISA de la India (Bakthavatchalam et al., 2017). Existen estudios que

identificaron al gen tcaA del operón tcaRAB, como clave para el cambio en los niveles de

resistencia a glicopéptidos (Maki et al., 2004), lo cual coincide con nuestros hallazgos,

dado que los tres aislamientos hVISA presentan la misma sustitución de aminoácidos en

TcaA; también se ha descrito que la deleción o alteración de tcaA en aislamientos in vitro

causa un incremento de dos a cuatro veces en la MIC de teicoplanina (Chen et al., 2016).

En los dos aislamientos de Perú, se halló la sustitución en el residuo de aminoácido

Y814H en Atl (hidrolasa de peptidoglicano) generando cambio de una tirosina por

histidina (en este caso N315, Mu3, Mu50 y E987 presentaron la secuencia consenso); si

bien, no se halló información de esta misma mutación o similares, Wootton et al. (2005)

habían descrito disminución de la expresión de alt, en los aislamientos hVISA y en la

mayoría de los aislamientos VISA, cuando se comparaban con los VSSA evaluados en

dicho estudio; sin embargo, Capone et al. (2016) referencian no haber encontrado

cambios de expresión en alt en dos cepas evaluadas, una hVISA y otra VISA. No

Page 94: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

76 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en

Suramérica

obstante, el hecho de que atl sea una de las dos autolisinas más importantes en S.

aureus, y que una de las hipótesis de resistencia en este fenotipo es el engrosamiento de

la pared y disminución de la actividad autolítica de S. aureus (Hiramatsu et al., 2014),

podría generar la hipótesis de que este cambio en el residuo de aminoácido aportó, junto

a las demás sustituciones, para la generación del fenotipo hVISA de estos aislamientos.

Hafer et al. (2012) postulan que dependiendo del origen clonal del aislamiento

hVISA/VISA, los polimorfismos parecen acumularse principalmente en vraR y vraS para

la secuencia tipo 8 (ST8) y en walK y walR para los aislamientos ST5 (Hafer et al., 2012);

en el presente estudio, los tres aislamientos presentaron mutaciones en walK, dos de

ellos pertenecen al ST5 y el otro es ST228. Otras mutaciones en genes o sistemas de

dos o tres componentes vraSR, graRS, yvqF, tcaB, dlt, entre otras han sido asociadas a

hVISA/VISA (Cui et al., 2010; Katayama et al., 2016; Matsuo, Hishinuma, Katayama, &

Hiramatsu, 2015; Shoji et al., 2011), pero no fueron encontradas en los aislamientos del

presente trabajo.

En este sentido, Neoh et al. (2008) compararon los genomas secuenciados de los

aislamientos N315 (aislamiento sensible a vancomicina), Mu3 y Mu50, encontrando 16

SNP en algunos genes. Incluso Hiramastu et al. (2014b) plantean que las mutaciones en

rpoB, walKR y vraUTSR, pudieran considerarse “el primer paso de las mutaciones para

pasar de VSSA hacia el fenotipo VISA”. En contraste Yoo et al. (2013) reportaron 87

aislamientos VISA con 31 patrones de mutación, pero también reporta siete aislamientos

VISA que no evidencian cambios en ninguno de los genes secuenciados (orf1, vraSR,

graSR, yvqF y tcaRAB).

Si bien, a la fecha no se ha sido elucidado completamente el mecanismo de bajos niveles

de resistencia a vancomicina, si se han descrito que múltiples mutaciones están

involucradas en la evolución de este, así como una serie de cambios metabólicos, entre

ellos el engrosamiento de la pared celular, disminución en el entrecruzamiento del PGN,

baja actividad autolítica, crecimiento lento, disminución de la actividad catalítica y

disminución de la virulencia (Howden et al., 2014;Hu, Peng & Rao, 2016; Munita & Arias,

2016).

Page 95: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Capítulo 5 77

En este mismo sentido, las mutaciones encontradas en los tres aislamientos hVISA, con

coherentes con genes o sistemas de dos componentes que se han relacionado en la

literatura con el fenotipo hVISA/VISA y de las cuales se menciona que el acumular

mutaciones (con sustituciones de residuos de aminoácidos), impacta para que los

aislamientos pasen del fenotipo VSSA a VISA.

Los hallazgos del presente estudio sugieren que la presencia de sustituciones de

residuos de aminoácidos en proteínas descritas anteriormente: WalK, RpoB, Atl y TcaA,

que pueden ser uno de los factores involucrados en la adquisición de bajos niveles de

resistencia a vancomicina, hallazgos que han sido descritos previamente; este es el

primer estudio que confirma presencia de aislamientos hVISA en Ecuador y Perú, con la

respectiva tipificación molecular de los mismos.

En este mismo sentido y tenido en cuenta la dificultad que se presenta para confirmar

fenotípicamente los S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina

(hVISA), las herramientas de secuenciación completa del genoma son una valiosa

alternativa que aporta datos detallados, a fin de caracterizar microorganismos en

diversos niveles, como comparación de secuencias de genes y de proteínas predichas,

detección de genes que confieren resistencia a antibióticos, y otros análisis

bioinformáticos que pueden desarrollarse a fin de caracterizar aislamientos, que

presentan grandes desafíos para su confirmación fenotípica, como es el caso de los tres

aislamientos estudiados en la presente tesis.

Page 96: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus
Page 97: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Conclusiones y recomendaciones 79

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

En el presente estudio se confirmó la presencia de tres aislamientos hVISA

mediante la técnica estándar de oro PAP-AUC, uno de Ecuador y dos de

Perú, no se detectaron este tipo de aislamientos en Colombia.

Mediante el uso de PFGE se halló relación de ocho de los aislamientos

(incluidos los tres hVISA) con el clon chileno/cordobés, lo cual concuerda con

lo reportado en la literatura para el clon circulante en Perú; por otro lado, si

bien este clon circuló hace unos años en Colombia, el clon que circula

actualmente en nuestro país es el clon USA300.

Los tres aislamientos hVISA pertenecen al complejo clonal 5, los dos

aislamientos peruanos son ST5 y el aislamiento ecuatoriano presenta ST228,

todos relacionados a MRSA-AH.

La caracterización genómica de los aislamientos hVISA, evidenció la

presencia de sustituciones de un sólo aminoácido, en proteínas, reportadas

en la literatura, relacionadas a aislamientos con reducida susceptibilidad a

vancomicina.

Este es el primer estudio en aislamientos de la región andina, que realizó

confirmación del fenotipo hVISA y caracterización genómica de cepas

procedentes de tres países de la región.

Page 98: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

80 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

6.2 Recomendaciones

Teniendo en cuenta que en la presente investigación no se hallaron

aislamientos hVISA en Colombia, se sugiere un nuevo estudio con

aislamientos procedentes de pacientes con infecciones a repetición por S.

aureus, que incluya aislamientos sensibles y resistentes a meticilina, dado que

este fenotipo también ha sido reportado en aislamientos SASM.

Se sugiere realizar difusión de recomendaciones realizadas en Bogotá,

respecto a la restricción del uso de vancomicina, para evitar la aparición de

aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina, a nivel nacional.

Sería ideal un procedimiento menos dispendioso a las PAPs, reportadas por

Hiramatsu y Wooton, para realizar la confirmación del fenotipo hVISA/VISA,

que es extremadamente costoso y dispendioso; se recomienda realizar un

estudio para estandarizar una técnica más accesible para realizar dicha

confirmación fenotípica.

Se sugiere a los entes gubernamentales de los tres países la discusión y

aplicación de normativas o políticas de uso y venta de antibióticos con

requisitos más estrictos, con el fin de disminuir la generación de más

aislamientos multi-resistentes, por exposición innecesaria a antimicrobianos.

Dado que otra de las características de hVISA/VISA es la diminución de la

actividad autolítica, se recomendaría realizar una prueba de actividad

autolítica a los tres aislamientos, para evaluar el comportamiento de estos.

Continuar con la vigilancia epidemiológica de resistencia a antibióticos en S.

aureus.

Se recomienda el uso de la secuenciación de genoma completo para

detección de sustituciones de residuos de aminoácidos asociados a este

fenotipo.

Page 99: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Anexos 81

Anexos

Anexo A. Alineamientos de otras secuencias de aminoácidos conservadas

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos VraS

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos VraR

Page 100: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

82 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos GraS

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos GraR

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos WalR

Page 101: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Anexos 83

Anexo B. Presentaciones en eventos

1. Berrio M, Díaz L, Reyes J, Ardila J, Carvajal LP, Porras P, Rincón S, Ríos R,

Munita J, Arias C. Can Whole Genome Sequencing Identify Heterogeneous

Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) Isolates? American

Society for Microbiology ASM Microbe 2017, Junio 1-5, de 2017. New Orleans

USA. Poster.

Page 102: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

84 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

2. Berrio M, Ardila J, Porras P, Carvajal LP, Rincon S, Ríos R, Reyes J, Munita JM,

Díaz L. Can Whole Genome Sequencing Identify Heterogeneous Vancomycin-

Intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) Isolates? UT Center for

Antimicrobial Resistance and Microbial Genomics (CARMiG) Antibiotic Resistance

Symposium: Novel Frontiers in Antimicrobial Research. January 19-20, 2017.

Houston, TX USA. Poster

Page 103: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Anexos 85

3. Berrio M, Porras P, Rincón S, Ardila J Carvajal L, Rios R, Reyes J, Díaz L, Arias

C. Caracterización genómica de aislamientos de Staphylococcus aureus con

reducida susceptibilidad a la vancomicina (hVISA), en tres aislamientos de la

Región Andina. X Encuentro Nacional de Investigadores en Enfermedades

Infecciosas, Medellín 2016. Infectio. 2016; 20 (S1). Oral.

Page 104: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

86 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

4. Berrio M, Duarte E, Reyes J, Díaz L, Rincón S, Arias C. Caracterización de

fenotipos de resistencia a vancomicina (VISA - hVISA) en aislamientos de

Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina de hospitales en la Región

Andina. VIII Encuentro Nacional de Investigación en Enfermedades Infecciosas,

Armenia 2012. Infectio. 2012; 16(S1). Poster.

Page 105: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 87

7. Bibliografía

Aboshkiwa, M., Rowland, G., & Coleman, G. (1995). Nucleotide sequence of the Staphylococcus aureus RNA polymerase rpoB gene and comparison of its predicted amino acid sequence with those of other bacteria. Biochim Biophys Acta, 1262(1), 73-78.

Adam, H. J., Louie, L., Watt, C., Gravel, D., Bryce, E., Loeb, M., . . . Simor, A. E. (2010). Detection and characterization of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates in Canada: results from the Canadian Nosocomial Infection Surveillance Program, 1995-2006. Antimicrob Agents Chemother, 54(2), 945-949. doi: AAC.01316-09 [pii]10.1128/AAC.01316-09

Adhikari, R. P., Arvidson, S., & Novick, R. P. (2007). A nonsense mutation in agrA accounts for the defect in agr expression and the avirulence of Staphylococcus aureus 8325-4 traP::kan. Infect Immun, 75(9), 4534-4540. doi: 10.1128/IAI.00679-07

Aligholi, M., Emaneini, M., Jabalameli, F., Shahsavan, S., Dabiri, H., & Sedaght, H. (2008). Emergence of high-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus in the Imam Khomeini Hospital in Tehran. Med Princ Pract, 17(5), 432-434. doi: 10.1159/000141513

Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25(17), 3389-3402.

Alvarado-Gamarra, A. G., Alcalá-Marcos, K. M., Alvarado-Gamarra, P. K., & Champi Merino, R. (2011). Riesgo de aparición de cepas Staphylococcus aureus resistente a vancomicina en pacientes hospitalarios de un hospital del Perú, 2008. Ciencia e Investigación Medico Estudiantil Latinoamericana, 15(2).

Álvarez, C. A., Yomayusa, N., Leal, A. L., Moreno, J., Mendez-Álvarez, S., Ibañez, M., & Vanegas, N. (2009). Nosocomial infections caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Colombia. American Journal of Infection Control, 38(4), 315-318. doi: 10.1016/j.ajic.2009.05.013

Page 106: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

88 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Andersson, D. I., & Hughes, D. (2010). Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? Nat Rev Microbiol, 8(4), 260-271. doi: nrmicro2319 [pii]10.1038/nrmicro2319

Appelbaum, P. C. (2007). Reduced glycopeptide susceptibility in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Int J Antimicrob Agents, 30(5), 398-408. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2007.07.011

Arias, C. A. (2000). Molecular Mechanism of Resistance to Vancomycin in Enterococcus gallinarum. (Doctoral), University of Cambridge, England.

Arias, C. A., Reyes, J., Zuniga, M., Cortes, L., Cruz, C., Rico, C. L., & Panesso, D. (2003). Multicentre surveillance of antimicrobial resistance in enterococci and staphylococci from Colombian hospitals, 2001-2002. J Antimicrob Chemother, 51(1), 59-68.

Atilano, M. L., Pereira, P. M., Yates, J., Reed, P., Veiga, H., Pinho, M. G., & Filipe, S. R. (2010). Teichoic acids are temporal and spatial regulators of peptidoglycan cross-linking in Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S A, 107(44), 18991-18996. doi: 10.1073/pnas.1004304107

Aubry-Damon, H., Soussy, C. J., & Courvalin, P. (1998). Characterization of mutations in the rpoB gene that confer rifampin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 42(10), 2590-2594.

Aucken, H. M., Warner, M., Ganner, M., Johnson, A. P., Richardson, J. F., Cookson, B. D., & Livermore, D. M. (2000). Twenty months of screening for glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother, 46(4), 639-640.

Avison, M. B., Bennett, P. M., Howe, R. A., & Walsh, T. R. (2002). Preliminary analysis of the genetic basis for vancomycin resistance in Staphylococcus aureus strain Mu50. J Antimicrob Chemother, 49(2), 255-260.

Azimian, A., Havaei, S. A., Fazeli, H., Naderi, M., Ghazvini, K., Samiee, S. M., . . . Peerayeh, S. N. (2012). Genetic characterization of a vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from the respiratory tract of a patient in a university hospital in northeastern Iran. J Clin Microbiol, 50(11), 3581-3585. doi: 10.1128/JCM.01727-12

Aziz, R. K., Bartels, D., Best, A. A., DeJongh, M., Disz, T., Edwards, R. A., . . . Zagnitko, O. (2008). The RAST Server: Rapid Annotations using Subsystems Technology. BMC Genomics, 9, 75-75. doi: 10.1186/1471-2164-9-75

Bae, I. G., Federspiel, J. J., Miro, J. M., Woods, C. W., Park, L., Rybak, M. J., . . . International Collaboration on Endocarditis-Microbiology, I. (2009). Heterogeneous vancomycin-intermediate susceptibility phenotype in bloodstream methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from an international cohort of patients with infective endocarditis: prevalence, genotype, and clinical significance. J Infect Dis, 200(9), 1355-1366. doi: 10.1086/606027

Page 107: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 89

Bakthavatchalam, Y. D., Veeraraghavan, B., Devanga Ragupathi, N. K., Babu, P., Munuswamy, E., & David, T. (2017). Draft genome sequence of reduced teicoplanin-susceptible and vancomycin-heteroresistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus from sepsis cases. J Glob Antimicrob Resist, 8, 169-171. doi: 10.1016/j.jgar.2016.12.008

Bartels, M. D., Petersen, A., Worning, P., Nielsen, J. B., Larner-Svensson, H., Johansen, H. K., . . . Westh, H. (2014). Comparing whole-genome sequencing with Sanger sequencing for spa typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 52(12), 4305-4308. doi: 10.1128/JCM.01979-14

Binda, E., Marinelli, F., & Marcone, G. L. (2014). Old and New Glycopeptide Antibiotics: Action and Resistance. Antibiotics (Basel), 3(4), 572-594. doi: 10.3390/antibiotics3040572

Bor, D. H., Woolhandler, S., Nardin, R., Brusch, J., & Himmelstein, D. U. (2013). Infective endocarditis in the U.S., 1998-2009: a nationwide study. PLoS One, 8(3), e60033. doi: 10.1371/journal.pone.0060033

Borukhov, S., & Nudler, E. (2003). RNA polymerase holoenzyme: structure, function and biological implications. Curr Opin Microbiol, 6(2), 93-100.

Brandenberger, M., Tschierske, M., Giachino, P., Wada, A., & Berger-Bachi, B. (2000). Inactivation of a novel three-cistronic operon tcaR-tcaA-tcaB increases teicoplanin resistance in Staphylococcus aureus. Biochim Biophys Acta, 1523(2-3), 135-139.

Burnham, C. A., Weber, C. J., & Dunne, W. M., Jr. (2010). Novel screening agar for detection of vancomycin-nonsusceptible Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 48(3), 949-951. doi: 10.1128/JCM.02295-09

Burnham, J. P., Burnham, C. A., Warren, D. K., & Kollef, M. H. (2016). Impact of Time to Appropriate Therapy on Mortality in Patients with Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Infection. Antimicrob Agents Chemother, 60(9), 5546-5553. doi: 10.1128/AAC.00925-16

Burnside, K., Lembo, A., de Los Reyes, M., Iliuk, A., Binhtran, N. T., Connelly, J. E., . . . Rajagopal, L. (2010). Regulation of hemolysin expression and virulence of Staphylococcus aureus by a serine/threonine kinase and phosphatase. PLoS One, 5(6), e11071. doi: 10.1371/journal.pone.0011071

Cafiso, V., Bertuccio, T., Spina, D., Purrello, S., Campanile, F., Di Pietro, C., . . . Stefani, S. (2012a). Modulating activity of vancomycin and daptomycin on the expression of autolysis cell-wall turnover and membrane charge genes in hVISA and VISA strains. PLoS One, 7(1), e29573. doi: 10.1371/journal.pone.0029573

Cafiso, V., Bertuccio, T., Spina, D., Purrello, S., Blandino, G., & Stefani, S. (2012b). A novel delta-hemolysis screening method for detecting heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus and vancomycin-intermediate S. aureus. J Clin Microbiol, 50(5), 1742-1744. doi: 10.1128/JCM.06307-11

Cameron, D. R., Jiang, J. H., Kostoulias, X., Foxwell, D. J., & Peleg, A. Y. (2016). Vancomycin susceptibility in methicillin-resistant Staphylococcus aureus is

Page 108: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

90 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

mediated by YycHI activation of the WalRK essential two-component regulatory system. Sci Rep, 6, 30823. doi: 10.1038/srep30823

Cameron, D. R., Ward, D. V., Kostoulias, X., Howden, B. P., Moellering, R. C., Jr., Eliopoulos, G. M., & Peleg, A. Y. (2012). Serine/threonine phosphatase Stp1 contributes to reduced susceptibility to vancomycin and virulence in Staphylococcus aureus. J Infect Dis, 205(11), 1677-1687. doi: 10.1093/infdis/jis252

Campanile, F., Borbone, S., Perez, M., Bongiorno, D., Cafiso, V., Bertuccio, T., . . . Stefani, S. (2010). Heteroresistance to glycopeptides in Italian meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates. Int J Antimicrob Agents, 36(5), 415-419. doi: S0924-8579(10)00305-5 [pii]10.1016/j.ijantimicag.2010.06.044

Campanile, F., Bongiorno, D., Falcone, M., Vailati, F., Pasticci, M. B., Perez, M., . . . Stefani, S. (2012). Changing Italian nosocomial-community trends and heteroresistance in Staphylococcus aureus from bacteremia and endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 31(5), 739-745. doi: 10.1007/s10096-011-1367-y

Canton, R., Mir, N., Martinez-Ferrer, M., Sanchez del Saz, B., Soler, I., & Baquero, F. (1999). [Prospective study of Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to glycopeptides]. Rev Esp Quimioter, 12(1), 48-53.

Capone, A., Cafiso, V., Campanile, F., Parisi, G., Mariani, B., Petrosillo, N., & Stefani, S. (2016). In vivo development of daptomycin resistance in vancomycin-susceptible methicillin-resistant Staphylococcus aureus severe infections previously treated with glycopeptides. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 35(4), 625-631. doi: 10.1007/s10096-016-2581-4

Casapao, A. M., Leonard, S. N., Davis, S. L., Lodise, T. P., Patel, N., Goff, D. A., . . . Rybak, M. J. (2013). Clinical outcomes in patients with heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) bloodstream infection. Antimicrob Agents Chemother. doi: AAC.00380-13 [pii]10.1128/AAC.00380-13

Castellano, M. J., & Perozo-Mena, A. J. (2010). Mecanismos de resistencia a Glicopéptidos en Staphylococcus aureus. Kasmera, 38(1), 36 - 44.

Cazares-Dominguez, V., Cruz-Cordova, A., Ochoa, S. A., Escalona, G., Arellano-Galindo, J., Rodriguez-Leviz, A., . . . Xicohtencatl-Cortes, J. (2015). Vancomycin tolerant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus reveals the effects of vancomycin on cell wall thickening. PLoS One, 10(3), e0118791. doi: 10.1371/journal.pone.0118791

Centers for Disease, Control & Prevention. (2002a). Staphylococcus aureus resistant to vancomycin-United States, 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 51(26), 565-567.

Page 109: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 91

Centers for Disease, Control & Prevention. (2002b). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus-Pennsylvania, 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 51(40), 902.

Centers for Disease, Control & Prevention. (2004). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus--New York, 2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 53(15), 322-323.

Clinical and Laboratory Standars Institute CLSI (2012). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twenty-first informational supplement M100-S21.

Corpet, F. (1988). "Multiple sequence alignment with hierarchical clustering" Nucl. Acids Res, 16(22), 10881-10890.

Corso, A., Guerriero, L., Pasteran, F., Ceriana, P., Callejo, R., Prieto, M., . . . La, E. (2011). [Capability of national reference laboratories in Latin America to detect emerging resistance mechanisms]. Rev Panam Salud Publica, 30(6), 619-626.

Courvalin, P. (2006). Vancomycin resistance in Gram-positive cocci. Clin Infect Dis, 42 Suppl 1, S25-34. doi: 10.1086/491711

Cruz, C., Moreno, J., Renzoni, A., Hidalgo, M., Reyes, J., Schrenzel, J.,… Arias, C. A. (2005). Tracking methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Colombian hospitals over 7 years (1996-2003): emergence of a new dominant clone. Int J Antimicrob Agents, 26(6), 457-462. doi: S0924-8579(05)00256-6 [pii]10.1016/j.ijantimicag.2005.08.013

Cui, L., Ma, X., Sato, K., Okuma, K., Tenover, F. C., Mamizuka, E. M.,… Hiramatsu, K. (2003). Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 41(1), 5-14.

Cui, L., Iwamoto, A., Lian, J. Q., Neoh, H. M., Maruyama, T., Horikawa, Y., & Hiramatsu, K. (2006). Novel mechanism of antibiotic resistance originating in vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 50(2), 428-438. doi: 50/2/428 [pii]10.1128/AAC.50.2.428-438.2006

Cui, L., Isii, T., Fukuda, M., Ochiai, T., Neoh, H. M., Camargo, I. L., . . . Hiramatsu, K. (2010). An RpoB mutation confers dual heteroresistance to daptomycin and vancomycin in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 54(12), 5222-5233. doi: 10.1128/AAC.00437-10

Chaudhari, C. N., Tandel, K., Grover, N., Sen, S., Bhatt, P., Sahni, A. K., & Praharaj, A. K. (2015). Heterogeneous vancomycin-intermediate among methicillin resistant Staphylococcus aureus. Med J Armed Forces India, 71(1), 15-18. doi: 10.1016/j.mjafi.2014.03.008

Chen, H., Liu, Y., Sun, W., Chen, M., & Wang, H. (2011). The incidence of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus correlated with increase of vancomycin MIC. Diagn Microbiol Infect Dis, 71(3), 301-303. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2011.06.010

Chen, H., Liu, Y., Zhao, C., Xiao, D., Zhang, J., Zhang, F., . . . Wang, H. (2013). Comparative proteomics-based identification of genes associated with

Page 110: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

92 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

glycopeptide resistance in clinically derived heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains. PLoS One, 8(6), e66880. doi: 10.1371/journal.pone.0066880

Chen, C. J., Lin, M. H., Shu, J. C., & Lu, J. J. (2014). Reduced susceptibility to vancomycin in isogenic Staphylococcus aureus strains of sequence type 59: tracking evolution and identifying mutations by whole-genome sequencing. J Antimicrob Chemother, 69(2), 349-354. doi: 10.1093/jac/dkt395

Chen, H., Xiong, Z., Liu, K., Li, S., Wang, R., Wang, X., . . . Wang, H. (2016). Transcriptional profiling of the two-component regulatory system VraSR in Staphylococcus aureus with low-level vancomycin resistance. Int J Antimicrob Agents, 47(5), 362-367. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2016.02.003

Chong, Y. P., Park, K. H., Kim, E. S., Kim, M. N., Kim, S. H., Lee, S. O., . . . Kim, Y. S. (2015). Clinical and microbiologic analysis of the risk factors for mortality in patients with heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus bacteremia. Antimicrob Agents Chemother, 59(6), 3541-3547. doi: 10.1128/AAC.04765-14

Choo, E. J., & Chambers, H. F. (2016). Treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Bacteremia. Infect Chemother, 48(4), 267-273. doi: 10.3947/ic.2016.48.4.267

Chung, D. R., Baek, J. Y., Kim, H. A., Lim, M. H., Kim, S. H., Ko, K. S., . . . Song, J. H. (2012). First report of vancomycin-intermediate resistance in sequence type 72 community genotype methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 50(7), 2513-2514. doi: 10.1128/JCM.00590-12

Da Costa, T. M., Morgado, P. G., Cavalcante, F. S., Damasco, A. P., Nouer, S. A., & Dos Santos, K. R. (2016). Clinical and Microbiological Characteristics of Heteroresistant and Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus from Bloodstream Infections in a Brazilian Teaching Hospital. PLoS One, 11(8), e0160506. doi: 10.1371/journal.pone.0160506

Dai, Y., Chang, W., Zhao, C., Peng, J., Xu, L., Lu, H., . . . Ma, X. (2017). VraR Binding to the Promoter Region of agr Inhibits Its Function in Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and Heterogeneous VISA. Antimicrob Agents Chemother, 61(5). doi: 10.1128/AAC.02740-16

Delaune, A., Dubrac, S., Blanchet, C., Poupel, O., Mader, U., Hiron, A., . . . Msadek, T. (2012). The WalKR system controls major staphylococcal virulence genes and is involved in triggering the host inflammatory response. Infect Immun, 80(10), 3438-3453. doi: 10.1128/IAI.00195-12

Delgado, A., Riordan, J. T., Lamichhane-Khadka, R., Winnett, D. C., Jimenez, J., Robinson, K., . . . Gustafson, J. E. (2007). Hetero-vancomycin-intermediate methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolate from a medical center in Las

Page 111: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 93

Cruces, New Mexico. J Clin Microbiol, 45(4), 1325-1329. doi: 10.1128/JCM.02437-06

Denis, O., Nonhoff, C., Byl, B., Knoop, C., Bobin-Dubreux, S., & Struelens, M. J. (2002). Emergence of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a Belgian hospital: microbiological and clinical features. J Antimicrob Chemother, 50(3), 383-391.

Di Gregorio, S., Perazzi, B., Ordonez, A. M., De Gregorio, S., Foccoli, M., Lasala, M. B., . . . Mollerach, M. (2015). Clinical, microbiological, and genetic characteristics of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus bacteremia in a teaching hospital. Microb Drug Resist, 21(1), 25-34. doi: 10.1089/mdr.2014.0190

Di Gregorio, S., Fernandez, S., Cuirolo, A., Verlaine, O., Amoroso, A., Mengin-Lecreulx, D., . . . Mollerach, M. (2017). Different Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Phenotypes selected from the same ST100-hVISA Parental Strain. Microb Drug Resist, 23(1), 44-50. doi: 10.1089/mdr.2016.0160

Diaz, R., Afreixo, V., Ramalheira, E., Rodrigues, C., & Gago, B. (2017). Evaluation of vancomycin MIC Creep in Methicillin resistant Staphylococcus aureus infections - a systematic review and meta-analysis. Clin Microbiol Infect. doi: 10.1016/j.cmi.2017.06.017

Dubrac, S., & Msadek, T. (2004). Identification of genes controlled by the essential YycG/YycF two-component system of Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 186(4), 1175-1181.

Dubrac, S., & Msadek, T. (2008). Tearing Down the Wall: Peptidoglycan Metabolism and the WalK/WalR (YycG/YycF) Essential Two-Component System. In R. Utsumi (Ed.), Bacterial Signal Transduction: Networks and Drug Targets (pp. 214-228). New York, NY: Springer New York.

Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., & Spratt, B. G. (2000). Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 38(3), 1008-1015.

Escobar-Perez, J. A., Castro, B. E., Marquez-Ortiz, R. A., Gaines, S., Chavarro, B., Moreno, J., . . . Vanegas, N. (2014). Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus isolates related to USA300 clone: Origin of community-genotype MRSA in Colombia?. Biomédica, 34 Suppl 1, 124-136. doi: 10.1590/S0120-41572014000500015

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing -EUCAST. (2017). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 7.1.

Faber, B. B. (1984). Vancomycin: Renewed Interest in an Old Drug (Editorial). Eur. J. Clin. Microbiol, 3(1), 1-3.

Falord, M., Mader, U., Hiron, A., Debarbouille, M., & Msadek, T. (2011). Investigation of the Staphylococcus aureus GraSR regulon reveals novel links to virulence, stress response and cell wall signal transduction pathways. PLoS One, 6(7), e21323. doi: 10.1371/journal.pone.0021323

Page 112: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

94 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Finks, J., Wells, E., Dyke, T. L., Husain, N., Plizga, L., Heddurshetti, R., . . . Miller, C. (2009). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, Michigan, USA, 2007. Emerg Infect Dis, 15(6), 943-945. doi: 10.3201/eid1506.081312

Fischbach, M. A., & Walsh, C. T. (2009). Antibiotics for emerging pathogens. Science, 325(5944), 1089-1093. doi: 325/5944/1089 [pii]10.1126/science.1176667

Fitzgibbon, M. M., Rossney, A. S., & O'Connell, B. (2007). Investigation of reduced susceptibility to glycopeptides among methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from patients in Ireland and evaluation of agar screening methods for detection of heterogeneously glycopeptide-intermediate S. aureus. J Clin Microbiol, 45(10), 3263-3269. doi: 10.1128/JCM.00836-07

Fong, R. K., Low, J., Koh, T. H., & Kurup, A. (2009). Clinical features and treatment outcomes of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in a tertiary care institution in Singapore. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 28(8), 983-987. doi: 10.1007/s10096-009-0741-5

Francois, P., Harbarth, S., Huyghe, A., Renzi, G., Bento, M., Gervaix, A., . . . Schrenzel, J. (2008). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Geneva, Switzerland, 1993-2005. Emerg Infect Dis, 14(2), 304-307. doi: 10.3201/eid1402.070229

Friaes, A., Resina, C., Manuel, V., Lito, L., Ramirez, M., & Melo-Cristino, J. (2015). Epidemiological survey of the first case of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus infection in Europe. Epidemiol Infect, 143(4), 745-748. doi: 10.1017/S0950268814001423

Fridkin, S. K., Hageman, J., McDougal, L. K., Mohammed, J., Jarvis, W. R., Perl, T. M., . . . Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Epidemiology Study, G. (2003). Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin Infect Dis, 36(4), 429-439. doi: 10.1086/346207

Furuya, E. Y., & Lowy, F. D. (2006). Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol, 4(1), 36-45. doi: nrmicro1325 [pii]10.1038/nrmicro1325

García, C., Rijnders, M. I., Bruggeman, C., Samalvides, F., Stobberingh, E. E., & Jacobs, J. (2012). Antimicrobial resistance and molecular typing of Staphylococcus aureus bloodstream isolates from hospitals in Peru. J Infect, 65(5), 406-411. doi: 10.1016/j.jinf.2012.06.009

García, C., Acuña-Villaorduña, A., Dulanto, A., Vandendriessche, S., Hallin, M., Jacobs, J., & Denis, O. (2016). Dynamics of nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among healthcare workers in a tertiary-care hospital in Peru. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 35(1), 89-93. doi: 10.1007/s10096-015-2512-9

Page 113: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 95

Gardete, S., Wu, S. W., Gill, S., & Tomasz, A. (2006). Role of VraSR in antibiotic resistance and antibiotic-induced stress response in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 50(10), 3424-3434. doi: 10.1128/AAC.00356-06

Gardete, S., & Tomasz, A. (2014). Mechanisms of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Invest, 124(7), 2836-2840. doi: 10.1172/JCI68834

Garnier, F., Chainier, D., Walsh, T., Karlsson, A., Bolmstrom, A., Grelaud, C., . . . Ploy, M. C. (2006). A 1 year surveillance study of glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus strains in a French hospital. J Antimicrob Chemother, 57(1), 146-149. doi: dki413 [pii]10.1093/jac/dki413

Gilot, P., Lina, G., Cochard, T., & Poutrel, B. (2002). Analysis of the genetic variability of genes encoding the RNA III-activating components Agr and TRAP in a population of Staphylococcus aureus strains isolated from cows with mastitis. J Clin Microbiol, 40(11), 4060-4067.

Gomes, A. R., Sanches, I. S., Aires de Sousa, M., Castaneda, E., & de Lencastre, H. (2001). Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Colombian hospitals: dominance of a single unique multidrug-resistant clone. Microb Drug Resist, 7(1), 23-32. doi: 10.1089/107662901750152729

Gordon, R. J., & Lowy, F. D. (2008). Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis, 46 Suppl 5, S350-359. doi: 10.1086/533591

Gosbell, I. B., Mitchell, D. H., Ziochos, H., & Ward, P. B. (2003). Emergence of hetero-vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in Sydney. Med J Aust, 178(7), 354. doi: letters_070403-1 [pii]

Gosbell, I. B., & van Hal, S. J. (2013). Staphylococcus aureus colonisation: some questions answered. Lancet Infect Dis, 13(5), 380-381. doi: 10.1016/S1473-3099(13)70048-3

Gowrishankar, S., Thenmozhi, R., Balaji, K., & Pandian, S. K. (2013). Emergence of methicillin-resistant, vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus among patients associated with group A Streptococcal pharyngitis infection in southern India. Infect Genet Evol, 14, 383-389. doi: 10.1016/j.meegid.2013.01.002

Graber, C. J., Wong, M. K., Carleton, H. A., Perdreau-Remington, F., Haller, B. L., & Chambers, H. F. (2007). Intermediate vancomycin susceptibility in a community-associated MRSA clone. Emerg Infect Dis, 13(3), 491-493. doi: 10.3201/eid1303.060960

Grumann, D., Nubel, U., & Broker, B. M. (2014). Staphylococcus aureus toxins--their functions and genetics. Infect Genet Evol, 21, 583-592. doi: S1567-1348(13)00086-5 [pii]10.1016/j.meegid.2013.03.013

Haag, A. F., & Bagnoli, F. (2016). The Role of Two-Component Signal Transduction Systems in Staphylococcus aureus Virulence Regulation. En Bagnoli F, Rappuolli R, Grandi G (eds) Staphylococcus aureus. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol 409. Springer, Cham

Page 114: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

96 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Hafer, C., Lin, Y., Kornblum, J., Lowy, F. D., & Uhlemann, A. C. (2012). Contribution of selected gene mutations to resistance in clinical isolates of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 56(11), 5845-5851. doi: 10.1128/AAC.01139-12

Hanaki, H., Cui, L., Ikeda-Dantsuji, Y., Nakae, T., Honda, J., Yanagihara, K., . . . Niki, Y. (2014). Antibiotic susceptibility survey of blood-borne MRSA isolates in Japan from 2008 through 2011. J Infect Chemother, 20(9), 527-534. doi: 10.1016/j.jiac.2014.06.012

Hanaki, H., Hososaka, Y., Yanagisawa, C., Otsuka, Y., Nagasawa, Z., Nakae, T., & Sunakawa, K. (2007). Occurrence of vancomycin-intermediate-resistant Staphylococcus aureus in Japan. J Infect Chemother, 13(2), 118-121. doi: 10.1007/s10156-006-0498-z

Harigaya, Y., Ngo, D., Lesse, A. J., Huang, V., & Tsuji, B. T. (2011). Characterization of heterogeneous vancomycin-intermediate resistance, MIC and accessory gene regulator (agr) dysfunction among clinical bloodstream isolates of staphyloccocus aureus. BMC Infect Dis, 11, 287. doi: 10.1186/1471-2334-11-287

Herbert, S., Bera, A., Nerz, C., Kraus, D., Peschel, A., Goerke, C., . . . Gotz, F. (2007). Molecular basis of resistance to muramidase and cationic antimicrobial peptide activity of lysozyme in staphylococci. PLoS Pathog, 3(7), e102. doi: 10.1371/journal.ppat.0030102

Hiramatsu, K., Hanaki, H., Ino, T., Yabuta, K., Oguri, T., & Tenover, F. C. (1997a). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother, 40(1), 135-136.

Hiramatsu, K., Aritaka, N., Hanaki, H., Kawasaki, S., Hosoda, Y., Hori, S.,… Kobayashi, I. (1997b). Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. Lancet, 350(9092), 1670-1673. doi: S0140-6736(97)07324-8 [pii]10.1016/S0140-6736(97)07324-8

Hiramatsu, K. (2001). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic resistance. Lancet Infect Dis, 1(3), 147-155. doi: S1473-3099(01)00091-3 [pii]10.1016/S1473-3099(01)00091-3

Hiramatsu, K., Katayama, Y., Matsuo, M., Sasaki, T., Morimoto, Y., Sekiguchi, A., & Baba, T. (2014a). Multi-drug-resistant Staphylococcus aureus and future chemotherapy. J Infect Chemother, 20(10), 593-601. doi: S1341-321X(14)00280-3 [pii]10.1016/j.jiac.2014.08.001

Hiramatsu, K., Kayayama, Y., Matsuo, M., Aiba, Y., Saito, M., Hishinuma, T., & Iwamoto, A. (2014b). Vancomycin-intermediate resistance in Staphylococcus aureus. J Glob Antimicrob Resist., 2(4), 213-224. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.jgar.2014.04.006

Page 115: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 97

Horne, K. C., Howden, B. P., Grabsch, E. A., Graham, M., Ward, P. B., Xie, S., . . . Grayson, M. L. (2009). Prospective comparison of the clinical impacts of heterogeneous vancomycin-intermediate methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-susceptible MRSA. Antimicrob Agents Chemother, 53(8), 3447-3452 doi: 10.1128/aac.01365-08

Howden, B. P., Johnson, P. D., Ward, P. B., Stinear, T. P., & Davies, J. K. (2006). Isolates with low-level vancomycin resistance associated with persistent methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Antimicrob Agents Chemother, 50(9), 3039-3047. doi: 10.1128/AAC.00422-06

Howden, B. P., Stinear, T. P., Allen, D. L., Johnson, P. D., Ward, P. B., & Davies, J. K. (2008). Genomic analysis reveals a point mutation in the two-component sensor gene graS that leads to intermediate vancomycin resistance in clinical Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 52(10), 3755-3762. doi: 10.1128/AAC.01613-07

Howden, B. P., Davies, J. K., Johnson, P. D., Stinear, T. P., & Grayson, M. L. (2010). Reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus, including vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains: resistance mechanisms, laboratory detection, and clinical implications. Clin Microbiol Rev, 23(1), 99-139. doi: 23/1/99 [pii]10.1128/CMR.00042-09

Howden, B. P., McEvoy, C. R., Allen, D. L., Chua, K., Gao, W., Harrison, P. F., . . . Stinear, T. P. (2011). Evolution of multidrug resistance during Staphylococcus aureus infection involves mutation of the essential two component regulator WalKR. PLoS Pathog, 7(11), e1002359. doi: 10.1371/journal.ppat.1002359

Howden, B. P., Peleg, A. Y., & Stinear, T. P. (2014). The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA. Infect Genet Evol, 21, 575-582. doi: S1567-1348(13)00136-6 [pii]10.1016/j.meegid.2013.03.047

Hsueh, P. R., Lee, S. Y., Perng, C. L., Chang, T. Y., & Lu, J. J. (2010). Clonal dissemination of meticillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a Taiwanese hospital. Int J Antimicrob Agents, 36(4), 307-312. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2010.06.035

Hu, J., Ma, X. X., Tian, Y., Pang, L., Cui, L. Z., & Shang, H. (2013). Reduced vancomycin susceptibility found in methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus clinical isolates in Northeast China. PLoS One, 8(9), e73300. doi: 10.1371/journal.pone.0073300PONE-D-13-16822

Hu, H. C., Kao, K. C., Chiu, L. C., Chang, C. H., Hung, C. Y., Li, L. F., . . . Lu, J. J. (2015a). Clinical outcomes and molecular typing of heterogenous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus bacteremia in patients in intensive care units. BMC Infect Dis, 15, 444. doi: 10.1186/s12879-015-1215-2

Hu, J., Zhang, X., Liu, X., Chen, C., & Sun, B. (2015b). Mechanism of reduced vancomycin susceptibility conferred by walK mutation in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain MW2. Antimicrob Agents Chemother, 59(2), 1352-1355. doi: 10.1128/AAC.04290-14

Page 116: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

98 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Hu, Q., Peng, H., & Rao, X. (2016). Molecular Events for Promotion of Vancomycin Resistance in Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus. Front Microbiol, 7. doi: 10.3389/fmicb.2016.01601

Huang, S. H., Chen, Y. C., Chuang, Y. C., Chiu, S. K., Fung, C. P., Lu, P. L., . . . Wang, J. T. (2015). Prevalence of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogeneous VISA among methicillin-resistant S. aureus with high vancomycin minimal inhibitory concentrations in Taiwan: A multicenter surveillance study, 2012-2013. J Microbiol Immunol Infect. doi: 10.1016/j.jmii.2015.07.003

Hubert, S. K., Mohammed, J. M., Fridkin, S. K., Gaynes, R. P., McGowan, J. E., Jr., & Tenover, F. C. (1999). Glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus: evaluation of a novel screening method and results of a survey of selected U.S. hospitals. J Clin Microbiol, 37(11), 3590-3593.

Hughes, D. (2003). Exploiting genomics, genetics and chemistry to combat antibiotic resistance. Nat Rev Genet, 4(6), 432-441. doi: 10.1038/nrg1084

Ike, Y., Arakawa, Y., Ma, X., Tatewaki, K., Nagasawa, M., Tomita, H., . . . Fujimoto, S. (2001). Nationwide survey shows that methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains heterogeneously and intermediately resistant to vancomycin are not disseminated throughout Japanese hospitals. J Clin Microbiol, 39(12), 4445-4451. doi: 10.1128/JCM.39.12.4445-4451.2001

Illumina Inc. (2012). Nextera® XT DNA Sample Preparation Guide. San Diego, CA.

Ji, G., Beavis, R., & Novick, R. P. (1997). Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants. Science, 276(5321), 2027-2030.

Ji, Q., Chen, P. J., Qin, G., Deng, X., Hao, Z., Wawrzak, Z., … He, C. (2016). Structure and mechanism of the essential two-component signal-transduction system WalKR in Staphylococcus aureus. Nat Commun, 7, 11000. doi: 10.1038/ncomms11000

Jones, T. E., Vasileff, H., & Hewton, C. (2012). Should monitoring of vancomycin be delayed? A case of likely nephrotoxicity occasioned by morbid obesity and minimal monitoring. Br J Clin Pharmacol, 74(6), 1063-1065. doi: 10.1111/j.1365-2125.2011.04006.x

Katayama, Y., Sekine, M., Hishinuma, T., Aiba, Y., & Hiramatsu, K. (2016). Complete Reconstitution of the Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Phenotype of Strain Mu50 in Vancomycin-Susceptible S. aureus. Antimicrob Agents Chemother, 60(6), 3730-3742. doi: AAC.00420-16 [pii]10.1128/AAC.00420-16

Khatib, R., Riederer, K., Sharma, M., Shemes, S., Iyer, S. P., & Szpunar, S. (2015). Screening for Intermediately Vancomycin-Susceptible and Vancomycin-Heteroresistant Staphylococcus aureus by Use of Vancomycin-Supplemented Brain Heart Infusion Agar Biplates: Defining Growth Interpretation Criteria Based

Page 117: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 99

on Gold Standard Confirmation. J Clin Microbiol, 53(11), 3543-3546. doi: 10.1128/JCM.01620-15

Kim, M. N., Hwang, S. H., Pyo, Y. J., Mun, H. M., & Pai, C. H. (2002). Clonal spread of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin in a university hospital in Korea. J Clin Microbiol, 40(4), 1376-1380.

Kirby, A., Graham, R., Williams, N. J., Wootton, M., Broughton, C. M., Alanazi, M., . . . Parry, C. M. (2010). Staphylococcus aureus with reduced glycopeptide susceptibility in Liverpool, UK. J Antimicrob Chemother, 65(4), 721-724. doi: 10.1093/jac/dkq00910.7326/0003-4819-152-3-201002020-01002

Kollef, M. H. (2007). Limitations of vancomycin in the management of resistant staphylococcal infections. Clin Infect Dis, 45 Suppl 3, S191-195. doi: 10.1086/519470

Kong, C., Neoh, H. M., & Nathan, S. (2016). Targeting Staphylococcus aureus Toxins: A Potential form of Anti-Virulence Therapy. Toxins (Basel), 8(3). doi: 10.3390/toxins8030072

Kos, V. N., Desjardins, C. A., Griggs, A., Cerqueira, G., Van Tonder, A., Holden, M. T., . . . Gilmore, M. S. (2012). Comparative genomics of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains and their positions within the clade most commonly associated with Methicillin-resistant S. aureus hospital-acquired infection in the United States. MBio, 3(3). doi: 10.1128/mBio.00112-12

Larkin, E. A., Carman, R. J., Krakauer, T., & Stiles, B. G. (2009). Staphylococcus aureus: the toxic presence of a pathogen extraordinaire. Curr Med Chem, 16(30), 4003-4019. doi: CMC - AbsEpub - 040 [pii]

Larsen, M. V., Cosentino, S., Rasmussen, S., Friis, C., Hasman, H., Marvig, R. L.,… Lund, O. (2012). Multilocus sequence typing of total-genome-sequenced bacteria. J Clin Microbiol, 50(4), 1355-1361. doi: 10.1128/JCM.06094-11

Layer, F., Ghebremedhin, B., Konig, W., & Konig, B. (2006). Heterogeneity of methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains at a German University Hospital implicates the circulating-strain pool as a potential source of emerging methicillin-resistant S. aureus clones. J Clin Microbiol, 44(6), 2179-2185. doi: 10.1128/JCM.02321-05

Leal, A. L., Eslava-Schmalbach, J., Alvarez, C., Buitrago, G., & Méndez, M. (2006). Endemic tendencies and bacterial resistance markers in third-level hospitals in Bogotá, Colombia. Rev Salud Pública, 8 (1), 59-70. doi: S0124-00642006000400006

Leal, A. L., & Ovalle, M. V. (2015). Análisis de la vigilancia de la resistencia bacteriana año 2014. Componente pediátrico y adulto. Boletín Informativo Grebo, 7, 42. http://www.grebo.org/documentos/Boletin_Grebo_2015.pdf

Leonard, S. N., Rossi, K. L., Newton, K. L., & Rybak, M. J. (2009). Evaluation of the Etest GRD for the detection of Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to glycopeptides. J Antimicrob Chemother, 63(3), 489-492. doi: 10.1093/jac/dkn520

Page 118: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

100 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Levine, D. P. (2006). Vancomycin: a history. Clin Infect Dis, 42 Suppl 1, S5-12. doi: CID36949 [pii]10.1086/491709

Lewis, T., Chaudhry, R., Nightingale, P., Lambert, P., & Das, I. (2011). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: epidemiology, outcome, and laboratory characteristics in a tertiary referral center in the UK. Int J Infect Dis, 15(2), e131-135. doi: 10.1016/j.ijid.2010.09.013

Liaqat, F., Sheikh, A. A., Nazir, J., Hussain, T., Rabbani, M., Shaheen, A. Y., & Muhammad, J. (2015). Report-Isolation identification and control of vancomycin resistant Staphylococcus aureus. Pak J Pharm Sci, 28(3), 997-1004.

Limbago, B. M., Kallen, A. J., Zhu, W., Eggers, P., McDougal, L. K., & Albrecht, V. S. (2014). Report of the 13th vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from the United States. J Clin Microbiol, 52(3), 998-1002. doi: 10.1128/JCM.02187-13

Lin, J., Lin, D., Xu, P., Zhang, T., Ou, Q., Bai, C., & Yao, Z. (2016). Non-hospital environment contamination with Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus: proportion meta-analysis and features of antibiotic resistance and molecular genetics. Environ Res, 150, 528-540. doi: 10.1016/j.envres.2016.06.040

Lo, C. W., Lai, Y. K., Liu, Y. T., Gallo, R. L., & Huang, C. M. (2011). Staphylococcus aureus hijacks a skin commensal to intensify its virulence: immunization targeting beta-hemolysin and CAMP factor. J Invest Dermatol, 131(2), 401-409. doi: 10.1038/jid.2010.319

Lowy, F. D. (1998). Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med, 339(8), 520-532. doi: 10.1056/NEJM199808203390806

Lulitanond, A., Engchanil, C., Chaimanee, P., Vorachit, M., Ito, T., & Hiramatsu, K. (2009). The first vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains isolated from patients in Thailand. J Clin Microbiol, 47(7), 2311-2316. doi: JCM.01749-08 [pii]10.1128/JCM.01749-08

Maki, H., McCallum, N., Bischoff, M., Wada, A., & Berger-Bachi, B. (2004). tcaA inactivation increases glycopeptide resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 48(6), 1953-1959. doi: 10.1128/AAC.48.6.1953-1959.2004

Malachowa, N., & DeLeo, F. R. (2010). Mobile genetic elements of Staphylococcus aureus. Cell Mol Life Sci, 67(18), 3057-3071. doi: 10.1007/s00018-010-0389-4

Maor, Y., Lago, L., Zlotkin, A., Nitzan, Y., Belausov, N., Ben-David, D.,… Rahav, G. (2009). Molecular features of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains isolated from bacteremic patients. BMC Microbiol, 9, 189. doi: 10.1186/1471-2180-9-189

Page 119: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 101

Maor, Y., Belausov, N., Ben-David, D., Smollan, G., Keller, N., & Rahav, G. (2014). hVISA and MRSA endocarditis: an 8-year experience in a tertiary care centre. Clin Microbiol Infect, 20(10), O730-736. doi: 10.1111/1469-0691.12498

Marzec, N. S., & Bessesen, M. T. (2016). Risk and outcomes of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteremia among patients admitted with and without MRSA nares colonization. Am J Infect Control, 44(4), 405-408. doi: 10.1016/j.ajic.2015.11.006

Mato, R., Campanile, F., Stefani, S., Crisostomo, M. I., Santagati, M., Sanches, S. I., & de Lencastre, H. (2004). Clonal types and multidrug resistance patterns of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) recovered in Italy during the 1990s. Microb Drug Resist, 10(2), 106-113. doi: 10.1089/1076629041310109

Matsuo, M., Hishinuma, T., Katayama, Y., Cui, L., Kapi, M., & Hiramatsu, K. (2011). Mutation of RNA polymerase beta subunit (rpoB) promotes hVISA-to-VISA phenotypic conversion of strain Mu3. Antimicrob Agents Chemother, 55(9), 4188-4195. doi: 10.1128/AAC.00398-11

Matsuo, M., Cui, L., Kim, J., & Hiramatsu, K. (2013). Comprehensive identification of mutations responsible for heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA)-to-VISA conversion in laboratory-generated VISA strains derived from hVISA clinical strain Mu3. Antimicrob Agents Chemother, 57(12), 5843-5853. doi: AAC.00425-13 [pii]10.1128/AAC.00425-13

Matsuo, M., Hishinuma, T., Katayama, Y., & Hiramatsu, K. (2015). A mutation of RNA polymerase beta' subunit (RpoC) converts heterogeneously vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) into "slow VISA". Antimicrob Agents Chemother, 59(7), 4215-4225. doi: AAC.00135-15 [pii]10.1128/AAC.00135-15

McCallum, N., Meier, P. S., Heusser, R., & Berger-Bachi, B. (2011). Mutational analyses of open reading frames within the vraSR operon and their roles in the cell wall stress response of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 55(4), 1391-1402. doi: 10.1128/AAC.01213-10

McDougal, L. K., Steward, C. D., Killgore, G. E., Chaitram, J. M., McAllister, S. K., & Tenover, F. C. (2003). Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a national database. J Clin Microbiol, 41(11), 5113-5120.

McEvoy, C. R., Tsuji, B., Gao, W., Seemann, T., Porter, J. L., Doig, K.,… Stinear, T. P. (2013). Decreased vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus caused by IS256 tempering of WalKR expression. Antimicrob Agents Chemother, 57(7), 3240-3249. doi: 10.1128/AAC.00279-13

Meehl, M., Herbert, S., Gotz, F., & Cheung, A. (2007). Interaction of the GraRS two-component system with the VraFG ABC transporter to support vancomycin-intermediate resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 51(8), 2679-2689. doi: 10.1128/AAC.00209-07

Mehraj, J., Witte, W., Akmatov, M. K., Layer, F., Werner, G., & Krause, G. (2016). Epidemiology of Staphylococcus aureus Nasal Carriage Patterns in the Community. Curr Top Microbiol Immunol. doi: 10.1007/82_2016_497

Page 120: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

102 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Meyer, F., Girardot, R., Piemont, Y., Prevost, G., & Colin, D. A. (2009). Analysis of the specificity of Panton-Valentine leucocidin and gamma-hemolysin F component binding. Infect Immun, 77(1), 266-273. doi: IAI.00402-08 [pii]10.1128/IAI.00402-08

Mlynarczyk, A., Mlynarczyk, G., & Luczak, M. (2003). [Searching for Staphylococcus aureus strains with reduced susceptibility to glycopeptides among clinical isolates obtained during the year of 2002]. Med Dosw Mikrobiol, 55(3), 209-217.

Moise-Broder, P. A., Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Schentag, J. J., Forrest, A., & Moellering, R. C., Jr. (2004). Accessory gene regulator group II polymorphism in methicillin-resistant Staphylococcus aureus is predictive of failure of vancomycin therapy. Clin Infect Dis, 38(12), 1700-1705. doi: 10.1086/421092

Monecke, S., Coombs, G., Shore, A. C., Coleman, D. C., Akpaka, P., Borg, M., . . . Ehricht, R. (2011). A field guide to pandemic, epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One, 6(4), e17936. doi: 10.1371/journal.pone.0017936

Morell, E. A., & Balkin, D. M. (2010). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a pervasive pathogen highlights the need for new antimicrobial development. Yale J Biol Med, 83(4), 223-233.

Mrgreen71 [Public domain], from Wikimedia Commons contributors. (2015). Vancomycin.svg. In File:Vancomycin.svg (Ed.), (Vol. 183 KB): Wikimedia Commons, the free media repository. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vancomycin.svg

Munita, J. M., Bayer, A. S., & Arias, C. A. (2015). Evolving Resistance Among Gram-positive Pathogens. Clin Infect Dis., 61(S2), S48–57. doi: 10.1093/cid/civ523

Munita, J. M., & Arias, C. A. (2016). Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiol Spectr, 4(2). doi: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015

Murdoch, D. R., Corey, G. R., Hoen, B., Miro, J. M., Fowler, V. G., Jr., Bayer, A. S.,… International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study, I. (2009). Clinical presentation, etiology, and outcome of infective endocarditis in the 21st century: the International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study. Arch Intern Med, 169(5), 463-473. doi: 10.1001/archinternmed.2008.603

Murray, B. E., Singh, K. V., Heath, J. D., Sharma, B. R., & Weinstock, G. M. (1990). Comparison of genomic DNAs of different enterococcal isolates using restriction endonucleases with infrequent recognition sites. J Clin Microbiol, 28(9), 2059-2063.

Murray, R. J., Sieunarine, K., Ward, P. B., & Pearman, J. W. (2004). Emergence of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) infection in Western Australia. Med J Aust, 181(4), 227-228. doi: letters_160804_fm-2 [pii]

Page 121: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 103

Mwangi, M. M., Wu, S. W., Zhou, Y., Sieradzki, K., de Lencastre, H., Richardson, P., . . . Tomasz, A. (2007). Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococcus aureus by whole-genome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(22), 9451-9456. doi: 10.1073/pnas.0609839104

Neoh, H. M., Cui, L., Yuzawa, H., Takeuchi, F., Matsuo, M., & Hiramatsu, K. (2008). Mutated response regulator graR is responsible for phenotypic conversion of Staphylococcus aureus from heterogeneous vancomycin-intermediate resistance to vancomycin-intermediate resistance. Antimicrob Agents Chemother, 52(1), 45-53. doi: AAC.00534-07 [pii]10.1128/AAC.00534-07

Nielsen, L. N., Larsen, M. H., Skovgaard, S., Kastbjerg, V., Westh, H., Gram, L., & Ingmer, H. (2013). Staphylococcus aureus but not Listeria monocytogenes adapt to triclosan and adaptation correlates with increased fabI expression and agr deficiency. BMC Microbiol, 13, 177. doi: 10.1186/1471-2180-13-177

Oliveira, D. C., & de Lencastre, H. (2002). Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 46(7), 2155-2161

O'Neill, A. J., Huovinen, T., Fishwick, C. W. G., & Chopra, I. (2006). Molecular Genetic and Structural Modeling Studies of Staphylococcus aureus RNA Polymerase and the Fitness of Rifampin Resistance Genotypes in Relation to Clinical Prevalence. Antimicrob Agents Chemother, 50(1), 298-309. doi: 10.1128/AAC.50.1.298-309.2006

Oshida, T., Takano, M., Sugai, M., Suginaka, H., & Matsushita, T. (1998). Expression analysis of the autolysin gene (atl) of Staphylococcus aureus. Microbiol Immunol, 42(9), 655-659.

Otto, M. (2010). Staphylococcus aureus toxin gene hitchhikes on a transferable antibiotic resistance element. Virulence, 1(1), 49-51. doi: 10453 [pii]10.4161/viru.1.1.10453

Panesso, D., Ospina, S., Robledo, J., Vela, M. C., Pena, J., Hernandez, O., . . . Arias, C. A. (2002). First characterization of a cluster of VanA-type glycopeptide-resistant Enterococcus faecium, Colombia. Emerg Infect Dis, 8(9), 961-965. doi: 10.3201/eid0809.010435

Panesso, D., Planet, P. J., Diaz, L., Hugonnet, J. E., Tran, T. T., Narechania, A., . . . Arias, C. A. (2015). Methicillin-Susceptible, Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus, Brazil. Emerg Infect Dis, 21(10), 1844-1848. doi: 10.3201/eid2110.141914

Park, K. H., Kim, E. S., Kim, H. S., Park, S. J., Bang, K. M., Park, H. J., . . . Kim, Y. S. (2012). Comparison of the clinical features, bacterial genotypes and outcomes of patients with bacteraemia due to heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus and vancomycin-susceptible S. aureus. J Antimicrob Chemother, 67(8), 1843-1849. doi: 10.1093/jac/dks131

Pereira, L. A., Harnett, G. B., Hodge, M. M., Cattell, J. A., & Speers, D. J. (2014). Real-time PCR assay for detection of blaZ genes in Staphylococcus aureus clinical isolates. J Clin Microbiol, 52(4), 1259-1261. doi: 10.1128/JCM.03413-13

Page 122: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

104 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Pitz, A. M., Yu, F., Hermsen, E. D., Rupp, M. E., Fey, P. D., & Olsen, K. M. (2011). Vancomycin susceptibility trends and prevalence of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in clinical methicillin-resistant S. aureus isolates. J Clin Microbiol, 49(1), 269-274. doi: 10.1128/JCM.00914-10

Planet, P. J., Diaz, L., Kolokotronis, S. O., Narechania, A., Reyes, J., Xing, G., . . . Arias, C. A. (2015). Parallel Epidemics of Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus USA300 Infection in North and South America. J Infect Dis, 212(12), 1874-1882. doi: 10.1093/infdis/jiv320

Plata, K., Rosato, A. E., & Wegrzyn, G. (2009). Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its pathogenicity. Acta Biochim Pol, 56(4), 597-612. doi: 20091925 [pii]

Pootoolal, J., Neu, J., & Wright, G. D. (2002). Glycopeptide antibiotic resistance. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 42, 381-408. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.42.091601.142813

Qureshi, N. K., Yin, S., & Boyle-Vavra, S. (2014). The role of the Staphylococcal VraTSR regulatory system on vancomycin resistance and vanA operon expression in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One, 9(1), e85873. doi: 10.1371/journal.pone.0085873

Ragbetli, C., Parlak, M., Bayram, Y., Guducuoglu, H., & Ceylan, N. (2016). Evaluation of Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus Isolates by Years. Interdiscip Perspect Infect Dis, 2016, 9171395. doi: 10.1155/2016/9171395

Ramli, S. R., Neoh, H. M., Aziz, M. N., & Hussin, S. (2012). Screening and detection of heterogenous vancomycin intermediate Staphylococcus aureus in Hospital Kuala Lumpur Malaysia, using the glycopeptide resistance detection Etest and population analysis profiling. Infect Dis Rep, 4(1), e20. doi: 10.4081/idr.2012.e20

Rehm, S. J., & Tice, A. (2010). Staphylococcus aureus: methicillin-susceptible S. aureus to methicillin-resistant S. aureus and vancomycin-resistant S. aureus. Clin Infect Dis, 51 Suppl 2, S176-182. doi: 10.1086/653518

Reyes, J., Rincón, S., Diaz, L., Panesso, D., Contreras, G. A., Zurita, J., . . . Arias, C. A. (2009). Dissemination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 sequence type 8 lineage in Latin America. Clin Infect Dis, 49(12), 1861-1867. doi: 10.1086/648426

Reyes Manrique, J. C. (2014). Contribución del Sistema Regulatorio de tres componentes LiaFSR en la resistencia a Daptomicina en Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. (Doctorado en Ciencias biológicas), Pontificia Universidad Javeriana.

Richter, S. S., Satola, S. W., Crispell, E. K., Heilmann, K. P., Dohrn, C. L., Riahi, F., . . . Doern, G. V. (2011). Detection of Staphylococcus aureus isolates with

Page 123: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 105

heterogeneous intermediate-level resistance to vancomycin in the United States. J Clin Microbiol, 49(12), 4203-4207. doi: 10.1128/JCM.01152-11

Riederer, K., Shemes, S., Chase, P., Musta, A., Mar, A., & Khatib, R. (2011). Detection of intermediately vancomycin-susceptible and heterogeneous Staphylococcus aureus isolates: comparison of Etest and Agar screening methods. J Clin Microbiol, 49(6), 2147-2150. doi: 10.1128/JCM.01435-10

Rincón, S., Panesso, D., Diaz, L., Carvajal, L. P., Reyes, J., Munita, J. M., & Arias, C. A. (2014). Resistance to "last resort" antibiotics in Gram-positive cocci: The post-vancomycin era. Biomédica, 34 Suppl 1, 191-208. doi: 10.1590/S0120-41572014000500022

Robert, J., Bismuth, R., & Jarlier, V. (2006). Decreased susceptibility to glycopeptides in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a 20 year study in a large French teaching hospital, 1983-2002. J Antimicrob Chemother, 57(3), 506-510. doi: 10.1093/jac/dki486

Rodríguez, C. A., & Vesga, O. (2005). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Biomédica, 25(4), 575-587.

Rossi, F., Diaz, L., Wollam, A., Panesso, D., Zhou, Y., Rincon, S., . . . Arias, C. A. (2014). Transferable vancomycin resistance in a community-associated MRSA lineage. N Engl J Med, 370(16), 1524-1531. doi: 10.1056/NEJMoa1303359

Rybak, M. J. (2006). The pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of vancomycin. Clin Infect Dis, 42 Suppl 1, S35-39. doi: 10.1086/491712

Rybak, M. J., Leonard, S. N., Rossi, K. L., Cheung, C. M., Sader, H. S., & Jones, R. N. (2008). Characterization of vancomycin-heteroresistant Staphylococcus aureus from the metropolitan area of Detroit, Michigan, over a 22-year period (1986 to 2007). J Clin Microbiol, 46(9), 2950-2954. doi: 10.1128/JCM.00582-08

Sader, H. S., Jones, R. N., Rossi, K. L., & Rybak, M. J. (2009a). Occurrence of vancomycin-tolerant and heterogeneous vancomycin-intermediate strains (hVISA) among Staphylococcus aureus causing bloodstream infections in nine USA hospitals. J Antimicrob Chemother, 64(5), 1024-1028. doi: 10.1093/jac/dkp319

Sader, H. S., Fey, P. D., Limaye, A. P., Madinger, N., Pankey, G., Rahal, J., . . . Jones, R. N. (2009b). Evaluation of vancomycin and daptomycin potency trends (MIC creep) against methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in nine U.S. medical centers from 2002 to 2006. Antimicrob Agents Chemother, 53(10), 4127-4132. doi: 10.1128/AAC.00616-09

Saha, B., Singh, A. K., Ghosh, A., & Bal, M. (2008). Identification and characterization of a vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolated from Kolkata (South Asia). J Med Microbiol, 57(Pt 1), 72-79. doi: 10.1099/jmm.0.47144-0

Saito, M., Katayama, Y., Hishinuma, T., Iwamoto, A., Aiba, Y., Kuwahara-Arai, K., . . . Hiramatsu, K. (2014). "Slow VISA," a novel phenotype of vancomycin resistance, found in vitro in heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strain Mu3. Antimicrob Agents Chemother, 58(9), 5024-5035. doi: AAC.02470-13 [pii]10.1128/AAC.02470-13

Page 124: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

106 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Jr., Wennersten, C., Venkataraman, L., Novick, R. P., & Gold, H. S. (2002). Accessory gene regulator (agr) locus in geographically diverse Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to vancomycin. Antimicrob Agents Chemother, 46(5), 1492-1502.

Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Jr., Novick, R. P., Venkataraman, L., Wennersten, C., . . . Gold, H. S. (2003). Staphylococcus aureus accessory gene regulator (agr) group II: is there a relationship to the development of intermediate-level glycopeptide resistance? J Infect Dis, 187(6), 929-938. doi: 10.1086/368128

Sakoulas, G., Moellering, R. C., Jr., & Eliopoulos, G. M. (2006). Adaptation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the face of vancomycin therapy. Clin Infect Dis, 42 Suppl 1, S40-50. doi: 10.1086/491713

Sambandam, S. N., Rohinikumar, G. J., Gul, A., & Mounasamy, V. (2016). Intramuscular Injection Abscess Due to VRSA: A New Health Care Challenge. Arch Bone Jt Surg, 4(3), 277-281.

Schwartz, D. C., & Cantor, C. R. (1984). Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell, 37(1), 67-75. doi: 10.1016/0092-8674(84)90301-5

Sharif, S., Singh, M., Kim, S. J., & Schaefer, J. (2009). Staphylococcus aureus peptidoglycan tertiary structure from carbon-13 spin diffusion. J Am Chem Soc, 131(20), 7023-7030. doi: 10.1021/ja808971c

Shoji, M., Cui, L., Iizuka, R., Komoto, A., Neoh, H. M., Watanabe, Y., . . . Hiramatsu, K. (2011). walK and clpP mutations confer reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 55(8), 3870-3881. doi: AAC.01563-10 [pii]10.1128/AAC.01563-10

Shorr, A. F. (2007). Epidemiology of staphylococcal resistance. Clin Infect Dis, 45 Suppl 3, S171-176. doi: 10.1086/519473

Sievert, D. M., Ricks, P., Edwards, J. R., Schneider, A., Patel, J., Srinivasan, A., . . . Participating, N. F. (2013). Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2009-2010. Infect Control Hosp Epidemiol, 34(1), 1-14. doi: 10.1086/668770

Sievert, D. M., Rudrik, J. T., Patel, J. B., McDonald, L. C., Wilkins, M. J., & Hageman, J. C. (2008). Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus in the United States, 2002-2006. Clin Infect Dis, 46(5), 668-674. doi: 10.1086/527392

Silveira, A. C., Cunha, G. R., Caierao, J., Cordova, C. M., & d'Azevedo, P. A. (2015). Molecular epidemiology of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in Brazil. Braz J Infect Dis, 19(5), 466-472. doi: 10.1016/j.bjid.2015.06.013

Page 125: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 107

Sola, C., Lamberghini, R. O., Ciarlantini, M., Egea, A. L., Gonzalez, P., Diaz, E. G., . . . Bocco, J. L. (2011). Heterogeneous vancomycin-intermediate susceptibility in a community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus epidemic clone, in a case of Infective Endocarditis in Argentina. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 10, 15. doi: 10.1186/1476-0711-10-15

Song, J. H., Hiramatsu, K., Suh, J. Y., Ko, K. S., Ito, T., Kapi, M., . . . Lee, N. Y. (2004). Emergence in Asian countries of Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin. Antimicrob Agents Chemother, 48(12), 4926-4928. doi: 48/12/4926 [pii]10.1128/AAC.48.12.4926-4928.2004

Strommenger, B., Cuny, C., Werner, G., & Witte, W. (2004). Obvious lack of association between dynamics of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus in central Europe and agr specificity groups. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23(1), 15-19. doi: 10.1007/s10096-003-1046-8

Sun, W., Chen, H., Liu, Y., Zhao, C., Nichols, W. W., Chen, M., . . . Wang, H. (2009). Prevalence and characterization of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates from 14 cities in China. Antimicrob Agents Chemother, 53(9), 3642-3649 doi: AAC.00206-09 [pii]10.1128/AAC.00206-09

Takahashi, J., Komatsuzawa, H., Yamada, S., Nishida, T., Labischinski, H., Fujiwara, T., . . . Sugai, M. (2002). Molecular characterization of an atl null mutant of Staphylococcus aureus. Microbiol Immunol, 46(9), 601-612.

Tenover, F. C., Arbeit, R. D., Goering, R. V., Mickelsen, P. A., Murray, B. E., Persing, D. H., & Swaminathan, B. (1995). Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 33(9), 2233-2239.

Tenover, F. C., Biddle, J. W., & Lancaster, M. V. (2001). Increasing resistance to vancomycin and other glycopeptides in Staphylococcus aureus. Emerg Infect Dis, 7(2), 327-332. doi: 10.3201/eid0702.700327

Tenover, F. C., & Moellering, R. C., Jr. (2007). The rationale for revising the Clinical and Laboratory Standards Institute vancomycin minimal inhibitory concentration interpretive criteria for Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis, 44(9), 1208-1215. doi: 10.1086/513203

Thanert, R., Goldmann, O., Beineke, A., & Medina, E. (2017). Host-inherent variability influences the transcriptional response of Staphylococcus aureus during in vivo infection. Nat Commun, 8, 14268. doi: 10.1038/ncomms14268

Thati, V., Shivannavar, C. T., & Gaddad, S. M. (2011). Vancomycin resistance among methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates from intensive care units of tertiary care hospitals in Hyderabad. Indian J Med Res, 134(5), 704-708. doi: 10.4103/0971-5916.91001

Thoendel, M., & Horswill, A. R. (2009). Identification of Staphylococcus aureus AgrD residues required for autoinducing peptide biosynthesis. J Biol Chem, 284(33), 21828-21838. doi: 10.1074/jbc.M109.031757

Page 126: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

108 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Tiwari, H. K., & Sen, M. R. (2006). Emergence of vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA) from a tertiary care hospital from northern part of India. BMC Infect Dis, 6, 156. doi: 10.1186/1471-2334-6-156

Toth, A., Kispal, G., Ungvari, E., Violka, M., Szeberin, Z., Paszti, J., . . . Fuzi, M. (2008). First report of heterogeneously vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) causing fatal infection in Hungary. J Chemother, 20(5), 655-656. doi: 10.1179/joc.2008.20.5.655

Traber, K. E., Lee, E., Benson, S., Corrigan, R., Cantera, M., Shopsin, B., & Novick, R. P. (2008). agr function in clinical Staphylococcus aureus isolates. Microbiology, 154(Pt 8), 2265-2274. doi: 10.1099/mic.0.2007/011874-0

Tsuji, B. T., Rybak, M. J., Lau, K. L., & Sakoulas, G. (2007). Evaluation of accessory gene regulator (agr) group and function in the proclivity towards vancomycin intermediate resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 51(3), 1089-1091. doi: 10.1128/AAC.00671-06

Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Sakoulas, G., & Mylotte, J. M. (2009). Loss of vancomycin bactericidal activity against accessory gene regulator (agr) dysfunctional Staphylococcus aureus under conditions of high bacterial density. Diagn Microbiol Infect Dis, 64(2), 220-224. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.01.028

Van Hal, S. J., Jones, M., Gosbell, I. B., & Paterson, D. L. (2011). Vancomycin heteroresistance is associated with reduced mortality in ST239 methicillin-resistant Staphylococcus aureus blood stream infections. PLoS One, 6(6), e21217. doi: 10.1371/journal.pone.0021217

Van Hal, S. J., & Paterson, D. L. (2011). Systematic review and meta-analysis of the significance of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates. Antimicrob Agents Chemother, 55(1), 405-410. doi: 10.1128/AAC.01133-10

Vaudaux, P., Ferry, T., Uckay, I., Francois, P., Schrenzel, J., Harbarth, S., & Renzoni, A. (2012). Prevalence of isolates with reduced glycopeptide susceptibility in orthopedic device-related infections due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 31(12), 3367-3374. doi: 10.1007/s10096-012-1705-8

Vega, F., Alarcón, P., Dominguez, M., Bello, H., Riedel, G., Mella, S., . . . Gonzalez-Rocha, G. (2015). Aislamiento de Staphylococcus aureus hetero-resistente a vancomicina en Hospital Clínico Regional de Concepción, Chile. Rev Chilena Infectol, 32(5), 588-590. doi: S0716-10182015000600017

Walters, M. S., Eggers, P., Albrecht, V., Travis, T., Lonsway, D., Hovan, G., . . . Kallen, A. (2015). Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - Delaware, 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 64(37), 1056. doi: 10.15585/mmwr.mm6437a6

Page 127: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

Bibliografía 109

Wang, R., Braughton, K. R., Kretschmer, D., Bach, T. H., Queck, S. Y., Li, M., . . . Otto, M. (2007). Identification of novel cytolytic peptides as key virulence determinants for community-associated MRSA. Nat Med, 13(12), 1510-1514. doi: 10.1038/nm1656

Wang, W. Y., Lee, S. Y., Chiueh, T. S., & Lu, J. J. (2009). Molecular and phenotypic characteristics of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates from patients with septic arthritis. J Clin Microbiol, 47(11), 3617-3623. doi: 10.1128/JCM.00539-09

Wootton, M., Howe, R. A., Hillman, R., Walsh, T. R., Bennett, P. M., & MacGowan, A. P. (2001). A modified population analysis profile (PAP) method to detect hetero-resistance to vancomycin in Staphylococcus aureus in a UK hospital. J Antimicrob Chemother, 47(4), 399-403.

Wootton, M., Bennett, P. M., MacGowan, A. P., & Walsh, T. R. (2005). Reduced expression of the atl autolysin gene and susceptibility to autolysis in clinical heterogeneous glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus (hGISA) and GISA strains. J Antimicrob Chemother, 56(5), 944-947. doi: 10.1093/jac/dki289

Wootton, M., MacGowan, A. P., Walsh, T. R., & Howe, R. A. (2007). A multicenter study evaluating the current strategies for isolating Staphylococcus aureus strains with reduced susceptibility to glycopeptides. J Clin Microbiol, 45(2), 329-332. doi: 10.1128/JCM.01508-06

World Health Organization - WHO. (2017). Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. Recuperado de: http://www.who.int/medicines/publications/global-priority-list-antibiotic-resistant-bacteria/en/

Yarwood, J. M., & Schlievert, P. M. (2003). Quorum sensing in Staphylococcus infections. J Clin Invest, 112(11), 1620-1625. doi: 10.1172/JCI20442112/11/1620

Yim, G., Thaker, M. N., Koteva, K., & Wright, G. (2014). Glycopeptide antibiotic biosynthesis. J Antibiot (Tokyo), 67(1), 31-41. doi: 10.1038/ja.2013.117

Yoo, J. I., Kim, J. W., Kang, G. S., Kim, H. S., Yoo, J. S., & Lee, Y. S. (2013). Prevalence of amino acid changes in the yvqF, vraSR, graSR, and tcaRAB genes from vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus. J Microbiol, 51(2), 160-165. doi: 10.1007/s12275-013-3088-7

Yoshida, Y., Matsuo, M., Oogai, Y., Kato, F., Nakamura, N., Sugai, M., & Komatsuzawa, H. (2011). Bacitracin sensing and resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett, 320(1), 33-39. doi: 10.1111/j.1574-6968.2011.02291.x

Yusof, A., Engelhardt, A., Karlsson, A., Bylund, L., Vidh, P., Mills, K., . . . Walsh, T. R. (2008). Evaluation of a new Etest vancomycin-teicoplanin strip for detection of glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus (GISA), in particular, heterogeneous GISA. J Clin Microbiol, 46(9), 3042-3047. doi: 10.1128/JCM.00265-08

Page 128: Caracterización de aislamientos Staphylococcus aureus

110 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3

países en Suramérica

T de la tesis o trabajo de investigación

Zankari, E., Hasman, H., Cosentino, S., Vestergaard, M., Rasmussen, S., Lund, O., …. Larsen, M. V. (2012). Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J Antimicrob Chemother, 67(11), 2640-2644. doi: 10.1093/jac/dks261

Zhang, S., Sun, X., Chang, W., Dai, Y., & Ma, X. (2015). Systematic Review and Meta-Analysis of the Epidemiology of Vancomycin-Intermediate and Heterogeneous Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus Isolates. PLoS One, 10(8), e0136082. doi: 10.1371/journal.pone.0136082

Zurita, J., Barba, P., Ortega-Paredes, D., Mora, M., & Rivadeneira, S. (2016). Local circulating clones of Staphylococcus aureus in Ecuador. Braz J Infect Dis. doi: 10.1016/j.bjid.2016.08.006