practica no. 3 microbiologia agro

7/31/2019 Practica No. 3 Microbiologia Agro

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Prcticas de Laboratorio de Microbiologa

Departamento de Biologa - FACENED

Mb. Bibiana Duarte Restrepo

1.1. Determinar efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin deoxgeno, sobre la morfologa y desarrollo de cultivos bacterias aislados en la

prctica anterior.

1.2. Aprender tcnicas de siembra y lectura de crecimiento en cultivos slidos ylquidos, y en cultivos en anaerobiosis

1.3. Realizar tcnica de microcultivo de Hongos para optimizar las observaciones ycaracterizacin de estructuras vegetativas y reproductivas

Para estudiar un microrganismo es necesario previamente poder aislarlo y cultivarlo en

las condiciones del laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cules son las

condiciones medioambientales y los nutrientes que requieren para su ptimo desarrollo y

reproduccin. En general, cuando se habla de desarrollo o crecimiento microbiano este

puede ser definido por un aumento de la masa celular, en el caso de las bacterias la

mayora de las veces nos referimos a un crecimiento poblacional mediado por los

procesos de replicacin del ADN y divisin celular, donde cada clula aislada o UFC

(Unidad Formadora de Colonia) origina primero 2 clulas hijas por fisin binaria hasta

conformarse una colonia y es una medida cuantitativa del nmero de bacterias iniciales.

En los hongos podramos hablar de un crecimiento celular ya que de una misma hifa o

espora se puede generar una gran cantidad de masa celular sobre el medio de

crecimiento formndose, y una vez que esporula cada espora es un individuo potencial y

hablamos de crecimiento poblacional. En esta oportunidad nos vamos a centrar en los

factores medioambientales o abiticos que condicionan las capacidades metablicas de

los microrganismos y por lo tanto su crecimiento, dejando de lado las relaciones intra e

inter-especficas que pueden afectar la dinmica del crecimiento microbiano.


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Ya sea que hablemosde crecimiento poblacional o celular factores como la temperatura, el pH, la presin

osmtica, la tensin de oxgeno, la intensidad lumnica y la presin atmosfrica afectan,

retardan, aceleran o definitivamente detienen el crecimiento de los microrganismos y los

llevan a la muerte. El identificar la influencia sobre el desarrollo y crecimiento

microbiano de dichos factores nos ayudar a explicar su distribucin en la naturaleza y

a disear mtodos para su control o inhibicin total (ver 6. Lectura complementaria).

No todos los microrganismos responden de la misma forma a un factor ambiental

determinado, convirtindose en una herramienta til a la hora de su aislamiento, cultivo,

clasificacin e identificacin en el laboratorio, dependiendo de si el microrganismos espatgeno (causante de enfermedad), saprfito (flora inocua que vive en la materia

orgnica muerta y ayuda a su descomposicin) u oportunista (puede causar enfermedad

o no dependiendo de los factores nutricionales, estructurales e inmunes del husped y

del medio), siendo este ltimo el que puede adaptarse a rangos ms amplios de dichas

condiciones. De hecho una condicin ambiental puede ser daina para un

microrganismo o beneficiosa para otro, pueden tolerar algunas condiciones adversas, que

rebasadas nos les permiten crecer y por lo tanto debemos diferenciar entre las

condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproduccin.

a. Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de ms de 2000reacciones bioqumicas de una gran diversidad, y la velocidad con que se efectan

dichas reacciones esta influida por la temperatura, l cuela puede determinar en parte la

velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microrganismos. Las

variaciones en temperatura pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa

celular. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento

clasificndose segn esto en los siguientes grupos:

Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima esalrededor de los 15 C. Ej: Flavobaterium sp

Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. Ej: Escherichia coli Euritermfilas: termfilas facultativas, aquellas que son capaces de crecer entemperaturas de las mesfilas. Ej: Bacillus stearothermophilus

Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C. Ej: Thermococcus celer Hipertermfilas: crecen a temperaturas superiores a los 80 C 1Pyrodictium brockii1

Hasta hace poco la temperatura ms alta de crecimiento reportada era de 105 C, entonces se crea que el

lmite de temperatura para la vida era de 100 C (punto de ebullicin del agua). Se han encontrado bacterias

que crecen en chimeneas calientes hidrotermales o "black smokers" (fumarolas negras) ubicadas en las

grietas del suelo ocenico que expulsan aguas bentnicas a temperaturas superiores a los 350 C. Se ha

demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 C.


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b. Potencial de hidrgeno, es un de los factores ms importantes ya que condiciona ladisponibilidad de nutrientes del medio para el microrganismo y refleja a la vez los

efectos sobre el medio del metabolismo mismo del microrganismo. Algunos

microrganismos toleran cambios de pH de 3 o 4 unidades. Los microrganismos que

soportan pH cidos se denominan acidfilos y pueden llegar a crecer en ph 4, los que

soportan pH bsicos se llaman basfilos o alcalinfilos. Como ya se sabe el pH

depende del tipo de soluciones que se encuentren presentes y disociadas en el medio,

y as mismo el pH puede cambiar por los procesos metablicos de los microrganismos

que generan sustancias cidas o bsicas que son liberadas al medio por la clula:

Utilizacin de carbohidratos---->Produccin de cidos orgnicos----> Acidificacin Catabolismo de protenas---->Produccin de materiales nitrogenados---->Alcalinizacin

Aunque los microrganismos crecen a menudo en medios con amplios rangos de pH, su

tolerancia tiene un lmite ya que variaciones intensas pueden alterar la membrana

citoplasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras, la

muerte bacteriana se produce su el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5, los

cambios de pH pueden ionizar los nutrientes disminuyendo su disponibilidad por el

organismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas

tampn o buffer que mantenga el pH del medio regulado durante todo el crecimientopara que no se vea afectado por el metabolismo del microrganismo. Uno de los ms

utilizados en microbiologa es la combinacin de Fosfatos de Potasio (KH2PO4 y

K2HPO4, manteniendo el pH del medio en aprox. en 6,8) tambin se usa la peptona.

El pH del medio se puede ajustar antes de esterilizarlo, titulando parte del medio con

Hidrxido de Sodio (NaOH) o Acido Clorhdrico (HCL) y ajustando el resto con las

mismas sustancias. De acuerdo al rango de pH ptimo de crecimiento los

microrganismos pueden clasificarse como:

Acdofilos: 0 a 5,5 Ej: Thiobacillus thiodoxidans, ptimo 2,0 a 3,5 Neutrofilos: 5,5 a 8.0 Ej: Escherichia coli, ptimo 6,0 a 7,0 Basfilos o Alcalfilos: 8,5 a 11,5, Ej: Bacillus alcalophilus, ptimo 10,6 (alcalfiloextremo)

c. Presin osmtica/Disponibilidad del agua: Los medios de cultivo deben ser ligeramente

hipotnicos que el interior de la clula, ya que de esta manera se facilita el flujo de

agua con nutrientes disueltos hacia el interior de las clulas. Aunque para la mayora

de los microrganismos el Cloruro de Sodio (NaCl) no es indispensable para su

crecimiento (salvo para las bacterias marinas (%NaCl=3) que requieren de


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concentraciones de Na en el medio para mantener en su interior concentraciones de K

adecuadas. Existen bacterias que requieren de medio hipertnicos denominadas halfilascomo Halobacterium sp (halfilo extremo) que pueden soportar hasta un 20% de

concentracin de NaCl, encontrado en lagos salados como los del Mar muerto (aw=

0.75)

La concentracin de solutos esta condicionada por la cantidad de agua disponible en el

medio, expresada en trminos fsicos como actividad del agua aw2. Se presenta en

rangos desde 1.0 (agua pura y pan), pasando por 0,95 (conservas), 0.80 los lagos

salados, 0,75 (cereales, caramelos, frutos secos, chocolate) hasta 0.60 (leche en

polvo). Por debajo de 0,55 se altera el ADN y por lo tanto no hay sobrevivencia.

La mayora de los microroganismos crecen e aw superiores a 0.95 donde se ubican losdel mar aw= 0,98. En actividades de agua inferiores hablamos de organismos

osmotorelantes que sintetizan o acumulan sustancias en el citoplasma para obtener agua

del medio denominadas solutos compatibles (pues no inhiben la bioqumica celular),

tales como la batana, prolina, glutamato, sacarosa, ectona, etc., esta capacidad esta

regulada genticamente permitiendo clasificar dichos microrganismos de acuerdo a la

concentracin y tipo de soluto compatible encontrado en su citoplasma. Existen especies

sacarfilas como la levadura Sacharomyces rouxii que pueden soportar aw cercanos a

0,60, otros se denomina xerfilos que crecen en ambientes muy secos con poca

disponibilidad de agua.

d. Tensin de Oxgeno:Los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el

oxgeno y el dixido de carbono. Casi todos los organismos superiores son aerbicos

obligados, donde el oxgeno acta como, aceptor final de electrones durante la

respiracin aerbica, adems los eucariotes utilizan el oxgeno para sintetizar esteroles y

cidos grasos instaurados. Los microrganismos presentan una respuesta amplia y variable

al oxgeno libre (Ver Tabla en la siguiente pgina)

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la

exposicin de estos microrganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de

anaerobiosis por los siguientes mtodos: Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sdico,para disminuir el contenido de O2.

Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y remplazndolo por N2 o CO2. Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivoinoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender

una vela se consume el oxigeno presente.

2aw: Razn entre la presin de vapor de aire con una sustancia o solucin y presin de vapor del agua pura a

la misma temperatura de la sustancia, inversamente proporcional a la presin osmtica.


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Tabla 3.1.: Relaciones de los microrganismos con el Oxgeno

Grupo Requerimiento

O2

Metabolismo Ejemplo Hbitat tpico del

Ejemplo

Aerbicos

Obligados o

Estrictos

Si Respiracin aerbica Micrococcus luteus Piel, polvo

Facultativos No Respiracin aerbica y

anaerobia, Fermentacin

Escherichia coli Intestino

Microaerfilos Si, baja

tensin

Respiracin aerbica Spirillium

volutans

Lagos

Anaerobios

Aerotolerantes No Fermentacin Streptococcus

pyogenes

Tracto respiratorio

Obligados o

Estrictos

Letal Fermentacin,

Respiracin anaerobia

Methanobacterium

formicicum

Diverso, rumen

Para los microaerfilos que no soportan tensiones de oxgeno atmosfricas mayores

(20%) se deben suministrar tensiones de 2 al 10%. Entre bacterias y protozoos

podemos encontrar todos los 5 grupos de tolerancia e intolerancia al O2, los hongos son

normalmente aerbicos, las levaduras anaerobias facultativas y las algas son aerbicas

obligadas. El oxgeno puede llegar a ser txico para algunos organismos ya que

muchas enzimas se inactivan cuando se oxidan. Cuando los organismos tienen comoaceptor de electrones al oxgeno, deben protegerse a si mismos sintetizando enzimas

como la superoxido dismutasa y la catalasa, ya que los productos de la reduccin del

oxgeno mismo son extremadamente txicos, como el radical superxido, el perxido de

hidrgeno y el radical hidrxilo. Estas enzimas son ausentes en los anaerobios

estrictos.

e. Suministro de luz: Los organismos fotosintticos o fototrfos debern ser expuestos a

una fuente de iluminacin ya que la luz es su fuente de energa, como es el caso de

las cianobacterias y algas. Esta fuente de iluminacin no debe plantear problemas de

variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con undesprendimiento mnimo de calor.

Para reproducir los microrganismos en

el laboratorio es necesario suministrarles adems de las condiciones ptimas para su

desarrollo, los nutrientes necesarios: fuentes de carbono (principalmente azcares), sales

inorgnicas (macro y oligoelementos), protenas (aminocidos y N orgnico) y factores

de crecimiento (vitaminas) necesarias a travs de la formulacin de medios de cultivo

sintticos o la utilizacin de materias primas naturales. Sea cual fuere el origen del

medio, este debe prepararse y esterilizarse de tal forma que facilite la observacin del


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crecimiento microbiano y la seguridad de contar con un medio libre de otros organismos

contaminantes. Los medios de cultivo deben ser diseados segn la especificidad delanlisis, el tipo de microrganismo interviniente y sus condiciones ptimas de desarrollo.

Los medios comnmente utilizados renen los requerimientos bsicos de la mayora de

los hetertrofos. En general los medios de cultivo se clasifican segn:

a. Estado:

Medios lquidos Medios slidos, llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacridoproducido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una

concentracin del 1,5%

Medios semislidos: agar a una concentracin del 0,7%.a. Composicin: Medios sintticos o qumicamente definidos, tienen un fuente de carbono, fuente denitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son

estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a

concentraciones conocidas.

Medios complejos o de composicin indefinida, estos llevan ingredientes como extractode levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen

nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni

cuantitativa de estos nutrientes.

Medios de enriquecimiento, son medios complejos (normalmente) con aditivosadicionales para favorecer el crecimiento de determinados microrganismos (particularmente

hetertrofos exigentes). Ej: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales

y plantas.

Medios selectivos, son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especficode un microrganismo particular (o grupo de microrganismos). Es de gran utilidad para

el aislamiento de microrganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ej: CO2

como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe

el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo

crecern los que usen maltosa.

Medios diferenciales, son aquellos destinados a facilitar la discriminacin demicrorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos

medios. Ej: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia

lactosa (+) de lactosa (-).

Medios de mantenimiento, suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que elcrecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas, por lo

general se les suprime la glucosa para mantener una poblacin normal, evitando la

acidificacin del medio que afecte las clulas


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Medios de recuento, utilizados para realizar recuentos de microrganismos con algnnivel de seleccin, Ej: Verde bilis brillante, TSA Triptona Soya Agar para mesfilosviables.

Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras

tomadas por cada grupo.

3.1. Efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno. Materiales

por grupo:

temperatura pH presin osmtica tensin de oxgeno

3 cajas de petripequeas con Agar

Nutritivo AN

3 Cajas de petripequeas con AN con

los siguientes pH

4 tubos de ensayocon CN con las

siguientes

concentraciones:

1 tubo de ensayo conAN sin solidificar para

siembra con prueba

de tensin de O2

Temperaturas a

cultivar:

4 C, 37oC, 60o C

1 caja con pH 2

1 caja con pH 6.8

1 caja con pH 8.5

1 tubo con [0.85%]

de NaCl

1 tubo con [3%] de

NaCl

1 caja de petri

pequea con AN para

cultivo en anaerobiosis

1 tubo de ensayo con

TSB Caldo Triptona

Soya efecto

temperatura deebullicin (100oC)

Caja de galletas o

frasco de boca ancha

de 30 cms, 2 velas

Nevera, Incubadoras (37oCy 60oC), Bao Mara

Procedimiento.

1. Realizar pases de la cepa purificada y caracterizada con asa redonda en cada uno

de los medios segn sea lquido o solido, y de acuerdo a las pruebas de temperaturas,

pH, presin, etc.

2. Salvo las pruebas de temperatura incubar el resto de los medios sembrados a 37oC

3. Realizar pase de la cepa en tubo de ensayo con TBS, someter 15 minutos a 100

C en Bao Mara, realizar extensin y tincin con Gram y luego incubar a 25 oC4. Realizar siembra profunda de la cepa, aplicando AN fundido para observar efecto de

la tensin de oxgeno sobre el crecimiento

5. Realizar siembra en caja de petri con AN y someter en cmara de anaerobiosis

(caja de galletas con velas encendidas)

6. Realizar lecturas comparando crecimiento, morfologa macro y micro de la cepa

purificada para determinar efecto de la temperatura y los otros factores sobre la cepa

6. Mantener cepa purificada en nevara sellado con vinipel, no descartar el primer

aislamiento.


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3.2. Crecimiento en Agar Inclinado y Motilidad

1 Tubo con Agar Nutritivo Inclinado1 Tubo con medio para ver motilidad SIM3

Procedimiento.

1. Sembrar inoculo de la cepa bacteriana aislada con asa recta en tubo de agar

inclinado y tubo con medio SIM, de forma precisa y recta.

2. Observar y describir tipo de crecimiento en ambos medios, en el medio SIM observar

coloracin y reaccin segn literatura.

3.3. Crecimiento y observacin de estructuras microscpicas de Hongos en Microcultivo

Cepas de hongos aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras

tomadas por cada grupo. 1 montaje de microcultivo esterilizado por cada grupo conmedio PDA o Saboraud

Figura 1. Tcnica de Microcultivo

Procedimiento.

Se deposita un cuadrado del medio estril sobre un portaobjetos previamente esterilizado.

Se siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjeto sobre el cuadrado de

medio, se lleva a incubadora de 25oC, hacen observaciones a las 24, 48 y 72 horas.

Cuando se verifica crecimiento de micelio del hongo sobre el medio y por ende en el

cubreobjeto, se toma este cuidadosamente y se coloca sobre una gota de azul de

lactofenol o azul de metileno, se sella con esmalte y se observa al microscopio para

hacer descripcin microscpica de las estructuras vegetativas y de reproduccin del

hongo. Anote en cuadro sobre estudio de su cepa de hongo que viene complementando

desde la clase anterior

Otros materiales.

Coloraciones de Gram, Azul de Lactofenol, Azul de Metileno Portas y cubreobjetos Microscopio, Hipoclorito, Alcohol, Solucin salina (0,85%), Asas, Pinzas, Gradilla y Mechero3Medio SIM: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de

hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.


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Cinta de enmascarar, vinipel

5.1. Investigue otros 2 ejemplos de microrganismos, segn la clasificacin realizada deacuerdo las condiciones de temperatura, pH, tensin de oxgeno, presin

osmtica,

5.2. Investigue otros ejemplos de medios de cultivo segn los tipos presentados, cuales la composicin y el principio de lectura del medio SIM que se utilizo para ver

motilidad

5.3. Cules con los organismos barotolerantes y barfilos, donde se encuentran, citeejemplos.

Anote y dibuje de esta manera sus observaciones de las cepas aisladas/ sembradas en

los diferentes medios y factores (temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de

oxgeno), referenciado los resultados de crecimiento4 y morfologa macro y microscpica

de la cepa

No.

Grupo/

Muestra

Morfologa

previa

Macro y

Micro del

Aislamiento

4 C 25 C 60 C 100 C

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Anote los resultados sobre efecto del pH:

No.

Grupo/

Muestra

Morfologa

previa

Macro y

Micro del

Aislamiento

pH 2 pH 6.8 pH 8.5

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:

4Crecimiento: Abundante: +++ , Medio: ++ , Escaso: + , Nulo: 0


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No.Grupo/

Muestra

Morfologaprevia

Macro y

Micro del

Aislamiento

0.2 % Na Cl 0.85% Na Cl 15% NaCl

Crecimiento Morfo. Crecimiento Morfo. Crecimiento Morfo.

Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:

No.

Grupo/

Muestra

Morfologa

previa

Macro y

Micro del

Aislamiento

0.2 % Sacarosa 0.85% Sacarosa 15% Sacarosa

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Crecimiento

Morfo

Macro y

Micro

Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en cuenta la siguiente

clasificacin:

Aerbico

Facultativo

Aerbico

Obligado o

Estricto

Microarerfilo Anaerobio

Aerotolerante

Anaerobio

Obligado o

Estricto

O


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CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS:ESTERILIZACION Y DESINFECCION

Reconocer las principales tcnicas de control de las poblaciones microbianas:

Esterilizacin y Desinfeccin, revisin terica

a. Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas.

b. Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos.

c. Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el

desarrollo de los microrganismos e incluso pueda matarlos.d. Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microrganismos al campo de

trabajo.

e. Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del

crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.

f. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microrganismos

(antibacterianos, antifngicos, etc.)

g. Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las

esporas de un microrganismo (bactericida, fungicida, etc.).

h. Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microrganismos

(bacteriostticos, fungistticos, etc.).i. Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

j. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.k. Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.l. Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de

enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas

malignas.

m. Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otroser vivo

Otro aspecto necesario y crtico en el trabajo en microbiologa es el lavado, desinfeccin

y esterilizacin adecuados segn el tipo de material y su uso. En general se utiliza

material de vidrio y algunas veces de plstico como el polipropileno, polietileno y el

niln (entre ms opaco el material como el niln ms soporta calor y puede ser

esterilizado. En todos los casos debe ser esterilizado primero el medio de cultivo o

material usado o contaminado antes de descartarlo, luego se retira con cepillo y agua

los desechos y se sumerge por 3 horas en detergente, se lava bien y se deja secar

en un horno o a temperatura ambiente. Si se requiere estril se lleva al autoclave, el


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cual funciona a base de calor hmedo a temperatura de 121C por 15 libras/pulgada2

de presin, durante 15 a 30 minutos. Tambin se puede esterilizar en fro con oxidode etileno, con radiaciones ionizantes (rayos gamma emanados por fuentes de Cobalto

68 o cesio 139), rayos catdicos (generadores de electrones), rayos X (mortales para

todas las clulas), ests tcnicas son costosas, sin embargo son efectivas y puede

utilizarse constantemente con material de plstico. La luz ultravioleta (bactericida desde

los 333 nm) es usada frecuentemente en laboratorios especializados y quirfanos para

reducir el nmero de bacterias del ambiente, sin embargo no se usa para esterilizar

material del laboratorio debido a su poca penetrabilidad.

Es conveniente tapar o envolver el material antes de esterilizarlo con tapones de algodn

y gasa y con papel kraft, mantenindolos en un lugar seco hasta su uso (de estaforma una material esterilizado puede durar hasta un ao disponible). De la misma

forma una vez preparados y bien disueltos los medios de cultivo se esterilizan en fiolas

llenas hasta la mitad y sin cerrar totalmente. Para luego verterlas en los tubos o cajas

de petri siempre al lado del mechero.

Los procedimientos de esterilizacin y desinfeccin por calor se basan en que los

diferentes microrganismos tienen rangos de temperatura especficos, teniendo un mximo

de temperatura sobre la cual detienen su crecimiento y pueden morir por la

desnaturalizacin de sus sistema enzimtico y una temperatura mnima bajo la cual no

se desarrollan ya sea porque los proceso de sntesis de protenas son extremadamentesensibles al fro o por que los lpidos empiezan de su estructura celular empiezan a

solidificarse. Cada microrganismo se ubica dentro de un lmite estrecho de temperatura

ptima que favorece su metabolismo y reproduccin. Para la mayora de las bacterias

patgenas la temperatura ptima esta entre 35 y 37 C, de esta forma en un proceso

infeccioso la fiebre es un mecanismo de defensa del ya que al presentarse una

temperatura mayor se desnaturalizan protenas esenciales del patgeno causando su

muerte o deteniendo su proliferacin. Las clulas vegetativas son ms sensibles al

calor que las esporas, que se constituyen en estructuras de resistencia en las cuales ha

ocurrido un proceso de deshidratacin y acumulacin de sustancias como el dipicolinato

de calcio en la pared celular. Sin embargo con la temperatura que puede alcanzar el

autoclave la mayora de las esporas se inactivan.

Criterio de muerte de un microrganismo: prdida irreversible de la capacidad de

reproduccin en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana

(la muerte de los microrganismos) se utilizan tcnicas que descubran a los

sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de

reproducirse estn muertos. Esto se determina generalmente mediante mtodos


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cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque

forman colonias.

Cuando una poblacin microbiana se expone a un agente letal, la cintica de la muerte

es casi siempre exponencial ya que el nmero de supervivientes disminuye de forma

geomtrica con el tiempo. Si representamos grficamente el logaritmo del nmero de

supervivientes frente al tiempo se obtiene una lnea recta cuya pendiente negativa define

la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice solamente que fraccin de la

poblacin inicial sobrevive a un determinado perodo de tratamiento. Para determinar el

nmero real de sobrevivientes es necesario conocer adems el tamao inicial de la

poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilizacin hay

que tener en consideracin dos factores: la tasa de mortalidad y el tamao de lapoblacin inicial. En la prctica de la esterilizacin la poblacin microbiana que ha de

ser destruida es mixta. Como los microrganismos difieren ampliamente en su resistencia

a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao de la

poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la

poblacin mixta. Para asegurar la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin se utilizan

suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de

esterilizacin se disean siempre de forma que proporcionen un amplio margen de

seguridad.

a. Temperatura: a mayor temperatura mayor accin.b. Tipo de microrganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms

susceptibles que las esporas.

c. Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que lasviejas.

d. Ambiente: El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en lapenetracin del agente.

Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistenciatrmica de los organismos.

La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de losagentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microrganismo.

a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es

uno de los mtodos ms efectivos para destruir microrganismos. Hay que distinguir entre

calor hmedo y calor seco. El hmedo mata los microrganismos porque coagula sus


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protenas siendo ms rpido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus

constituyentes qumicos. La accin letal del calor es una relacin de temperatura ytiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium

botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que

se necesitan alrededor de 2 horas de exposicin al calor seco para obtener los mismos

resultados.

Esterilizacin por calor hmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agentems prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas

superiores a las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave

(una olla que regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio seemplean generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la

presin atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de

exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes

pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son

mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben

esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser

alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microrganismos que contengan. Otras

sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose

en estos casos otros mtodos de esterilizacin.

Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse porencima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material

de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin.

Las esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente

exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas.

Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) sesometen a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de

microrganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura

seleccionada para la pasteurizacin se basa en el tiempo trmico mortal de

microrganismos patgenos (es el tiempo ms corto necesario para matar una suspensin

de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los

microrganismos patgenos ms resistentes al calor que puede transmitirse por la leche

cruda y se destruye en 15 minutos a 60 C. Posteriormente se descubri que Coxiella

burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms

resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la

leche se realiza a 62,8 C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente

superior, 71,7 C durante 15 segundos (Flash-Pasteurizacin).

Esterilizacin por calor seco: (se utiliza para materiales slidos estables al calor)


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Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material devidrio y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el hornoPasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de

exposicin a 160 C.

Incineracin: La destruccin de los microrganismos por incineracin es una prcticarutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros

Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacin de residuos hospitalarios.

b. Bajas Temperaturas. En general, el metabolismo de las bacterias est inhibido a

temperaturas por debajo de 0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los

microrganismos sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Esta

circunstancia es aprovechada por los microbilogos para conservar los microrganismosindefinidamente. Los cultivos de microrganismos se conservan congelados a -70 C o

incluso mejor en tanques de nitrgeno lquido a -196 C.

c. Radiaciones

Radiaciones ionizantes:

Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas porciertos istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este

istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma

pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y

despus esterilizar. Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizarmaterial quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se

puede esterilizar despus de empacado (ya que stas radiaciones penetran las

envolturas) y a la temperatura ambiente.

Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiacionesdesde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen

mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin

microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y

para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV

tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microrganismos que

se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin

de la luz UV son susceptibles de ser destrudos.

d. Filtracin

Algunos materiales como los lquidos biolgicos (suero de animales, soluciones de

enzimas, algunas vitaminas y antibiticos) son termolbiles. Otros agentes fsicos como


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las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprcticos para esterilizarlos,

por lo que se recurre a la filtracin a travs de filtros capaces de retener losmicrorganismos. Los microrganismos quedan retenidos en parte por el pequeo tamao

de los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su paso

a travs del filtro debido a la carga elctrica del filtro y de los microrganismos. Debido

al pequeo tamao de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los

mtodos de filtracin que dejan libre de bacterias una solucin, se van a eliminar

tambin los virus.

Filtros de membrana: Los filtros de membranas son discos de steres de celulosacon poros tan pequeos que previenen el paso de los microrganismos. Existen distintos

tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems

de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico deaguas ya que concentran los microrganismos existentes en grandes volmenes de agua.

Filtros HEPA: Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto porpliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los

microrganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

e. Desecacin. La desecacin de las clulas vegetativas microbianas paraliza su actividad

metablica. Este proceso fsico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la

refrigeracin. El tiempo de supervivencia de los microrganismos despus de desecados

depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos

Gram (-) son ms susceptibles a la desecacin que los cocos Gram (+). Las

endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecacin pudiendo permanecerviables indefinidamente.

a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que

sea voltil as como txico para los microrganismos, de manera que pueda ser

fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se

utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para

la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a

temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos

objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta

inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante

una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H).

b. Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad

antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y

hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.

a. Esterilizacin: es el proceso de destruccin de todas las formas de vida microbiana.


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b. Desinfeccin: es el proceso de destruccin de los agentes infecciosos.

Desinfectantes: son aquellas sustancias qumicas que matan las formas vegetativas y nonecesariamente las formas de resistencia de los microrganismos patgenos. Se refiere a

sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

c. Antispticos: son aquellas sustancias qumicas que previenen el crecimiento o accin

de los microrganismos ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se

refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

INORGANICOS. Metales: Los ms efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc.Actan inactivando las protenas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos

de mercurio que se emplean como antispticos en heridas superficiales de la piel y

mucosas estn el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos deplata utilizados como antispticos est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al

1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de los recin

nacidos aunque actualmente se est remplazando por antibiticos como la penicilina.

Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se

utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. Tambin es

fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fngicas de plantas (Mezcla

Bordolesa).

Acidos y lcalis: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En

general los cidos son ms eficaces que los lcalis. Dentro de estos compuestos se

encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido sdico (NaOH) ehidrxido potsico (KOH). Tienen aplicacin limitada debido a su naturaleza custica y

corrosiva. Aun as el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de

madera.

Compuestos inorgnicos oxidantes: actan oxidando los componentes de la membrana y

enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes) se utiliza como

antisptico en pequeas heridas de la piel.

Halgenos: Los halgenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos

antimicrobianos. Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son

altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las clulas

microbianas. Cloro: La muerte de los microrganismos por accin del cloro se debe en

parte a la combinacin directa del cloro con las protenas de las membranas celulares y

los enzimas. As mismo en presencia de agua desprende oxgeno naciente (O) que

oxida la materia orgnica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (cido hipocloroso)

HClO ----------------> HCl + O (oxgeno naciente)


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El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El

hipoclorito sdico (leja) al 1% se puede utilizar como desinfectante domstico.

Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su accin antimicrobiana es debido

a su accin oxidante. Adems la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el

aminocido tirosina resulta en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El iodo se

puede utilizar como antisptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solucin

alcohlica (tintura) de iodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI). ii)

iodforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actan como agentes

transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine)

es un complejo de iodo y polivinilpirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la ventaja de

que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente paradesinfectar la piel as como en la desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los

vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.

ORGANICOSAlcoholes: El alcohol metlico (1C) es menos bactericida que el etlico (2C) y adems

es altamente txico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la

longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior

al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se

suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas,

disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usacomo antisptico de la piel y como desinfectante en los termmetros clnicos orales y

algunos instrumentos quirrgicos.

Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata rpidamente a

las clulas vegetativas de los microrganismos. Sin embargo, las esporas son mucho ms

resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un olor desagradable ya

casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado por compuestos

fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms activas frente a

los microrganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenlicos que se utiliza para

desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y

compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana citoplsmica as

como desnaturalizando protenas.

a. Tcnica de dilucin en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente

qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada

tubo se le aade la misma cantidad de una suspensin del microrganismo utilizado como


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prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alcuota de cada tubo a

otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a latemperatura ptima de crecimiento del microrganismo utilizado como prueba durante 24 a

48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microrganismo mediante

la aparicin de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento

-). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilucin a la cual ese

agente qumico mata al microrganismo utilizado como prueba cuando este microrganismo

es expuesto al agente qumico durante ese perodo de tiempo.

b. Tcnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo

slido con el microrganismo utilizado como prueba. El agente qumico se coloca en el

centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al

cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento -) alrededor delagente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente qumico

en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula

con el microrganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento

microbiano.

c. Tcnica del coeficiente fenlico: Es una tcnica estandarizada que se utiliza para

comparar el poder desinfectante de un agente qumico frente al del fenol. Es una

modificacin de la tcnica de dilucin en tubo tal como se describe a continuacin: (i)

Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del

desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan

diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 mlde un cultivo de 24 horas del microrganismo utilizado como prueba (cepas especficas

de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se

recoge una alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de

cultivo estril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se

observa el crecimiento del microrganismo (aparicin de turbidez). (vi) La mayor

dilucin del desinfectante que mate a los microrganismos en 10 minutos pero no los

mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos

resultados. El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante.

practica no. 3 microbiologia agro

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