Microbiología

Introducción

Microbiología.La Microbiología, el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica.

Estructura moleculardistribución de los átomos en un compuesto por medio de los enlaces químicos. Existen varios tipos de enlace y las características típicas de la sustancia se deben a ellos. Cuando los átomos de un elemento pierden uno o más electrones se convierten en iones cargados positivamente (cationes). Estos electrones son captados por los átomos de otro elemento, convirtiéndolos en iones cargados negativamente (aniones). Como las cargas positivas y negativas se atraen, esos cationes y aniones se unen mediante un enlace iónico para formar un conjunto que consiste en grandes cantidades de iones de ambas clases. El compuesto resultante se llama compuesto iónico. Un ejemplo es el cloruro de sodio, que está compuesto por la misma cantidad de cationes de sodio y aniones de cloro.

Clasificación de los microorganismos Eucariontes Procariontes.Existen dos tipos fundamentalmente distintos de células, las procariotas § y las eucariotas §. En las células procarióticas, el material genético se encuentra en forma de una molécula grande y circular de DNA § a la que están débilmente asociadas diversas proteínas. En las células eucarióticas, por el contrario, el DNA es lineal y está fuertemente unido a proteínas especiales. Dentro de la célula eucariótica, el material genético está rodeado por una doble membrana, la envoltura nuclear §, que lo separa de los otros contenidos celulares en un núcleo § bien definido. En las procariotas, el material genético no está contenido dentro de un núcleo rodeado por una membrana, aunque está ubicado en una región definida llamada nucleoide §.

En el citoplasma se encuentra una gran variedad de moléculas y complejos moleculares. Por ejemplo, tanto los procariotas como los eucariotas contienen complejos proteicos y de RNA § llamadosribosomas § que desempeñan una función clave en la unión de los aminoácidos § individuales durante la síntesis de proteínas §. Las moléculas y complejos moleculares están especializados en determinadas funciones celulares. En las células eucarióticas, estas funciones se llevan a cabo en una gran variedad de estructuras rodeadas por membranas -llamadas organelas §- que constituyen distintos compartimientos internos dentro del citoplasma. Entre las organelas se destacan los peroxisomas § que realizan diversas funciones metabólicas; las mitocondrias §, centrales energéticas de las células y, en las algas y células vegetales, los plástidos como los cloroplastos §, donde acontece la fotosíntesis.

La membrana celular de los procariotas está rodeada por una pared celular § externa que es elaborada por la propia célula. Ciertas células eucarióticas, incluyendo las de las plantas y hongos, tienen una pared celular, aunque su estructura es diferente de la de las paredes celulares procarióticas. Otras células eucarióticas, incluyendo las de nuestros propios cuerpos y las de otros animales, no tienen paredes celulares. Otro rasgo que distingue a los eucariotas de los procariotas es el tamaño: las células eucarióticas habitualmente son de mayor tamaño que las procarióticas.

En las células eucarióticas, ciertas proteínas se organizan formando intrincadas estructuras que dan lugar a una especie de esqueleto interno, el citoesqueleto §, que aporta sostén estructural y posibilita el movimiento celular.

Algunos ejemplos de células procariotas son la bacteria Escherichia coli y las cianobacterias, grupo de procariotas fotosintéticos llamadas antes algas azules. Un eucariota fotosintético unicelular es el alga Chlamydomonas.

Características mas importantes en la industria de los alimentos.

Algunos   géneros bacterianos importantes en alimentos

Las bacterias se han utilizado desde los tiempos históricos más remotos para producir alimentos[1]. Los procesos bacterianos pueden darle a los alimentos más resistencia al deterioro o características organolépticas más agradables (sabor, textura, etc.). Existe un amplio rango de bacterias involucradas en la producción, conservación y alteración de productos alimenticios.

 

Bacterias lácticas o productoras de ácido láctico

Su característica más importante es la capacidad de fermentar los azúcares para dar ácido láctico. Debido a la rápida producción de ácido son capaces de eliminar a muchos microorganismos competitivos. La mayoría de las bacterias pertenecientes a este grupo crecen en el rango de los termófilos. En este grupo se incluyen:

Lactobacillus bacilos Gram positivos, forman cadenas en la mayoría de las especies, no esporulados y generalmente no móviles. Son microaerófilos, aunque existen algunos anaeróbios estrictos; son catalasa negativos y fermentadores. Son benéficas en la elaboración de quesos y fermentación de vegetales. Pero pueden producir gases que perjudican los quesos y vinos.

Streptococcus cocos Gram positivos, dispuestos característicamente en pares o cadenas. Las especies importantes en alimentos se dividen en: piógenos y estreptococos. Los piógenos comprenden especies patógenas, entre las que se encuentran S. agalactiae, que ocasiona mastitis en las vacas, y S. pyogenes, muy patógeno en humanos, el cual causa la faringitis séptica, escarlatina y otras enfermedades. Se puede encontrar en la leche cruda. Los piógenos crecen en rangos de temperaturas característicos de animales de sangre caliente (37°C). Los pertenecientes al grupo de los otrosestreptococoscrecen exclusivamente a 45°C. Incluyen el S. thermophilus, importante en la elaboración de quesos y en ciertas leches fermentadas como el yoghurt.

Enterococcus Cocos Gram positivos, no esporulados, hemolíticos. Crecen tanto a 10°C como a 45 °C. Resisten las temperaturas de pasterización de la leche e incluso mayores.; toleran un porcentaje de sal del 6.5% o superior; crecen a un pH alcalino de 9,6 unidades. En este grupo se encuentran E. faecalis,resistente al calor, proveniente de los humanos y E. faecium.

Lactococcus Cocos Gram positivos, no esporulados. Crecen a 10°. Se emplean como fermentadores para la producción del queso y la mantequilla de varios tipos. Comprenden bacterias importantes en la leche, como L. lactis y L. cremoris.

 Leuconostoc Son cocos Gram positivos, organizados en pares o cadenas. Son importantes en los alimentos por: producir diacetilo y otras sustancias aromáticas; tolerar las concentraciones salinas de ciertas salmueras, como las de la fermentación de encurtidos hortícolas.; algunas especies toleran altas concentraciones de azúcares (55-60%), lo que les permite crecer en jarabes, caramelo líquido, crema de helados, etc.; producir cantidades considerables de dióxido de carbono a partir de los azúcares, ocasionado la aparición de ojos en ciertos quesos, alteraciones en alimentos con alto contenido de azúcar y la fermentación de algunas clases de pan; producir mucílago en medios que contienen sacarosa, proceso óptimo en la producción de dextrano, pero representa un riesgo en alimentos ricos en dicho disacárido, como en la producción de azúcar a partir de caña o remolacha.

Pediococcus Son cocos aislados, en parejas, en cadenas cortas o en tétradas: Gram positivos, catalasa positiva y microaerófilos. Se han encontrado en las salmueras de los encurtidos en fase fermentativa, siendo los responsables de ciertas alteraciones en las bebidas alcohólicas.

Bacterias acéticas o productoras de ácido acético

La mayor parte de las bacterias acéticas pertenecen a uno de los dos géneros, Acetobacter y Gluconobacter.

Acetobacter Son formas bacilares, Gram negativas, aeróbicas estrictas y móviles. Oxidan el alcohol etílico a ácido acético y se encuentran en masa fermentada de granos de cereales, frutas, hortalizas y bebidas alcohólicas y constituyen un problema en estas últimas, ya que causa una alteración de las mismas. Algunas especies comoA. aceti oxidan el etanol convirtiéndolo en ácido acético para producir vinagre, lo que constituye su más importante aplicación industrial.

 

Gluconobacter Este género pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Las bacterias pertenecientes a este grupo oxidan el etanol a ácido acético. La especieG. oxydansproduce viscosidad en la cerveza y más adelante una proliferación viscosa que afecta la infusión de malta.

 

Bacterias Butiricas

Las bacterias de este grupo, en su mayoría, son anaerobias esporuladas del géneroClostridium.

Clostridium Son bacilos anaerobios o microaerófilos, Gram negativos, catalasa-negativos, formadores de endosporas resistentes a altas temperaturas. Muchas especies fermentan activamente los carbohidratos, con producción de ácidos, entre los que se encuentra el butírico, y gases, usualmente dióxido de carbono e hidrógeno.

 

C. thermosaccharolyticum determina la alteración gaseosa de las conservas vegetales. La putrefacción de los alimentos es a menudo ocasionada por especies mesófilas proteolíticas tales como C. lentoputrescens y C. putrefaciens. El rompimiento violento de la cuajada de la leche es ocasionado por C. perfringens o especies semejantes y da lugar a una “fermentación tumultuosa” de la leche; C. butyricum, que fermenta los lactatos, determina la producción tardía de gas en los quesos curados.

 

Bacterias Propiónicas Son bacterias pequeñas, inmóviles, Gram positivas, no esporuladas, catalasa-positivas de carácter anaeróbico o aerotolerante y de forma bacilar. Fermentan el ácido láctico, los carbohidratos y los polialcoholes para producir grandes cantidades de ácidos propiónico y acético y a menudo dióxido de carbono. Ciertas especies, como Propionibacterium freudenreichii, proliferan en el queso suizo fermentando los lactatos con producción de gas, que da lugar a la formación de “ojos” y contribuyen a la obtención de su típico sabor. Las propionibacterias pigmentadas pueden causar modificaciones del color del queso

 Bacterias Proteolíticas

Tienen la capacidad de descomponer la estructura de las proteínas. Muchas especies de Clostridium, Bacillus, Pseudomonas y Proteus son proteolíticas. Las bacterias de la putrefacción son capaces de descomponer anaeróbicamente las proteínas y producir compuestos malolientes, como ácido sulfhídrico, mercaptanos, aminas, indol y ácidos grasos. La mayor parte de las especies proteolíticas de Clostridium son putrefactivas, así como ciertas especies deProteus, Pseudomonas y otros géneros no esporulados. 

Bacillus cereus En la industria alimentaria ha sido de interés y objeto de estudio la destrucción de las esporas de B. cereus por su termorresistencia. Produce graves intoxicaciones debido a que genera una enterotoxina diarreica, un factor emético y hemolisinas.

Pseudomonas diversas especies de Pseudomonas son capaces de efectuar alteraciones en los alimentos. Pueden desarrollarse a bajas temperaturas (refrigeración). En aerobiosis, crecen rápidamente y originan productos de oxidación y mucílago en las superficies de los alimentos, donde es más probable una contaminación abundante. Ciertas especies producen pigmentos como la fluorescencia verdosa producida por la pioverdina de Pseudomonas fluorescens y el color blanco, cremoso, rojizo, castaño o incluso negro producido por P. nigrilaciens.

Proteus las bacterias de este género son responsables de la alteración de carnes, productos pesqueros y huevos. La presencia de estas bacterias en muchos alimentos no refrigerados las ha hecho sospechosas de ser causantes de toxiinfecciones alimentarias, o sea infecciones causadas por endotóxinas o exotoxinas producidas por microorganismos. Se hallan en el intestino humano y de animales.

 

Bacteria lipolíticas

Corresponde a un grupo heterogéneo de bacterias que producen lipasas, enzimas que catalizan la hidrólisis de las grasas a ácidos grasos y glicerol. Muchas bacterias aeróbicas y proteolíticas son también lipolíticas. Pseudomonas fluorocescens es una de las especies fuertemente lipolítica. Los génerosPseudomonas, Alcaligenes, Serratia y Micrococcus tienen especies lipolíticas.

 

Serratia, enterobacteria gram negativa, móvil, en forma de bacilo, fermenta butanodiol. Muchas de sus especies producen un pigmento rosáceo o magenta y dan lugar a coloraciones rojizas en la superficie de los alimentos. S. marcescens es la especie más común.

 

Micrococcus son Gram positivos, aerobios y catalasa-positivos. A menudo se encuentran en utensilios y equipo usados en alimentación que no han sido adecuadamente limpiados e higienizados. Son importantes en los alimentos debido a las siguientes características: son capaces de utilizar las sales amónicas y otros compuestos nitrogenados simples como única fuente de nitrógeno, la mayoría fermentan los azúcares, produciendo cantidades moderadas de ácido, otros toleran gran cantidad de sal, creciendo por lo tanto a niveles de humedad bajos; estas especies se desarrollan en salmueras del curado de carnes, tanques de salmuera, muchos resisten la pasterización comercial de la leche (M. varians), otros son pigmentados y dan coloración anormal a las superficies de los alimentos sobre los que crecen; M. luteus, por ejemplo, es amarillo y M. roseus, rosa.

Bacterias Sacarolíticas

Hidrolizan los disacáridos o polisacáridos a azúcares sencillos. Bacillus subtilis y Clostridium butyricum son amilolíticos. Pocas especies bacterianas son capaces de hidrolizar la celulosa.

Bacterias Pectolíticas

Las pectinas son carbohidratos complejos que forman parte de hortalizas y frutas. Las pectinasas, compuestas de varias enzimas pectolíticas, pueden dar lugar al ablandamiento de los tejidos vegetales o a la pérdida de la capacidad de gelificación de los zumos de frutas. Se comportan como pectolíticas especies de Erwinia, Bacillus y Clostridium, así como ciertos mohos.

Las especies del género Erwinia son patógenas y saprofitos de vegetales, en los que causan necrosis, agallas, marchitamientos y podredumbre, lesionando frutas, hortalizas y otros productos vegetales. Puede presentarse directamente en el campo o durante el almacenamiento de los frutos. Es de interés económico ya que las bacterias se pueden diseminar rápidamente por los exudados producidos en los tejidos y dañar un lote de producción.

 

Bacterias termófilas

Estas bacterias tienen una temperatura óptima por encima de 45 °C, en muchos casos de 55°C o superior y son importantes en el caso de alimentos mantenidos a elevadas temperaturas. Bacillus spp. causan la fermentación ácida de algunos alimentos enlatados y Clostridium thermosaccharolyticum da lugar a una alteración gaseosa.Lactobacillus thermophilus es un microorganismo ácido láctico y termófilo obligado. 

Bacterias psicótropas

Estas bacterias se pueden desarrollar a temperaturas no muy por encima de las de congelación y tienen importancia en alimentos refrigerados. Las bacterias psicrotróficas se encuentran principalmente en los géneros Pseudomonas, Flavobacterium y Alcaligenes, aunque también hay especies psicrotróficas de los géneros Micrococcus, Lactobacillus, Enterobacter; Arthrobacter y otros.

Flavobacterium especies de este género, amarillas o anaranjadas, determinan coloraciones anormales superficiales en las carnes y toma parte en el deterioro de mariscos, aves, huevos, mantequilla y leche. Algunos miembros son psicrótrofos, habiéndose observado su crecimiento, tras la descongelación, en hortalizas congeladas.

 

Bacterias halófitas

Necesitan para su crecimiento determinadas concentraciones de cloruro sódico. Pertenecen a los géneros Halobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio, Pediococcus y Alcaligenes.

Halobacterium normalmente aparecen en los pecados salados y en pieles adobadas debido a que la sal utilizada es portadora de este grupo de bacterias, produciendo manchas coloreadas.

Vibrio son patógenos importantes para el hombre. V. cholerae es el agente causante del colera y V. parahaemolyticus produce gastroenteritis en humanos por el consumo de comida de mar contaminada. V. anguillarum y otras especies, son responsables de enfermedades en peces.

Bacterias formadoras de viscosidad

Pertenecientes a este tipo de bacterias se pueden citar: Alcaligenes viscolatis (viscosus) y Enterobacter aerogenes, que producen la alteración viscosa de la leche, especies de Leuconostoc, que originan mucosidad en las soluciones de sacarosa y el crecimiento viscoso superficial de ciertas bacterias presentes en los alimentos. Algunas especies de Streptococcus y Lactobacillus poseen variedades que determinan la viscosidad o mucosidad de la leche; se conoce un micrococo que hace viscosas las soluciones de curado de las carnes. Hay cepas de Lactobacillus plantarum y de otros lactobacilos que pueden causar viscosidad en varios productos derivados de las frutas, hortalizas y cereales, por ejemplo, en la sidra y cerveza.

 

Bacterias coliformes

Son bacilos que han sido definidos como “aeróbicos o anaeróbicos facultativos, Gram negativos y no esporulados, que fermentan la lactosa con formación de gas”.

 Las principales especies de bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. E. aerogenes produce menor cantidad de ácido, forma acetoína pero no indol, da lugar a dióxido de carbono e hidrógeno en la proporción 2:1 y utiliza el citrato como única fuente de carbono. Produce más gas queE. coli y por lo tanto, es más peligroso como microorganismo, ya que puede originar gas en quesos, leche y otros alimentos. Ambas especies fermentan los azúcares con formación de ácido láctico, etanol, ácidos acético y succínico, dióxido de carbono e hidrógeno.

 Los recuentos de coliformes, Coliformes fecales y de E. coli se emplean en los alimentos con carácter indicador. En general, no se admite la presencia de bacterias coliformes en los alimentos y en algunos casos, como el agua o las ostras, es índice de contaminación con materiales cloacales y, por lo tanto, con posibles patógenos entéricos. Además pueden dar lugar a la alteración de los alimentos por multiplicación en los mismos

 

Otras bacterias importantes en alimentos

Salmonella las bacterias de este género son intestinales. A este grupo pertenecen los agentes productores de fiebre tifoidea y paratifoidea, así como los causantes de Salmonelosis humanas transmitidas por alimentos. Su presencia en alimentos es totalmente inadmisible.

Staphylococcus la mayoría de las cepas de S. aureus producen un pigmento dorado y coagulan el plasma sanguíneo mientras que S. epidermis no produce ni coagulasa ni pigmentos. Se asocian con la piel, membranas mucosas del hombre y animales. S. aureus causa abscesos, forunculosis, neumonía infecciones en heridas y un importante síndrome de toxoinfección alimenticia en el hombre. Algunas cepas han presentado últimamente múltiple resistencia a los medicamentos. El S. epidermis se encuentra comúnmente en la piel y es el responsable de endocarditis e infecciones en pacientes con baja resistencia.

 

Hongos fundamentales en la industria alimenticia

Las levaduras forman parte de la población micótica unicelular, que por su capacidad de degradar azúcares puede producir efectos importantes en la industrialización de alimentos.

 Las levaduras son un grupo particular de hongos unicelulares (constituidos por una sola célula) y caracterizados por su capacidad de transformar los azúcares. Hay muchas especies de levaduras. La más comúnmente conocida es Saccharomyces cerevisiae la cual es utilizada en la industria panadera y en la elaboración de la cerveza. Las levaduras también juegan un papel importante en la producción de otros productos como el vino y el kefir.

La mayoría de las levaduras usadas en la industria alimentaria son de forma redonda y se dividen produciendo pequeños brotes. Esta producción de brotes es una característica utilizada para reconocerlas a través del microscopio, ya que, durante el brote, las células poseen una forma de ocho (8).

 Las levaduras necesitan azúcares para crecer y los fermentan produciendo alcohol y dióxido de carbono (CO2). Esta reacción y sus productos derivados hacen que la levadura posea una función muy importante en la industria alimentaria. Así mismo, las levaduras también producen componentes de aroma agradable, los cuales juegan un papel muy importante en el aroma del producto final. Por ejemplo, en la cerveza, la levadura se necesita para producir el alcohol y el dióxido de carbono que forma la espuma. Por otro lado, en la industria panadera el alcohol producido durante la fermentación se evapora durante el horneado.

 

Las levaduras pueden encontrarse en todas partes en la naturaleza, especialmente en plantas y frutas.

Trichothecium La especie habitual Trichothecium roseum es un moho de color rosa que crece en la madera, en el papel, en las frutas como manzanas y en hortalizas como los pepinos. Este moho se identifica fácilmente por los grupos de conidios bicelulares situados en el extremo de conidióforos cortos y erectos. Los conidios poseen una prolongación apezonada en el punto de inserción, y encontrándose en este extremo la menor de las dos células de conidio.

Geotrichum Las especies de este género, cuyo crecimiento primeramente tiene aspecto de una masa compacta que se vuelve blanda y cremosa, puede tener un color blanco, grisáceo, naranja o rojo. La especie Geotrichum candidum se le conoce como “hongo de la lechería”, da un crecimiento de aspecto cremoso de color variable entre el blanco y el rojo. Las hifas de los mohos de este genero son septadas y, en las especies habituales, poseen ramificaciones. Las esporas asexuales son astrosporas (oidios), las cuales pueden tener forma rectangular cuando son producidas en hifas sumergidas, y forma ovalada si las producen las hifas aereas.

Neurospora A la especie Neurospora sitophila, la mas importante de las que crece en los alimentos, se le conoce con la denominación de “moho rojo del pan” porque su crecimiento rosado de textura laxa se le suele encontrar en la superficie del pan.También crece en la superficie de la caña de azucar y en la distintos alimentos. Rara vez se observa su fase perfecta, o fase en la que se producen ascosporas.

Sporotrichum Entre las especies saprofitas de este género se encuentra Sporotrichum carnis, cuyo crecimientoha sido hallado en la superficie de carnes refrigeradas, en las que se produce un “moteado Blanco”.

Botritis La única especie que tiene importancia en los alimentos es Botritis cinerea. Produce una enfermedad en las uvas, aunque puede crecer como saprofita en la superficie de algunos alimentos.

Mucor Los mohos de este género Mucor intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación de otros. La especie Mucor rouxii se utiliza en el proceso industrial para la sacarificación del almidon siendo especies de este género las que contribuyen a madurar algunos quesos.

Rhizopus La especie Rhizopus stolonifer el denominado moho del pan, es muy corriente e interviene en la alteración de algunos alimentos como frutas, hortalizas, pan, etc.

Thamnidium elegans se encuentra en carne que se mantiene almacenada a temperaturas de refrigeración en las que produce las denominadas “barbas”.

Aspergillus Los aspergillus son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que son de utilidad para preparar determinados alimentos.el grupo Aspergillus glaucus con Aspergillus repens son especies que intervienen en la alteración de alimentos. Los mohos de esta especie crecen bien en concentraciones elevadas de azúcar y de sal, por tanto,en muchos alimentos con escaso contenido de humedad.

Endomyces Hongos levaduriformes, que producen micelio y artrosporas. Algunas especies pudren las frutas.

Monascus Las colonias de Monascus purpureus son delgadas e invasoras y de color rojizo o morado. Se encuentran creciendo en la superficie de los productos lácteos y del arroz chino rojo.

Sclerotinia Algunas especies producen pudredumbre de las hortalizas y frutas, en las que se encuentran en la fase de los conidios.

Alternaria Los mohos de este género son con frecuencia causa de alteración de los alimentos. Alternaria citri produce pobredumbre en los frutos. La masa miceliar suele tener un aspecto seco y un color verde grisáceo, aunque las hifas, vistas al microscopio, muchas veces parecen casi incoloras.

Penicillum Es otro genero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos. Penicillum expansum, moho cuyas esporas tienen un color verde azulado, produce la pobredumbre blanda de las frutas; Penicillum digitatum, con conidios color verde oliva o verde amarillento, que produce la pobredumbre blanda en las frutas cítricas. Penicillum italicum, se le conoce con la denominación de “hongo azul de contacto”, provisto de conidios verde azulados, también produce pobredumbre de las frutas cítricas. Penicillum camembert, con conidios grisáceos, que se utilizan en la maduración de quesos de Camembert y penicillum roqueforti, provisto de conidios de color verde con tinte azulado, ayuda en la maduración de quesos azules, como el queso de Roquefort. Unas pocas especies producen ascas cuyas esporas se hayan en el interior de cleistotecios, mientras que otras pocas producen esclerocios y por esta razón han originado alteraciones en alimentos ácidos enlatados.

Técnicas básicas de laboratorio.

Técnicas de esterilización de medios de cultivo y de material de laboratorio.

Preparación y esterilización de medios de cultivo.

Preparación y esterilización de material de vidrio.

1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada.

2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.

3. Colocar (con un clip) un filtro de algodón en la boquilla a las pipetas de 1.0 mL.

4. Envolver las cajas de Petri y las pipetas con papel kraft, en la envoltura de éstas últimas, anotar el volumen.

5. Introducir los hisopos en un tubo de 22x175 y tapar con algodón.

6. Introducir el material en un horno previamente calentado a 180ºC, esperar a que la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el tiempo de esterilización (1 hora).

Metodos para aislar bacterias.

Las bacterias son esenciales para el apropiadofuncionamiento de los ecosistemas. Descomponen los organismos muertos y reciclan materia orgánica transformándola en nutrientes minerales. Aislar bacterias en un cultivo puro ayuda a los investigadores a estudiar y ganar entendimiento sobre laspropiedades fisiológicas de ciertos organismos que no es posible recabar en una base de estudio más amplia. Las diferentes bacterias prefieren diferentes condiciones físicas y químicas. Algunas tienen un límite de tolerancia. Por esta razón, se utilizan varios métodos para aislar y estudiar microbios.

Placa de diseminaciónEl método de aislamiento por diseminación en placa es un procedimiento en el cual el investigador disemina una mezcla diluida de células sobre una superficie de agar, utiliza una varilla doblada de vidrio esterilizada, de tal forma que cada célula crece en su propia colonia separada. Los cultivos son incubados por un periodo de tiempo específico. En el medio sólido aparece un crecimiento macroscópicamente visible o un grupo de microorganismos, cada colonia representando un cultivo puro. Luego de que las colonias han crecido, son contadas y se calcula el número de bacterias en la muestra original.

Placa vertidaEl procedimiento de placa vertida se utiliza extensivamente con bacterias y hongos y también puede producir colonias aisladas. Se prepara una muestra bacteriológica diluida. El investigador introduce una pequeña cantidad dentro de un plato de petri vacío. Se vierte agar derretido dentro del plato de petri que

contiene la muestra. El agar y la muestra se mezclan meticulosamente al cubrir el plato e inclinarlo y revolverlo suavemente. Se le da tiempo para que el agar se vuelva gel mientras se asienta sobre la superficie plana. Los platos recubiertos se invierten y se dejan incubar por un periodo de tiempo específico. Las colonias son luego observadas y contadas, y se registra la información.

Placa estriadaEl método de estrías en placa es el procedimiento clásico para aislar cepas de bacterias. El investigador esteriliza un lazo de alambre con una llama. Luego de enfriarse, el lazo de alambre es colocado en una placa de agar estéril. El investigador sumerge el lazo dentro de la muestra, recogiendo miles de bacterias, y a continuación realiza estrías con el lazo en la superficie de agar. Luego de esterilizar nuevamente el lazo y dejar que se enfríe, el investigador arrastra el lazo a través del recorrido anterior, levantando un grupo de bacterias y realiza otra estría en un área diferente del agar. Este procedimiento se repite varias veces. Los platos cerrados son incubados por un periodo de tiempo específico, luego del cual se observa el crecimiento bacteriano.

Placa de exposiciónLa exposición de un medio estéril al ambiente demuestra la técnica aséptica. El investigador etiqueta dos placas de agar de nutrientes para una comparación y observación posterior y se las deja descubiertas. Se permite que una placa de agar permanezca como está, exponiéndola al ambiente por un corto periodo de tiempo. La segunda placa es expuesta a una fuente de posibles contaminantes, tales como un estornudo, tos o dedos colocados en contacto directo con la superficie de agar. Las placas se cubren, invierten e incuban a temperatura ambiente por un periodo de tiempo antes de la observación.

Técnicas de identificación de microorganismos

La identificación bacteriana primaria se basa en los siguientes puntos:

Tinción de Gram : Revela la forma de la bacteria, agrupación y grupo taxonómico al que pertenece: Gram positivo o Gram negativo.

Tinción de Ziehl Neelsen : Las bacterias Alcohol-Ácido resistentes (BAAR), son difíciles de cultivar, tal vez y en un agar sangre muestre algo de crecimiento, por eso es útil esta tinción de identificación primaria.

Tinción de esporas: La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los géneros Bacillus y Clostridium.

Prueba de   catalasa : La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al género Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo.

El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia. Ejemplos:

Catalasa (+): Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp.

Catalasa (-): Streptococcus spp.

Prueba de   oxidasa : Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la identificación de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de electrones.

El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos. Un resultado positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente auto-oxidable del sistema de citocromo es al final catalizado. Utilizando un tubo capilar con tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, se adiciona una pequeña cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones: una reacción positiva (presencia de oxidasa) se indica por la apariencia de un color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 segundos; al contrario una reacción negativa, que consiste en una ausencia de color púrpura, indica según los ejemplos:

Oxidasa (+): Pasteurella multocida Oxidasa (-): Escherichia coli

Ácido de la Glucosa: La mayoría de las bacterias de interés médico usan la glucosa como fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de dicho carbohidrato. En un tubo con agua peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitación teniendo cuidado de no mover el tubo de Durham e incubándolo 24 horas y 37°C se obtienen los siguientes resultados.

Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observará rosa, si produce gas, se observará una burbuja en el tubo de Durham. Ejemplos:

Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli

Negativo a producción de gas: Proteus stuartii.

Prueba de O/F: para realizar esta prueba se usa el medio básico de Hugh y Leisfon con un pH de 7.1. Es un medio semisólido de color verde que se inocula por picadura, contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro con acetie o vaselina sellándolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37°C por 24 horas, obteniéndose:

TUBO ABIERTO TUBO SELLADO INTEPRETACIÓN

Amarillo VerdeOxidación

(aerobio)

Amarillo (anaerobio

facultativo)Amarillo Fermentación

Verde (anaerobio estricto) Amarillo Fermentación

Verde Verde Negativo (NH3)

Prueba de Motilidad: Llamada también de la gota suspendida. Algunas bacterias son móviles por presentar flagelo, los flagelos son encontrados principalmente en las formas bacilares y pueden presentarse en número y posición variados(monotricos, peritricos, etc.). La base de esta prueba es determinar si la bacteria es móvil o inmóvil. Con un asa de inoculación se le coloca a un cubreobjetos un poco de muestra y se le agrega una gota de agua destilada. Se coloca sobre un portaobjetos y se observa al microscopio. Podremos observar si las bacterias tienen movimientos rectilíneos o curvos y en todas direcciones. Ejemplos:

Motilidad (+): como en Pseudomonas auruginosa.

Motilidad (-): como en Pasteurella multocida.