microbiologia 2005
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FACULTAD DE ESTOMATOLOGIACurso de Microbiología y Parasitología
General y Estomatológica
Guía de Práctica2005
INTRODUCCIÓN
En ninguna parte se aprecia mejor la diversidad biológica como en los microorganismos, los cuales no se pueden ver a simple vista. En forma y función,
ya sea la propiedad bioquímica o mecanismo genético, el estudio de los microorganismos lleva a los límites de comprensión de los fenómenos biológicos. Por lo
tanto, la necesidad de originalidad – prueba del valor de una hipótesis científica - puede cumplirse con la Microbiología. Una hipótesis útil deberá proporcionar
una base para generalizar y la diversidad microbiana proporciona un campo donde este reto está siempre presente.
Entregamos a ustedes, la “Guía de Prácticas de Microbiología y Parasitología”, en cuya elaboración han colaborado los docentes de la asignatura, con el
objetivo específico que sirva como una guía de trabajo durante las clases prácticas.
El desarrollo de ésta guía, va de acuerdo con el contenido teórico del Sylabus, preparado especialmente para estudiantes de Estomatología.
La descripción y desarrollo de las prácticas comienza fijando los objetivos, primero, luego se hace una breve introducción o fundamento teórico; seguida
por una relación de materiales y reactivos. Posteriormente se procede a explicar el procedimiento o técnica experimental, dando la orientación respectiva para el
desarrollo de las experiencias, sobre como se deben efectuar las mismas, las anotaciones de las observaciones respectivas y deducir las conclusiones; para que el
alumno pueda alcanzar la verdadera comprensión de la Microbiología, así como de los objetivos propuestos en cada práctica.
Durante la realización de las experiencias, el alumno debe cumplir una serie de acciones:
Llegar al laboratorio, habiendo estudiado previamente el fundamento teórico y el procedimiento técnico a utilizarse en cada experimento, de tal manera que
durante la práctica el alumno debe saber lo que tiene que hacer.
En caso de duda consultará con el profesor que estará pendiente a resolver su pregunta.
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PRACTICA 01
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
OBJETIVO
Conocer los principales instrumentos, equipos y material de vidrio usados en el Laboratorio de Microbiología y Parasitología.
INTRODUCCIÓN
El Laboratorio de Microbiología y Parasitología, requiere algunos instrumentos específicos para el normal desarrollo de sus actividades.
Teniendo en cuenta, que el material procesado tiene microorganismos patógenos y no patógenos; el material de vidrio, los instrumentos, los medios de
cultivos; permiten propiciar y evidenciar el desarrollo de los microorganismos para después estudiarlos e identificarlos.
Los siguientes, son los principales instrumentos y el uso que tienen cada uno en la Microbiología.
EL MICROSCOPIO
PARTES :
1. Mecánica.
2. Óptica.
3. Sistema de iluminación.
1. MECANICA :
a) Pié.
b) Platina. ( Circular o rectangular fija o móvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren ).
c) Tubo Óptico. Revólver para objetivos.
d) Sistema de enfoque. Tornillos micrométricos y macrométricos (Cremallera ).
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2. SISTEMA OPTICO
a) Oculares : 05 – 10 – 20x.
b) Objetivos : 05 – 10 – 40 – 100x.
Objetivos de observación en seco y en inmersión.
3. SISTEMA DE ILUMINACIÓN
a) Espejo : Plano y Cóncavo.
b) Condensador.
c) Diafragma, filtros.
d) Fuentes de iluminación natural y artificial.
Para determinar el aumento de cada sistema ocular – objetivo se multiplica la cifra del ocular con la del objetivo. Ambas representan el aumento
proporcionado por cada lente.
Utilice los objetivos secos para pequeños aumentos. A menor aumento se requiere menor iluminación, lo cual se consigue bajando el condensador y
cerrando parcialmente el diafragma. Luz en todo caso la mayor nitidez.
La observación de las muestras húmedas, o sea en fresco se hace con lentes de menor aumento o sea sin inmersión; esta queda para las muestras
coloreadas y en general para aquellos casos en que se requieren la máxima cantidad de luz y se practica con el auxilio del aceite de cedro u otra sustancia que
tenga un índice de refracción parecido.
Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden :
Ilumine empleando el espejo cóncavo o plano; la elección depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros factores.
Enfoque de preferencia con la lente de menor aumento que por lo común tiene un tope inferior que impide la ruptura de las laminas a observar.
Una vez enfocado el objetivo, haga rotar el revolver y utilice el objetivo deseado. Si se va a usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite
de cedro sobre la preparación. Al colocarse la lente en posición debe haber una continuidad entre ellas, con la superficie de la lámina y el aceite de cedro.
Para el enfoque preciso, use el tornillo micrométrico.
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Tenga ambos ojos abiertos, aunque el microscopio sea mono ocular.
Al terminar la observación limpie el objetivo con un papel especial para lente o con algodón o un lienzo fino. Si hay impregnación de aceite utilice xilol
en pequeña cantidad y seque bien en cuanto consiga la limpieza deseada. Las laminas una vez observadas, se depositarán en un recipiente apropiado, el
que contiene la mezcla sulfocrómica.
La composición de la mezcla es como sigue :
Bicromato de potasio 100 grs.
Ácido sulfúrico 100 grs.
Agua destilada 1000 ml.
Esta mezcla es la empleada en los frascos en que se desecha todo material contaminado.
AUTOCLAVES :
Destinado a la esterilización con calor húmedo a presión ( 121°C por 15’ ), material de desecho y para esterilizare medios de cultivo.
HORNO :
Destinado a la esterilización con calor seco ( se llama también horno Pasteur o Poupinel ). La temperatura usual es de 160 - 180 °C por 01 a 02 horas. Se
esteriliza material de vidrio e instrumentos metálicos.
ESTUFA O INCUBADORA :
De una temperatura que se mantiene fija mediante un termostato; esta temperatura se mantiene y se elige según el requerimiento del microorganismo a
cultivar. Generalmente se mantiene a 37 °C.
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REFRIGERADOR O NEVERA :
Permite conseguir bajas temperaturas y se utiliza con fines de conservación de gérmenes, de medio de cultivo, muestras reactivos, etc. Por lo general se
usa a una temperatura de 0° a 4°C.
CENTRÍFUGA :
Aparato de muy diversa capacidad que permite separar una sustancia en suspensión del liquido respectivo. Por ejemplo para centrifugar orna o sangre.
LA BALANZA :
Se usa en bacteriología para pesar colorantes, componentes de los medios de cultivo, animales, etc. Las hay de diferentes tipos según su aplicación y
sensibilidad.
BAÑO MARIA :
Permite la transmisión de calor de un liquido sobre una sustancia de menor temperatura, a través de un recipiente. Evita el calor directo. Se emplea entre
cosas para licuar medios y para inactivación de sueros. Hay diversos modelos según su aplicación.
AGITADORES MECÁNICOS :
Diversos diseños y con frecuencia variable en el número de veces que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y láminas
excavadas.
POTENCIOMETRO :
Aparato destinado a determinar la concentración de iones ( pH ) en una solución. El más perfeccionado es el de Beckman.
BOMBA DE VACIO :
Produce presión negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable, a través de una membrana filtrante donde se retienen las
bacterias contaminantes.
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CONTADOR DE COLONIAS :
( Québec ) Se utiliza para el recuento de colonias en una placa de cultivo: de una manera más exacta y con mayor facilidad que sin el uso de este
instrumento.
MATERIAL DE VIDRIO :
Es el mismo que se emplea en cualquier otro laboratorio; tubos de ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas, pipetas, placas Petri,
placas de Roux, placas de Brewer, tubos de centrífuga, tubos de vidrio de diversos calibre, pipetas Pasteur, jeringas, frascos, goteros, láminas portaobjetos,
láminas cubreobjetos, perlas de vidrio, termómetros, embudos, etc.
OTROS MATERIALES :
Bujías para esterilización por filtración, morteros, láminas excavadas de porcelana, gradillas. Atención especial merece el asa de Kölle o asa
bacteriológica, el asa va fijada al mango por un tornillo, las formas que se da a la extremidad libre del asa puede ser : recta ( hilo o aguja ), circular como un
anillo con diversos diámetros ( se consiguen con el calibrador de asas ), Microplacas de titilación ( Microplacas de titilación por ejemplo para prueba de Elisa ),
Micro pipetas y Tips, Eppendorf ( para guardar sueros y para medir volúmenes muy pequeños expresados en microlitros ).
Cuestionario:
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PRACTICA 02
COLORANTES Y COLORACIONES
OBJETIVO
El objetivo de esta practica es hacer una introducción preliminar al conocimiento de los colorantes y las técnicas más importantes de coloración.
INTRODUCCIÓN
La finalidad de las coloraciones es entre otras hacer visibles los microorganismos y revelar su estructura. El estudio microscópico de un microorganismo
puede ser realizado de diversas maneras, incluidos los preparados en fresco, pueden además utilizarse técnicas especiales como el contraste de fases, el campo
oscuro, la fluorescencia, etc.
Las coloraciones más importantes e la bacteriología son : GRAM y la ZIEHL – NIELSEN, existen además coloraciones especiales para teñir
estructuras bacterianas como cápsulas, esporas, flagelos, etc.
MATERIALES
COLORANTES :
Son sustancias que tienen la capacidad de transmitir su color. Estos pueden ser :
a) NATURALES : Carmín, hematoxilina, tornasol, etc.
b) ARTIFICIALES. Estos a su vez pueden ser :
1. Básicos : Como la tionina, violeta de genciana, fucsina básica.
2. Ácidos : Ácido pícrico, fucsina ácida, eosina.
3. Neutra : Eosinato, azul de metileno, Wrigth, Giemsa.
COLORANTES COMUNES
A) Azul de metileno de Loeffler :
Azul de metileno ........................................................... 0.31 gr.Alcohol etílico ........................................................... 30 ml.Solución de KOH 0.01% .................................................... . 100 ml.
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B ) Violeta de Genciana fenicada :
Violeta de Genciana ............................................................ 1 gr.Ácido Fénico cristalizado ................................................ 2 gr.Alcohol etílico ............................................................ 10 ml.Agua destilada ............................................................ 100 ml.
C ) Violeta de Genciana de Hucker :
( Cristal de violeta oxalato de amonio )
Cristal violeta ........................................................................... 2 gr.Alcohol etílico ............................................................ 20 ml.Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gr.Agua destilada ............................................................ 80 ml.
D ) Fucsina Fenicada de Ziehl :
Fucsina básica ............................................................ 0.3 gr.Ácido fénico ........................................................................ 5 gr.Alcohol etílico ............................................................ 10 ml.Agua destilada ............................................................ 100 ml.
E ) Solución Iodo – yodurada ( Lugol ):
Yodo ................................................................................... 1 gr.Yoduro de potasio ........................................................... 2 gr.Agua destilada ........................................................... 200 ml.
F ) Soluciones de Safranina :
Safranina ( Sol. al 2.5 % Alc. Etílico )................................. . 10 ml.Agua destilada ............................................................ 100 ml.
G ) Alcohol Acetona :
Alcohol 95° ........................................................................ 80 ml.Acetona ........................................................................ 20 ml.
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H ) Alcohol Ácido :
Ácido Clorhídrico ............................................................ 3 ml.Alcohol etílico ............................................................ 97 ml.
PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN
A ) Extensión : En lámina portaobjeto con asa bacteriológica ( de nicrom ) u instrumento. El asa debe de estar esterilizada al rojo vivo en el mechero, antes y
después de su empleo.
B ) Fijación : Su objeto es adherir firmemente la preparación sobre la lámina. Se emplea para este fin el calor suave o alcohol éter; este último es
indispensable cuando se trata de muestras serosas.
C ) Tinción : Con el colorante o grupo de colorantes elegidos.
D ) Lavado : A chorro.
E ) Secado : Puede utilizarse calor o aire a presión.
F ) Observación : Nunca observe una lámina coloreada, antes de que se seque sobre todo cuando va utilizar lentes de inmersión.
COLORACION SIMPLE :
Son aquellas en que se usa un solo colorante. Ejemplo : La coloración con el azul de metileno, con Ziehl u otros colorantes.
COLORACIÓN COMPUESTA :
Son aquellas donde se usa más de un colorante, generalmente dos. La más importantes son al Coloración GRAM y la Coloración ZIEHL
NIELSEN.
COLORACIÓN GRAM
Fue creada por Christian Gram., estudiante danés entre 1884 – 1886.
TÉCNICA :
a) Previa la fijación de la muestra, cubrirla con violeta de genciana o cristal violeta. Tiempo : 60 seg. aproximadamente.
b) Lavar con agua a chorro tenue.
c) Cubrir con Lugol y dejar actuar de 1 – 2 minutos.
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d) Lavar.
e) Decolorar con alcohol – acetona hasta que ya no se desprenda más colorante de la lámina.
f) Lavar.
g) Contrastar con Safranina. Tiempo : 10 a 30 seg.
h) Lavar, secar y observar a inmersión.
Al final de la coloración según se verá en el microscopio, los microorganismos pueden quedar teñidos de violeta o rojo. Los que toman color violeta, se llama
GRAM ( + ) y los que toman color rojo se llaman GRAM ( - ) .
Los microorganismos GRAM ( - ) son los que han cedido al color violeta por acción del alcohol - acetona y por haber quedado sin coloración, han estado
aptos para tomar el segundo colorante que es el rojo.
La acción del Lugol en esta coloración, es conseguir una mayor fijación de violeta por parte de los microorganismos GRAM ( + ), por unión del colorante
con el yodo de lugol.
En termino generales son GRAM ( + ) todos los cocos a excepción de las Neisserias y son GRAM ( - ) todos los bacilos a excepción de los esporulados (
Clostridium y Bacillus ).
ESQUEMA DE LA PRACTICA
Utilizar para el desarrollo de esta práctica, como material por colorear, frotis de sarro dental, raspado de mucosa labial, etc. Seguir los pasos señalados
para la coloración GRAM y observar en inmersión, previo secado de la lámina y anotar la morfología, la coloración y la agrupación de los
microorganismos.
COLORACIÓN ZIEHL NIELSEN
(Para microorganismos ácido – alcohol resistentes, como las mycobacterias )
TÉCNICA :
A ) Preparar el frotis.
B ) Cubrir íntegramente con el colorante fucsina fenolada.
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C ) Calentar a la llama hasta desprendimiento de vapores, por tres veces consecutivas sin llegar a ebullición.
D ) Lavar intensamente a chorro.
E ) Decolorar con alcohol – ácido.
F ) Colorear con azul de metileno por 30 seg.
Los microorganismos que retienen el color rojo a pesar de la decoloración con alcohol – ácido, son los llamados ácido – alcohol resistentes ( a.a..r ) y
destacan en un fondo de color azul, si se usa el azul de metileno. Aquellos microorganismos no a.a.r ceden su color bajo el alcohol – ácido y al quedar desprovisto
de colorante tienen actitud para tomar el colorante de fondo ( azul ).
COLORACIONES ESPECIALES
Son utilizados para teñir estructuras bacterianas especiales.
a) Método de WIRTZ : Esporas.
b) Método de MANEVAL : Cápsulas.
c) Coloración tinta china o NIGROSINA : Cápsulas.
d) Coloración de ALBERT : Gránulos metacromáticos.
e) Coloración de LEIFSON : Flagelos.
f) Coloración de CASARES - GIL : Flagelos.
CUESTIONARIO
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PRACTICA 03
MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICO
OBJETIVOS
Comprender que los microorganismos tienen diferentes y variados requerimientos nutricionales los que deben tenerse en cuenta al preparar los reactivos
MEDIOS DE CULTIVO.
Conocer algunos medios de cultivo, cuyo uso en Microbiología es frecuente.
INTRODUCCIÓN
Las necesidades nutricionales de los microorganismos varían considerablemente; algunos requieren sustancias simples ( Microorganismos no
exigentes ) y otros requieren sustancias más complejas ( Microorganismos exigentes ).
En general los medios de cultivo son sustancias o compuesto nutritivos estériles, gracias a los cuales es posible el desarrollo microbiano; tienen un pH
generalmente entre 6.8 – 7.6, estos medios además nos permiten :
El aislamiento de microorganismos.
Identificación.
Conservación.
Clasificación.
Obtención de toxinas, enzimas y otros metabolitos.
Recolección de cosecha para la preparación de vacunas.
En cuanto a la clasificación de los medios de cultivo, existen varios esquemas, algunos más complejos que otros, se ha optado por uno de los más
simples, comprensibles y convencionales, que clasifica a los medios bacteriológicos según su aplicación en :
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I. Medios COMUNES.
II. Medios ESPECIALES.
Es importante resaltar que los medios de acuerdo a su estado físico pueden ser : LIQUIDOS , SÓLIDOS Y SEMISÓLIDOS.
I. MEDIOS COMUNES
Se destinan para cultivar a la mayoría de las bacterias. Ejemplo . Agua peptonada de Koch, Agua común, Caldo simple, Gelatina, etc. Tienen
sustancias nutritivas mínimas.
II. MEDIOS ESPECIALES.
Son aquellos que s e forman a partir de un medio basal o común. Al añadir diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada y puede ser :
II.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS O DE ENRIQUECIMIENTO.
Cuando se les adiciona sustancia de mayor poder nutritivo como : sangre, huevos, extracto de levadura, etc. Sirven para cultivar
microorganismos exigentes en sus necesidades CULTURALES. También se les conoce como MEDIOS MEJORADOS.
Ejemplos :
- Agar Sangre ( la mayoría de las bacterias patógenas existentes ).
- Lowenstein – Jensen ( Mycobacterias ).
- Agar Chocolate ( Gonococos y meningococos ).
- Agar Mitis Salivarius ( para estreptococos orales ).
II.2. MEDIOS SELECTIVOS :
Que tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo inhibe el desarrollo de otras, para este fin, se
adicionan sustancia de efectos conocidos llamados INHIBIDORES. Estos medios son llamados también, MEDIOS DE AISLAMIENTO.
Ejemplos :
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- Agar Salmonella – Shigella.
- Agar Mac Conkey ( E. coli y otras enterobacterias ).
- Caldo Glucosa Azida ( Enterococos ).
II.3. MEDIOS DIFERENCIALES :
Son los que nos permiten evidenciar la actividad bioquímica de un Microorganismo, frente a un sustrato determinado, cambiando sus
características observables; esto gracias a los indicadores de pH, que tienen estos medios. Ejemplos :
- Medio “OX – FERM”.
- Citrato de Simons.
- TSI.
- LIA.
NOTA IMPORTANTE :
A veces se combinan las características de cada uno de estos medios y por lo tanto el medio resultante será : Enriquecido – Selectivo – Diferencial.
La división planteada no es rígida, sino por el contrario flexible y didáctica.
MATERIALES :
- Agar común deshidratado.
- Placas Petri.
- Tubos de ensayo.
- Mechero.
- Algodón.
- Matraces o balones.
- Cocina eléctrica.
- Balanzas.
- Lápiz de cera.
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PROCEDIMIENTOS :
Se siguen los siguientes pasos.
Pesar las sustancias indicadas en los medios respectivos, calculando las cantidades en relación con los volúmenes requeridos. ( Poner cantidades ).
Disolverlas en las cantidades de agua necesaria y hervir en un matraz o balón.
Esterilizar en autoclave por 15’ a 120°C.
Repartir en tubos o placas petri siempre en ambiente estéril ( frente a un mechero de Bunsen o de alcohol ).
Se comprueba la esterilidad de los medios, colocándolos en estufa a 37°C por 24 horas.
NOTA :
En la actualidad en el mercado los medios de cultivo ya preparados, a los cuales solamente se añade la cantidad de agua destilada que indiquen en el
envase.
CUESTIONARIO :
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PRACTICA 04
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
OBJETIVOS
Enseñar al estudiante de Microbiología la manualidad y las técnicas necesarias para sembrar diferentes muestras en los medios de cultivo.
INTRODUCCIÓN
La siembra es uno de los pasos principales e iniciales en el estudio completo de un microorganismo dado; por lo tanto es indispensable hacerlo
correctamente. Teniendo en cuenta las máximas condiciones de esterilidad, desde la toma de muestra, hasta la acción misma del sembrado. Efectuar al siembra a
la brevedad posible.
Se define a la siembra como la acción de poner bacterias en contacto con un medio de cultivo, en el cual se forman colonias. Es necesario precisar
algunos términos relacionados con la siembra como :
- RESIEMBRA Y TRASPLANTE O REPICAJE : Es cuando se extrae con un asa de Kölle o aguja de Kölle una fracción de
colonia, a partir de un medio sólido o de un medio líquido ( cuando hay un solo tipo de bacteria ) y se lleva este inóculo a otro
medio líquido o sólido; en el cual se obtendrá el desarrollo de una sola especie bacteriana, constituyendo así el aislamiento
bacteriano.
- CULTIVO PURO : Es aquel que consta de una sola especie bacteriana y a partir de este se estudia sus características
morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, hasta que finalmente se ubican en la taxonomía correspondiente exacta, en cuyo
caso el cultivo puro se conoce como CEPA.
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MATERIALES :
- Medio agar nutritivo ( en placas y tubos ).
- Asa de Kölle.
- Aguja de Kölle.
- Mechero.
- Láminas porta objetos.
- Solución salina fisiológica.
- Hisopos.
- Tubos de prueba.
PROCEDIMIENTO :
Los procedimientos de siembra en los trasplantes varían según el medio que van a usar. Si el medio es liquido bastará tocar la superficie de este con el
inóculo. Si el medio es sólido puede ser : - Por estrías, es decir pasando el inóculo en zig – zag sobre la superficie del medio; o puede ser - Por punción o
picadura, que consiste en introducir la aguja hasta el fondo o apoca profundidad, según la naturaleza del medio; esto generalmente se hace en tubo.
No olvidar las siguientes recomendaciones importantes .
El asa se esteriliza antes y después de su uso.
La boca de los tubos se flamea al destaparlos y antes de volver a tapar.
Todas las manipulaciones de siembra, se realizan frente a una llama de alcohol o gas.
Los tubos y las placas petri se marcan con un lápiz para vidrio ( lápiz de era ) poniendo nombre, fecha u otros datos de importancia.
MODALIDADES DE SIEMBRA EN PLACAS
Es necesario conocer un método de siembra conocida como : Siembra de Incorporación, que consiste en diluir la muestra y añadirla a un medio licuado y
enfriado a 45°C, el cual es incorporado sobre un petri.
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Finalmente una vez realizado la siembra ( con la modalidad adecuada y elegida ) se debe incubar en la estufa, los medios sembrados a 37°C por 24 horas,
al cabo de los cuales se hace la lectura correspondiente y la coloración necesaria.
En la estufa, las placas deben de queda con la tapa hacia abajo para que el agua de condensación ( desprendida por el calor de la estufa ), no malogre la
siembra.
En la lectura debemos de tener en cuenta la forma, el tamaño, la elevación, el contorno y la consistencia de las colonias entre otra características.
En los medios diferenciales se observan los efectos bioquímicos del microorganismo sobre los diversos componentes del medio.
CUESTIONARIO
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PRACTICA 05
METABOLISMO BACTERIANO . PRODUCCIÓN DE ENZIMAS. HIDRÓLISIS DEL ALMIDON. HIDRÓLISIS DE LA GELATINA. PRODUCCIÓN DE HEMOLISISNAS. PRODUCCIÓN DE COAGULASA.
OBJETIVOS Conocer y estudiar la capacidad metabólica de los microorganismos para la producción de diversas enzimas. Conocer y estudiar las exoenzimas producidas por los microorganismos y que atacan substratos importantes como carbohidratos y proteínas. Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los glóbulos rojos.
INTRODUCCIÓN
La determinación de la producción de enzimas por parte de los microorganismos nos permitirá : Identificar microorganismos. Determinar patogenicidad de los mismos ; y determinar sus características de desarrollo.
Asimismo, los microorganismos producen enzimas que de manera intrínseca no son toxicas, pero que intervienen en forma importante en el proceso infeccioso.
Ejemplos de enzimas : Amilasas, Gelatinazas, Coagulasa, Hemolisinas, etc.
1. HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
Existe microorganismos que producen exoenzimas ( enzimas extracelulares ) y que atacan substratos importantes como carbohidratos y proteínas.El almidón es un polímero de glucosa que se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas denominadas Amilasas : Alfaamilasas
y Betaamilasas. Estas amilasas son enzimas extracelulares.
ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFAMALTOSA BETA AMILASA + ALMIDON = ALFAMALTOSA.
1.1 MATERIALES
Agar almidón ( 02 placa Petri ). Solución de yodo ( Lugol ) Cepas de Bacillus y E.coli.
1.2. PROCEDIMIENTO
Tomar las placas con agar almidón y colocar cerca del mechero, para manipulación.
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Sembrar al muestra de Bacillus en una placa; y E. coli en la otra. Incubar ambas placas a 37°C por 24hrs.
1.3. COMPROBACIÓN
Se comprueba la hidrólisis del almidón agregando gotas de lugol. Si hay presencia de color azul, indica la presencia de carbohidratos; por lo tanto no hay presencia de amilasas, por lo que la reacción será
AMILASA ( - ). Color pardo, puede indicar hidrólisis parcial de almidón. Si hay ausencia de color azul entonces hay ausencia de carbohidratos porque esta presente la enzima amilasa; por lo tanto la reacción será
AMILASA ( + ).
2. HIDRÓLISIS DE LA GELATINA
La Gelatina es una proteína dotada de la propiedad de formar GEL cuando se disuelve en agua caliente. Por tratarse de una proteína puede ser atacada por algunas bacterias que la priven de su propiedad gelificante.
La hidrólisis de la gelatina es una reacción enzimática y se conoce por GELATINASA la enzima causante de esta transformación.
2.1. MATERIALES
Cepas de Proteus, Bacillus y E.coli. Tubos con gelatina – nutriente estéril ( 03 ). Asa de Kölle en aguja.
2.2. PROCEDIMIENTO
Inocule cada uno de los microorganismos en un tubo con gelatina – nutriente por puntura hasta el fondo del tubo, sólo una vez. Incubar a temperatura de ambiente por 2 a 7 días, no en incubadora porque derrite la gelatina.
2.3. COMPROBACIÓN
Si inclinamos el tubo, notaremos menor consistencia de la superficie de la gelatina. Esto indica la presencia de la Gelatinasa, entonces la reacción es Gelatinasa ( + ).
Si inclinamos el tubo y se mantiene la consistencia de la gelatina, entonces la reacción es Gelatinasa ( - ).
3. PRODUCCIÓN DE HEMOLISINAS
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Existen microorganismos que producen exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los glóbulos rojos. A estas enzimas se les denomina Hemolisinas : Hemolisina Alfa y Hemolisina Beta.
La Hemolisina Beta destruye y decolora la hemoglobina. Esto se observa como áreas claras alrededor de la colonia.La Hemolisina Alfa, destruye y decolora parcialmente a la hemoglobina. Se observa cambio a color verdoso.
3.1. MATERIALES
Cepa de Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. Agar sangre ( 02 placas petri )
3.2. PROCEDIMIENTO
Dividir en dos placas cada una de las placas petri e inocular por estrías las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 378C por 24 – 48 hrs. Observar si ha habido hemólisis.
4. PRODUCCIÓN DE COAGULASA
La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el S. aureus y que coagula el plasma humano o de cobayo.La capacidad para coagular el plasma guarda relación directa con la patogenicidad.
4.1. MATERIALES
Cepa de S. aureus. Plasma humano o de cobayo citratados en tubo ( 02 ).
4.2. PROCEDIMIENTO
Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado. Incubar por 2 – 3 hrs. Revisar cada 30’ el tubo para ver si han empezado a formar coágulos. Para esto incline el tubo para ver que tan liquido esta el
plasma.
4.3. COMPROBACIÓN Si el tubo presenta turbidez o hay presencia de coágulos entonces hay presencia de Coagulasa, entonces la reacción será Coagulasa ( + ). Si no hay cambio alguno, entonces la reacción será Coagulasa ( - ).
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CUESTIONARIO
PRACTICA 06
ACCION DE LOS AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO Y ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
Demostrar la acción de los agentes físicos y químicos sobre el crecimiento de las bacterias.
Determinar “in vitro” la sensibilidad de las bacterias frente a los antibióticos.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos están presentes en todos los ambientes; en el agua, aire, suelo contaminado con alimentos, ropas e instrumentos de todo tipo.
En la práctica médica, estomatológica, farmacéutica o en la industria de alimentos es muy importante el control de los microorganismos para evitar
infecciones, transmisión de enfermedades o el deterioro del producto.
Con esta finalidad existen procedimientos físicos como la ebullición, el autoclavado, las radiaciones y el uso de sustancias o agentes químicos como el
alcohol, fenol, eugenol, savlón, etc que eliminan o reducen la cantidad de microorganismos del material o instrumento sometido a uno de estos procedimientos.
Por otro lado cuando se determina la sensibilidad de una bacteria aislada e identificada en relación a varios antibióticos estamos frente a una prueba de
ANTIBIOGRAMA. Los fines prácticos de esta prueba sirven para determinar cual es el mejor antibiótico que se debe prescribir en una enfermedad determinada.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
A ) Acción de la Temperatura.
Sembrar 10 tubos en caldo de cultivo con cepas de estafilococos ( 05 tubos ) y Escherichia coli ( 05 tubos ).
Someterlos a diferentes temperaturas y tiempos de la siguiente manera :
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Tubo 01 : Control.
Tubo 02 : 70°C por 05’.
Tubo 03 : 100°C por 01’.
Tubo 04 : 100°C por 05’.
Tubo 05 : 121°C por 15’. ( Autoclave ).
Incubar a 37°C por 24 horas. Leer los resultados.
B ) Acción de pH.
Sembrar cepas de E. coli ( 02 tubos ) y estafilococos ( 02 tubos ) con caldo nutritivo con pH diferentes : 2, 7, 10.
Incubar a 37°C por 24 horas. Leer los resultados.
C ) Acción de la Radiaciones ( UV ).
Sembrar por diseminación en TSA estafilococos ( 01 placa ) y E.coli ( 01 placa ) y dividir c/u en 04 cuadrantes.
Irradiar con UV de la siguiente manera :
I CUADRANTE : CONTROL.
II CUADRANTE : a 15 cm por 10’.
III CUADRANTE : a 30 cm por 10’.
IV CUADRANTE : a 60 cm por 10’.
Incubar a 37°C por 24 horas. Leer los resultados.
D ) Acción de los Agentes Químicos.
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Sembrar cepas de estafilococos y E.coli en placas de TSA.
Colocar en la superficie sembrada discos estériles de papel de filtro embebido previamente en los siguientes agentes químicos :
- Alcohol 70%
- Savlon
- H2O2.
- Eugenol.
Incubar a 37°C por 24 horas. Leer los resultados.
E ) Con relación a los ANTIBIOGRAMAS, las secuencia de pasos a según el método de KIRBY – BAUER, se describen en la pagina siguiente.
CUESTIONARIO
ANTIBIOGRAMA : KIRBY – BAUER
Incluir 4 ó 5 colonias del microorganismo en estudio en 05 ml de TSB o Mueller – Hinton Broth.
Diluir l inóculo con SSF estéril, hasta encontrar el STANDARD DE TURBIDEZ.
Introducir un hisopo estéril en el cultivo y exprimir el exceso de líquido, rotando el algodón contra la pared del tubo.
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Sembrar en placas de TSA o Mueller - Hinton Agar por estrías, en tres diferentes direcciones. Dejar que e inóculo seque durante 05’ por lo menos y 20’
como máximo.
Distribuir los discos de sensibilidad sobre la superficie del agar. Se presiona suavemente los discos sobre la superficie el medio, empleando pinzas
estériles. La distancia entre disco y disco debe ser no menor de 15 mm.
INCUBAR 18 a 24 h. INCUBAR a 37°C.
LECTURA DE LOS ZONAS DE INHIBICIÓN
( Medir los halos en mm )
SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE
NOTA : La sensibilidad o resistencia de las bacterias, está expresada en las TABLAS DE INTERPRETACIÓN de las zonas de inhibición, que es imprescindible consultar cuando se realiza la lectura del antibiograma.
PRACTICA 07
FAGOCITOSIS IN VITRO
OBJETIVO
Demostrar la capacidad de los leucocitos de fagocitar microorganismos.
Demostrar la diferencia de acción opsonante del suero normal y del suero inmune.
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INTRODUCCIÓN
Casi desde principios de la historia de la bacteriología médica la fagocitosis ocupa un lugar muy importante en la resistencia a las enfermedades
infecciosas.
Existen células capaces de ingeririr y digerir muchos tipos de microorganismos que logran penetrar en el cuerpo. Necesitan de la ayuda inmunitaria
específica del sistema linfoide.
Los macrófagos y los fagocitos mononucleares participan fundamentalmente en el fenómeno de Fagocitosis.
Ciertas sustancias que facilitan la velocidad con que son fagocitados las bacterias y otros agentes infectantes son los denominados OPSONINAS.
MATERIALES
Cultivo de Candida albicans.
05 cc de sangre fresca con anticoagulante Wintrobe 01 cc.
Una jeringa de 05 cc.
Baño María.
Pipeta Pasteur.
Colorante de Wright. Agua tamponada.
Colorante rojo de congo al 1%.
Láminas portaobjetos y láminas cubreobjetos.
Microscopio. Aceite de cedro.
PROCEDIMIENTO
1. Obtener 5 ml de sangre fresca, agregar solución Wintrobe 1cc y agitar.
2. agregar al tubo con sangre 2cc de caldo de Candida albicans.
3. incubar a 37° C por 30’.
4. Centrifugar.
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5. Con una pipeta Pasteur retirar de la interfase plasma, sangre, la capa leucocitaria.
6. Depositar una gota en una lámina con una gota de rojo congo. Cubrir con lámina cubreobjetos. Observar al microscopio.
7. Depositar otra gota en una lámina portaobjeto y extender como para hemograma y colorear con Wright.
8. Observar al microscopio.
CUESTIONARIO
PRACTICA 08
REACCIONES SEROLOGICAS
OBJETIVO
Conocer las pruebas serológicas de uso más frecuente en el diagnóstico de enfermedades infecciosas en nuestro medio.
INTRODUCCIÓN
Las reacciones o pruebas serológicas son reacciones Antígeno – Anticuerpo que se realizan “in vitro”. Estas pruebas sirven para detectar por ejemplo,
anticuerpos presentes en el suero, para lo cual el antígeno debe ser conocido.
Si lo que desea encontrar son antígenos, entonces los anticuerpos correspondientes deberán ser conocidos.
Estas reacciones pueden ser : CUALITATIVAS O CUANTITATIVAS; las primeras determinan presencia o ausencia y las segundas cuantifican los
anticuerpos o antígenos. Este último tiene mayor uso en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
El tipo e reacción serológica que se usa depende básicamente del estado físico del antígeno con que se cuenta.
Existen muchos tipos de reacción serológica, siendo los que a continuación se indican, los tipos más usados :
A ) AGLUTINACIÓN :
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Es la reacción donde el antígeno, se caracteriza por ser celular, particulado o forme ( Ag. no soluble ) y que al irse con su anticuerpo
correspondiente forman grumos : Aglutinación ( + ).
Este tipo de ración se usa para diagnosticar serológicamnente algunas enfermedades como la brucelosis, tifoidea y otras; además es muy usada
en ela determinación de grupos sanguíneos.
B ) PRECIPITACIÓN :
Es una reacción Antígeno – Anticuerpo, y se caracteriza por que el antígeno esta en solución ( Ag. soluble ) y cuando se encuentra con su
anticuerpo especifico se forma una zona o anillo de precipitación.
Este tipo de reacción se usa:
a) Determinación del Laboratorio de enfermedades como la Sífilis ( VDRL ), a esta prueba también se le llama de floculación; y el Ántrax ,
Hidatidosis.
b) También se usa este tipo de reacción para la identificación de sangre y líquido seminal en manchas de ropa, armas y otros con fines médico –
legales.
c) Otro de los fines de esta reacción es descubrir adulteraciones de alimentos.
C ) PRUEBA DE ELISA :
Ensayo Inmunosorbente ligado a enzimas. Esta reacción es muy utilizada actualmente, aunque la técnica era conocida antes de la aparición del
SIDA; fue con esta enfermedad que se hizo muy conocida y su uso se difundió por muchos laboratorios de análisis clínicos.
La prueba de Elisa, no solamente se usa para determinar serológicamente el SIDA, sino también otras enfermedades como la Hepatitis,
Cisticercosis, Rubéola, etc.
Se usa tanto para determinar la presencia de antígenos o anticuerpos. Cuando la prueba se usa para determinar anticuerpos, se sigue los
siguientes pasos :
1. Fijar un Antígeno a un soporte sólido ( por ejemplo, una microplaca ).
2. agregar a la microplaca, el suero – problema ( suero sospechoso ) en diluciones y luego incubar.
3. lavar y luego incubar con ANTIINMUNOGLOBULINA marcada o ligada a una ENZIMA ( generalmente una peroxidasa ).
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4. lavar y agregar el sustrato especifico para la enzima usada, para determinar actividad enzimática.
5. estimar la actividad enzimática por colorimetría.
La reacción es POSITIVA, cuando se evidencia CAMBIO DE COLOR; y es NEGATIVA cuando no hay cambio de color.
PRACTICA 09
EXAMEN PARCIAL DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA
PRACTICA DE LABORATORIO
PRACTICA 10
BACTERIOLOGÍA : GENERO STREPTOCOCCUS.
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GENERO STAPHYLOCOCCUS
OBJETIVO
Conocer las características morfológicas, de tinción y de cultivo de las bacterias pertenecientes al género Streptococcus.
Conocer los aspectos morfológicos, de tinción y de cultivo del género Staphylococcus, necesarios para el diagnóstico de las enfermedades que produce
INTRODUCCIÓN
Los estreptococos son bacterias esféricas ( cocos ) agrupadas en cadenas. Crecen bien en medios enriquecidos. Son Grampositivos. Son anaeróbicos
facultativos y algunas especies son anaeróbicos estrictos.
La clasificación de Lancefield reúne grupos serológicos ( A – O ), teniendo como base el carbohidrato C de la pared celular de los estreptococos.
Los estreptococos producen muchas toxinas y enzimas como la fibrinolisina, la hialuronidasa, hemolisinas, etc; las que son responsables de las
enfermedades que causan los estreptococos como son la faringitis, fiebre reumática, impétigo, glomerulonefritis y septicemia entre otras.
Los estafilococos son bacterias esféricas, agrupadas en racimos, grampositivos, no exigentes culturalmente. Algunos
producen enzimas extracelulares ( Hemolisinas, coagulasas, etc ) y toxinas, que los hacen patógenos ( forman abscesos, forúnculos,
septicemias, etc ); otros son integrantes de la flora normal de la piel y mucosas. Tienden a resistir la acción de los antibióticos,
especialmente de la penicilina, mediante mecanismos genéticos donde intervienen los plásmidos.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO DE LA IDENTIFICACIÓN
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GENERO STREPTOCOCCUS
MUESTRAS
Secreción faríngea, pus, sangre, etc.
COLORACIÓN
El frotis realizado se colorea con GRAM y se observan lsa cadenas de cocos GRAM ( + ) con objetivo de inmersión.
CULTIVO
Los medios más útiles en el aislamiento de estreptococos son el Agar Sangre ( Para determinar hemólisis ) y el Caldo de Tioglicolato, en este último
medio los estreptococos crecen formando pequeños grumos, sin producir turbidez.
Cuando se quieren acelerar la hemólisis en el agar sangre se incuba en una atmósfera de CO2 al 10%.
Para aislar estreptococos orales, se usa el medio Agar Mitis Salivarius.
Los antibiogramas son recomendados, una vez que ha sido identificado el estreptococo para determinar el antibiótico de elección.
Una prueba serológica que ayuda en el diagnóstico de una enfermedad por estreptococos se denomina Antiestreptolisina O ( ASTO ) y consiste en
determinar cuantitativamente anticuerpos contra la Estreptolisina O de los estreptococos. Una cantidad por encima de 160 – 200 unidades de ASTO indica una
infección reciente por estas bacterias.
GENERO STAPHYLOCOCCUS
MUESTRA :
Material purulento, exudados de lesiones superficiales, sangre, hisopado traqueal, etc.
También se examinan alimentos y bebidas ( Para buscar estafilococos productores de toxinas ).
COLORACIÓN
Las muestras previamente fijadas en las láminas porta objetos se tiñen con al coloración GRAM y se observa con el objetivo de inmersión.
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CULTIVO
Se emplean varios medios, de los más importantes son el Agar Manitol Salado ( Para ver si el estafilococo degrada el manitol produciendo una
coloración amarilla ) y el Agar Sangre ( Para ver si el estafilococo produce hemólisis ).
Una prueba muy utilizada para determinar la patogenicidad de los estafilococos es la Prueba de la Coagulasa. Esta consiste en colocar en un tubo de
ensayo plasma citratado ( de conejo o humano ) diluido al quinto ( 1/5 ), con un volumen igual de cultivo de estafilococos, se incuba a 37°C y se espera de 1 a 4
horas.
RESULTADO
Si hay coagulación del plasma, el estafilococo es COAGULASA ( + ).
Si no hay coagulación el estafilococo es COAGULASA ( - ).
Cuestionario
PRACTICA 11
BACTERIOLOGÍA : GENERO MYCOBACTERIUM. GENERO NEISSERIA. GENERO CORYNEBACTERIUM
OBJETIVO
Conocer las características morfológicas, tintoriales y de culturales del género Mycobacterium, necesarias para su identificación.
Conocer las características morfológicas, tintoriales y de culturales del género Neisseria, necesarias para su identificación.
Conocer las características morfológicas, tintoriales y de culturales del género Corynebacterium, necesarias para su identificación.
INTRODUCCIÓN
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Las especies de Mycobacterias de interés humano son dos : M. tuberculosis y M. leprae; existen otras especies saprofitas. Son aerobias. En el proceso de
coloración, una vez teñidas resisten la decoloración por los ácidos o el alcohol y basándose en esta razón son llamados bacilos ácido – alcohol resistentes ( a.a.r ).
M. tuberculosis.
Son bacilos delgados exigentes. Produce la TBC, la que al principio tiene una localización pulmonar primaria y luego puede invadir otros órganos, como
los riñones, intestinos, piel o huesos, etc.
M. leprae.
Son bacilos a.a.r. produce la LEPRA, cuya localización es básicamente la piel y mucosas. El bacilo hasta hoy no es posible cultivarlo en el laboratorio y
el diagnóstico de la enfermedad se basa en el aspecto clínico de las lesiones y la coloración Ziehl – Nielsen.
El material y procedimiento que a continuación se menciona se refiere a M. Tuberculosis, por ser la TBC, una enfermedad mucho más frecuente
que la lepra en nuestro medio.
El género Neisseria, son cocos Gram.(-), que desde el punto de vista morfológico se presentan formando parejas con aspecto de granos de café enfrentados
por su cara plana. Son aerobios estrictos.
El género posee varias especies comensales ubicadas en la orofaringe y dos especies patógenas : N. meningitidis ( Meningococo ) y N. gonorrhoeae
( gonococo ), cuyo único hábitat natural es el hombre.
Dentro del genero Neisseria existe un gran numero de especies comensales en la orofaringe : N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. lactamica, N.
mucosa, N. polysaccharea, N. sicca y N. subflava.
Los microorganismos pertenecientes al género Coynebacterium son bacilos Gram. (+) que no forman esporas, son un grupo variado de bacterias. Muchos
miembros del genero Corynebacterium, forman parte de la flora normal de la piel y membranas mucosas del hombre. Otras corinebacterias se encuentran en
animales y plantas.
En este género destaca C. diphtheriae, que causa la difteria, caracterizada por una faringitis muy exudativa que puede llegar a obstruir las vías
respiratorias, produciendo grave sintomatología general.
Otras especies de este género denominadas colectivamente “difteroides” o “difteromorfos”, forman parte de la flora normal de piel y mucosas; y pueden
causar, como oportunista, infecciones en catéteres, sondas, prótesis y otros cuerpos extraños, una patología semejante a la de los estafilocococos Coagulasa(-) :
C. jeikeium, C. cystitidis, C. pseudodiphtheriticum, C. pseudotuberculosis, C. xerosis, C. striatum y C. minutissimum.
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También entre los difteroides destaca por su importancia oral el C. matruchotti, ya que tiene la capacidad de formar cristales intracelulares de
hidroxiapatita.
MATERIAL Y PROCESO DE IDENTIFICACIÓN
GENERO MYCOBACTERIUM
MUESTRAS
Diversos productos patológicos como esputo, orina, lavado gástrico, lesiones de piel, liquido senovial, tejidos obtenidos por biopsia, etc.
COLORACIÓN
Por el método de Ziehl – Nielsen ( Ver procedimiento en práctica de Coloraciones ).
CULTIVO
El medio más adecuado y más usado en nuestro medio es el Agar Lowenstein – Jensen. La bacteria requiere por lo menos 15 días para presentar
desarrollo visible macroscópicamente sobre el medio de cultivo ( hasta 8 semanas de incubación ).
Sus colonias generalmente rugosas y secas son polimorfas y de dimensiones muy variables.
La coloración de las colonias es crema y algunas veces de color rosado.
Finalmente en los laboratorios especializados se realizan, las pruebas de susceptibilidad antibiótica ( antibiograma ) de cada una de las cepas de M.
Tuberculosis aislados.
GENERO NEISSERIA
MUESTRA
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Secreción uretral ( gonococo ) y secreción faríngea ( meningococo ).
MATERIALES
Mechero, asa de Kolle, láminas porta, Coloración Gram, microscopio, aceite de inmersión. Campana de Gaspack.
Agar sangre. Agar Tayer Martín.
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de Kolle esterilizada y enfriada, realizar la siembra de las cepas y los especimenes clínicos en las placas de Agar sangre y agar Thayer Martín.
Incubar a 37°C por 24 hrs en la campana de Gaspack.
2. A partir de las muestras y las cepas, fijar y colorear con Gram., trabajar con cuidado tratando de no contaminarse.
3. Observar las láminas coloreadas con objetivo de inmersión e identificar los microorganismos en estudio.
4. Esquematice o dibuje sus observaciones macroscópicas y microscópicas.
GENERO CORYNEBACTERIUM
MATERIALES ( Observación de crecimiento )
Cepa de C. diphtheriae.
Placas con medio de cultivo.
Asa y mechero.
PROCEDIMIENTO
Coger dos azadas del caldo que contiene C. d. y sembrar en la placa por estrías.
Llevar a la incubadora por 24 hrs.
Hacer la lectura para identificar las diferentes variedades.
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MATERIALES ( Observación morfológica y gránulos metacromáticos) : Coloración de Gram y de Albert.
Cepas de C. diphteriae.
Láminas.
Azul de metileno.
Lugol.
PROCEDIMIENTO ( col. De Albert para gránulos metacromáticos ).
Fijar la muestra.
Cubrir la lámina con azul de metileno de 1 a 2 minutos.
Lavar con agua corriente.
Aplicar lugol por 1 minuto.
Lavar con agua.
Secar y observar a inmersión.
Haga otro frotis para coloración Gram.
CUESTIONARIO
PRACTICA 12
BACTERIOLOGÍA : GENERO BACILLUS. GENERO CLOSTRIDIUM
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OBJETIVOS
Conocer las características morfológicas, tintoriales y de culturales del género Bacillus, necesarias para su identificación.
Conocer las características morfológicas, tintoriales y de culturales del género Clostridium, necesarias para su identificación.
INTRODUCCIÓN
Dentro de los microorganismos denominados bacilos formadores de esporas tenemos los géneros Bacillus y Clostridium. Estos bacilos debido a que
forman esporas pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. El género Bacillus es aerobio, mientras que el género Clostridium es anaerobio estricto.
Género BACILLUS. Son bacilos grampositivos, aerobios, grandes, que se agrupan formando cadenas. La mayoría de los miembros de este género son
saprofitos : Bacillus cereus y Bacillus subtilis. Prevalecen en el suelo, aire, agua, vegetales diversos.
De las especies conocidas la mayoría no producen enfermedades en el hombre, siendo importantes en enfermedades animales. Sin embargo, algunas especies,
causan enfermedades en el hombre, una de ellas el Bacillus anthracis que es el responsable del Ántrax.
Género CLOSTRIDIUM. Los clostridios son bacilos grandes casi todos móviles ( poseen flagelos peritricos ), grampositivos y anaerobios; muchos
descomponen proteínas, forman toxinas o ambas cosas. Su hábitat natural es el suelo o el intestino de los animales y el hombre, donde viven como saprofitos.
Entre los más patógenos se encuentran los causantes del botulismo, tétanos y la gangrena gaseosa. La espora se puede encontrar en tres formas : Ecuatorial,
Subterminal y Terminal.
Cultivo : Crecen solamente en condiciones de anaerobiosis, mediante dos métodos :
1. Placas de agar o tubos de cultivo en un recipiente hermético, del cual se extrae el aire y se reemplaza por nitrógeno con 10% de CO2 o puede
extraerse el oxígeno por otros métodos ( Gaspack ).
2. Medios líquidos conteniendo tejidos animales ( carne molida ) o bien 0.1% agar y un agente reductor como el tioglicolato. Cerrados. Se observa
crecimiento desde el fondo del tubo hasta aprox. 15 mm de la superficie expuesta al aire.
Destacan : C. tetani, C. perfringens y C. botulinum
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MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
GENERO BACILLUS
A ) Observación microscópica : CoLoración de Gram y Wirtz.
1. Tomar una muestra de espécimen clínico o cepa de Bacillus y hacer frotis en 02 láminas. Teñir una ellas con Gram y la otra con Verde de malaquita o de
Wirtz.
2. Secar las láminas y observar al microscopio con lente de inmersión.
B ) Siembra en Medios de Cultivo:
Medios de cultivo a usarse : Agar sangre, Medio SIM, Medio gelatina, Agar Almidón. 02 de cada uno.
MATERIALES
Cepas de B. anthracis y B. subtilis en caldo
Mechero y Asa de Kolle.
PROCEDIMIENTO
Sembrar por estrías las cepas de B. anthracis y B. Subtilis en una de las placas de agar sangre y agar almidón.
Sembrar cada cepa, por puntura en el medio SIM. Hacer lo mismo con los tubos del medio gelatina.
Incubar a 37°C por 24hrs, marcando previamente cada placa y tubo.
GENERO CLOSTRIDIUM
MATERIALES : Observación del crecimiento.
Cepa de Clostridium.
Tubos con Caldo carne o tioglicolato.
Asa y mechero.
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PROCEDIMIENTO
Sembrar por azadas ( 02 ) en el medio indicado.
Incubar por 24 hrs.
Observar las características del cambio ocurrido en le medio.
MATERIALES : Observación de la morfología y esporas.
Cepas de clostridium.
Colorante de verde de malaquita y safranina.
Asa y mechero.
PROCEDIMIENTO : Coloración Wirtz.
Fijar la muestra tomándola de la parte más turbia del tubo.
Agregar verde de malaquita y realizar 03 llameadas en 05 min.
Lavar a chorro lento.
Agregar colorante de contraste.
Lavar y secar.
Observación de esporas.
CUESTIONARIO
PRACTICA 13
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE : ESTUDIO DE LA BIOQUÍMICA PRELIMINAR DE SALMONELLAS, SHIGELLA, E.COLI Y PROTEUS.
FAMILIA VIBRIONACEAE : VIBRIO CHOLERAE
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OBJETIVOS
Conocer las fuentes de aislamiento de las bacterias de estas familias y estudiar los principales aspectos morfológicos, tintoriales y bioquímicos de
algunos géneros de importancia en Patología Humana.
Familiarizar al estudiante con las técnicas de bacteriología aplicadas.
INTRODUCCIÓN
Los miembros de esta familia son bacilos gramnegativos. Oxidasa negativa, aerobios y anaerobios facultativos, no forman esporas, peritricos o atricos,
metabolizan glucosa por fermentación. Reducen nitratos a nitritos.
Las enterobacterias son importantes porque algunas especies son patógenas humanas y producen enfermedades de elevada incidencia en nuestra
población; tal es el caso de las Salmonellas, Shigellas y E.coli enteropatógenos que producen trastornos gastrointestinales severos que pueden devenir en
trastornos sistémicos como la fiebre tifoidea producida por la Salmonella typhi.
El aislamiento de una enterobacteria puede originar en las rutinas de diagnóstico o de investigación, métodos de aislamiento y de diferenciación. La
diferencia entre uno y otro radica en que el protocolo de investigación incluye técnicas y medios específicos para géneros especiales como el Campylobacter,
Yersinia y los Vibriones, que no se usan en el diagnóstico rutinario por su alto costo.
El Vibrio cholerae pertenece a la Familia Vibrionaceae y como muchas de las eneterobacterias producen diarrea, con la diferencia que el COLERA
produce una deshidratación intensa que puede llagar a la muerte del paciente.
PROCEDIMIENTO
Las muestras más idóneas para el aislamiento de enterobacterias patógenas, son las heces que se obtienen mediante un hisopo rectal que se lleva al
laboratorio en un medio de transporte ( semisólido ), como los medios de Stuart y Cary – Blair entre otros.
Las muestras en estas condiciones pueden ser llevadas la laboratorio para un posterior procesamiento de identificación.
La muestra se siembra en un medio de aislamiento que puede ser Mac Conkey, XLD, DC o en un caldo de enriquecimiento especifico para
Salmonella como es le de Selenito o Tetrationato suplementado con verde brillante para luego sembrar en SS.
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Después de 24 horas de incubación a 37°C las colonias traslucidas e incoloras se repican para estudiar sus características bioquímicas fundamentales, en
los medios de TSI y LIA ( bioquímica preliminar ). Posteriormente se realiza la bioquímica complementaria usando otros medios diferenciales.
El TSI y LIA son medios diferenciales, el primero tienen un indicador rojo fenol; y el segundo tiene púrpura de bromocresol.
INTERPRETACIÓN
EN TSI :
Color amarillo en la parte inclinada : Lactosa ( + ).
Color amarillo en parte profunda : Glucosa ( + ).
Formación de burbujas de aire : Gas ( + ).
Coloración oscura en zona de inoculación : H2S ( + ).
EN LIA :
Color lila : Descarboxilación de la lisina.
Color rojo : Desaminación oxidativa de la lisina.
TSI SALMONELLA SHIGELLA PROTEUS E.COLI V.CHOLERAE
LACTOSA - - - + -
GLUCOSA + + + + +
GAS + +/- + +/- -
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H2S + - + - -
LIA Descarboxilación - Desaminación Descarbox. Descarbox.
EN TSI
EN LIA
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CUESTIONARIO
PRACTICA 14
METODOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO MICOLOGICO
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OBJETIVOS
Conocer la metodología para diagnosticar en el laboratorio una enfermedad micótica.
Reconocer las principales características macroscópicas y microscópicas de los hongos.
INTRODUCCIÓN
Los hongos, organismos eucarióticos, pueden ser pluricelulares ( hongos miceliales o mohos ) y unicelulares ( hongos levaduriformes o
levaduras ).existen hongos ambientales que no causan enfermedad y otros que son patógenos.
El estudio de h. patógenos puede ser realizado a partir de muestras de micosis superficiales ( que afectan piel, pelos y uñas ) o en micosis sistémicas que
afectan órganos internos como pulmones, intestinos, ganglios linfáticos, etc.
Los métodos diagnósticos en el laboratorio varían de acuerdo a la localización del cuadro clínico y en consideración del tipo o especie de hongo probable
causante de la enfermedad.
En líneas generales los pasos que se siguen en el laboratorio son los siguientes :
Una MUESTRA O ESPÉCIMEN puede ser tratada de la siguiente manera :
1. MICROSCOPIA
a) En Fresco :
- Con KOH al 10% o 20%.
- Con lactofenol.
- Con tinta china.
- Con cinta de celulosa.
- Florescencia con naranja de acridina.
b) Por Coloración :
- Gram.
- Ziehl Nielsen.
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- Giemsa.
- PAS.
- Hematoxilina – eosina.
2. CULTIVO : Utilización de medios comunes y medios mejorados. Se pueden utilizar uno o más de los siguientes medios.
- Saboraud. - Mycobiotic agar.
- Czapeck - Agar de levadura.
- Agar Mycosel. - Agar Mycophil.
- Agar sangre. - Infusión de cerebro y corazón.( BHI )
3. INMUNOLOGIA o METODOS INDIRECTOS ( MICOSIS SISTEMICAS )
a) Intradermo reacciones : b ) Reacciones serológicas.:
- Histoplammosis. - Aglutinación.
- Paracoccidiodomicosis - Precipitación.
- Esparotriquina. - Fijación de complemento.
- Inmunodifusión.
- Inmunofluorescencia.
4. PRUEBAS ADICIONALES : Detalladas y descritas para determinadas micosis.
- Pruebas de fermentación y asimilación de carbón para
levaduras.
- Pruebas nutricionales para las diferentes especies del género Trichophyton.
- Cultivo en vidrio de cabellos para diferenciación de dermatofitos.
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Los alumnos describirán las características microscópicas de las colonias de diferentes hongos y esquematizaran las estructuras características
observadas microscópicamente.
CUESTIONARIO
PRACTICA 15
PARASITOSIS INTESTINALES . – TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO
OBJETIVOS
Conocer cuales son las técnicas más usuales en el diagnóstico de investigación de parásitos intestinales más frecuentes en nuestro medio.
INTRODUCCIÓN
El estudio de la parasitosis, es importante ya que constituyen un significativo problema de salud pública en los países en vía de desarrollo y con mayor
incidencia en los lugares de climas templados.
Los parásitos que ocasionan estas enfermedades, son de tres tipos : protozoos, helmintos, artrópodos; y los órganos o sistemas afectados en nuestro
organismo son diversos, así tenemos algunos ejemplos de parasitosis y los órganos que afectan :
Fasciolasis : Hígado.
Tricomaniasis : Cavidad vaginal.
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Paragonimiasis : Pulmones.
Trypanosomiasis : Sangre.
Leishmaniasis : Piel y mucosas.
Amebiasis, Ascariasis, Giardiasis, etc : Intestinos.
De todas estas parasitosis, las intestinales son las que mayormente afectan a nuestra población, sobretodo en las áreas urbano marginales, donde los
servicios de agua potable son más deficientes, ocasionando una mala higiene personal y de los alimentos, factores que permiten la permanencia y
propagación de este tipo de parasitosis.
El objetivo de esta práctica es conocer cuáles son las principales métodos en el diagnóstico de estas parasitosis.
A ) METODO DIRECTO
Se coloca una muestra de heces en una lámina portaobjetos, cubrir con suero fisiológico lugol, colocar cubreobjetos y observar
microscópicamente a menor y mediano aumento.
B ) METODOS DE CONCENTRACIÓN :
Entre los más usados tenemos :
B.1. METODO DE FAUST. Es utilizado para la demostración de quistes de
protozoarios, huevos y larvas de helmintos en heces. Se basa en el proceso de concentración por centrifugación y luego flotación usando sulfato
de zinc concentrado.
B.2. METODO MIFC. ( Modificado por Coutinho ). Es un método usado para la detección de quistes de protozoarios y huevos de helmintos. Se
basa este método en la sedimentación por centrifugación de las heces y el lavado y eliminación de grasas y detritus mediante el uso de una
solución denominada MICF y éter sulfúrico.
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B.3. METODO DE BAERMAN. Este método se usa para la obtención de larvas de nematodos en las heces y se fundamenta en el hidrotopismo
positivos que presentan tales larvas.
Es importante resaltar que el diagnóstico de laboratorio de parasitosis intestinales, se basa fundamentalmente en la observación
microscópica de heces tratando de observar huevos, quistes, trofozoitos o larvas de parásitos.
No es de uso rutinario en éste diagnóstico el uso de medios de cultivo.
CUESTIONARIO.
PRACTICA 16
VIROLOGIA : DIAGNOSTICO DEL LABORATORIO. CULTIVOS. SEROLOGIA
OBJETIVOS
Brindar al alumno de microbiología los conocimientos básicos del desarrollo de los virus en huevos embrionados y en cultivos celulares.
Conocer las principales reacciones serológicas que se usan en el diagnóstico de enfermedades virales.
INTRODUCCIÓN
Los virus son agentes infecciosos intracelulares obligados, ultramicroscópicos que únicamente se propagan en células vivas y que no poseen funciones
enzimáticas para su reproducción, a diferencia de las bacterias, hongos, algas y protozoos que tienen reproducción autónoma.
En el diagnóstico del laboratorio de una virosis se utiliza básicamente las pruebas serológicas como son RADIOINMUNOENSAYO ( RIA ),
INMUNOFLUORESCENCIA y Ensayo Inmunosorbente Ligado a Enzimas ( ELISA ). Solamente algunos laboratorios en nuestro medio realiza cultivos
celulares para el aislamiento de los virus los que son de gran importancia para el diagnóstico de las virosis.
A continuación describimos algunas características de cultivos celulares.
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Se conocen tres tipos de cultivos celulares para virus :
a) Cultivos Primarios .- Se obtienen de un órgano o tejido animal. Ejemplo ; tejido de riñón de mono. No susceptibles de ser propagados
indefinidamente.
b) Cultivos de Líneas Celulares Continuas .- Se propagan en numerosos pasos sucesivos pero no indefinidamente. Ejemplo; HeLa, Hep2, FL.
c) Cultivo de Células Diploides .- Se propagan en numerosos pasos sucesivos indefinidamente. Ejemplo; tejido pulmonar de embrión humano.
En todos los cultivos celulares se requiere de condiciones osmóticas y nutritivas especiales que garanticen la supervivencia y crecimiento viral. Muchos
virus patógenos para el hombre y animales pueden propagarse en células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de pollo.
Con la finalidad que el alumno identifique la anatomía del huevo embrionado, se inoculará un colorante para visualizar la cavidad alantoidea, amniótica
y saco vitelino.
MATERIALES
- Huevos embrionados de 7 a 12 días. - Tijera curva.
- Pinzas de disección sin uñas. - Ovoscopio.
- Placas Petri. - Cinta adhesiva.
- Alcohol yodado. - Fuccina al 1%.
- Azul de metileno al 1%. - Pipeta Pasteur.
- Jeringa de tuberculina con aguja N°22 y N°25. - S.S.F.
PROCEDIMIENTO
A ) Inoculación por Vía Alantoidea :
50
Marcar la zona opuesta al embrión con el ovoscopio, zona libre de vascularidad en los huevos embrionados de 10 a 12 días.
Se limpia la zona de inoculación con alcohol yodado y hacer un pequeño orificio en la cáscara de huevo.
Se introduce la aguja de la jeringa que contiene fuccina formando un ángulo de 45° y se inocula 0.2 ml.
Para verificar se corta con la tijera curva la cáscara tomando como referencia la cámara de aire, levantar la membrana corioalantoidea y observar el
líquido alantoideo con la fuccina.
Verter todo el contenido en una placa petri.
B ) Inoculación del Saco Vitelino :
Con el ovoscopio ubicar la cámara de aire en un huevo embrionado de 5 a 7 días y limpiar con alcohol yodado.
Introducir la jeringa con aguja N° 22 e inocular 0.5 ml de azul de metileno, en posición vertical, a una profundidad aproximada de 35 mm.
Verificar cortando la cáscara con la tijera curva levantando la membrana.
Vertir el contenido del huevo en la placa Petri y observar el saco vitelino coloreado.
C ) Inoculación por Vía Amniótica :
Ubicar la cámara de aire con el ovoscopio en un huevo embrionado de 10 a 12 días y limpiar con alcohol yodado. Hacer un perforación rectangular de 5
mm.
Dejar caer una gota de solución fisiológica estéril.
Con pinza curva abrir el área expuesta y coger la membrana amniótica levantándola para formar una “tienda” en cuya base se inyecta el colorante.
Tapar la abertura con cinta adhesiva.
Verificar cortando la cáscara y extraer el líquido amniótico con pipeta Pasteur el que debe estar coloreado. Se debe desechar previamente el líquido
alantoideo.
CUESTIONARIO
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PRACTICA 17
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. BROWN, N. Microbiología de Jawetz. 1999.
2. KONEMAN, A. Diagnóstico Microbiológico. 1998.
3. LIÉBANA, F. Microbiología Oral. 1995.
4. MURRHY, E. Microbiología Médica. 1999.
5. NOLTE, W. Microbiología Odontológica. 1997.
6. ZAPATEAR, R. Micología Médica. 1983.
EXAMEN FINAL DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA
PRACTICA DE LABORATORIO
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