Universidad Andrs Bello Facultad Ciencias Biolgicas

Departamento de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Microbiologa

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

MICROBIOLOGA

BIOL 150

2015

CARRERA: ENFERMERA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

!1. Identificacin de la Asignatura

CURSO : MICROBIOLOGA GENERAL

CDIGO : BIOL 150 CARRERA : ENFERMERA TIPO DE ACTIVIDAD: TERICO-PRCTICO HORARIO DE CLASES: Seccin 1: Martes: 14:55-16:35 hrs (Mdulos 8-9), Viernes: 13:05-14:45 hrs (Mdulos 6-7). Seccin 2: Viernes: 10:20-12:00 hrs (Mdulos 3-4), Lunes: 12:10-13:50 hrs (Mdulos 5-6). Seccin 3: Viernes: 13:05-14:45 hrs (Mdulos 6-7), Martes: 14:55-16:35 hrs (Mdulos 8-9). HORARIO LABORATORIO: Lu 1-2/ Ma 1-2 (08:30-10:10): SECCIONES 4-5-6-7-12-13. Lu 3-4/ Ma 3-4 (10:20-12:00): SECCIONES 8-9-10-11-14-15. 2. Profesores Prof. Coordinador de la asignatura: Dr. Rodrigo Villanueva (rodrigo.villanueva@unab.cl) Profs. Encargados de Ctedra: Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (paula.rodas@unab.cl, Seccin 1)

Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (Seccin 2) Dra. Pamela Machuca (pamela.mac@gmail.com, Seccin 3)

Prof. Coordinadora de Laboratorio: Mg. Camila Miranda (camila.miranda.c@gmail.com) Profs. Laboratorio: Mg. Karina Espinoza (karinafespinozag@gmail.com)

Mg. Valeska Herrera (vale.herrera@uandresbello.edu) Mg. Luis Saona (lsaona@ug.uchile.cl) Lic. Rhonda Veas (rh.veas@uandresbello.edu)

Lic. Pa Viera (pia.vierav@gmail.com) Dra. Pamela Machuca (pamela.machuca.v@gmail.com)

Dr. (C) Ignacio Fuentevilla (iafuentevilla@gmail.com) Secciones de laboratorios:

Seccin 4: Prof. Camila Miranda/Rhonda veas Seccin 5: Prof. Rhonda Veas/Camila Miranda Seccin 6: Prof. Ignacio Fuentevilla /Pa Viera Seccin 7: Prof. Pa Viera /Ignacio Fuentevilla Seccin 8: Prof. Pamela Machuca/ Karina Espinoza Seccin 9: Prof. Karina Espinoza/Pamela Machuca Seccin 10: Prof. Pa Viera /Rhonda Veas Seccin 11: Prof. Rhonda Veas/ Pa Viera Seccin 12: Prof. Valeska Herrera/Karina Espinoza Seccin 13: Prof. Karina Espinoza/Valeska Herrera Seccin 14: Prof. Camila Miranda/ Luis Saona Seccin 15: Prof. Luis Saona/Camila Miranda

3. Cronograma de las actividades tericas

BIOL 1050T-1 y BIOL 150T-3 BIOL 150T-2 ACTIVIDAD

Ma 4 de Agosto Lu 3 de Agosto Presentacin del Curso Introduccin

Vi 7 de Agosto Vi 7 de Agosto Filogenia y Taxonoma Morfologa y Agrupaciones

Ma 11 de Agosto Lu 10 de Agosto Fisiologa Bacteriana

Vi 14 de Agosto Vi 14 de Agosto Metabolismo y Crecimiento Bacteriano

Ma 18 de Agosto Lu 17 de Agosto Gentica Bacteriana I

Vi 21 de Agosto Vi 21 de Agosto Gentica Bacteriana II

Ma 25 de Agosto Lu 24 de Agosto Antimicrobianos y Resistencia I

Vi 28 de Agosto Vi 28 de Agosto Antimicrobianos y Resistencia II

Ma 1 de Septiembre Lu 31 de Agosto Relacin hospedero-parsito

Vi 4 de Septiembre Vi 4 de Septiembre Infecciones estafiloccicas

Ma 8 de Septiembre Ma 8 de Septiembre SOLEMNE I Mdulos 12 y 13

Ma 22 de Septiembre Lu 21 de Septiembre Infecciones Estreptoccicas

Vi 25 de Septiembre Vi 25 de Septiembre Infecciones por bacilos Gram +

Ma 29 de Septiembre Lu 28 de Septiembre Enterobacterias I

Vi 2 de Octubre Vi 2 de Octubre Enterobacterias II y bacilos no fermentadores

Ma 6 de Octubre Lu 5de Octubre Bacterias nutricionalmente exigentes. Neisserias, Espiroquetas y otras ETS

Vi 9 de Octubre Vi 9 de Octubre TBC. Bacterias Especiales (Micoplasmas, Clamidias y Rickettsias)

Ma 13 de Octubre Vi 16 de Octubre Micologa. Generalidades

Ma 20 de Octubre Ma 20 de Octubre SOLEMNE II Mdulos 12 y 13

Vi 23 de Octubre Vi 23 de Octubre Micosis superficiales y oportunistas

Ma 27 de Octubre Lu 26 de Octubre Micosis profundas patgenas Drogas antifngicas

Vi 30 de Octubre Vi 30 de Octubre Virologa. Generalidades Replicacin viral

Ma 3 de Noviembre Lu 2 de Noviembre Virus de importancia mdica I

Vi 6 de Noviembre Vi 6 de Noviembre Virus de importancia mdica II y III

Ma 10 de Noviembre Lu 9 de Noviembre Conceptos Generales de parasitologa y Enteroparasitosis Nemtodos Intestinales I

Vi 13 de Noviembre Vi 13 de Noviembre Nemtodos Intestinales II Cstodes Intestinales

Ma 17 de Noviembre Lu 16 de Noviembre Protozoos Intestinales Helmintos Tisulares

Vi 20 de Noviembre Vi 20 de Noviembre Protozoos Tisulares

Ma 24 de Noviembre Ma 24 de Noviembre SOLEMNE III Mdulos 12 y 13

Vi 27 de Noviembre Vi 27 de Noviembre Artrpodos de inters mdico Malaria, amebas de vida libre

Mi 9 de Diciembre Mi 9 de Diciembre EXAMEN Mdulos 7 y 8

4. Cronograma de las actividades prcticas

Fecha Seccin ACTIVIDAD

10 Agosto 4-6-8-10-12-14 01. Presentacin del curso

11 Agosto 5-7-9-11-13-15 01. Presentacin del curso

17 y 18 Agosto 4-6-8-10-12-14 02. Procedimientos Bsicos

24 y 25 Agosto 5-7-9-11-13-15 02. Procedimientos Bsicos

31 Ago y 1 Sept 4-6-8-10-12-14 03. Morfologa Bacteriana

7 y 8 Sept 5-7-9-11-13-15 03. Morfologa Bacteriana

21 y 22 Sept 4-6-8-10-12-14 04. Muestras Clnicas Gram + y Flora Normal

28 y 29 Sept 5-7-9-11-13-15 04. Muestras Clnicas Gram + y Flora Normal

5 y 6 Oct 2014 4-6-8-10-12-14 05. Muestras Clnicas Gram y Antibiticos

19 y 20 Oct 2014 5-7-9-11-13-15 05. Muestras Clnicas Gram y Antibiticos

26 Octubre 4-6-8-10-12-14 06. Levaduras y Hongos Filamentosos

27 Octubre 5-7-9-11-13-15 06. Levaduras y Hongos Filamentosos

16 Nov 2014 4-6-8-10-12-14 07. Parasitologa

17 Nov 2014 5-7-9-11-13-15 07. Parasitologa

23 Nov 2014 Todas las secciones 00. Controles Recuperativos

23 Nov 2014 Todas las secciones 00. Revisin controles e informes

5. Requisitos de asistencia La asistencia a clases tericas debe ser superior al 80%. La asistencia a los laboratorios debe ser de 100%. La justificacin de inasistencia a alguna actividad se debe realizar en la Direccin de la Escuela de Enfermera. Los alumnos debern presentar una fotocopia validada del certificado mdico o similar al profesor encargado de ctedra o laboratorio (segn corresponda) dentro de los 7 das hbiles despus de presentado el justificativo. Ms de un 20% de inasistencia (incluso justificada) equivale a la Reprobacin automtica del curso. La puntualidad para las actividades prcticas es indispensable, ya que los controles de entrada se realizarn durante los primeros 10 minutos. El alumno que llegue al laboratorio despus de ese tiempo ser calificado con nota 1,0. Si un alumno llega con un atraso superior a 30 minutos, no podr realizar la actividad prctica y la situacin ser considerada como inasistencia. No se permitirn cambios de seccin en los trabajos prcticos, cada alumno debe permanecer en la seccin que le corresponde durante todo el semestre. 5. Condiciones para aprobar el curso:

El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, segn la planilla de clculo del sistema en Intranet. La nota de presentacin se calcular de acuerdo a los siguientes parmetros: TERICO: La ponderacin de la parte terica del curso corresponde al 70% de la nota de presentacin, segn: Prueba Solemne I: 25%, Prueba Solemne II: 25%, Prueba Solemne III: 20%. PRCTICO: La ponderacin de la parte prctica del curso corresponde al 30% de la nota de presentacin, segn: 1) Controles de entrada: 70%, 2) Informes: 30%. El promedio de las actividades sealadas con la ponderacin establecida corresponde a la nota de presentacin.

PROMEDIO FINAL: 1) Nota presentacin: 70% 2) Examen Terico!Prctico: 30%

Los alumnos que sean sorprendidos en actividades irregulares (copia, uso de torpedos, plagio, etc) en pruebas solemnes, controles de laboratorio, informes de laboratorio, pruebas parciales o durante el examen final, sern evaluados con nota 1,0 en esa actividad. Particularmente, se considerar plagio la facilitacin y/o utilizacin de informacin de otros grupos del curso, as como el uso de informacin de internet sin citar con su respectiva referencia bibliogrfica.

Los alumnos que presenten bloqueos de cualquier tipo y no aparezcan en las listas oficiales tienen

como plazo mximo para regularizar su situacin el da Lunes 14 de Septiembre, de lo contrario no podrn hacer ingreso a la sala de clases. 6. Prueba Recuperativa

Ante la inasistencia a una Solemne, se considerar el Examen como prueba recuperativa. Slo tendrn derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas ante la Escuela de Enfermera. 7. Condiciones de eximicin Se eximirn del examen final SLO los alumnos que alcancen una nota 4,95 superior que NO hayan obtenido ninguna nota roja en las pruebas solemnes ni en los controles e informes del laboratorio (Condiciones establecidas que se rigen segn el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artculo 40). 8. Metodologa de actividades acadmicas

El curso se desarrollar a travs de clases tericas presenciales, distribuidas en 4 horas semanales, con uso de material audiovisual y guas de apoyo. Los trabajos prcticos se desarrollarn en los laboratorios de microbiologa con actividades programadas para que cada alumno manipule material microbiolgico y aprenda las tcnicas bsicas de la microbiologa, bajo la supervisin de dos profesores por sala.

Los controles son de tipo verdadero y falso, donde solo las preguntas falsas se responden de la siguiente manera: Pregunta1: __F_ El pasto es azul. Respuesta: El pasto es verde. No se evaluaran como respuestas correctas si Ustedes justificaran que el cielo es azul. Porque no se le esta preguntando por el cielo, sino que por el pasto. Informes:

Durante cada trabajo prctico los alumnos debern entregar un informe de las actividades realizadas, los resultados obtenidos y la correspondiente discusin de estos, para esto los alumnos realizaran un informe pre-establecido, el cual se completara durante las secciones practicas de laboratorio. Los informes se deben completar con los datos solicitados segn corresponda en cada actividad prctica. En los informes se evaluarn los resultados obtenidos (si fueron realizados correctamente los objetivos del practico) y las metodologas utilizadas. Los grupos de trabajo son de DOS PERSONAS, las cuales deben trabajar juntas durante todo el semestre, SIN DERECHO A SEPARARSE.

Formas de citar las referencias en el informe:

En los informes la bibliografa debe ser escrita de forma correcta, segn su procedencia. Algunos ejemplos: 1. Artculos en revistas: Nombre Autores, Ao de publicacin, Nombre Revista, Volumen, Pginas. Ej: Woese, C.R., 1987, Bacterial evolution, Microbiol. Rev., 51:221!271. 2. Libros: Nombre Autores, Nombre Libro, Ao de publicacin, Edicin, Editorial, Pginas. Ej: Madigan M. T., Martinko J. M., Dunlap P. V. y Clark D. P., Brock. Biologa de los Microorganismos. 2009, 12 ed., Editorial Pearson Educacin, 125 135. 3. Electrnicas: Temas principal, tema especfico, fecha de cuando se utiliz, direccin electrnica. Ej: Parsitos Intestinales, Ascaris, sbado 1 de enero 2011, http://www.hnt.cl/p4_hospital/site/pags/20040405111759.html Las citas electrnicas deben provenir de sitios confiables como Universidades, Sociedades Cientficas, Sitios de revistas electrnicas, etc. No se permitira la utilizacion de sitios como wikipedia, rincon del vago, etc. 9. Eliminacin de nota: No se eliminar ninguna de las notas obtenidas en las pruebas solemnes, ni en el laboratorio. 10. Normas de disciplina

Durante todas las actividades, los alumnos deben cumplir las siguientes condiciones:

- Disciplina: Las normas de orden y disciplina deben ser mantenidas durante todas las actividades. Esto significa que no pueden hacer uso de telefona celular u otra forma de comunicacin mientras se encuentren dentro de la sala de clases. Los estudiantes no podrn salir/retirarse de la sala de clases sin previa autorizacin del profesor encargado. En cuanto a las normas de respeto y sana convivencia, se exigir un lenguaje adecuado y un comportamiento acorde a un estudiante universitario.

Participacin: Se espera participacin activa en clases teoricas y practicas, por lo que el alumno debera tener conocimiento de los contenidos que se abordaran en la clase y de materias anteriores. En todas las clases se realizarn interrogaciones orales sorpresas de materia del prctico correspondiente o prcticos pasados, una buena respuesta conlleva a una evaluacin positiva, de lo contrario una mala respuesta ser evaluada con puntaje negativo, reflejado dicho puntaje en el control.

- Evaluacin: Cada alumno es responsable de traer consigo lpiz, goma y corrector. No se aceptarn prstamos entre los alumnos mientras se realice la evaluacin.

Queda estrictamente prohibido el uso de celulares dentro de la sala, por lo que se solicita apagar!"

silenciar estos previo al ingreso a las actividades del curso. Ademas, el uso de grabadoras, mp 3, mp4, etc. durante las evaluaciones y revisiones de las solemnes y controles queda extrictamente prohibido.

La asistencia al laboratorio es obligatoria, y de la misma manera es obligatorio el cumplimiento de las siguientes normas:

Asistencia con delantal blanco y calzado apropiado (cerrado). En caso que el alumno(a) tenga pelo largo debe asistir al laboratorio con este tomado con un moo

tipo tomate.

No se puede ingresar al laboratorio con mochilas, bufandas, pauelos, etc por lo que cada alumno debe llevar un candado para dejar sus pertenencias en las gavetas provistas por la universidad.

El incumplimiento de cualquiera de estas normas imposibilita al alumno de realizar el trabajo prctico.

Por otra parte, se exigir puntualidad en el horario de salida del trabajo prctico (10:00 a.m. y 11:50 a.m.), el cual tiene una duracin de 90 minutos. En caso de no cumplir con este horario, existir un descuento en la nota de control del entrada del trabajo prctico que se est realizando. El descuento ser de 0,1 puntos por cada minuto de retraso, el cual se puede extender hasta 10 minutos (correspondientes al tiempo de recreo).

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRCTICOS DE MICROBIOLOGA

Durante el desarrollo de las actividades prcticas se debe mantener una serie de normas, cuyo propsito

fundamental es la preservacin de la salud del alumno, sus familias y la comunidad.

1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminacin de sus ropas.

2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.

3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado, se exige moo tipo tomate.

4. Est estrictamente prohibido comer, beber, fumar, masticar chicle, o llevarse cualquier objeto a la boca, por

el riesgo de contagio.

5. No ingresar bolsos, pauelos, bufandas o chaquetas a la sala de trabajos prcticos.

6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y despus de su uso. Al enfriarla, evite salpicar, los

aerosoles son muy contagiosos.

7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material cortopunzante.

8. Las placas de Petri slo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor a los 30 cm del

mechero Bunsen encendido.

9. Los tubos deben flamearse (la boca del tubo) antes y despus de ser utilizados.

10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto tambin se recomienda

frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto con material contaminado.

11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. ste slo debe encenderse al momento de la

observacin de su tincin. La que debe retirarse terminada la observacin (y ser eliminada donde corresponde),

y para limpiar el objetivo 100 x se utiliza solucin limpia lentes y papel tissue.

12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y despus de realizado el trabajo prctico, por

lo tanto en su bandeja Usted encontrara un aspersor con Etanol 70 % y algodn.

El estudio de bacterias, virus, parsitos y hongos potencialmente patgenos para el hombre, animales u otros

seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los procedimientos empleados. Las normas

de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable el riesgo asociado a su manipulacin. Deben considerarse

para lograr que el personal que manipula estos agentes infecciosos en el mbito hospitalario estn

mnimamente expuestas a adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.

TRABAJO PRCTICO N1

PROCEDIMIENTOS BSICOS

BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a proteger la salud de las

personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biolgicos, fsicos o qumicos en el laboratorio,

como tambin indirectamente al ambiente.

AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genticamente modificados, presentes en

forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originar cualquier infeccin, alergia o

toxicidad.

CONTROL DE LA CONTAMINACIN EN EL LABORATORIO

El laboratorio tiene importancia central en el diagnstico etiolgico, de modo que resulta fundamental evitar la

contaminacin de las muestras, ya sea desde el operador como desde las otras muestras (contaminacin

cruzada).

Con este fin, se debe trabajar con TCNICA ASPTICA y utilizando material ESTRIL. Algunos conceptos

que debemos conocer y manejar son:

DESINFECCIN: proceso que busca eliminar la mayora de los microorganismos patgenos, excepto esporas

y algunos virus, en objetos inanimados.

ASEPSIA: proceso que utiliza agentes qumicos para impedir infeccin de piel, mucosas u otros tejidos en

seres vivos. Los antispticos actan provocando muerte de los microorganismos patgenos o impidiendo su

multiplicacin.

SANITIZACIN O HIGIENIZACIN: Proceso que utiliza lavado mecnico o agentes qumicos para

REDUCIR el nmero de patgenos presentes en un objeto hasta niveles aceptables para la salud pblica.

ESTERILIZACIN: proceso fsico o qumico destinado a destruir TODA vida microbiana, incluyendo

esporas, en materiales u objetos inanimados.

TCNICAS DE ESTERILIZACIN

1.- Mtodos Fsicos

a) Calor

Es el mtodo ms usado, econmico y fcil de controlar. Proceso rpido al cual la totalidad de los

microorganismos resulta sensible.

Pasteurizacin: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lcteos (Tuberculosis, Brucelosis,

Salmonelosis) y retrasar descomposicin de la leche.

Autoclave (vapor saturado a presin): Entre los mtodos de esterilizacin, es el ms efectivo y de menor costo;

es el mtodo de eleccin para instrumental mdico de uso repetido.

Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A travs del flameado se evita

la contaminacin de tubos y matraces., al someterlos directamente a la llama.

b) Radiaciones

Rayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicacin del DNA durante la

replicacin celular.

Se usa principalmente en ambientes de quirfanos, sala de prematuros, esterilizacin de superficies.

Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilizacin en fro de

materiales desechables como: jeringas, bisturs, catteres, prtesis, guantes de ciruga y equipos de transfusin.

2.- Mtodos Mecnicos

Ondas snicas y ultrasnicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendo desnaturalizacin de protenas

y muerte celular.

Filtracin: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias lquidas o gases, mediante su paso

a travs de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es la esterilizacin de sueros o lquidos

que contengan protenas o metabolitos termolbiles.

3.- Mtodos Qumicos (antispticos y desinfectantes)

La penetracin de estos agentes es ms rpida en bacterias Gram positivo, debido principalmente a la presencia

protectora de la membrana externa en las bacterias Gram negativo.

Los agentes qumicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al encontrarse contaminados

con bacterias, siendo el gnero Pseudomonas el ms habitual. Esto es de suma importancia y para evitarlo es

imprescindible que el personal de salud cuente con un acabado conocimiento del tema.

El siguiente cuadro resume los principales agentes qumicos y su utilidad

AGENTE ACCIN APLICACIN Alcoholes 70% Sobre formas vegetetivas (no esporas). Desnaturaliza

protenas. Piel y superficies inertes

Cloro Bactericida. Acta oxidando grupos sulfhidrilos libres. tiles de cocina, chatas, patos, baos, unidades de dilisis

Yodo/povidona yodada

Bactericida. Acta sobre formas vegetativas y esporas, hongos y algunos virus. Interfiere procesos de oxido reduccin y fosforilacin bacterianos.

Piel heridas, material quirrgico

TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA

El objetivo principal del prctico es la adquisicin de conocimientos bsicos en lo que respecta a la

manipulacin de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de esterilidad, siembra en medios

lquidos, en medios slidos (diferenciales, selectivos, etc) y siembra en condiciones anaerbicas.

El cumplimiento de las tareas en microbiologa clnica exige la realizacin de tres actividades: la primera

de ellas, aislamiento e identificacin de microorganismos, se inicia con el cultivo de las muestras de distinto

origen, en medios especficos y en condiciones definidas, y va seguido de examen microscpico y pruebas

bioqumicas al microorganismo aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o

sensibilidad a antibiticos, biotipificacin y serotipificacin; y por ltimo, la tercera actividad involucra la

identificacin epidemiolgica o comparacin de los aislamientos de la misma especie con el fin de hacer el

control de la infeccin o anlisis de poblacin.

Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo puro que debe

ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e indispensable emplear material

completamente estril (Tabla N 1).

Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento importante

en el rea de la microbiologa que es la siembra o cultivo. Esta consiste en colocar a los microorganismos en un

ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo

constituyen los medios de cultivo corrientes o bsicos y especiales, operacin que debe realizarse en forma

asptica.

Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas

especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son

las que tienen un rol patgeno.

Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza,

condicin indispensable para poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas y lograr as su

identificacin correcta.

Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de UNA

colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.

En el caso de los medios lquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un

aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio slido para obtener colonias aisladas y puras

(Tabla N 2).

Si fuese necesario, las colonias se sometern a uno o ms re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es

decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfologa y microscpicamente correspondan

a un solo tipo de bacteria.

Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana mediante el traspaso

de UNA sola colonia a una batera de medios de identificacin.

MORFOLOGA BACTERIANA: ANLISIS MACROSCPICO

Una etapa importante y bsica en el estudio de las caractersticas de una bacteria, es la observacin de su

morfologa. Como consecuencia del pequeo tamao que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y,

debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas

colonias es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgnica, iones

inorgnicos y factores de crecimientos entre otros a travs de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde

en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido,

hasta formar una poblacin que se represente como una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada

por millones de bacterias.

El crecimiento de las bacterias en medios lquidos, no da origen a la formacin de colonias. El desarrollo

se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras caractersticas.

Cabe destacar que la morfologa macroscpica de las colonias (anlisis macroscpico) permite un

acercamiento en la identificacin de los gneros bacterianos que poseen caractersticas propias de desarrollo de

sus colonias, segn su forma, elevacin, margen, superficie, brillo, color y hemlisis (en agar sangre).

Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace imposible

diferenciarlas solo con la observacin macroscpica de estas por lo que se hace necesario adems una

observacin microscpica de las clulas que conforman estas colonias.

Esto datos proporcionan una orientacin sobre las pruebas bioqumicas para la identificacin definitiva de

las colonias.

En la siguiente figura se observan algunas caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas,

frecuentemente utilizadas para la descripcin de una bacteria o microorganismo.

Figura N 1: Criterios macroscpicos para la descripcin de una colonia bacteriana.

Tabl

a N

1 :

Mat

eria

l de

uso

com

n e

n el

Lab

orat

orio

de

Mic

robi

olog

a

Mat

eria

l Ti

po e

ster

iliza

cin

Es

teril

izac

in

Tipo

de

mat

eria

l A

ntes

de

ser u

tiliz

ada

Des

pus

de

ser u

tiliz

ada

Asa

de

plat

ino

Dire

cto

a la

llam

a de

l mec

hero

S

S

R

e-ut

iliza

ble

Pipe

tas a

fora

das d

e vi

drio

* D

irect

o a

la ll

ama

del m

eche

ro

S

S

Re-

utili

zabl

e

Pipe

tas a

fora

das d

e pl

stic

o Q

um

ica

No

No

Des

echa

ble

Pipe

tas P

aste

ur d

e vi

drio

* A

utoc

lave

N

o Si

D

esec

habl

e

Tubo

s est

rile

s**

Aut

ocla

ve

Llam

a M

eche

ro

Si

Si

Re-

utili

zabl

e

Plac

as P

etri

de v

idrio

A

utoc

lave

Si

Si

R

e-ut

iliza

ble

Punt

as d

e Pa

pel A

bsor

bent

e A

utoc

lave

N

o N

o D

esec

habl

e

Plac

as P

etri

de p

lst

ico

Qu

mic

a N

o Si

D

esec

habl

e

* E

ste

mat

eria

l se

pued

en e

ncon

trar e

n ci

lindr

os m

etl

icos

o e

nvue

ltas e

n pa

pel,

ya e

str

iles.

En e

l prim

er c

aso,

se d

ebe

pone

r el c

ilind

ro e

n fo

rma

horiz

onta

l, de

stap

arlo

y

saca

r una

pip

eta

sin

toca

r con

los d

edos

las o

tras,

en e

l seg

undo

cas

o se

deb

e de

senv

olve

r la

pipe

ta, d

e m

aner

a de

no

toca

r su

extre

mo

infe

rior.

** C

ada

vez

que

se d

esta

pe u

n tu

bo e

str

il, se

deb

e fla

mea

r su

boca

y re

petir

la o

pera

cin

inm

edia

tam

ente

ant

es d

e vo

lver

a c

erra

rlo. E

ste

proc

edim

ient

o pr

eten

de e

vita

r la

ent

rada

de

mic

roor

gani

smos

del

aire

al i

nter

ior d

el tu

bo.

ACTIVIDADES PRCTICAS (PRIMERA SESIN)

1. De medios Slidos a medios Slidos (tcnica de aislamiento en cuadrantes). 1.1. Desde placa Petri a placa Petri:

a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha).

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan

colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio, la

muestra se tomara una sola vez (Con solo tocar la colonia estar tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

e. Colocar la tapa de la placa sobre el mesn cerca del mechero. f. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello:

i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la placa. Flamear el asa.

ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamear el asa.

iii. A partir de las ltimas lneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.

iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estras en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.

g. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 2: Siembra desde medio solido a medio solido (placa de Petri

2. De medios Slidos a medios Lquidos. 2.1. Desde placa Petri a tubo con medio lquido:

a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo, Fecha).

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio (Con

solo tocar la colonia estar tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

e. Flamear la boca del tubo con medio lquido. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilizacin.

Figura N 3: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

A B

C D

18 24 Hrs.

3. De medios Lquidos a medios Slidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a placas de Petri:

a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes.

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan

colonias. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e

introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesn cerca del mechero. g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello:

v. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la placa. Flamear el asa.

vi. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamear el asa.

vii. A partir de las ltimas lneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.

viii. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estras en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.

h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin.

4.

Figura N 4: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a agar en placa Petri.

A B C

D

18 24 Hrs.

5. De medios Lquidos a medios Slidos (Zig-zag superficie). 5.1. Desde tubo de cultivo bacteriano lquido a tubo con Agar tendido:

a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha).

b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. c. Flamear el asa en punta para su esterilizacin. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y

enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. g. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un slo movimiento, deslizar el

asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo. h. Flamear y tapar la boca del tubo. i. Flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 5: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar tendido.

6. De medios Lquidos a medios Slidos. 6.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar blando (Por pinchadura).

a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. c. Flamear el asa en punta para su esterilizacin. k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estril; para ello: i.- Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Retirar el asa con precaucin para producir el menor desgarro posible. e. Flamear la boca del tubo y tpelo. f. Flamear el asa para su esterilizacin. g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada. h. Ver ejemplo del procedimiento en la Figura N4.

Figura N 6: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar blando.

7. De medios Lquidos a medios Slidos. 7.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar semi tendido (Pinchadura

en el fondo y zig-zag en la superficie). a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin. c. Flamear el asa en punta para su esterilizacin. k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estril; para ello: i.- Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Al retirar el asa con precaucin para producir el menor desgarro posible, en la superficie tendida pasar el asa en forma de zig-zag. e. Flamear la boca del tubo y tpelo. f. Flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 7: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar semi tendido.

8. Tcnicas de esterilizacin

7.1. Flameado

a. Dividir una placa por la mitad. b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del

agar. Cerrar la placa. c. Flamear el asa para su esterilizacin, enfrela en la tapa y deslcela suavemente por la otra

mitad del agar. d. Cerrar la placa. e. Incubar la placa a 37C.

9. Desinfeccin y Asepsia 8.1. Cloro

a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos. b. Tomar una trula estril y humedecerla en suero fisiolgico. c. Deslizarla rpidamente por un sector del mesn de trabajo, alejado del mechero (ms de 30 cm). d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag). e. Humedecer la misma trula con la solucin de cloro, espere tres minutos. f. Ahora pasar la trula por la otra mitad del agar (Zig-Zag). g. Incubar la placa a 37C por 24hr.

8.2 Yodo

a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar. b. Tome un trozo de algodn con yodo y aplquelo en el dedo que utiliz, espere unos segundos. c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. d. Incubar la placa a 37C.

8.3 Alcohol

a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro. b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposicin. c. Incubar la placa a 37C.

ACTIVIDADES PRCTICAS (SEGUNDA SESIN)

OBJETIVOS

1. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo slido (Placas de Agar).

2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscpicos.

3. Practicar preparacin de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.

En la segunda sesin de trabajo prctico Ud. debe: 1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando los siguientes aspectos: forma, borde, elevacin, superficie, caractersticas fsicas (textura, color y brillo) (Figura N1).

2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo lquidos y slidos sembrados en la primera sesin. Describa lo observado. 3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar. 4. Realizar anlisis de morfologa microscpica 4.1 Preparacin de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lmina (del tamao de una arveja).

b. Flamear el asa para su esterilizacin.

c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.

d. Obtener una pequea muestra desde la placa.

e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto, suavemente,

formando una capa delgada.

f. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque.

4.2 Tincin simple

a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%

b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusin del colorante

c. Lavar suavemente con agua.

d. Secar con papel absorbente

e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil (USAR ACEITE DE INMERSIN).

f. Describa lo que observa: forma, agrupacin, color.

MICROSCOPIO PTICO:

Sistema ptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecnico o SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. o REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los

objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico

que consigue el enfoque correcto.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO PTICO CON ACEITE DE INMERSIN

1. Colocar la preparacin sobre la platina del microscopio

2. Verificar que el condensador est arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de inmersin requiere

mucha ms luz que los objetivos secos.

3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la zona de inters.

4. Colocar el revlver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersin 100x (lnea negra)

EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE

INMERSIN.

5. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin

6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deber estar

prcticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deber ocupar este pequeo espacio

7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando slo el micromtrico

8. Una vez terminada la observacin microscpica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL OBJETIVO,

RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES (PAPEL SUAVE) IMPREGNADO

EN XILOL.

9.- Una vez terminado el trabajo prctico su microscopio debe quedar limpio y apagado, con la platina

abajo y el revlver puesto con el objetivo menor (4x)

TRABAJO PRCTICO N2

MORFOLOGA BACTERIANA

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es una preparacin slida o lquida hecha especficamente para el crecimiento,

almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios lquidos pueden ser usados en tubos de ensayo o en

botellas de vidrio. Los medios slidos se obtienen de una solucin de nutrientes solidificada con agar

(polisacrido obtenido de ciertas algas marinas que acta como agente gelificante) o gelatina y se usan en

placas Petri. El agar es el agente gelificante ms comnmente usado ya que no es atacado por la mayora

de las bacterias y no se funde a 37C (T usada para la incubacin de las bacterias).

Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de microorganismos que se

desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (protenas, aminocidos y/o sales inorgnicas que

contengan nitrgeno) y fuentes de energa (carbohidratos, protenas o sales inorgnicas).

Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clnica:

- Agar nutriente (corriente): Es un medio bsico usado con propsitos generales para el cultivo de

muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la adicin de sustancias adecuadas.

- Agar sangre: Es un medio enriquecido y diferencial. Se prepara en base a agar nutriente enriquecido con

5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella

pertussis (agente causal de tos convulsiva) y tambin para detectar hemlisis. Al calentar el agar sangre a

70-80C hasta obtener un color caf se obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es

ms apropiado que el agar sangre para el crecimiento de ciertos patgenos, como por ejemplo Neisseria

gonorrhoeae.

- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y cristal violeta para

inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan de

las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entricas que utilizan lactosa (tales como E. coli)

forman colonias rojas debido a que los productos acdicos que se forman a partir de lactosa afectan el

indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entricas que no usan lactosa (por

ejemplo muchas cepas de Salmonella spp.) forman colonias incoloras.

Clasificacin de los medios de cultivo

1.- Segn estado fsico:

a. Slidos (solidificados por adicin de agar al medio lquido o de alguna protena coagulada).

b. Lquidos

c. Semislidos

2.- Segn contenido nutricional:

a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).

b. Mejorados (o enriquecidos): por adicin al medio corriente de: sangre, protenas, hidratos de carbono,

extracto de rganos o levadura.

c. Sintticos y mnimos: Los primeros son medios de frmula perfectamente conocida, en la cual se

emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen a propsitos bien definidos. Los

segundos son tambin sintticos, pero a su frmula que no permite el crecimiento bacteriano se le adiciona

uno o dos sustratos o elementos, sobre los cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio,

sin interferencia de otro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecer slo si esa sustancia es

utilizada.

3.- Segn su empleo con propsitos de diagnstico o taxonmicos.

a. Selectivos: Son aqullos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento de otros

microorganismos. La seleccin se efecta mediante el control de los ingredientes del medio. ej.: cristal

violeta es selectivamente bacteriosttico para las bacterias Gram positivo, por lo tanto este colorante puede

ser incorporado a un medio para examinar patgenos entricos que son predominantemente bacilos Gram

negativo. ej.: Agar sangre con azida de sodio, agar Petragnani.

b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pH que permiten

apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con un conjunto de pruebas de este tipo

clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonoma sobre base de pruebas bioqumicas".

Muchos de estos medios slidos diferenciales contienen uno o ms hidratos de carbono fermentables y un

indicador adecuado para la determinacin de la produccin de cidos o compuestos alcalinos. ej.: citrato

(Simmons), agar triple azcar hierro (TSI). Los cambios producidos en el medio por un organismo o grupo

de organismos son caractersticos, diferencindolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios

diferenciales permiten identificar reacciones de fermentacin de los cultivos puros de bacterias o su

capacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.

c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola frmula los elementos de los medios selectivos y

diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar y clasificar.

Ej.: Medio N 110 para Staphylococcus, ste contiene 7.5% de NaCl, en circunstancias que la

concentracin salina de la mayora de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Este ingrediente evita el desarrollo de

casi todas las dems bacterias.

Adems, las pruebas de la gelatina y la fermentacin del manitol permiten diferenciar las diversas cepas de

Staphylococcus.

Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey.

MORFOLOGA BACTERIANA: ANLISIS MICROSCPICO

La observacin al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de caractersticas

complementarias a la morfologa de colonia entre las que encontramos: forma, disposicin o agrupacin,

presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.

Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los microorganismos. En el laboratorio

son fciles de realizar las siguientes:

1. Observacin de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teir, se utiliza el microscopio de

fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarroll para hacer posible observar clulas pequeas sin

teir. Se basa en utilizar y aumentar la pequea diferencia de ndice de refraccin que existe entre las

clulas y el medio que las circunda. Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho

mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente

objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; adems para aumentar el contraste

se insertan filtros verdes o azules.

a. En fresco: Este mtodo de examen permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las

deformaciones artificiales de su morfologa que producen las tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms

importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.

b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa. Para la observacin se

sustituye el condensador de Abb por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la

preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin

penetrar en el objetivo del microscopio. Se emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de

aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el

medio.

c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un lquido y depositar una gota

de la suspensin sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un portaobjeto, luego se procede a la

observacin microscpica.

2. Observacin de bacterias muertas:

a. Tincin simple: Se utiliza un slo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su forma en

general. Son de poco uso en bacteriologa.

b. Tincin negativa: Se tie el fondo mientras que las clulas permanecen sin teir (transparentes),

observndose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de este tipo de tincin es la tincin de

cpsula en la que se usa tinta china.

c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como nucleoide, flagelo,

esporas, etc.

d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre s, tanto en su estructura fsica como en su

composicin qumica, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas tinciones

se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La Tincin de Gram es la tincin diferencial

ms importante usada en bacteriologa. Otra muy utilizada es la Tincin de Ziehl Neelsen.

Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por mtodos de tincin son esporas

y cpsula:

a. Observacin de esporas: Esta tincin es un ejemplo de tincin especial. Algunos gneros bacterianos

como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones

ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan

por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la espora se debe

a la estructura proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace

resistentes a tincin. Por este motivo las esporas se tien en caliente.

b. Observacin de cpsula: se trata de una tincin negativa usando tinta china que permite determinar la

presencia de cpsulas polisacardicas.

El estudio macro y microscpico de una muestra bacteriana permite obtener una orientacin preliminar de

su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioqumicas especficas que permitirn una identificacin

ms certera y precisa.

La tcnica de mayor importancia en el rea de la microbiologa, es la tincin de Gram (Figura N 2), pues

divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Adems permite

diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupacin bacteriana (pares, cadenas, racimos).

La tincin de Gram consiste en teir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego tratarlas con una

solucin mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se tien en estas condiciones. Sin

embargo, slo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como

etanol o una solucin decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram

positivo; las que se decoloran son Gram negativo y para observarlas debern teirse con un colorante de

contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se vern de color violeta y las Gram negativo de

color rojo o rosado.

La diferencia en la reaccin frente a la tincin de Gram se debe a la diferencia en la composicin

qumica de las estructuras externas de las bacterias (pared celular). Las bacterias Gram positivo tienen

una capa gruesa de peptidoglicn o murena, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad

de peptidoglicn y tienen una membrana externa (adems de la membrana citoplasmtica). La

explicacin ms aceptada es que, luego de la accin de la solucin decolorante, las bacterias Gram

positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicn. En cambio, las Gram negativo,

pierden parte de los lpidos de su membrana externa por accin del decolorante (un solvente orgnico

como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicn, hace que se

decoloren. Es importante destacar que la etapa crtica en la tincin es la de decoloracin, por lo que se

debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.

Tambin es importante sealar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como Gram negativo en

algunas condiciones: en cultivos viejos (de ms de 24 48 horas), a pH cido y en condiciones de

decoloracin muy prolongada.

Un gnero bacteriano que representa una excepcin a la tincin de Gram (no se tien) es Mycobacterium

(bacilos cido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M. tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae

(Bacilo de Hansen) deben ser teidos con la tincin de Ziehl Neelsen.

Son bacterias que se tien con dificultad, pero una vez teidas, el colorante no se libera, an por accin de

decolorantes enrgicos como una solucin de alcohol y cido clorhdrico. Esta resistencia se debe a la gran

cantidad de lpidos que tiene su cubierta, incluyendo cidos grasos de alto peso molecular que constituyen

entre el 20 y 40% del peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lpidos le confiere a este

grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio lquido),

resistencia a la accin de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido a la dificultad de absorcin

de nutrientes a travs de esta pared celular lipdica.

Figura N 2: Tcnica Tincin Gram. 1. Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos

2. Agregue solucin de lugol por 1min.

3. Decolore con alcohol-acetona y lave con agua

4. Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel

TAB

LA N

1: C

uadr

o R

esum

en T

ipo

de T

inci

ones

TIN

CI

N

RE

AC

TIV

OS

PRIN

CIP

IO

UT

ILID

AD

Gra

m

Cris

tal V

iole

ta, L

ugol

,

Alc

ohol

A

ceto

na, S

afra

nina

Gra

m p

ositi

vo re

tiene

n cr

ista

l vio

leta

(azu

l)

Gra

m n

egat

ivo

se ti

en

con

cont

rast

e (r

ojo)

Cla

sific

aci

n ba

cter

iana

cl

sica

:

Gra

m P

ositi

vo y

Neg

ativ

o

Tin

cin

de

espo

ras

Ver

de d

e m

alaq

uita

, Saf

rani

na

Tie

la e

spor

a (v

erde

) Es

pora

s de

baci

los G

ram

Pos

itivo

Kin

youn

Fu

csin

a, A

cido

Sul

fric

o, A

zul d

e M

etile

no

Uni

n

cido

resi

sten

te d

e fu

csin

a a

esca

sos

cid

os m

icl

icos

de

la p

ared

(fuc

sia)

N

ocar

dia

(BA

A l

bile

s)

Ana

ranj

ado

de a

crid

ina

Nar

anja

de

Acr

idin

a

(flu

ores

cenc

ia)

Tie

el D

NA

bac

teria

no (f

luor

esce

ncia

nar

anja

) B

acte

rias G

ram

lbi

les

Gim

nez

Fu

csin

a, V

erde

de

Mal

aqui

ta

Tie

la p

ared

de

Bart

onel

la (f

ucsi

a)

Bart

onel

la sp

p, c

orp

scul

o el

emen

tal

de C

hlam

ydia

Zie

hl-N

eels

en

Fucs

ina,

Alc

ohol

A

cido

, Azu

l de

Met

ileno

U

nin

ci

do-a

lcoh

ol re

sist

ente

de

fucs

ina

a

cid

os m

icl

icos

de

pare

d (f

ucsi

a)

Mic

obac

teri

as (B

AA

R*)

Aur

amin

a / r

odam

ina

Aur

amin

a

Rod

amin

a

Perm

anga

nato

de

Pota

sio

Uni

n d

e au

ram

ina-

roda

min

a al

ci

do

mic

lic

o de

la p

ared

(flu

ores

cenc

ia a

mar

illa)

Mic

obac

teria

s

(may

or se

nsib

ilida

d qu

e Zi

ehl N

eels

en)

Utilidad clnica de la tincin de Gram:

Este examen permite al clnico sospechar el agente causal de una infeccin, que muchas veces sirve de

base para el inicio de terapia antibitica.

La sensibilidad analtica (nmero mnimo de bacterias que la tcnica puede detectar) es de 100.000 bacterias

/ml de muestra.

La sensibilidad clnica (probabilidad que un paciente que tenga una infeccin tenga un test positivo) vara

segn tipo de muestra:

Lquido cefalorraqudeo (meningitis) : 75 %

Lquido pleural (empiema pleural) : 50-80%

Lquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%

Lquido articular (artritis sptica) : 50%

Se debe solicitar en toda muestra clnica

De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aerbicas y anaerbicas, pues si bien los anaerobios

no crecen en los medios habituales, s se observan en la tincin de Gram.

ACTIVIDADES PRCTICAS Primera sesin prctica

OBJETIVOS

1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo slido (Placas de Agar) de

acuerdo a criterios macroscpicos.

2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tincin de Gram, tincin de cpsula y tincin de esporas.

3. Observar endosporas y su disposicin en formas vegetativas de Bacillus spp.

4. Observar la presencia de cpsula en Klebsiella spp.

SIEMBRA DOS BACTERIAS EN DISTINTOS MEDIOS SOLIDOS

1.- Siembre mediante tcnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el laboratorio tanto en agar

sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37C por 24hrs.

OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Tincin de Esporas.

Procedimiento:

a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamao de una arveja) sobre el portaobjeto.

b. Esterilizar el asa y obtener una pequea muestra desde la placa de Bacillus spp.

c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).

d. No olvidar esterilizar el asa despus de usarla.

e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuacin agregar solucin colorante Verde de malaquita. El

colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.

f. Esta tincin se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del

mechero hasta observar emisin de vapor durante 3 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra

o se rompa el portaobjeto.

g. Si la emisin de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.

h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de malaquita y el papel.

i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.

j. Lavar con agua.

k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersin.

NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamao que las bacterias) son

pequeas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas ltimas se

determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de la clula y, si la espora deforma o no al bacilo.

A

B

Papel Absorbente

Verde Malaquita Safranina

E F G

C D

Figura N 3: Procedimiento Tincin de Esporas.

Figura N 8: Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

2. Tincin de Cpsula.

Procedimiento:

a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamao de una arveja.

b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.

c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 4 veces (slo agregar la bacteria). La Tinta china impide ver si la solucin tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.

d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegrese de esterilizar el asa previamente y de enfriar sta en las paredes del tubo.

e. Realizar un frotis extendiendo la suspensin de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta china-bacteria. Ver figura.

f. Fijar suavemente en el mechero.

g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.

h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersin.

B

C D

A

E Fucsina

Bacterias Cpsula

F

Figura N 9: Procedimiento Tincin de Cpsula.

Segunda sesin prctica

1. Anlisis Macroscpico Analisis macroscpico de las siembras en agar sangre y agar MacConkey, segn los criterios enlistados en la figura N1. 2. Anlisis Microscpico mediante tincin de Gram

1. Realice tincin de Gram a las muestras que Ud. sembr y observe al microscopio.

Preparacin de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Flamear el asa para su esterilizacin.

b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lmina (aprox. 0,5 cm de dimetro).

c. Flamear el asa para su esterilizacin.

d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.

e. Obtener una pequea muestra desde la placa.

f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.

g. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque.

Tincin frotis mediante Gram

a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no est demasiado caliente.

b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.

c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solucin de Lugol. Dejar con Lugol por 1 min.

d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente, hasta que se

decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y luego con agua)

e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.

f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.

2. Observar en el microscopio ptico con aumento de 100X y aceite de inmersin. Caracterizar segn criterios

microscpicos (afinidad tintorial, morfologa y agrupacin) los microorganismos.

TRABAJO PRCTICO N3 FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLNICAS DE

BACTERIAS GRAM POSITIVO

Como en la mayora de los animales, el organismo humano posee lugares que normalmente se

mantienen estriles y otros donde cohabitan, tambin normalmente, una gran diversidad y una cantidad

sorprendente de microorganismos, an en las personas ms sanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la

mdula sea y las vas areas inferiores (bronquios y alvolos), entre muchos otros, carecen de

microorganismos debido a los mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos,

vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal

(microbiota comensal) del ser humano.

La colonizacin microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros

microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del rea perineal, hacia la

piel, la boca, la nariz y regin farngea del nio. Las biotas caractersticas de stas y otras reas, se desarrollan

posteriormente y probablemente se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.

Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de sustancias alimenticias, que favorecen el crecimiento de

saprfitos.

Zona boca, regin orofarngea y vulva: Con sustancias provenientes del exterior o acumulacin de restos

celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia de anaerobios.

Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido lipdico, que tiende

a seleccionar una biota algo diferente.

Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en nmero a las formas facultativas y aerobias por un

factor de 10 a 100 o ms. Existe una interaccin permanente entre los componentes de la flora y el hospedero,

que provoca fluctuaciones en la biota, tanto cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones

incluyen los beneficiosos, inaparentes, hasta los perjudiciales.

Algunos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del

cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis,

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus

mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como Clostridium

tetani.

La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram positivo, como

Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fngica como Candida albicans.

Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a travs de la nasofaringe, la

trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y

deglutidos. As, los senos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles. La

nasofaringe es el hbitat natural de bacterias y virus patgenos que causan infecciones en la nariz, garganta,

bronquios y pulmones.

Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos descargando estos

microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.

Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin embargo este

equilibrio puede romperse por:

- Aumento de la masa crtica

- Traslado desde el sitio original

- Ruptura de barreras mecnicas por traumatismos.

Esto produce una proliferacin e invasin de los microorganismos, dando origen a una infeccin endgena. Por

lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades, como son:

- Deficiencia en el estado inmunitario del husped.

- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.

- Cirugas.

- Uso de antibiticos.

Como ejemplos de infeccin endgena se pueden mencionar:

- Infeccin urinaria por Enterobacterias.

- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)

- Diarrea por sobreinfeccin de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibiticios.

ETAPAS DEL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO

Para llegar a la identificacin de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El primero implica la toma

de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados segn la sospecha clnica.

El segundo paso corresponde al examen microscpico directo, con o sin tincin.

El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de cultivo adecuados donde

la muestra y las bacterias, que sta pudiese o no contener, puedan encontrar los nutrientes y factores adecuados

para propiciar su crecimiento y desarrollo.

El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrir a determinar su morfologa bacteriana

como su posible agrupacin, y se aplicar distintas pruebas bioqumicas y fisiolgicas destinadas a conocer sus

caractersticas metablicas.

Por ltimo se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

TOMA DE MUESTRA

EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO

(Gram o Ziehl-Neelsen)

AISLAMIENTO DEL AGENTE

IDENTIFICACIN FISIOTAXONMICA DEL AGENTE

Tincin: Morfologa y agrupacin

Pruebas Bioqumicas

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

INFORME

SELECCIN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS

MICROBIOLGICOS

En la recuperacin del o los microorganismos causantes de la infeccin, lo ms importante es la correcta

recoleccin de una muestra para su estudio microbiolgico.

Esta recoleccin comprende cuatros pasos importantes:

1. Seleccionar el sitio anatmico ms adecuado para tomar la muestra. 2. Usar la tcnica ms apropiada.

3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos

causantes del proceso infeccioso, y que adems impida la filtracin o derrame de la muestra,

como medida de proteccin para el personal que posteriormente la manipula.

4. Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea

posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados.

Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo etiolgico real, y la

recuperacin de contaminantes puede llevar a indicar una antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso

perjudicial. Debe recordarse entonces, que la calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser

superior a la calidad de la muestra recibida.

Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo ste parte activa, es necesario

explicarle el porqu del procedimiento y el tipo de tcnica a realizar, para lograr as su colaboracin y

participacin, lo que lleva a la obtencin de la muestra en ptimas condiciones.

Recoleccin y transporte de la muestras:

Preparacin del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por aspiracin, se

debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%, seguido por povidona yodada, la

que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se

debe usar solo alcohol.

Volumen. Si es posible obtener muestras lquidas (mediante aguja o aspiracin) no debieran usarse trulas. El

volumen de muestra que se enva al laboratorio es generalmente menor de lo requerido. No existe consenso

sobre los volmenes mnimos para cada tipo de muestra.

Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes mtodos de recoleccin, desde la trula hasta aparatos

recolectores de muestra.

Las trulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de calcio o polyster).

stas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estril con un medio de transporte. Para muestras

lquidas, lo ms adecuado es usar envases plsticos estriles, o tubos con tapa rosca.

Tcnicas de recoleccin. Con el fin de obtener una muestra ptima para la recuperacin del agente etiolgico

es necesario seguir las instrucciones dadas ms adelante.

Medio de transporte. No deben usarse trulas sin medio de transporte (excepto para ciertas tcnicas

especficas) porque esto lleva a la desecacin de la muestra y a la prdida de la viabilidad bacteriana. Los

medios de transportes recomendados cuando se usan trulas, en el caso de las secreciones, son del tipo tampn

(Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til para suprimir

cambios oxidativos en el medio de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los

microorganismos durante su envo al laboratorio.

PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS DE

DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS

INFECCION TRACTO URINARIO (ITU) (Orina, secrecin uretral y prosttica)

UROCULTIVOS

Muestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y retrayendo el prepucio

en el varn durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de orina, a fin de arrastrar mecnicamente la

flora externa del tracto genitourinario.

Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptculo estril y sin interrumpir la miccin. Tener presente de

poner un tapn vaginal en la mujer a fin de evitar contaminacin con la flora vaginal.

Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las primeras dos

horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4C y trasladarla manteniendo la cadena de fro.

Muestra por puncin de catter urinario: Desinfectar el sitio de puncin del segmento proximal del catter

con alcohol 70%, aspirar con jeringa estril entre 2 a 5 ml de orina, vaciar en tubo estril y transportarla al

laboratorio de la misma forma que la muestra miccional.

Muestras por puncin suprapbica: Antisepsia de la piel en el sitio de puncin, aspirar con tcnica asptica

entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual forma que los casos anteriores.

Secrecin uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secrecin en trula estril, colocar en medio

de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera hora de la maana o despus de una hora

de orinar.

Secrecin prosttica:

La tcnica de recoleccin es exprimir la prstata a travs de un masaje prosttico por va rectal e impregnar una

trula estril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.

INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)

(Neumona, TBC)

TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS

Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger la muestra en

receptculos estriles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible mantenerla

refrigerada transitoriamente a 4 C por no ms de dos horas. Es recomendable facilitar la expectoracin con

kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En pacientes intubados realizar la aspiracin endotraqueal con

sonda estril y tcnica asptica, introducirla evitando su contaminacin con grmenes exgenos y aspirar

depositando el contenido en tubo estril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este ltimo

tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el diagnstico etiolgico

en pacientes conectados a ventilacin mecnica.

TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS

Cuando se trata de identificar el agente etiolgico de neumona nosocomial, las muestras que tienen mejor

rendimiento; pero tambin mayores riesgos para el paciente, son aquellas tomadas por broncoscopas (lavado

broncoalveolar, aspirado telescopado protegido), Toracocentesis y Biopsia.

Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a travs de broncoscopa y con tcnica asptica aspirar

entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo estril al laboratorio para su estudio.

Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopa introducir cepillo a travs del catter protegido frotar la

zona alterada y enviar en tubo estril de inmediato al laboratorio para estudio semicuantitativo. *

Toracocentesis: Realizar el procedimiento con tcnica asptica, aspirar 10 ml si es posible. Transportar de

inmediato al laboratorio para su estudio.

Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con tcnica asptica, enviar un trocito de tejido en tubo estril o

en medio de transporte con caldo especfico. Trasladar la muestra de inmediato para su estudio.

*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumona es: Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar

INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)

Secrecin farngea: Deprimir la lengua y frotar con trula estril amgdalas, pilares anteriores y pared

posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible

la muestra se mantiene transitoriamente a temperatura ambiente.

Secrecin nasal: Introducir trula estril ms o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y colocar en medio de

transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra transitoriamente a temperatura ambiente

INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)

(Superficial, profunda abscesos cerrados)

Infeccin superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular subcutneo.

Infeccin profunda: son aquellas que incluyen fascia y msculo, pudiendo comprometer o no cavidades u

rganos.

Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiolgico o Ringer, frotar con trula estril el

centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio para

su siembra y estudio

Toma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiolgico o Ringer, tomar la muestra

con trula de la parte ms profunda de la herida, colocar en medio de transporte y enviarla al laboratorio.

Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antispticos la superficie y los bordes de la herida, aspirar de la

zona profunda de la herida 0,5 ml de secrecin y enviar en la misma jeringa sellada al laboratorio, teniendo la

precaucin de eliminar toda burbuja de aire de su interior.

Si no es posible aspirar material, introducir trula en lo ms profundo de la herida y colocarla en tioglicolato.

De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido (6 mm) con pinza estril y dejarlo caer en el

tioglicolato o en suero fisiolgico e incluso en tubo estril sin ningn preservante.

Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de puncin con antisptico, aspirar material en lo posible 10 ml y

vaciar a tubo estril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios enviar en la misma jeringa sellada,

eliminando todo el aire remanente.

COMENTARIO

Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH cido de este material destruye rpidamente los

microorganismos, siendo difcil su aislamiento posterior a la siembra.

INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS

Secrecin conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estril, frotar con trula humedecida el

borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.

Secrecin tica: Limpiar el canal auditivo con jabn antisptico, tomar la muestra con trula estril y

colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.

Secrecin umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza, colocar en medio de

transporte y enviar al laboratorio.

COMENTARIO.

Las muestras tomadas por puncin ocular u tica deben ser enviadas en la misma jeringa o en caldo de cultivo

tioglicolato.

INFECCIONES GINECO OBSTETRICAS

Endocervix: Previo aseo genital, introducir trula hacia el canal cervical y rotar, colocar la trula en medio de

transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseria gonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de

Thayer Martin en Z la que debe ser solicitada previamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al

laboratorio en receptculo con una fuente que consuma oxigeno.

Endometritis: A travs de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa con catter protegido.

Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado en tioglicolato. NO REFRIGERAR.

Douglas: Aspirar por puncin del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en la misma jeringa tapada

como para estudio de anaerobios.

Secreciones vaginales: Para estudio bacteriolgico y de hongos. A travs de un especulo frotar con trula

estril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco, colocar en medio de transporte y enviar

al laboratorio.

Para Trichomonas, introducir suero fisiolgico tibio, recoger y vaciar en tubo estril de 3 a 5 ml. Enviar de

inmediato al laboratorio.

Lquido Amnitico: Obtener por puncin, previa desinfeccin con antisptico y enviar al laboratorio en la

misma jeringa o en tubo estril entre 5 a 10 ml de muestra.

Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar en tubo estril o caldo

tioglicolato como para estudio de anaerobios.

Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la ciruga y enviar tejido o aspirado de la misma forma que para

estudio de anaerobios.

COMENTARIO

En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiolgicos no son necesarios para su notificacin ya que

es suficiente el criterio clnico, por otra parte la etiologa es polimicrobiana y predecible.

En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectar Streptococcus beta

hemolitico grupo A u otro agente no habitual.

MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES Y CATETERES

Lquido cefalorraqudeo

Previa desinfeccin de la zona con antisptico y con tcnica asptica, obtener entre 2 a 3 ml de muestra y en

tubo estril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla al momento, transitoriamente debe

mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.

Lquido asctico

Aspirar idealmente 10 ml de muestra a travs de puncin abdominal con tcnica asptica, vaciar a frasco de

hemocultivo y simultneamente 1 ml en tubo estril seco para tincin en laboratorio.

Lecha Materna

Limpiar el pezn previo a extraccin de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre 2 a 5 ml en tubo

estril. Enviar de inmediato al laboratorio.

Cateter

La cateterizacin venosa se define como la insercin de un catter biocompatible en el espacio intravascular,

central o perifrico, con el fin de administrar soluciones, medicamentos, nutricin parenteral, medios de

contraste y realizar pruebas diagnsticas, entre otros.

Para cultivar catteres vasculares, existen 2 tcnicas.

1.- Cortar de forma asptica la punta del catter e introducirla en un tubo con caldo corriente. Esta tcnica tiene

la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por lo cual, no se puede asegurar que en

un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda a una contaminacin con flora de piel.

2.- Cortar de forma asptica la punta y el segmento intracutneo del catter. Introducir en un frasco o tubo

estril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando una pinza estril, hacer rodar el

catter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces hacia adelante y hacia atrs (tcnica de Maki). Es una

tcnica semicuantitativa que permite realizar el recuento de colonias y, basndose en este recuento, determinar

con mayor exactitud si un cultivo positivo corresponde a contaminacin con flora de piel o a infeccin

relacionada con el catter.

Figura N 10: Catter venoso central tunelizado. Catter venoso central implantable.

INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)

Coprocultivos

Introducir trula limpia en la zona ms alterada de las deposiciones recin emitidas (mucus o sangre) y

colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse directamente del recto, del

paal o receptculo limpio.

Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de transporte. Las

muestras tomadas por rectoscopa o colonoscopas tienen mayor rendimiento, por cuanto de ser posible es

recomendable obtener las muestras de esta forma.

Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recin emitidas en tubo o frasco limpio y seco.

Aspirado gstrico en RN

Aspirar por sonda nasogstrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estril. Slo se justifica esta muestra

en las primeras 24 horas de vida.

FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

La fisiologa bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a travs de las alteraciones

que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido establecer diferencias entre ellas,

l