INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MICROBIOLOGÍA GENERAL

TEMA:DIGESTIÓN DE MACROMOLECULASEQUIPO:4 GRUPO:3QM1

OBJETIVOSEntender y montar ensayos de

degradación de polímeros por enzimas extracelulares microbianas.

PLACASEquipo 7 sección 3

ENZIMA Mas de 100 aa, masa: 100 KDa, Diametro: 25

amstrongs Afectan la velocidad de la reaccion sin participar

como reactantes ni aparecer en los resultados Pueden ser inhibidas Se ocupan cantidades minimas

Alta especificidad Modifican la estructura química del sustrato No alteran el equilibrio de la reacción

Sitio activo:

1. Tamaño 2. Forma 3. Unión 4. Interacción 5. Especificidad

CLASIFICACIÓN Las enzimas se clasifican en varias categorías dependiendo del tipo

de reacción que controlen: Hidrolíticas Oxidantes Reductoras Las enzimas se denominan añadiendo asa al nombre del sustrato

con el cual reaccionan.

Polímero Enzima

Polisacárido Glicosidasas

Proteína ProteasasPolipeptisas

Lípido Lipasas

Ácido nucleico Nucleasas

Organismos auxótrofos: presentan deficiencias a nivel biosíntesis (incapaces de convertir precursores biosintéticos con biopolímeros)

Organismos protótrofos: no requieren de factores de crecimiento.

Factores de crecimiento: sustancias capaces de sustituir deficiencias metabólicas.

Hidrólisis de gelatina.

a. Prueba de licuefacción de la gelatina en tubo.

37ªC 24-48h.

Baño de Hielo 1 h.

Tubo liquido +Tubo solido -

Hidrólisis de gelatina.

b. Prueba de la digestión de la

gelatina y caseína en caja.

28-30ºC48h.

HgCl2 Halos transparentes de hidrólisis.

Hidrólisis Almidón.

37ºC48h.

Solución de Lugol.

Halos de hidrólisis como zonas transparentes que rodean a bacterias sobre un fondo azul.

Gelosa gelatina .Agar leche descremada.

Procedimiento.

Hidrólisis de fosfolípidos.

37ºC 48h.

Presencia de zona opalescente en el agar en torno al crecimiento del microorganismo.

Digestión de proteínas y fermentación de leche tornasolada.

37ºC24h.

Acidificación: Vire del indicador a color rojizo que indica fermentación de lactosa.Coagulación: Aparición de un coágulo semisólido que ocupa todo el tubo.Reducción: El medio pierde color del tornasol (se ve blanco).Peptonización: Fragmentación del coagulo.Licuefacción del coagulo: El medio se licua totalmente (apariencia agua con arena).Alcalinización: El medio vira a un color violeta.

Agar yema de huevo.

Gelosa sangre.

Hemólisis alfa : Capa opalescente.Hemolisis beta: Halo traslucido.Hemólisis gama: Ausencia de halo.

GELOSA GELATINA

COMPOSICIÓN Caldo nutritivo deshidratado……………….…….............8.0 gGelatina…………………………………..30.0 gAgar…………...…………………………...7.5 gAgua (aforar)………..……………….1000.0 mlAjustar el pH a 7.0

Gelosa GelatinaEquipo: 7 sección: 3

Pseudonomas aeruginosa/Bacillus subtilis

GELOSA GELATINA

Medio diferencial.La gelatina es el producto desnaturalizado parcial del colágeno, y muestra la propiedad de gelificar cuando se disuelve en agua caliente y solidificar en ambientes frios. Sus productos de la hidrólisis carecen de esta propiedad.

PROTEASAS Y PEPTIDASAS Para utilizar la gelatina muchos microorganismos

producen gelatinasa, una exoenzima que la hidroliza. Este proceso ocurre en dos etapas: Primera, se liberan polipéptidos Segunda, una mezcla de aminoácidos.

RESULTADOS GELATINA EN TUBOMicroorganismo R. Teórico R. Práctico (SECCIÓN 3) R. Práctico (SECCIÓN 4)

Escherichia coli - - +Bacillus subtilis + + +Pseudonomas aeruginosa

+ +

Salmonella typhi -Proteus vulgaris + -Klebsiella pneumoniae

- - -

Shigella flexneri - -Staphylococcus aureus

+

GELATINA EN TUBOEquipo 7 sección 3

Bacillus subtilis

GELATINA EN TUBOEquipo 5 sección 3

Klensiella pneumoniae

RESULTADOS GELATINA EN PLACAMicroorganismo R. Teórico R. Práctico (SECCIÓN 3) R. Práctico (SECCIÓN 4)

Escherichia coli - - -Bacillus subtilis + + +Pseudonomas aeruginosa

+ + -

Salmonella typhi - - -Proteus vulgaris + - -Klebsiella pneumoniae

- - -

Shigella flexneri - - -Staphylococcus aureus

+ - +

GELOSA GELATINAKlebsiella pneumoniae

/Shigella flexneri

GELOSA GELATINA GELOSA GELTINAEquipo 7 sección 3

Pseudonomas aeruginosa/Bacillus subtilis

AGAR ALMIDÓN

COMPOSICIÓN Caldo nutritivo deshidratado....…………8.0 galmidón soluble....…….....……………….5.0gAgar...…………………….……………..15.0 g Agua (aforar) …..…………......……..1000mLAjustar a pH a 6.8-72

Agar Almidónequipo:7 sección: 3

Bacillus subtilis/ Pseudonomas aeruginosa

Componentes del almidón El almidón es un homopolisacarido, su monómero es el α-D-glucosa

que están unidos por puentes α-glucosidicos. Amilosa lineal (10-20%) y amilopectina ramificada (80-90%) La hidrolisis enzimática ocurre en las uniones α-1-4-acetal y α-1-6-

acetal.

α-amilasa La α-amilasa La α-amilasa cataliza la hidrolisis de las uniones α-1,4-glucosidicas. La amilosa es degradada por completo por la amilasa. La hidrolisis completa del almidón requiere de otra enzima, que

actúa en los puntos de ramificación.

LUGOL La amilosa, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo,

formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina, forma hélices mucho más cortas, obteniéndose un

color entre naranja y amarillo Al romperse o hidrolizarse el almidón en unidades más pequeñas de

carbohidrato, el color azul-negro desaparece.

Microorganismo Teórico Laboratorio 3 Laboratorio 4

Escherichia coli - (-) (-)Bacillus subtilis + (+) (+)Pseudomonas

auruginosa - (+)….…….….(-)

(-)

Salmonella typhi - (-) (-)Proteus vulgaris - (-) (-)

Klebsiella pneumoniae + (-) (-)

Shigella flexneri - (-) (-)Staphylococcus

aureus [-] (-) (+)[-]=70-80%

http://www.lamission.edu/lifesciences/steven/biochemical%20unknown%20guidelines.pdf

Agar almidón Equipo 8 | Laboratorio 3 |

Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa

Agar almidónEquipo 2 Laboratorio 3

Escherichia coli y Salmonella typhi

Equipo 8/Laboratorio 4 Bacillus subtilis y Pseudomonas

aeruginosa

AGAR LECHE DESCREMADA

COMPOSICIÓNCaldo nutritivo deshidratado........8.0 gLeche descremada en polvo…..25.0 g Agar…………..………………….15.0 gAgua (aforar)…………………1000 mLAjustar pH a 7.0

Agar leche descremada Equipo: 7 sección: 4

Bacillus subtilis / Pseudonomas aeruginosa

AGAR LECHE DESCREMADA Caseína: proteína de la leche, la

cual proporciona el color. cuando esta se hidroliza se ve un

halo transparente alrededor de la colonia eso indica ausencia de la caseína

Enzimas: caseinasa (proteasa)

Agar leche descremada Equipo: 7 sección: 3

Bacillus subtilis / Pseudonomas aeruginosa

RESULTADOS: LECHE DESCREMADAMicroorganismo R. Práctico (SECCIÓN 3) R. Práctico (SECCIÓN 4)

Escherichia coli - -Bacillus subtilis + +Pseudonomas aeruginosa

+ +Salmonella typhi - -Proteus vulgaris - -Klebsiella pneumoniae

+ +Shigella flexneri - -Staphylococcus aureus

+ +

Agar leche descremada (reverso)Equipo:5 sección:3

Shigella flexneri (no crece)Klebsiella pneumoniae (crece y es positiva)

Agar leche descremada (anverso)Equipo:5 sección:3

Pseudonomas aeruginosa

LECHE TORNASOLADA Medio diferencial Determinación de funciones metabólicas de un microorganismo:

1. Fermentación de la lactosa2. Caseólisis3. Coagulación de la caseína

COMPOSICIÓNLeche descremada en polvo.………………100.0 gTornasol en polvo………….………………….0.75 gAgua (aforar)………….…………………….1000 mlpH 6.8

FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA (ACIDIFICACIÓN)

Tornasol como indicadorRojo en condiciones ácidas (pH 4.5)Azul en condiciones alcalinas (8.3)Azul purpúreo pH 6.8

FORMACIÓN DE UN COAGULO ÁCIDO (PEPTONIZACIÓN)

Por condiciones ácidas del medio, se produce un coágulo firme como resultado de la precipitación de la caseína

Se llega a la peptonización por caseasas.

FORMACIÓN DE UN CUAJO (COAGULO)

Conversión de la caseína en paracaseína por la renina, pepsina o quimiotripsina

REDUCCIÓN DEL TORNASOL

El tornasol es un indicador de pH y un indicador de oxidación-reducción.

El tornasol puede actuar como aceptor de electrones La acción de las reductasas elimina el oxígeno para

formar compuestos leucotornasolados incoloros.

INTERPRETACIÓN Rojo/rosadoReacción ácida, fermentación de la lactosa.

La subsuperficie cambia primero a rosa pálido, mientras que a superficie permanece rosa-púrpura. Cuando se produce más ácido la capa superior torna a rosa claro y la porción rosa del fondo se decolora.

También empieza la coagulación ácida manifestada por una banda angosta o collar rosa en la parte superior por la disminución de la oxidación.

Azul purpúreoSin fermentación de lactosa.Sin cambios en el indicador pH.

AzulReacción alcalina, sin fermentación de lactosa.Los microorganismos atacan a las sustancias nitrogenadas en el medio, actividad sobre lactoalbúmina (producción de amoníaco).

Tubo no inoculado

Blanco (reducción)Reducción del tornasol en todo el tubo a una leucobase blanca cuado el tornasol actúa como un aceptor de electrones.

Formación del coágulo 1. Precipitación por el ácido producido a partir de la lactosa.2. Conversión de la caseína en paracaseína por acción de la renina.

DigestiónProteína de la leche digeridaMedio claroDilución del cuajo o de las proteínas de la leche por enzimas proteolíticas.

Altas de pruebas bioquímicas,Universidad Nacional Autónoma de México, 2003Bailón Lira, Lucía; González Meléndez ,Roberto Cruz; Cervantes Sandoval, Armando.

Leche tornasoladaequipo sección 3

Leche tornasoladaequipo 4 sección 3Proteus vulgaris

Leche tornasoladaequipo 5 sección 3

Shigella flexneri

AGAR YEMA DE HUEVO.

Peptona………………………………………. 20,0 g Fosfato disódico ……………………………..2,5 gCloruro de sodio ……………………………..1,0 gSolución al 0,5% p/v de sulfatode magnesio ……………………………….....0,1 mL Glucosa…………………………………..........1,0 g Agar…………………………………………... .12,5 g Agua destilada………………………………...500,0 mL Emulsión estéril de yema de huevopH a 7.3 – 7.4

Lípidos neutros 65,0 %

Colesterol 4,0 %

Lípidos polares(31,0 %)

Fosfatidilcolina 26,0 %

Fosfatidiletanolamina 3,8 %

Lisofosfatidilcolina 0,6 %

Esfingomielina 0,6 %

Composición de lípidos de Yema de Huevo.

Hidrólisis de Fosfolípidos.• Pertenecen al grupo de lípidos derivados del glicerol,

presentando una estructura similar a la de los triglicéridos (TGs).

• Los fosfolípidos están compuestos por una molécula de glicerol a la que se unen 2 ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-2, estos ácidos grasos pueden presentar distinto largo de cadena hidrocarbonada, y variar en el grado de insaturación según su procedencia.

Hidrólisis de Fosfolípidos.

Zona opalescente en el agar en torno al crecimiento de un

microorganismo.

Hidrólisis de Fosfolípidos.

Zona opalescente en el agar en torno al crecimiento de un

microorganismo.

Agar yema de huevoplaca contaminada por el

anverso Agar yemas de huevoPlaca contaminada por hongos

Agar SangreAGAR SANGRE (COMPOSICIÓN)

Infusión 500 g de corazón de ternera, deshidratada……………………………….2.0 g Triptosa……………………………………10.0 gCloruro de sodio …………………………..5.0 gAgar……………………………………... ..15.0 g Agua aforar a ……………………….....1000 mL pH de 6.8

Medio ENRIQUECIDO y DIFERENCIAL que se usa para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos.

El medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.

Agar Sangre Tipos de hemólisis:

Hemólisis La hemólisis alfa

se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias. Debido a la liberación de un producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina.

Hemólisis Una zona de

hemólisis incolora, clara y bien definida que rodea a ciertas colonias bacterianas que se desarrollan sobre el agar. Esta hemólisis es causada por hemolisinas que destruyen al glóbulo rojo y la hemoglobina se convierte en sustancia incolora.

Hemólisis Los

microorganismos clasificados como gamma hemolíticos no producen hemólisis en agar sangre; es más correcto llamarles no hemolíticos.

Microorganismo

Hemólisis

Escherichia coli γ - βBacillus subtilis βPseudomonas aeruginosa

βSalmonella typhi γProteus vulgaris Hemolíti

caKlebsiella pneumoniae

β - γShigella flexneri Hemolíti

caStaphylococcus aureus

β

Resultados Teóricos

Microorganismo

Hemólisis

Escherichia coliBacillus subtilisPseudomonas aeruginosa

βSalmonella typhiProteus vulgarisKlebsiella pneumoniaeShigella flexneriStaphylococcus aureus

β

Microorganismo

Lab 3 Lab 4

Escherichia coli

Bacillus subtilis β

Pseudomonas aeruginosa

β

Salmonella typhi

Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae

γ

Shigella flexneri γ

Staphylococcus aureus

Resultados prácticos

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

γ γ γ γ

β β β β β

β β γ β β

γ γ γ

αγ γ β β

γ γ β

β α β

EQUIPO 7 LAB 4

Pseudomonas aeruginosa/ Bacillus subtilis Bacillus subtilis /

Pseudomonas aeruginosa

EQUIPO 8 LAB 3

Klebsiella pneumoniae / Shigella flexneri

Equipo 5 Lab 3

Equipo 4 Lab 3 Proteus vulgaris