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GUÍAS PARA LAS ACTIVIDADES Y FUNDAMENTACIÓN DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

FUNDACION UNIVERSITARIA DEL ÁREA ANDINA SECCIONAL PEREIRA

ARTICULACIÓN EDUCACIÓN MEDIA, EDUCACIÓN SUPERIOR

ELABORADO POR:

Patricia Durán. Microbióloga Universidad de los Andes. CENTRO DE RECURSOS EDUCATIVOS

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AREA ANDINA PEREIRA

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PRÁCTICA No.1.

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS PRUEBA PARA ANÁLISIS DE COLIFORMES TOTALES Y

FECALES EN AGUA Y LECHE

1. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Realizar diluciones y siembras para la identificación de los principales microorganismos presentes en muestras de agua contaminada y alimentos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Conocer los medios de cultivo empleados en Microbiologia de alimentos Reconocer los métodos Standard y los valores permitidos para el examen de Agua y deshechos residuales empleadas en la fabricación de productos alimenticios Conocer los diferentes exámenes que se realizan para el análisis microbiológico de aguas: Colisert, NMP, Filtración por membrana Identificar la flora presente en muestras de agua contaminada

2. INTRODUCCIÓN El agua contiene muchos microorganismos, aunque sea llamada agua “potable” sólo los análisis microbiológicos nos permiten saber si es apta para el consumo humano o no. El agua que se va a emplear para lavado y fabricación de alimentos debe ser muy limpia con el fin de no producir un aumento en los microorganismos presentes en los alimentos. Los patógenos intestinales presentes en los

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animales y humanos causantes de fiebre tifoidea, cólera, disentería bacteriana pueden estar presentes en aguas contaminadas en altos índices que no las hacen aptas. Algunas aguas arrastran materia fecal y por esto se toman microorganismos indicadores como son los coliformes totales y fecales para establecer parámetros en estas muestras. Los microorganismos indicadores de presencia de materia fecal son: Escherichia coli y Streptococcus faecalis. Estos microorganismos están normalmente en el tracto digestivo y normalmente no están presentes en suelo o agua así que su presencia en ellas indica contaminación con materia fecal. Las pruebas para detectar estos microorganismos incluyen averiguar la presencia de microorganismos coniformes: E coli, Enterobacter aerogenes. Un Coniforme es un bacilo no esporulado, gram negativo y anaeroio facultativo que fermenta lactosa y produce gas. Las pruebas que se realizan en el laboratorio de Microbiología incluyen:

1. Pruebas presuntivas 2. Pruebas confirmativas 3. Pruebas complementarias

1. PRUEBAS PRESUNTIVAS: Se basan en la presencia o no de gas, si fermentan la lactosa. 2. PRUEBAS CONFIRMATIVAS: Se hacen pases de los microorganismos que son presuntivos positivos para hacer la prueba confirmativa en agares selectivos 3. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS: Para hacer la prueba confirmativa, observación al microscopio, ver formación de esporas y producción de enterotoxinas

3. MARCO TEÓRICO

Las siguientes son las pruebas aprobadas Internacionalmente para el recuento de microorganimos en aguas. Algunas son cualitativas (si están o o presentes) y algunas son cuantitativas (cuántos microorganismos hay). Para observar colonias se debe tener en cuenta que una UFC ( unidades formadoras de colonia) tiene aproximadamente 106 microorganismos La prueba del número más probable (NMP) se ha venido utilizando por muchos años para la detección de presencias coniformes en aguas y

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leches, se siembran por triplicado tubos de ensayo taparosca con caldo lactosado y un tubo durham en su interior para ver presencia de burbujas después de incubar a 37ºC por 24 a 48 horas, para detectar la presencia de gas por bacterias que fermentan la lactosa (coliformes), esta prueba es una prueba presuntiva, después de incubar de los tubos positivos se realiza un pase en agar EMB (prueba confirmativa) (ver figura 1) y se incuba por otras 24 horas a 37ºC para detectar la presencia de Escherichia coli (indicadora de contaminación fecal).

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FIGURA 1 NÚMERO MAS PROBABLE PARA DETECCION DE BACTERIAS COLIFORMES EN AGUAS

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Aunque tiene desventajas en cuanto a la gran cantidad de tubos de ensayo que se deben incubar para una sola muestra de agua es una prueba segura que aun se emplea en muchas industrias. La siguiente Tabla contiene la interpretación de la serie de tubos para la lectura

TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE MÉTODO DE NMP PARA EXAMEN DE AGUAS Y LECHES

Los medios cromogénicos (que indican presencia bacteriana por cambios de indicadores y colorimetría), y los medios basados en la detección de DNA (Colisert y colilert, INDEXX) han venido reemplazando en las grandes industrias de alimentos la búsquela de microorganismos.

4. MATERIALES Y MÉTODOS A. NMP (Número más probable ) PARA AGUAS Y LECHE

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Muestras de agua de piscina, de leche cruda o de pozos sépticos 10 Frascos taparosca 10 Pipetas de 10 ml 10 Pipetas de 1 ml 10 Pipetas de 0,1 ml 50 tubos de ensayo taparosca Tubos Durham o tapas de jeringas deshechables Caldo bilis verde brillante 5 Cajas de Petri Mechero Alcohol Cinta de enmascarar Lápiz de cera Estufa Balanza analítica

B. PRUEBA DETERMINATIVA A PARTIR DE ALIMENTOS SOLIDOS Queso, carne, pollo, o cualquier alimento a determinar contaminante microbiano 10 Pipetas de 10 ml 10 pipetas de 1 ml Balanza analítica Medios de cultivo: SPC, Mc Conkey, Baird Parker, Sabouroud Espátula Mechero Alcohol Cinta de enmascarar Lápiz de cera Estufa Licuadora Peptona 1 garrafa de Agua destilada

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4. PLAN DE TRABAJO (PROCEDIMIENTO) DILUCIONES A PARTIR DE MUESTRAS LÍQUIDAS

FIGURA 2. PREPARACIÓN DE DILUCIONES A PARTIR DE LÍQUIDOS

(Nota: se debe trabajar siempre en condiciones asépticas, cerca al mechero y con las normas de bioseguridad) Prepara tres frascos con agua peptonada estéril. De la muestra inicial (10º) de leche o agua, agitar y tomar 1 ml con una pipeta estéril y disolver en 99 ml de agua peptonada (Dilución 1: 100), agitar y a partir de esta tomar 1 ml y disolver en 99 ml de agua peptonada ( Dilución 1: 10.000) PREPARCION DE MUESTRAS A PARTIR DE MEDIOS SÓLIDOS Si es muestra de carne o de queso

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FIGURA 3: DILUCION A PARTIR DE MUESTRAS SOLIDAS Pesar 20 gramos de la muestra a examinar y suspender en 180 ml. Al igual que para medios sólidos preparar 3 diluciones: 1:100 1:1000 y 1:10000 Prepara los medios de cultivo que requiere el alimento ( por ejemplo Baird Parker para recuento de Staphylococcus sp. Agar Mc Conkey para búsqueda de Enterobacterias, Agar Sabouroud para hongos, Agar SPC para recuento de aerobios mesófilos. Sembra algunas en fonfo y otras en superficie con diferentes soluciones marcar y llevar a incubar incubar a 37ºC por 24 horas.

6. RESULTADOS 7. DISCUSION Y CONCLUIR

8. CUESTIONARIO Y AUTOEVALUACION

1. Cómo se debe informar la presencia de colonias en UFC? 2. Cuál es el recuento normal de bacterias en SPC ( recuento de

aerobios mesófilos ) para ygurth, leche, carnes, pescados, panes 3. Cómo se diferencia la flora normal de alimentos procesados con

microorganismos de flora patógena? 4. Que significa un recuento de

20 X 10-2 UFC/ml

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100 X 10-1 UFC/ mg

5. Qué es una cepa bacteriana? 6. Cuántas bacterias aproximadamente tiene una UFC? 7. Que es un cultivo sincrónico?

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TALLER No. 2 MÉTODOS DE MUESTREO Y DILUCIONES PARA

ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS PROFESOR: PATRICIA DURAN

OBJETIVOS

Identificar los diferentes métodos para el recuento microbiano de alimentos.

MARCO TEORICO

TIPOS DE RECUENTOS MICROBIANOS

1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras líquidas u homogeneizadas).

- Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento.

- Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales.

- Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

- Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:.

1.- Recuento en Placa Standard (Standard Plate Count). Recuento de Aerobios mesófilos

2.- Determinación del número más probable. NMP. Presencia de coliformes.

3.- Métodos basados en la reducción de colorantes por viables.

4.- Recuento microscópico directo.

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1.- Recuento en Placa: Consiste en la siembra en placa de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).

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3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de

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acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables.

4. Recuento de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación.

6.- Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.

7.- Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exacto.

8.- Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).Se realiza en medios cromogénicos

9.- Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

10.- Recuento microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias.

- Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de colonias observable (técnicas biológicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en técnicas químicas, físicas e inmunológicas.

2. Métodos físicos para la detención de microorganismos.

A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como función del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107

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células por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones».

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el medio.

C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión por un sistema de detección; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersión de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Métodos químicos de detección de microorganismos.

A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.

B) Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacárido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no-viables. Es muy rápido.

C) Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern.

D) PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo en cuestión.

E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

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F) Radiometria: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente.

G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.

4. Métodos inmunológicos.

Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas móviles de Salmonella y otras bacterias)

A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicación ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.

B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la detección de Salmonella, el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos.

C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las cámaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias móviles de este género atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella.

D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.

E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado.

El método se ha usado para detección de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.

F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos.

5. Examen de superficies.

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- Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos presentes en superficies contaminadas.

- Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie.

- El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento).

- En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.

6. Recuento de mohos y levaduras.

Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es más rápido que el de los mohos.

VALORES MICROBIOLÓGICOS EN LOS ALIMENTOS

1.- OBJETIVOS

El análisis microbiológico de los alimentos tiene dos finalidades:

(1º) Comprobar la calidad de las prácticas de elaboración del alimento

(2º) Comprobación la calidad aceptable de los alimentos en el mercado internacional.

Los valores de referencia son aquéllos que indican los límites máximos de microorganismos presentes en los alimentos elaborados de acuerdo a las «buenas prácticas de elaboración» (BPE).

Para decidir el número y los criterios que se usen como valores de referencia ha de seguirse una serie de principios:

(1º) El número de criterios a valorar ha de limitarse de modo estricto para poder incrementar el número de muestras analizadas por un laboratorio.

(2º) Los criterios han de escogerse atendiendo a consideraciones ecológicas: han de referirse a microorganismos que interfieren con la salubridad del alimento (microorganismos índices) o que indiquen falta de seguridad o perjudiquen su inocuidad (microorganismos indicadores).

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(3º) Los criterios han de formularse con sumo cuidado en términos cuantitativos (considerando los errores de la medida y la distribución de los microorganismos en el alimento).

(4º) Los microorganismos han de denominarse de forma taxonómicamente correcta.

(5º) Los métodos han de ensayarse, de describirse con todo detalle para que puedan repetirse en diferentes laboratorios con resultados coherentes entre sí.

(6º) Los valores de referencia numéricos han de deducirse de muestras obtenidas después de tratamiento siguiendo las BPE.

2.- Procedimiento de determinación de los valores de referencia.

2.1.- Sondeos o estudios exploratorios.

En primer lugar seleccionar más de 10 industrias y valorar sus BPE corrigiéndolas si es necesario. Cuando se han corregido errores se toman alrededor de 10 muestras por empresa y se valoran los criterios seleccionados y con los datos obtenidos se confeccionan curvas de distribución (Fig. 1), en las que se calcula el

percentil 95% ( ) que suele estar 1 ó 2 órdenes de magnitud por debajo de los valores máximos aceptables (DMI o NMA nivel mínimo de alteración). Si los

valores de se aproximan a los DMI o a los NMA hay que revisar las técnicas de elaboración y distribución de los alimentos antes de proceder a una nueva estimación de los valores de referencia.

2.2.- Deducción de los valores de referencia a partir de datos de sondeos.

Normalmente se adopta un valor algo por encima del valor ø (el valor m en la Figura 1), cuando se trata de microorganismos no patógenos se suele aceptar una cierta tolerancia. en el valor.

Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m es la llamada «Zona de alerta» cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del método de recuento, tipo de alimento, modo de preparación y población de riesgo. Este valor M ha de establecerse teóricamente y la relación M/m vería entre 3 y 103 dependiendo del tipo de alimento.

En el caso de microorganismos patógenos se acepta la medida de muestras agrupadas (x muestras de y gramos o una muestra de xy gramos) en las que los valores de patógenos se ajusten a los criterios de referencia aunque, en grandes cantidades dealimento, puedan aparecer algunos microorganismos patógenos.

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3.- Fundamentos ecológicos de la elección de criterios microbiológicos y de la fijación de valores de referencia.

4.1.- Generalidades.

Los criterios microbiológicos han de establecerse después de un cuidadoso estudio ecológico de la asociación de microorganismos con cada alimento particular. En los criterios para microorganismos no patógenos la tolerancia que se acepta es: si el valor de referencia es 10S no se aceptan más de 2 muestras de 10 que tengan entre 10S y 10S+1 y ninguna que supere el nivel de 10S+2.

En los ejemplos siguientes se indican más criterios de los estrictamente necesarios, esto es debido a regulaciones locales y a exigencias de los consumidores; en cualquier caso, lo más conveniente es hacer una slección adecuada de los criterios atendiendo a consideraciones ecológicas.

Los productos que presenten pequeñas deficiencias pueden destinarse al reprocesamiento, eliminación de las partes afectadas o alimentación animal.

4.2.- Alimentos protéicos.

a) Leche, crema, queso y helados: La leche cruda es un alimento peligroso en que deben realizarse recuentos de aerobios totales y Gram-negativos y sobre todo cuando se destina a la producción de alimentos para población de riesgo. La leche pasteurizada tiene una alta calidad microbiologíca y los valores de enterobacterias y aerobios están ampliamente aceptados (Tabla 2), en ciertos casos es necesario hacer un recuento de Gram-positivo psicrotrofos (Bacillus) para valorar la posibilidad de deterioro debido a proteasas y lecitinasas. Queso: en aquellas zonas donde se prepara a partir de leche cruda de oveja o cabra es especialmente importante valorar la presencia de Brucella; y en los quesos salazonados, de S. aureus que se selecciona en el proceso. El queso elaborado a partir de leche pasteurizada es más seguro y el criterio es valorar enterobacterias y S. auerus. Helados: presentan un problema particular por su alta posibilidad de contaminación con microorganismos de origen entérico (tabla 3) debido a la alta manipulación de la materia prima.

b) Carne fresca: En zonas en que el tratamiento térmico de las canales no es adecuado pueden haber una proliferación en profundidad de C. perfringens de origen intestinal. Si el tratamiento es adecuado la flora más importante es la Gran-negativa no fermentadora (Pseudomonas, por ejemplo) que hay que determinar en superficie.En carnes es especialmente importante prevenir la transmisión de las zoonosis mediante la observación ante morten y post-mortem de los animales; aunque la eliminación de las enfermedades se fundamenta en la prevención en el ganado y en el tratamiento térmico de los alimentos. En carnes deshuesadas es importante valorar enterobacterias para determinar las condiciones higiénicas del

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proceso. Las carnes picadas, debido a su procesamiento, tienen títulos bacterianos mayores. No deben consumirse crudas, y los valores de referencia rondan 105 aerobios/gr.La carne de pollo no se consume nunca cruda y por tanto la contaminación es posterior a la preparación. El criterio es el análisis de enterobacterias en superficie para valorar los riesgos posteriores.

c) Alimentos de origen marino: Las diferencias en el pH de la carne y del pescado y marisco hacen que éstos sean más susceptibles al deterioro microbiológico. El pescado de alta mar está notablemente limpio de microorganismos, no así el de zonas costeras para el que se han descrito valores de referencia (tabla 4).

En el caso de los moluscos la situación es más delicada porque a veces se consumen crudos. Se han descrito límites de enterobacterias y E. coli, así como para las aguas en las que se cultivan. (Es importante la transmisibilidad de hepatitis A, a través de los moloscos).

Es importante el control de aminas vasopresoras.

d) Huevos y derivados:

Los huevos enteros no tienen carga microbiológica (salvo excepciones y en los casos de huevos de pata o de oca) y por tanto no tiene sentido establecer criterios. En el caso de los productos es importante el momento de la rotura y separación de la cáscara que, si se hace de forma higiénicamente correcta permite recuentos totales del orden de 106 cfu/ml y E. coli inferior a 102/ml.

e) Hortalizas y verduras y tubérculos:

Las asociaciones microbianas son similares a las de los alimentos cárnicos aunque aquí toman más importancia los microorganismos capaces de hidrolizar carbohidratos de alto pero molecular (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia y Corynebacterium) que, junto a los mohos son causantes de «podredumbres » (tabla 5).

En estos alimentos no son de utilidad los recuentos microbiológicos y sólo las propias alteraciones macroscópicas constituyen criterios válidos de la pérdida de calidad.

En el caso de hortalizas es importante considerar la posible contaminación con microorganismos derivados del estiércol o del agua de riego. Por consiguiente es importante lavar las hortalizas para arrastrar microorganismos, huevos y virus y usar como valores de referencia 10 E. coli/gr y 10 estreptococos grupo D/gr con valores de los microorganismos psicotrofos del orden de 105 cfu/ml (para los que se consumen crudos).

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4.3.- Alimentos de pH ácido. En ellos sólo pueden crecer acidotolerantes: mohos, levaduras, bacterias lácticas y acetobacterias.

a) Frutas, zumos y refrescos: Las frutas se conservan en atmósferas especiales y los zumos y refrescos se suplementan con conservante que unidos a la baja temperatura de conservación por razones organolépticas hace que el recuento sea innecesario.

b) Alimentos a los que se añade vinagre: (encurtidos) En general el control microbiológicas es innecesario siempre que los valores pH sean suficientemente bajos: el control del pH permite valorar las BPE.

4.4.- Alimentos emulsionados.

Los alimentos de este tipo deben su estabilidad al efecto combinado de la dispersión de la fase acuosa junto a su protección con valores subinhibidores de aw pH.

a) Mantequilla: Los riesgos sanitarios son prácticamente nulos cuando se ha elaborado a partir de leche pasteurizada. En cualquier caso, la valoración de microorganismos lipolíticos puede permitir evaluar el riesgo de enranciamiento.

b) Margarina: La discusión es similar al caso de la mantequilla. Aquí se adiciona conservante. El mayor riesgo está en la fase acuosa contaminante. El criterio más sencillo es la medida del pH de esta fase acuosa, y si hay alteraciones en el mismo el recuento de microorganismos lipolíticos.

4.5.- Alimentos con actividad de agua reducida.

a) Alimentos con humedad intermedia:( aw= 0,7-0,85) (son salazones, leche condensada, mermeladas). Las asociaciones de microorganismos que se forman dependen del valor concreto de aw y del pH del alimento. En estos casos los controles del alimento recién preparado son de poca utilidad y las muestras han de someterse a incubaciones cíclicas para detectar luego los microorganismos.

b) Alimentos completamente estabilizados: (aw <0,6). Estos alimentos están perfectamente protegidos frente al deterioro microbiano; pero los microorganismos no esporulantes pueden conservarse en un estado de baja actividad metabólica por lo que es necesario un control microbiológico de los mismos. Este control es mucho más importante cuando el alimento va a usarse en poblaciones de riesgo. También es importante valorar la calidad microbiológica del agua empleada en la rehidratación del alimento.

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4.6.- Alimentos perecederos pasterizados no envasados.

a) Productos de pastelería: La contaminación con E. coli es indicativa de las condiciones de conservación que siempre ha de hacerse en frío por la cualidad perecedera de su interior. La presencia de Staphylococco en la crema de productos de pastelería también es importante.

b) Empanadas de carne: La corteza y la presencia de conservantes protege el interior, aunque en ocasiones se han roto estas barreras y se han producido contaminaciones. Deben vigilarse enterobacterias, S. aureus y C. pefringens.

c) Pan: El mayor problema es el enmohecimiento que es facilmente detectable por lo que en condiciones normales no es necesario un control microbiológico especial.

4.7.- Alimentos congelados. Durante la congelación no hay desarrollo microbiano, el problema surge durante la descongelación que puede no desarrollarse conforme a las BPE. El criterio suele ser el control de la calidad del producto fresco antes de congelarse. Cuando el alimento se cocina inmediatamente antes de procederse a la congelación, los valores de referencia suelen ser similares a los de la leche pasterizada.

4.8.- Semiconservas envasadas.

Son aquellos productos que conservados en refrigeración tienen una duración de varias semanas pero que a temperatura ambiente se alteran en pocos días.

a) Alimentos perecederos: Embutidos: en los que se da una gran variedad de valores de referencia aunque pueden señalarse, en conjunto, los de la tabla.

Productos cárnicos en lonchas envasados al vacío: en que la alteración se efectúa por bacterias lácticas y el criterio es incubar a temperatura de refrigeración el producto y valorar entonces S. aureus y enterobacterias.

b) Alimentos de gran tamaño enlatados: Las asociaciones presentes en estos microorganismos son bacterias psicrotrofas resistentes al calor (Streptococos de grupo D y ciertos bacilos). No es útil detectar microorganismos en el producto recién preparado, es necesario hacen ensayos de incubación a una temperatura que permite el desarrollo máximo de los organismos psicrotrofos sin matarlos (16º C). En la tabla 7 se muestran los valores de referencia para estas semiconservas.

c) Semiconservas de pescado: Las condiciones de análisis son similares a las del apartado anterior. En aquellas semiconservas que contienen vinagre, la medida del pH suele ser suficiente criterio (si el pH es diferente del de referencia se

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destaca el producto). Para alimentos con pH superior a 4.5 hay que analizar enterobacterias, S. aureus y Clostridium.

d) Otros productos bastante estables: Para quesos y ambutidos se deben realizar pruebas de incubación para detectar Bacillus y Clostriclium. El incremento no debe ser superior a 3 veces. En pescados ahumados las estabilidad es buena y en ellos debe controlarse Clostridium botulinum de tipo E.

4.9.- Alimentos tratados térmicamente y envasados en recipientes herméticos.

a) Conservas apertizadas: Las conservas son muy estables y no presentan riesgos, excepto en el caso de C. botulinum cuando el tratamiento no es el adecuado y en los casos de contaminación postprocesado debido a defectos en el envase. El mejor criterio es el control de los mecanismos de producción porque las contaminaciones son demsiado esporádicas para ser detectables por un muestreo.

Se puede valorar el poder de conservación de la appertización incubando envases durante largo tiempo a altas temperaturas (30º C) y valorando las alteraciones organolépticas.

b) Alimentos totalmente estériles:

Estos no deben contener ningún tipo de microorganismo. El análisis se centra en el estudio de la presencia de esporas termoresistentes. El análisis se hace incubando a alta teperatura una serie de envases y detectando abombamientos, cambios organolépticos, si no es el caso, se siembra una muestra del contenido y se incuba en anaerobiosis a alta temperatura.

5.- Concordancia entre valores y métodos:

Los métodos de análisis deben ser normalizados para que los resultados del mismo sean constantes y reproducibles entre laboratorios. Hay una serie de organizaciones responsables de la elaboración y normalización de los métodos de análisis y los valores de referencia. En España el código alimentario y una serie de normas publicadas en el BOE y que desarrollan definiciones, métodos y valores de referencia, constituyen la normativa vigente para la decisión sobre calidad microbiológica del alimento.

TIEMPOS Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN

Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC 48 ± 2 h

Mesofílicos aerobios* 35 ± 2ºC 48 ± 2 h

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Psicrotróficos 20 ± 2ºC 3 - 5 días

Psicrofílicos 5 ± 2ºC 7 - 10 días

CUESTIONARIO

1. Qué es un recuento en placa? 2. Qué diferencia hay entre una siembra en superficie y una siembra en

fondo? 3. Cuáles son las diluciones empleadas para análisis de alimentos? 4. En que se realizan las diluciones? 5. Cuándo se emplean diluciones 10º y cuando 10-1 y 10-2 y 10-3 6. Cómo se reporta oficialmente un recuento de 1000 bacterias en una

dilución 10º de SPC? 7. Nombra tres métodos inmunológicos para la detección de microorganismos 8. Qué son los métodos colorimétricos para identificar bacterias en alimentos? 9. Qué microorganismos se pueden identificar en: a. agar Baird Parker, b.

agar Mc Conkey c. Agar Hektoen d. Agar Sabouroud. E. Agar EMB 10. Qué es el petrifilm? 11. Qué pruebas consideras importantes realizar para la búsqueda de bacterias

en un asadero de pollos? 12. Qué recuentos recomendaría para determinar contaminates microbianos en

mermeladas? 13. Qué pruebas microbiológicas para kumis y yogurt?

BIBLIOGRAFIA http://www.unavarra.es/genmic/programa%20microbiologia_general.htm Universidad de Navarra. España. Microbiologia de alimentos. BENSON. Harold. Microbiological Applications FRAYZER Microbiologia de alimento. Editorial ACRIBIA

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PRÁCTICA No. 3 METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNÓSTICO PAR HONGOS:

MOHOS Y LEVADURAS DE IMPORTANCIA EN INGENIERIA DE ALIMENTOS

PROFESOR: PATRICIA DURAN OSPINA 1. OBJETIVOS

1. Realizar recuentos sobre medios de cultivo para la identificación de hongos que contaminan alimentos

2. Reconocer las diferentes morfologías de los hongos.

3. Distinguir algunos hongos ambientales que causan micosis oportunistas.

2. INTRODUCCIÓN Aunque la mayoría de mohos y levaduras no requieren del hombre para sobrevivir, salvo raras excepciones como los dermatófitos, ellos han llegado hasta el hombre accidentalmente y le han causado enfermedades infecciosas superficiales, cutáneas, subcutáneas, sistémicas y oportunistas que se han estudiado desde finales del siglo XIX; dada su cronicidad, baja incidencia, prevalencia y mortalidad en salud pública en relación con el auge que tomaron las enfermedades infecciosas bacterianas, quedaron un poco en el olvido de los investigadores y sólo en el corazón de unos pocos amantes de la micología. Como consecuencia de los cambios ambientales ocasionados por el hombre, los desastres naturales, las antibioticoterapias prolongadas, la utilización de inmunosupresores y los adelantos de la ciencia que permiten mantener con vida pacientes crónicos en las unidades de cuidados intensivos, las micosis oportunistas invasivas se incrementaron, considerándose en la actualidad como enfermedades infecciosas

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emergentes cuyos blancos de acción son personas con transplantes, cáncer, sida, enfermedades crónicas y usuarios de las unidades de cuidados intensivos, población donde causan alta morbilidad y mortalidad, lo que no sucede en personas inmunocompetentes. Entre los agentes etiológicos más encontrados en estas patologías oportunistas son: Cryptococcus, Aspergillosis, Penicilium, Candida, Rhizopus, Mucor. Esta práctica le dará a los estudiantes la oportunidad de conocer métodos de estudio y diagnóstico de los hongos y además apreciar la gran variedad de éstos en cuanto tamaño, forma, color y crecimiento en los medios apropiados para su aislamiento.

3. MARCO TEÓRICO

El término hongo ( del latín fungus, seta) incluye organismos uni y multicelulares, eucarióticos, portadores de esporas, carentes de clorofila, heterótrofos, fundamentalmente terrestres, aunque algunos son de agua dulce o marinos. Muchos son patógenos e infectan plantas y animales. Pertenecen al reino Fungi. La ciencia que estudia los hongos es la Micología, del griego mykos: seta y logos: tratado. Según la morfología los hongos se clasifican en: levaduras (unicelulares) y mohos y setas (pluricelulares).

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LEVADURAS

Son células ovaladas o esféricas, miden alrededor de 5 micras de diámetro y se asemejan a cocos bacterianos, unicelulares con un único núcleo que se reproduce de forma asexual por gemación y división transversal o por reproducción sexual por la formación de esporas. Cada yema que se separa puede crecer y convertirse en una nueva levadura, y algunas se agrupan para formar colonias. Algunas levaduras forman un brote elongado que se denomina conducto germinal. Cuando se alinean una serie de conductos germinales extremo con extremo, adquieren una apariencia de hifas, denominadas seudohifas (falsas hifas), porque no hay puentes de interconexión entre las células, como sucede en las especies de Candida.

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MOHOS

Consisten en filamentos largos, a modo de hilos ramificados, de células llamados hifas, (del griego hyphe: red), que forman un micelio, masa enredada o agregado análogo a un tejido. Cada hifa es una célula rectangular o tubular, compuesta de una pared celular externa y una luz interna, que contiene el citosol y los orgánulos, el citoplasma está rodeado de una membrana celular situada junto a la pared celular. En algunos hongos el protoplasma fluye a lo largo de las hifas, sin tabiques transversales que lo detengan, éstas hifas se conocen como cenocíticas

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o aseptadas . Las hifas de otros hongos poseen tabiques transversales llamados septos con un único o múltiples poros que permiten el flujo del citoplasma, éstas hifas se denominan septadas. HONGOS AMBIENTALES

ASPERGILLUS

ASPERGILLUS

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PENICILLUM

RHIZOPUS

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MUCOR

4. MATERIALES

Alimentos contaminados con hongos

Levadura de panaderia

Agar Sabouroud Agar PDA (Papa dextrosa agar) Microscopios Mecheros Láminas porta y cubreobjetos Bisturís Cultivos de mohos y levaduras Colorantes de Gram Azul de lactofenol Lápiz de cera Agujas de disección

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Cinta transparente Papel para limpiar lentes Guantes Tapabocas Hipoclorito de Sodio en recipiente de boca ancha

5. PLAN DE TRABAJO PARA MOHOS

1. El docente hará una demostración de un montaje directo de muestras de

hongos a partir de alimentos previamente contaminados: naranjas, pan, arepas, agua de piscina, utilizando como reactivo azul de lactofenol

2. Cada estudiante preparará placas de diversos hongos ambientales (mohos) y de levaduras para observar su morfología 3. Observar la preparación al microscopio con los objetivos de 10X y 40X.

PARA LA LEVADURA a) En una lámina portaobjetos coloque una gota de azul de metileno, utilizando

el asa redonda. b) Con el asa toque la colonia de la levadura, emulsiónela en la gota del

colorante y colóquele una lámina cubreobjetos encima. c) Observe la preparación con los objetivos de 10 y 40X. d) Prepare otra lámina portaobjetos con una gota de solución salina,

utilizando el asa redonda. e) Con el asa toque la colonia de la levadura, haga una pequeña extensión

sobre el portaobjetos, séquela al mechero. f) Proceda a colorear la lámina portaobjetos con los reactivos de Gram. g) Una vez seca, obsérvela al microscopio con el objetivo de 100X, utilizando

aceite de inmersión.

6. RESULTADOS

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7. DISCUSION Y CONCLUSIONES 8. CUESTIONARIO Y AUTOEVALUACION 1) Qué son los hongos? 2) Cómo se clasifican los hongos? 3) Cuáles son las partes que componen la estructura de los mohos? 4) Qué es una hifa y sus clases? 5) Qué es el micelio y sus clases? 6) Cuál reactivo se utiliza para observar una muestra que proceda de una lesión sospechosa de hongos? 7) Cuál reactivo se utiliza para observar la morfología de los hongos a partir de

un cultivo? 8) Nombre algunos hongos ambientales. 9) En Que medios se aislan los hongos a partir de alimentos? 10) Qué hongos se emplean industrialmente para la fabricación de alimentos? 11) Qué hongos se emplean para producir antibióticos? 12) Qué es el Sacharomyces cereviceae? 13) A qué temperatura y por cuanto tiempo se incuban los hongos? 14) Cuál es la principal fuente de contaminación de hongos en alimentos?

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PRÁCTICA No. 4 OBSERVACIÓN DE ALGUNOS HELMINTOS

PROTOZOARIOS Y ECTOPARASITO IMPLICADOS EN INFECCIONES PARASITARIAS MAS COMUNES

EN SALUD PÚBLICA

1. OBJETIVOS

Identificar las características morfológicas de los helmintos y protozoarios.

Establecer diferencias y semejanzas entre helmintos y protozoarios.

Observar macro y microscópicamente algunos ectoparásitos comunes implicados en infecciones humanas.

2. 2. INTRODUCCIÓN

Las enfermedades parasitarias constituyen un problema de salud pública en el mundo en general y específicamente, en los países tropicales en vía de desarrollo como el nuestro.

Los helmintos son la causa más prevalente de enfermedades en el mundo y son comunes en particular en países tropicales con malas condiciones habitacionales y agua y alimentos contaminados con heces humanas.

Es importante que los estudiantes de las Ciencias de la Salud observen en el laboratorio de Microbiología los principales helmintos y protozoarios implicados en los problemas de salud pública de la región, del país y del mundo y con la ayuda del microscopio puedan establecer las diferencias morfológicas existentes entre ellos.

3. MARCO TEÓRICO Los parásitos que causan infecciones se dividen en dos grupos principales: helmintos (gusanos) que constan de células múltiples y protozoarios que constan de una sola célula.

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Los helmintos son un grupo grande de gusanos parásitos que incluye cestodos (taenias), nematodos (gusanos redondos) y trematodos ( fasciolas). Los protozoarios parásitos se dividen en dos grupos principales, el primero está formado por los protozoarios que viven en el lumen y el segundo por los que viven en sangre y tejidos. La mayor parte de los protozoarios que viven en el lumen y son patógenos para el hombre infecta el aparato digestivo y ocasionan diarrea.

CLASIFICACION TAXONOMICA DE LOS ENDOPARÁSITOS HUMANOS

CLASIFICACION NOMBRE COMUN

EJEMPLOS

HELMINTOS

Filum Nematelmintos Clase Nematoda

Gusanos redondos

Uncinarias, Ascaris, Enterobius, Tricocéfalo, Stronyloides, Onchocerca, Trichinella

Filum Platelmintos Clase Cestoda Clase Trematoda

Tenias Fasciolas

Taenia solium y saginata, Echinococcus, Hymenolepis, Dyphilidium, Dyphillobotrium Schistosoma, Clonorchis, Fasciola, Paragonimus.

PROTOZOARIOS

Filum Apicomplexa Esporozoarios Babesia, Crytosporidium, Isospora, Plamodium, Pneumocystis, Toxoplasma

Filum Ciliophora Ciliados Balantidium

Filum Sarcomastigophora Subfilum Mastigophora Subfilum Sarcodina

Flagelados Amebas

Giardia, Leishmania, Tricomonas, Tripanosoma Acanthamoeba, Entamoeba, Naegleria

4.MATERIALES Microscopios Preparaciones de helmintos y protozoarios Algunos ectoparásitos: piojos, pulgas, garrapatas Helmintos adultos: Ascaris, tenias

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Lugol Solución salina Láminas porta y cubreobjetos Palillos Papel para limpiar lentes Guantes Tapabocas Toallas de papel Recipientes con hipoclorito

5. PROCEDIMIENTO (PLAN DE TRABAJO) 1.El docente hará las preparaciones en fresco y coloreadas de los helmintos y protozoarios.

2.El estudiante observará al microscopio con los lentes de 4 y 10X los ectoparásitos en las láminas portaobjetos.

3.El estudiante examinará macroscópicamente los helmintos y ectoparásitos y establecerá las diferencias y semejanzas entre ambos.

6. RESULTADOS

7. CONCLUSIONES

8. PREGUNTAS DE EVALUACIÓN

1.Qué es un parásito?

2.Cómo se clasifican los parásitos? 3.Qué parásitos producen zoonosis alimentarias

4.Dé ejemplos de protozoarios? 5.Qué es el cisticerco?

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6.Las amebas se pueden pasar por agua contaminada?

7.Dé ejemplos de helmintos?

8.Dé ejemplos de ectoparásitos?

9.Por qué los parásitos son de importancia en la medicina?

10. De las siguientes fotos de parásitos cuales son considerados vectores y cuales reservorios?

ECTOPARASITOS

GARRAPATAS HEMBRA Y MACHO

PIOJO

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PULGA