ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGÍA AMBIENTAL

GRUPO

QU-301

MATERIA

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

Reporte de diagnóstico microbiológico en sitio alterado Presa Blanca Compuerta 2 de acuerdo a la NMX-AA-42-SCFI-1987 y PROY-NMX-AA-042/1-SCFI-2008

PRESENTAN:

Cruz Romo Diana LauraGaona Aboytes María AlejandraGonzález Sánchez Carla Valeria

Mireles Villasana Alejandra Pérez Gómez Cynthia Sarai

Generación: 2014-2016

León, Guanajuato. 24 JUNIO 2015

ANTECEDENTES

En el municipio de León Guanajuato cuenta con Presas de aguas negras y residuales un ejemplo muy claro es la Presa Blanca (Figura 1 y 2) ubicada al suroeste de la ciudad y la cual se encuentra a 1784 metros sobre el nivel del mar (snm).

En donde desembocan todo tipo de desechos industriales y domésticos, el agua de dicha presa se conduce a través de un canal a cielo abierto, hacia las comunidades de Santa Rosa Plan de Ayala en donde su estructura económica es de un total de 1027 hogares en donde estos tienen 967 viviendas, 23 tienen piso de tierra y unos 48 consisten de una sola habitación, 910 de todas las viviendas tienen instalaciones sanitarias, 933 son conectadas al servicio público, 957 tienen acceso a la luz eléctrica.1

En San Pedro del Monte en cual su estructura económica es de un total de 173 hogares. De estas 166 viviendas, 2 tienen piso de tierra y unos 8 consisten de una sola habitación, 141 de todas las viviendas tienen instalaciones sanitarias, 166 son conectadas al servicio público, 164 tienen acceso a la luz eléctrica.2

En la presa blanca, los riesgos y vulnerabilidad, se pueden ver como de mayor importancia por las consecuencias a la población, que hacen vulnerable el entorno urbano son los riesgos por fugas de los ductos de Pemex ya que alrededor de la presa se encuentra una planta de Pemex y los riesgos implícitos por la colindancia a la carretera, por falta de accesos y salidas adecuadas que den seguridad a la población.

En la comunidad se presentan usos de suelo tales como:

uso urbano-habitacional uso agrícola potencial. uso mixto agrícola

En donde su destino final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas están fuertemente contaminadas química y bacteriológicamente, al no sufrir ningún tratamiento de remediación.

Figura 1. Recuperado el 20 de junio de 2015 de:

https://www.google.com.mx/maps/@21.0857414,101.7137486,2970m/data=!3m1!1e3

Figura 2 Ubicación de La Presa Blanca.

1San Pedro del Monte (La Huizachera)  - Guanajuato . Consultado el 20 de junio del 2015. Recuperado de: http://www.nuestro-mexico.com/Guanajuato/Leon/San-Pedro-del-Monte-La-Huizachera/

2 Plan de Ayala (Santa Rosa)  - Guanajuato . Consultado el 20 de junio del 2015. Recuperado de:http://www.nuestro-mexico.com/Guanajuato/Leon/Plan-de-Ayala-Santa-Rosa/

PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA Y SIEMBRA IN SITU

MUESTREO

Materiales, equipos y reactivos.

2 Frascos o recipientes para colectar la muestra de condición estéril.

4 Hisopos en condición estéril

2 Jeringa estéril

2 cajas Petri con agar

2 Metros de Aluminio esto es para envolver las muestras recolectadas.

1 Hielera pequeña

Hielo (para la preservación de las muestras recolectadas).

Medio de cultivo de Agar de bilis y rojo violeta

Nota: Los frascos o los recipientes de muestreo deben estar estériles esto es para el material no

se contamine ya que en la esterilización elimina todo tipo de microorganismos.

Preparación de medios de cultivo

Agar de Bilis y rojo violeta

Ingredientes

Extracto de levadura 3 g

Peptona de gelatina 7 g

Mezcla de sales biliares 1.5 g

Lactosa 10 g

Cloruro de sodio 5 g

Agar 15 g

Rojo neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.002 g

Agua para llevar a 1000 mL

pH 7.4± 0.2

Método de preparación

Se suspendieron 4.98 g de Agar de bilis y rojo violeta en 120 mL de agua destilada y se mezcló

perfectamente, posteriormente se procedió a esterilizarlo en autoclave a 121° C por 15 minutos.

Figura 3. Toma de muestra microbiológica en matriz de agua.

Procedimiento

Muestreo en cuerpos receptores (agua):

1. Tomar 1 mL de muestra con la jeringa estéril sumergiéndola en el agua sin sacarla evitando

contaminar en todo momento.

2. Verter el volumen tomado con la jeringa en una caja Petri preparada un día antes del muestreo

con agar de bilis y rojo violeta.

3. Llenar un frasco de vidrio (previamente debe de estar esterilizado) hasta 2/3 partes de su

volumen (cantidad menor sería insuficiente, mayor, disminuiría el espacio de aire disponible),

evitar contaminar en todo momento.

NOTA: El volumen suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, debe de ser de un aproximado de

100mL.

4. Para tomar el volumen de muestra en el frasco quitar el papel aluminio del cuello del frasco e

introducir el frasco aproximadamente 30 mL bajo la

superficie del agua. (figura 3).

5. Destapar el frasco dentro del agua. (La boca del envase

debe quedar en sentido contrario al flujo de la corriente, si

no existe corriente, crearla empujando el frasco

horizontalmente, en dirección opuesta al movimiento de la

mano).

6. Tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el

papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la botella.

7. Si no es posible la recolección de muestras en las

condiciones antes anunciadas; fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua.

Procedimiento

Muestreo en cuerpos receptores (suelo):

1. Tomar con ayuda de un hisopo estéril la muestra de suelo de forma rápida, y cultivarla en la

placa de cultivo preparada un día antes del muestreo con agar de bilis y rojo violeta el cual es

usado para el crecimiento de organismos coliformes.

2. En el frasco receptor almacenar la muestra del suelo cerca y rápida para no contaminar el

recipiente.

NOTAS: Se recomienda tomar la muestra de suelo cerca al área de la muestra de agua.

3. Los frascos estériles para el muestreo no se deben destapar sino hasta el momento en el que se

efectúe el muestreo.

4. Evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material

contaminante.

5. Realizar el muestreo lo más pronto posible, para evitar proliferación o muerte de las bacterias.

6. Cuando se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultados empiezan a ser

inciertos.

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE COLIFORMES TOTALES (NPM): PRUEBA PRESUNTIVA

Fundamento:

El caldo lactosado es un medio rico en nutrientes, y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano.

Sus ingredientes como el extracto de carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa requieren de la acción de dos enzimas: la permease de lactosa y la β galactosidasa, la primera es necesaria para ingresar la molécula de lactosa a la célula bacteriana y la segunda hidroliza el enlace glucosídico y produce glucosa y galactosa. Por la fermentación de la lactosa, (la cual es llevada a cabo por los coliformes totales) se produce ácido y gas, y éste último se demuestra al usar las campanas Durham. Para bacterias coliformes debe incubarse de 35 a 37 °C durante 24-48 horas.

Materiales, equipos y reactivos.

9 Tubos de cultivo1 Gradilla 5 Vasos de precipitados de 250 mL9 Campanas Durham8 Pipetas de diferentes volúmenes 1 Espátula 3 Matraz Erlenmeyer 250 mL1 Incubadora 1 Autoclave Balanza analíticaAgua destiladaCaldo lactosado

Preparación de medios de cultivo

Caldo lactosado

Medio de doble concentración:

Ingredientes

Peptona de gelatina 5 g

Extracto de carne 3 g

Lactosa 5 g

Agua para llevar a 1000 mL

pH final 6.9 ± 0.2

Método de preparación

Se suspendieron 1.56g de caldo lactosado en 120 mL de agua destilada y se mezcló

perfectamente y se distribuyó en 9 tubos de cultivo con campana Durham. Esterilizar a 121°C de 12 a 15

minutos.

Prueba presuntiva

1. Preparar la muestra para el análisis para lograr una distribución uniforme de los microorganismos

(agitando, mezclando la muestra).

NOTA: Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.

2. A partir de una muestra de 100 mL de agua o una dilución del suelo con 1 g de suelo, inocular los

tubos de con 10 mL de medio de cultivo líquido a doble concentración (caldo lactosado) con 3

volúmenes diferentes de agua o dilución de suelo los volúmenes son de 10 mL, 1 mL y 0.1 mL,

tomándolos con pipetas estériles en cada caso. Cada tubo de ensayo con su respectiva campana

Durham.

NOTA: Se harán 3 réplicas del medio que será incubado.

3. Incubar los tubos de 24 a 48 horas ya sea a 35 °C ó a 37 °C.

4. Posterior a la incubación examinar los tubos después de haber transcurrido de 18 a 24 horas y

considerar como resultados positivos a aquellos en los que se produjo gas dentro de la campana

Durham, turbidez. Si es necesario reincubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos

cambios y examinarlos nuevamente a las 48 horas.

5. Mediante tablas estadísticas llevar a cabo el cálculo del número más probable (NMP) de organismos

coliformes, organismos coliformes fecales y E. coli que puedan estar presente en 100 mL de muestra,

partiendo del número de tubos que resultaron positivos por réplica así como de la concentración de

donde proviene.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA LA IDENTIFICACION DE COLIFORMES TOTALES

Fundamento:

La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de

la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de

resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud

pública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la

presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de

otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros

del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse

para estimar el grado de contaminación fecal.

EL caldo lactosa bilis verde brillante Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el

aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos,

y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o

alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de

nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el

rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la

fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa

como agente selectivo.

La prueba confirmativa consiste en analizar los tubos una vez que resultaron positivos en la prueba presuntiva.

Materiales, equipos y reactivos

Pipetas de diferentes volúmenes

1 Matraz Erlenmeyer 250 mL

2 Asa de nicromo

2 Mechero

2 Vasos de precipitados 250 mL

1 Gotero

1 Autoclave

1 Incubadora

Caldo lactosa bilis verde brillante

Agua destilada

Reactivo Kovacs

Peptona

Preparación de medios de cultivo

Agar verde brillante bilis

Ingredientes:

Bilis de buey 20 g

Lactosa 10 g

Peptona de gelatina 10 g

Verde brillante 13.3 mg

Agua para llevar a 1000 mL

Método de preparación

Disolver 3.2 g del medio deshidratado en 80 mL de agua destilada, agitando frecuentemente

para disolver el producto, disperse en tubos con campana de Durham. Esterilizar a 121° C durante 15

minutos.

Solución salina de peptona

Ingredientes

Peptona 1.0 g

Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 g

Agua para llevar a 1000 mL

Método de preparación

Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que al

terminar la esterilización sea de 6.7. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.

Prueba confirmatoria

1. Reinocular con un asa de nicromo (esterilizándola en mechero) en caldo lactosa bilis verde

brillante un volumen (0.1 mL) del contenido de los tubos que resultaron positivos en la

prueba presuntiva.

2. Incubar los tubos por 48 horas a 37 °C para la detección de organismos coliformes y a 44°C

por 24 horas para organismos termotolerantes (fecales). Para confirmar la presencia de E.

coli. presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona tanto para agua como para suelo para

detectar la formación de indol a 44°C durante 24 horas.

3. Después de incubación examinar los tubos, observar si se produjo gas en la campana

Durham esto para confirmar la presencia de coliformes pero para la presencia de E.coli se

podrá ver el desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar así como después de

haber añadido el reactivo de Kovacs.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE INDOL PARA E. coli PRESUNTIVA

Fundamento:

En la realización de la prueba de indol, el reactivo Kovacs y el agua peptona son los que

detectan la presencia del microorganismo E.coli presentes en la muestra de agua y suelo de La Presa

Blanca. Su detección fue instantánea tanto en agua como en suelo.

El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y esta

reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto

triptofanasas. Para detectar la producción de indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la

prueba se realiza con el reactivo de Kovacs con el que el indol producido reacciona generando una

coloración rosa intensa.

Inoculación del medio.

1. Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento de verde brillante bilis que muestre un

resultado positivo en uno o más tubos de medio confirmativo para detectar la producción de gas

e indol.

2. Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de Caldo Bilis Lactosa

Verde Brillante o Caldo EC a 37°C y examinarlo para ver si hay producción de gas dentro de un

período de 48 horas.

3. Para confirmar la presencia de E. coli presuntiva, incubar un tubo de agua de peptona para

detectar la formación de indol a 44°C durante 24 horas.

4. Después añadir de 0.2 a 0.3 cm3 de reactivo de Kovacs al tubo de agua de peptona; el

desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar suavemente denota la presencia de indol.

NOTA.- La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de

contaminación fecal.

Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se considera

necesario.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE OXIDASA PARA E. coli

Fundamento:

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromo C

oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de

respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana,

en las siguientes líneas se dará una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de

entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromo C oxidasa, entiéndase que todo este

proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones

desde sus sustratos hasta llegar  al citocromo C, la enzima llamada citocromo C oxidasa le quita

electrones al citocromo C, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el

último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un

exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o

peróxido de hidrógeno.

Algunas bacterias que se encuentran en el agua pueden conformar la definición de organismos

coliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosa solo a

temperaturas abajo de 37 °C.

Por consecuencia dan resultados negativos en las pruebas confirmativas de rutina para

organismos coliformes, y su presencia en agua no es usualmente considerada como significativa.

Las especies de Aeromonas, las cuales es natural que estén presentes en agua, interfieren con

la determinación sólo a temperatura de 37 °C o menor, se requiere la prueba confirmativa de la oxidasa

solo cuando se están determinando coliformes totales.

El fundamento básico es que el reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la

enzima citocromo C oxidasa cambia a un color morado debido a que el  tetrametil-p-fenilendiamina es

una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado.

Materiales y equipos

2 Papel filtro

2 Cajas Petri

1 Gotero

2 Asa metálica de platino

Reactivos

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que

sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, Tetrametil-p-fenilendiamina.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%. Este reactivo

se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso.

Procedimiento

Incubación de los tubos

Incube los tubos inoculados por 48 horas ya sea a 35 °C ± 0,5 °C ó a 37 °C ± 0,5.

Revisión de los tubos en cultivo presuntivo

1. Examinar los tubos de cultivo después de incubarlos por 18 a 24 horas y registre con reacción

positiva aquellos que muestren turbidez debido al crecimiento bacteriano y/o formación de gas

en el interior del tubo invertido (Durham). Así como la producción de acido si el medio de

aislamiento contiene un indicador de pH.

2. Reincubar aquellos tubos que no muestren alguno o todos estos cambios y examínelos

nuevamente para reacciones positivas a las 48 horas.

Prueba de oxidasa

1. Lleve a cabo la prueba de la oxidasa con subcultivos puros de organismos fermentadores de

lactosa, desarrollados en medio de agar nutritivo, de la siguiente manera: Coloque dos o tres

gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en un papel filtro colocado sobre una caja

Petri.

2. Con una varilla de vidrio, palillo de madera o asa metálica de platino (no de nicromo) de punta

redonda, unte una pequeña porción del crecimiento sobre el papel filtro preparado.

3. Considere la aparición de un color azul-morado profundo en un lapso de 10 segundos como una

reacción positiva.

NOTA: Cada ocasión en que se utilice el reactivo de oxidasa, deben realizarse pruebas control con

cultivos de organismos que se sabe dan reacción positiva (Pseudomona aeruginosa) y una reacción

negativa (E. coli).

Factores a considerar en  la prueba de oxidasa.

No considerar un resultado positivo después de 30 seg, ya que el oxígeno molecular del ambiente oxida

al reactivo.

No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de

oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.

No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que

contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando

como resultado falsos negativos en la prueba.