guia de laboratorio microbiologia de alimentos

7/17/2019 Guia de Laboratorio Microbiologia de Alimentos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Práctica Nº 1

PRÁCTICA No. 1

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

ES OBLIGATORIO EL USO DE MANDIL, COFIA Y MASCARILLA DE TELA

REVISAR LAS INDICACIONES DEL LABORATORIO

ESTUDIAR EL CONTENIDO TEORICO, SE REALIZARÁ UNA EVALUACIÓN AL INICIARLA PRÁCTICA, TRAER TODO EL MATERIAL SOLICITADO





CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

1. OBJETIVOS:

Simular en el laboratorio los métodos de control del crecimiento microbiano utilizadosen la industria.

Determinar la sensibilidad bacteriana a dosis diferentes de Gentamicina y compuestosquímicos mediante un antibiograma

2. BASES CONCEPTUALES

El crecimiento de los microorganismos está influido fuertemente por la naturaleza física yquímica de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambientales permite el controldel crecimiento microbiano y el estudio de la distribución ecológica de los microorganismos

Los principales factores que influyen en la eficacia de los agentes físicos y químicos son lossiguientes:

- Número de microorganismos- Clase de microorganismos (no todos los microorganismos son igual de sensibles a los

agentes físico-químicos).- Concentración y clase del agente químico.- Intensidad y naturaleza del agente físico.

- Tiempo (necesitan un tiempo mínimo para producir el efecto que es distinto para cadaagente).- Temperatura y pH.- Naturaleza del material soporte de los microorganismos.

El control de microorganismos comprende todos los métodos físicos, mecánicos ypreferentemente químicos, que se emplean para destruir gérmenes (Tabla 1)

Los agentes físicos y químicos tienen una acción inespecífica y una actuación múltiple sobrecomponentes y estructuras

Agentes químicos: Sustancias químicas que influyen negativamente sobre lasbacterias. Sus efectos más importantes son el impedir el crecimiento microbiano(statico) o la destrucción de microorganismos (cida)

Agentes físicos: condición o propiedad física que causa un cambio





Tabla 1. Principales agentes físicos y químicos usados para el control microbiano

AGENTESFÍSICOS

Temperatura

Altas(Calor)

Seco

Llama directa:flameado,incineraciónaire caliente:estufas

Húmedo

AutoclaveTindalizaciónEbulliciónPasteurización

BajasCongelaciónRefrigeración

Radiaciones UltravioletaRayos X

Agentes mecánicosOndas sónicas y ultrasónicasFiltración

AGENTESQUÍMICOS

Soluciones químicasGases Antibióticos y quimioterapéuticos

Constituyentes antimicrobianos y estructuras biológicas en alimentos

Ciertos alimentos son muy estables frente al ataque microbiano, esto se debe a la presencia

de determinadas sustancias que han demostrado poseer actividades antimicrobianas. Lacubierta de algunos alimentos (membrana testácea de las semillas, la cubierta externa de losfrutos, la cáscara de las nueces, entre otras) proporciona una excelente protección contra laentrada y subsiguiente ataque de los microorganismos productores de alteraciones. Actualmente se están realizando ensayos para determinar la capacidad antimicrobiana deciertos compuestos que forman parte de los alimentos para usarlos con fin industrial.

CONCEPTOS GENERALES

- Esterilización: destrucción de todo tipo de vida microbiana presente en elementosinanimados.

- Desinfección: eliminación de la infección potencial de un material, no implicando

necesariamente en la destrucción de todos los organismos viables. Es un procesorelativo del control del microbiano. Es un término aplicado en relación con lassuperficies inanimadas (instrumentos, muebles, utensilios, aparatos y lugares) y a lassustancias inanimadas.

- Desinfectante: agente químico capaz de matar formas vegetativas potencialmentepatógenas. Se utiliza sobre objetos inanimados.

- Antiséptico: sustancia que impide el desarrollo de los microorganismos y que seutiliza sobre piel o mucosas.

- Antibiótico: cualquier compuesto químico utilizado para eliminar o inhibir elcrecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad común a todos los antibióticoses la toxicidad selectiva.

- Asepsia: técnicas orientadas a impedir la presencia de microorganismos patógenos enobjetos (ej. instrumental médico) o áreas determinadas.

- Agentes antimicrobianos: interfieren en el crecimiento de la actividad microbiana:





o BACTERICIDA, agente que mata bacterias.o BACTERIOSTATICO, agente que inhibe la multiplicación de las bacterias por

detener algunos procesos fisiológicos.

ANTIBIOGRAMA

En la actualidad están disponibles una cantidad de agentes antibacterianos con el objeto decontrolar las enfermedades que las bacterias producen

Los antibióticos son sustancias químicas producidas por microorganismos o derivadossemisintéticos de éstas, mientras que los quimioterápicos son productos de síntesis química,pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana.

Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos compuestosantibacterianos. La evaluación de esta sensibilidad ayuda a la selección del compuesto másadecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las pruebas más utilizadas para

evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano están basadas en elenfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.

• Concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la menorconcentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepabacteriana dada.

• Concentración mínima bactericida (CMB) se define como la menorconcentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.

El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se enfrenta labacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solución antibióticaabsorbida en discos de papel de filtro. Este método está estandarizado y los halos deinhibición han sido obtenidos correlacionándolos con las CMI y aparecen en unas tablas.

Hay varios factores que afectan al halo de inhibición: la carga del antibiótico en los discos, ladifusión del antibiótico en el medio de cultivo, el tamaño del inóculo bacteriano, la composicióny grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo deincubación.

El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland,

aproximadamente 108

UFC/ml y ser preparado en solución salina estéril o caldo de cultivo.

Se puede trabajar en dos tipos de ensayos:

Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibióticas.Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un sólo antibiótico, preparado a distintasconcentraciones.

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3. MATERIALES

Material

- Cultivo bacteriano de 24 horas Escherichia coli Klebsiella pneumoniae - 9 tubos de ensayo con caldo nutritivo (estériles)- 4 placas petri con Agar Mueller Hinton (estériles)- Hisopos estériles- Asa de inoculación- Pinzas

Reactivos

Agentes químicos:

- Cloro- Amonio cuaternario- Alcohol 70º

Antibiótico

- Gentamicina

Equipos

- micropipetas- Baño maría- Autoclave- Congelador

4. MÉTODO

I) AGENTES FÍSICOSInocular 100 uL de suspensión bacteriana en los tubos de ensayo que contienen 2.9 mL decaldo nutritivo.

TUBONo. AGENTE FÍSICO PROCESO

1 EBULLICION Someter a ebullición por 1 minuto

2 Someter a ebullición por 10 minutos

3 PASTEURIZACIÓN Mantener en un baño a 65ºC por 30 minutos,introducir el tubo de ensayo en un baño de hielo

4 Mantener en un baño a 90ºC por 15 segundos,introducir el tubo de ensayo en un baño de hielo

5 CONGELACION Congelar el tubo de ensayo por 24H





6 REFRIGERACION Refrigerar el tubo de ensayo por 24H

7 CALOR SECO(ESTUFA)

Mantener en la estufa un tubo de ensayo por 1hora a 160ºC

8 CALOR HUMEDO(AUTOCLAVE)

Someter al tubo al proceso de esterilización porautoclave (121ºC, 15 minutos)

9 CONTROL SIN TRATAMIENTO

Una vez aplicado el tratamiento, INCUBAR LOS TUBOS y realizar las lecturas a las 24-48horas. Reportar los resultados como crecimiento bacteriano +; -; +-

II) ANTIBIOGRAMA

1. Preparar el inóculo._ Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra Xcolonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inóculodebe equivaler al estándar 0.5 de McFarland.

Los patrones de Mc Farland se utilizan como patrones de turbidez en la preparación de suspensionesde microorganismos. El patrón 0.5 tiene una aplicación especial en la preparación de inóculosbacterianos para la realización de pruebas de sensibilidad. La fórmula aproximada de preparaciónaproximada para este patrón por cada 10ml de agua purificada es (9.95 ml de Acido sulfúrico 1% +0.05ml de cloruro de bario 1%) y es equivalente a una concentración bacteriana de 1.5 x 10

8 UFC /ml

2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasándolo uniformemente portoda la superficie en tres direcciones. Por último, pasar el hisopo por el reborde de laplaca de agar. Dejar secar 5 minutos.

3. Colocar los discos impregnados del agente químico o la concentración de antibiótico(5µl) correspondiente sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estériles yapretándolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar amenos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos paraque no se superpongan sus zonas de inhibición. Dejar las placas 15 minutos atemperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibióticos.

4. Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18-24 horas.5. Medir los diámetros de los halos de inhibición con una regla.

DESINFECTANTES:

Agujero No. SUSTANCIA

1 Cloro

2 Amonio cuaternario

3 Alcohol 70º

4 Agua destilada(control)





ANTIBIÓTICO: Gentamicina a diferentes concentraciones

Agujero No. SUSTANCIA

1 Gentamicina 40 ppm

2 Gentamicina 80 ppm

3 Gentamicina 160ppm

4 Agua destilada estéril(control)

5. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIÓN

1. Escribir el concepto y un ejemplo de desinfectantes de actividad alta, media y baja.

2. Cuál es la diferencia entre: bacteriostático, bacteriolítica, bactericida.

3. Describir el mecanismo de acción de la gentamicina sobre el crecimiento bacteriano.

4. qué es la validación de un desinfectante? cómo se realiza?

6.BIBLIOGRAFÍA

- Maturin, L. y Peeler, J.T. (1998) Bacteriological Analytical Manual, Edition 8, Revision A. Chapter 3

- Solano C. (2006) Microbiología de alimentos (Guión de prácticas). Universidadautónoma de Navarra. Disponible enhttp://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf

7. REGISTRO DE DATOS

http://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf

http://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf





AGENTES FÍSICOS

TUBONo.

AGENTE FISICO PROCESO RESULTADO

1 EBULLICION ebullición por 1 minuto2 Someter a ebullición por 10

minutos3 PASTEURIZACIÓN 65ºC 30 minutos + baño de

hielo4 90ºC 15 segundos, baño de

hielo5 CONGELACION Congelación 24H6 REFRIGERACION Refrigeración 24H7 CALOR SECO

(ESTUFA)1 hora a 160ºC

8 CALOR HUMEDO(AUTOCLAVE) 12ºC, 15 minutos

AGENTES QUÍMICOS

DESINFECTANTES:

AgujeroNo.

SUSTANCIA Halo de inhibición(mm)

12

34

ANTISEPTICOS Y ANTIBIÓTICOS:

Agujero No. SUSTANCIA Halo de inhibición(mm)

1 Gentamicina 20ppm2 Gentamicina 40ppm3 Gentamicina 80ppm4 Control




MATERIA: MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Práctica Nº 2

MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIÓNDE ALIMENTOS

CADA GRUPO DEBE TRAER LAS MUESTRAS DESIGNADAS y deberán sertraídas en un recipiente con control de temperatura - coolers a temperatura de

refrigeración en frascos estériles (frascos de vidrio -gatorade- limpios ysometidos a un proceso de desinfección por ebullición que se puede hacer encasa).

- TRAER ADEMÁS POR GRUPO UN ENVASE TETRAPACK DE LECHEDESCREMADA UHT TOTALMENTE SELLADO - NUEVO (LAPRESENTACIÓN MÁS PEQUEÑA – 100 o 200ml)

LAS MUESTRAS DE ALIMENTO NO DEBEN SER COMPRADOS EN

SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDADSINO DEBEN CONSEGUIRSE EN MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DEALIMENTOS DE PREFERENCIA EN FORMA ARTESANAL

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIÓN DE ALIMENTOS

1. OBJETIVOS:

Determinar el número de microorganismos (UFC/ml-g) proteolíticos y psicrófilos,totales en diferentes muestras de alimentos.

Conocer el número de microorganismos anaerobios totales de diferentes muestras dealimentos fermentados.


La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligropara el consumidor o una calidad inferior de estos productos. A excepción de un reducidonúmero de productos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas,mohos, bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se convierten enpotencialmente peligrosos para el consumidor sólo después de que han sido violados losprincipios de higiene, limpieza y desinfección. Si los alimentos han estado sometidos acondiciones que pudieran haber permitido la llegada a los mismos y/o la multiplicación deagentes infecciosos o toxigénicos, pueden constituirse en vehículo de transmisión deenfermedades, tales como la salmonelosis o la intoxicación estafilocócica. La puesta enevidencia de estos riesgos se basa en el examen de muestras de alimentos en busca de lospropios agentes causales o de indicadores de una contaminación no admisible. Se denominanmicroorganismos alterantes a aquellos que son responsables del deterioro y cambios en loscaracteres sensoriales de los alimentos.

Para la conservación de alimentos con calidad óptima hasta su consumo, se debe impedir eldeterioro de su valor biológico, nutritivo y organoléptico. El mantenimiento de la higiene en unaplanta elaboradora de alimentos es una condición esencial para asegurar la inocuidad de susproductos. En cada etapa de la cadena alimentaria, desde la producción primaria hasta elconsumo, es necesario aplicar prácticas higiénicas eficaces.

En alimentos como carnes, leche, frutas y verduras, pueden desarrollarse microorganismospatógenos, (Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa). Las medidas de prevención debenevitar que los alimentos frescos (leche, carnes) sean vehículo de los microorganismosmediante un adecuado control (pasteurización de la leche, higiene en la obtención de lascarnes, estricto control en la elaboración de jugos). Debe vigilarse la contaminación exógena

de los alimentos frescos y la recontaminación de los ya procesados. La presencia demicroorganismos alterantes y patógenos puede explicarse por la aplicación incorrecta en lasindustrias de programas de limpieza-desinfección de las superficies y materiales en contactocon la materia prima y el producto elaborado.

Los alimentos perecederos, como las carnes, huevo, pescado, leche, frutas y vegetales, sondeteriorados más rápidamente por los microorganismos y requieren más cuidado en sumanejo y almacenaje. Los alimentos semiperecederos, como las papas, manzanas, semantienen por más tiempo sin mostrar deterioro, a menos que los manejen inadecuadamente.Los alimentos estables o no perecederos, como la harina, azúcar, alimentos secos,generalmente no son deteriorados por microorganismos bajo condiciones apropiadas dealmacenaje.





MICROORGANISMOS MESÓFILOS:

La temperatura óptima de crecimiento de los organismos mesófilos oscila entre los 40 y 50 ºC(generalmente es de 37 ºC). Según su capacidad para atacar a los hidratos de carbono

pueden ser de dos tipos: proteolíticos o putrefactivos y sacarolíticos. Los primeros soncausantes de alteraciones gaseosas con degradación del alimento y producción decompuestos de olor desagradable. Éstos son más importantes en los alimentos de acidez bajay media, excepto en el jamón york enlatado, en el cual se producen alteraciones de tiposacarolítico causadas por C. perfr ingens . Destacan C. hysto lyt icum , C. spor ogenes y C.

bifermentans . Entre los de tipo sacarolítico los más frecuentes son C. butyr icum, C.pasteurianum, C. perfr ingens y otros.

MICROORGANISMOS PSICRÓFILOS

En alimentos refrigerados y congelados se encuentran en número predominante losmicroorganismos psicrófilos y psicrotróficos, tanto bacterias como mohos y levaduras. Se ha

encontrado que bacterias psicrotróficas causan alteración de pescado congelado, productosmarinos frescos empacados al vacío, frutas frescas cortadas, leche refrigerada. Este tipo demicroorganismos producen reacciones proteolíticas y lipolíticas provocando la alteración dealimentos almacenados a baja temperatura, produciendo pérdida de productos.

MICROORGANISMOS PROTEOLÍTICOS

Las bacterias proteolíticas pueden descomponer los alimentos al degradar las proteínas yliberar productor indeseables. El recuento de estos microorganismos se lo realiza sembrandolas muestras por vaciado en placa, en un medio que contiene leche descremada que posee laproteína caseína. Los microorganismos capaces de usar la caseína son reconocidos comoproteolíticos

Las bacterias proteolíticas producen hidrólisis de las proteínas, transformando la caseína encompuestos solubles de nitrógeno, alterando el sabor y la textura de los productos

Las especies proteolíticas presentan la peculiaridad de que pueden desdoblar las moléculasnitrogenadas de mayor tamaño en los alimentos. De este modo, estas especies de bacteriasposibilitan la existencia y proliferación de otras especies no proteolíticas o débilmenteproteolíticas que utilizan el nitrógeno de los compuestos de degradación originados por elataque de las proteínas.

ANAEROBIOS

Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de cantidadessignificativas de oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, portanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativasmueren cuando son expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado deresistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Las esporas bacterianas noson afectadas por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasaproporción de agua en su composición.La sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una especie a otra. Se distinguenbacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados.Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como elatmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%.

Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones brevesal oxígeno atmosférico, se desarrollan óptimamente en condiciones anaerobias.Los anaerobios estrictos no toleran el oxígeno y mueren en su presencia por tanto sólo se





desarrollan en condiciones anaerobias.

Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustanciasorgánicas son los aceptores finales de electrones, aunque también pueden obtener energía a

partir de la respiración anaerobia. Otras características comunes a los microorganismosanaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad,lo cual, sumado a sus requerimientos atmosféricos estrictos (de O2 y CO2) hace que suaislamiento sea difícil; además, al ser la mayoría de las infecciones mixtas (aerobios yanaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento más rápido puedencrecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias.

Las bacterias anaerobias están diseminadas en la naturaleza. La mayoría de las bacteriasanaerobias que causan infecciones en humanos son parte de la flora normal de piel ymucosas, superando en cantidad a las bacterias facultativas en el intestino por un factor de1000:1, mientras que en piel, boca, vías aéreas superiores y tracto genital inferior femenino larelación anaerobios-facultativos es de 5-10:1. Otros patógenos anaerobios como Clostridium

botulinum y Clostridium tetani se encuentran en suelos y no son considerados parte de la florahumana.

El género Clostridium está formado por más de cien especies con limitada relación genética ypropiedades bioquímicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios,esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales así comotambién en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayoría son saprofitos, pero lospatógenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, tétanos,infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibióticos e intoxicacionesalimentarias. La capacidad para provocar enfermedad está vinculada a la posibilidad desobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formación de esporas, crecerrápidamente y producir toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotoxinas.

SULFITORREDUCTORES

Este grupo de microorganismos se caracterizan por ser esporulados, anaerobios. Puedenproceder del intestino del hombre o de los animalesSe trata de FORMAS ESPORULADAS = forma de resistencia que no es indicativo decontaminación reciente. No tiene interés para indicar contaminación fecal, nos indicandeficiencias higiénicas por contaminación telúrica.

Pseudomonas

Las bacterias del grupo al que pertenecen las Pseudomonas están constituidas pormicroorganismos Gram-negativos, móviles con flagelación polar. Se encuentran normalmenteen el suelo, aunque pueden ser patógenos oportunistas en animales (P. aeruginosa) ypatógenos de plantas (P. syringae). Su metabolismo es siempre respiratorio, o bien aerobio (lamayoría usa como aceptor de electrones O2) o anaerobio (algunos usan NO-).

Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Estos pigmentos actúan como sideróforos: moléculascuya función es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo delmicroorganismo

Actividad como patógenos vegetales: La especie P. syringae es un verdadero parásito

vegetal. Las especies del género Xanthomonas también son en su mayoría patógenosvegetales.





Actividad como agentes alterantes de alimentos: Las Pseudomonas son el grupo debacterias más frecuente en los alimentos frescos. Debido a su gran potencial metabólico, lasbacterias de estos grupos son agentes importantes en la alteración de alimentos. Sinconsiderar los aspectos de deterioro de vegetales producidos por diferentes especies de este

grupo. Las Pseudomonas son uno de los principales géneros responsables de la alteración deproductos cárnicos almacenados incorrectamente en condiciones de aerobiosis. Algunasbacterias del grupo son psicrófilas por lo que la alteración de los alimentos que producentambién tiene lugar durante la conservación en refrigeración. Cuando piezas de alimentoscárnicos son conservadas en refrigeración en ambientes impermeables al gas o en vacío, lasPseudomonas pueden producir H2S que reacciona con la hemoglobina dando lugar a laaparición de manchas verdes.

Deterioro de vegetales:Los mayores causantes de deterioro son las bacterias del género Erwinia y algunasPseudomonas que producen pectinasas capaces de romper la capa exterior de los vegetalesy colonizar así los tejidos internos.

Deterioro productos cárnicos:En las canales se puede producir deterioro superficial debido a hongos y a levaduras; sinembargo, en carnes procesadas, picadas, el deterioro es debido a bacterias del grupo dePseudomonas, Acinetobacter , Moraxella únicamente.

En el caso de filetes o piezas cortadas conservadas a baja temperatura, el deterioro puedeproducirse por bacterias u hongos dependiendo de la humedad ambiental (bacterias a altahumedad).

El crecimiento de bacterias (sobre todo Pseudomonas) puede detectarse primero por laaparición de colonias discretas, luego mal olor y luego un capa de limo que cubre la pieza yque se produce por la coalescencia de las colonias.

Deterioro de carnes envasadas y otros productos:La formación de limo tiene lugar en la superficie y se debe predominantemente a las bacteriaslácticas; el agriado ocurre bajo la superficie y es consecuencia de la actividad de las bacteriaslácticas sobre productos que contengan lactosa. La formación de color verde se debe a laproducción de peróxidos o de H2S por algunas bacterias y tiene lugar en el interior de laspiezas.

El enverdecimiento producido por peróxidos es debido a bacterias lácticas, y el producto verdeno es peligroso desde el punto de vista toxicológico. El enverdecimiento debido a H2S se

produce por una reacción con la hemoglobina causada por Psedomonas o algunas bacteriaslácticas.

Deterioro de productos lácteos:El deterioro de leche no pasteurizada se produce rápidamente debido a su alta cargamicrobiana. En la pasteurizada el deterioro se debe a estreptococos termorresistentes.

En el caso de mantequilla el deterioro se puede producir como putrefacción debido aPseudomonas putrefaciens o por enranciamiento debido a actividades lipolíticas de algunasbacterias de tipo Pseudomonas o bacterias lácticas; aunque el deterioro más frecuente de lamantequilla es el producido por hongos.

Tanto en el caso de bacterias como en el de hongos, el deterioro puede iniciarse incluso antesde la recolección y se ve favorecido por cualquier circunstancia que altere la integridad físicadel vegetal (porque así se permite la entrada de los microorganismos al interior).





MOHOS

Los hongos son microorganismos eucariontes heterotróficos que poseen una estructura muypoco diferenciada llamada talo. La complejidad de esta estructura es muy variable. Loshongos se reproducen asexualmente mediante formación de esporas o yemas; algunoshongos también producen esporas sexuales no para reproducirse sino como medida deprotección.

En comparación con las bacterias, los hongos son de mayor tamaño, forman estructuras máscomplejas y sus células poseen núcleo. Son microorganismos aeróbicos y generalmentecrecen más lentamente que las bacterias. Se desarrollan formando estructuras filamentosasdenominadas micelio que son fáciles de ser detectadas visualmente. Tienden a crecer en elintervalo mesófilo o psicrotrofo. Generalmente toleran condiciones ácidas y osmóticas.

Los mohos invaden con rapidez cualquier sustrato, gracias a su eficacia en la diseminación,un crecimiento rápido y a que poseen una rica carga enzimática.

Mohos como alterantes de los alimentos

La alteración de los alimentos por mohos se debe a las modificaciones que estos producendurante su desarrollo. Toman del sustrato todos los elementos que les son necesarios parasus procesos vitales, transformándolos gracias a sus múltiples sistemas enzimáticos.

Las reacciones producidas en los alimentos como consecuencia del metabolismo de loshongos se pueden concretar en:

o Hidrólisis de polisacáridos estructurales (sustancias pécticas,hemicelulosas, celulosas) o reserva (almidón), por medio de enzimashidrolíticas (celulosas, amilasas, etc.)

o Hidrólisis de proteínas, por proteinasaso Hidrólisis de las grasas, por lipasaso Reacciones de oxido-reducción, realizadas por medio de oxidasas,

peroxidasas, deshidrogenasas, etc.

Las modificaciones químicas producidas en los alimentos por los mohos se traducen enalteraciones del valor nutritivo o de sus características sensoriales, en dificultades deconservación y a veces en enfermedades (micosis, alergias) e intoxicaciones (micotoxinas)

LEVADURAS

Los cambios indeseables producidos por las levaduras que contaminan los alimentos semanifiestan de dos formas:Una puramente estética, debido a la presencia física de levaduras (turbidez o formación depelículas en la superficie de los líquidos).Otra, más profunda, resultado del metabolismo de las levaduras que puede provocarmanifestaciones tales como: aumento de pH, aromas particulares, etc.Las levaduras para su crecimiento necesitan oxígeno, fuentes orgánicas de carbono ynitrógeno mineral u orgánico, diversos minerales, además de varias vitaminas y otros factoresdel crecimiento.

Utilizan numerosos sustratos carbonatados, bien por vía oxidativa únicamente o, como pasaen la mayoría de los casos, por vía fermentativa, después de una fase inicial del crecimientoaeróbico





La presencia de una cantidad de levaduras y mohos no es deseable en los alimentos, exceptoen los quesos madurados por mohos.

Pese a lo expuesto anteriormente, es importante recalcar que algunos hongos sonbeneficiosos ya que se utilizan en fermentaciones de alimentos. La levadura Saccharomycescerevisiae se usa en panadería y en fermentaciones alcohólicas; los mohos: Penicillium spp.participa en la maduración de los quesos Camembert y azules y Mucor spp. es la fuente delcuajo microbiano

3. MATERIALES

balanza incubadora botella y tubos con agua peptonada pipetas placas petri contador de colonias Agua peptonada Agar PCA Agar MRS Agar Pseudomonas F Agar Saboraud Cristal Violeta Azul de Lactofenol

4. MÉTODO

I. PROTEOLITICOS VIABLES Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente Prepare las diluciones hasta 10-4

Asépticamente deposite alícuotas de 1ml cada dilución en su placa correspondiente(10-2, 10-3, 10-4 )

Añada 2ml de leche descremada estéril a cada placa. Añada a cada placa medio fundido PCA (50ºC) Homogenice las placas en el agitador, dejar solidificar Prepare una placa testigo del medio sin muestra (medio + leche), divida en dos

sectores y en uno de ellos siembre E. coli – esta placa servirá como testigo Incube las placas a 37ºC entre 24 – 48 horas Revelar la presencia de microorganismos proteolíticos, adicionando a las placas una

solución de HCl al 1% o ácido acético al 1%, dejar por 1 minuto, vaciar el exceso deácido, lavar con agua corriente.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación realice el conteo solo de las coloniasproteolíticas (las que muestren un área clara alrededor, por degradación de lacaseína), compare con la placa testigo

Determine el número de bacterias proteolíticas / g de muestra





II. PSICROTROFICOS VIABLES Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente Prepare las diluciones, 10-1 ,10 -2 y 10-3 Inocular por la técnica de vertido Añadir el agar PCA temperado y homogenizar. Incubar 5 días / 5ºC Reportar los resultados.

III. ANAEROBIOS Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente Prepare las diluciones, 10-2 ,10 -3 y 10-4 Inocular por la técnica vertido. Añadir el agar PCA temperado y homogenizar Incubar en la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a 37ºC o en su defecto aplicar la

técnica de “sandwich” que consiste en añadir una capa de agar virgen a la placa en la

que se ha sembrado por vertido una vez que el agar ha solidificado.

IV. RECUENTO DE Pseudomonas

Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente Preparar diluciones, 10-1 , 10 -2 y 10-3 Inocular por la técnica de EXTENSIÓN o superficie, 0.1 ml de cada dilución en las

placas Petri con Agar Pseudomonas F Incubar 24H – 30ºC Contar las colonias típicas de Pseudomonas.

Si no hay crecimiento a las 24H dejar 24H más de inoculación.

Identificación:

Observar la producción de fluorescencia en las colonias de las placas en las que se reportecrecimiento

V. MOHOS Y LEVADURAS

Recuento:

Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente Preparar las diluciones, 10-1 ,10 -2 y10-3 Inocular por la técnica de vertido en placas Petri Añadir el agar Saboraud + 40ppm gentamicina y homogenizar. Incube las placas boca arriba a 25ºC durante 3 – 5 días Reportar los resultados.

Identif icación:

Levaduras

1. Recoja a partir de cualquier placa tres colonias de levaduras, representantes de

diferentes morfologías. Transfiera una porción de colonia a una gota de agua sobre unportaobjeto

2 Realice un frotis con la muestra (extensión secado fijación)





3. Haga una tinción simple (cristal violeta por 60 segundos)4. Examine las células utilizando en lento con aceite de inmersión (100x). Dibuje la

morfología celular de las levaduras

Mohos

1. Coloque una gota del colorante azul de lactofenol en un portaobjetos2. Toque suavemente la superficie de una colonia de moho con la parte adhesiva de un

pedazo de cinta. Coloque la cinta en la gota de colorante.3. Examine el portaobjeto al microscopio. Dibuje la morfología del moho. Si la tinción ha

sido correcta se puede observar el micelio y las estructuras reproductoras.4. Compare sus observaciones con cada una de las especies indicadas en el manual de

hongos5. Repita estos pasos en tres colonias de mohos de distinta morfología


1. Qué composición tiene el agar tributirina que permite el crecimiento demicroorganismos lipolíticos?

2. Escribir dos ejemplos de microorganismos del grupo de sulfito reductores, indicar elmedio de cultivo que se utiliza para su recuento.

3. Las bacterias alterantes de alimentos pueden comportarse como patógenosoportunistas?

4. Cuál es el procedimiento para la identificación de hongos por la clave de Barnet?

5. Por qué se añade gentamicina al agar Saboroud para el aislamiento y recuento demohos y levaduras?

6. Señalar tres medios de cultivo para el recuento y aislamiento de hongos y comparar sucomposición química.

6.BIBLIOGRAFÍA

- González-Velásquez, G.H. y Holguín.-artínez, G. (1990) Manual sobre técnicasmicrobiológicas. Universidad de Antioquia. Colombia

- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Pérez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prácticas.Laboratorio Microbiología General. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana.

- Olives E., Alarcón L. (2004) Manual de prácticas de microbiología básica yMicrobiología de Alimentos. Universidad de Juarez


DESCRIPCIONDE LA MUESTRA





DATOS GENERALES

Muestra

Condiciones de conservaciónNombre y lugar del expendedor

Fecha y hora de toma de lamuestra.

Responsable de muestreo

CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS

Consistencia

Olor

Color

TRANSPORTE DE LA MUESTRA Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______

Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hastael análisis:

CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA

Proceso tecnológico al que fuesometido

ANALISIS REALIZADO

DATOS GENERALES

Muestra

Condiciones de conservación

Nombre y lugar del expendedor

Fecha y hora de toma de lamuestra.

Responsable de muestreo

CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICASConsistencia

Olor

Color

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______

Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hastael análisis:

CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA

Proceso tecnológico al que fuesometido





ANALISIS REALIZADO

1.1. RECUENTO DE MICROORGANISMOS PROTEOLITICOS VIABLES

DILUCION No. colonias Resultado

PROMEDIORESULTADO No. UFC / g de muestra

1.2. RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTROFICOS VIABLES



1.3. RECUENTO DE MICROORGANISMOS MOHOS Y LEVADURAS



1.4. RECUENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS


PROMEDIORESULTADO UFC / g de muestra

REPORTE DE RESULTADOS

ANALISISSOLICITADO

METODO DE ANALISIS

RESULTADO VALORESREFERENCIALES

NORMA





*Análisis solicitado: colocar los ensayos realizados en el laboratorio*Metodo de análisis: el nombre del método aplicado*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES

*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES*Norma: nombre o número de la norma. Si se consulta en normas que no constan en ellaboratorio, debe adjuntarse el documento en el informe.





MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS AALIMENTOS (E. coli y B. cereus )

CADA GRUPO DEBE TRAER LAS MUESTRAS DESIGNADAS y deberán sertraídas en un recipiente con control de temperatura - coolers a temperatura derefrigeración en frascos estériles (frascos de vidrio -gatorade- limpios ysometidos a un proceso de desinfección por ebullición que se puede hacer encasa).



SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDADSINO DEBEN CONSEGUIRSE EN MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DEALIMENTOS DE PREFERENCIA EN FORMA ARTESANAL






MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS AALIMENTOS (E. coli y B. cereus )

1. OBJETIVOS:

Realizar el recuento aislamiento e identificación de E. coli y B. cereus en diferentesmuestras de alimentos

Comparar los resultados obtenidos con las normas de requisitos microbiológicosrespectivos.


Las Enfermedades transmitidas por Alimentos (ETAS) se definen como cualquierenfermedad causada por la ingestión de un alimento contaminado que produce efectosnocivos en la salud del consumidor. Estos trastornos físicos son provocados por el consumode alimentos y de agua contaminados con células de bacterias patógenas viables (o esporas)o de alimentos que contienen toxinas producidas por bacterias y mohos toxigénicos

El control de alimentos y bebidas se basa en dos pilares: la inspección y el análisis delaboratorio. El análisis microbiológico, se utiliza para establecer si el agua o alimento esinocuo y tomar decisiones acertadas para proteger la salud pública; haciéndose necesaria unaadecuada interpretación y análisis de resultados, para poder brindar soluciones frente adeterminados problemas de la industria y ofrecer seguridad al productor y consumidor final.

Indicadores microbiológicos: ColiformesLas bacterias coliformes son aerobias o facultativas anaerobias, gram negativas, noformadoras de esporas, tienen forma bacilar y fermentan la lactosa con la producción de ácidoy gas en 48 horas a 35 grados centígrados.

Las reacciones bioquímicas y la morfología de las células es similar a la de Escherichia coli para todos los miembros de este grupo.

Se diferencian de otros grupos de microorganismos por su capacidad de crecer en mediosque contienen sales biliares (o agentes selectivos equivalentes) y por la utilización de lalactosa como fuente de carbono con la producción de ácido y gas en 48 horas a 35 grados

centígrados. La fermentación de la lactosa se da independientemente de la presencia oausencia de sales biliares que son usadas para inhibir el crecimiento de microorganismos noentéricos.

Coliformes fecales: coliformes de origen fecal que pertenecen al grupo anterior y que, ademásson capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44°C en un tiempomáximo de veinticuatro horas.

Escherichia coli : bacterias coliformes generalmente indol positivas, citrato negativas, rojo demetilo positivas, no producen acetilmetilcarbinol y son capaces de fermentar la lactosa conproducción de ácido y gas entre 37°C y 44°C en un tiempo máximo de veinticuatro horas.

El hallazgo de gran número de organismos en los alimentos y en el agua indica la polución ocontaminación fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son decarácter intestinal la presencia de polución indica la posibilidad de que existan agentes





etiológicos productores de estas enfermedades.

Los coliformes comprenden tres géneros: Escherichia, Klebsiella y Enterobacter . Sonhabitantes comunes del tracto intestinal por lo que su presencia en los alimentos puede indicar

una contaminación fecal, suelen ser considerados microorganismos indicadores. Sin embargolos coliformes que se encuentran en los alimentos pueden tener un origen fecal o no por loque el recuento de coliformes debe interpretarse con mucha cautela. La presencia decoliformes no tiene necesariamente relación con una contaminación de origen fecal yconsiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenosde procedencia entérica, sino que es sólo una indicación de deficiencias o fallos en eltratamiento industrial de los alimentos.

Se utiliza a veces también la denominación "coliformes fecales" refiriéndose a losmicroorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contienesales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 °C.

Hay tres fases para el análisis de coliformes en agua y alimentos:

a) Prueba presuntiva: Estima el recuento presuntivo de coliformes ya que puedenenumerarse también las colonias que son similares a las de coliformes. Si un recuentopresuntivo de coliformes es bajo, el analista puede considerar que el producto esaceptable en relación con esta prueba y puede decidir no realizar más análisis. Encaso de recuentos elevados debe pasar al segundo nivel analítico

b) Prueba confirmativa: Se realiza para confirmar el recuento obtenido en el testpresuntivo. Si la prueba presuntiva se basó en la detección del gas producido por lasbacterias fermentadoras de lactosa, la prueba confirmatoria puede implicar ladetección de la formación de ácido en condiciones más selectivas

c) Prueba concluyente – complementaria: puede estar destinada a comprobar si loscoliformes encontrados son o no de origen fecal o para comprobar que E. coli estárepresentado entre los microorganismos del recuento confirmado de coliformes

Contaminación del agua

La contaminación es un proceso de alteración o de modificación más o menos importante delos equilibrios físicos, químicos o biológicos del agua que son responsables de su calidad y lahacen inadecuada para sus numerosos usos y aplicaciones. Dicha contaminación puede tenerdos orígenes: químico o microbiológico. El agua natural constituye un reservorio demicroorganismos autóctonos (Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus) o exógenos (Escherichiacoli, Enterococcus). El agua recibe y arrastra partículas cargadas de bacterias, por lo que en

cercanías de las grandes poblaciones incluso el agua de lluvia es portadora de un elevadonúmero de microorganismos.

El análisis microbiológico por recuento de bacterias indicadoras de contaminación fecal enaguas es de suma importancia al evaluar el estado sanitario del sistema en estudio. Debido aque la concentración de microorganismos en el agua habitualmente es baja, su deteccióndirecta es complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son defácil detección y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia que excede alde los patógenos en ese ambiente.

Dentro de los métodos de recuento de bacterias se encuentran dos que son los másampliamente utilizados: la técnica de Número Más Probable (NMP) y la técnica de recuento en

placa. Con la primera sólo se obtiene una estimación de la población de microorganismoscontenidos en una muestra, no proporcionando una enumeración precisa. Cuando lapoblación es muy elevada, el recuento en placa supera en precisión a este método. Por el





contrario en poblaciones bajas (menos de 10 células por mL) es más eficaz la técnica de NMPporque permite la utilización de muestras de mayor tamaño.

Procedimiento de m uestreo p ara anális is m icrobio lógico d e agua:

Para tomar muestras para un análisis microbiológico de agua se debe contar con lossiguientes materiales:1. Alcohol 70º2. Guantes3. Botella estéril (*)4. Gel-pack o hielo (cooler, hielera)(*) Si no se cuenta con botella estéril, se pueden esterilizar las botellas con tapas en unrecipiente con agua hirviendo durante 20 minutos a baño térmico.

Procedimiento de toma de muestra:1. Se procede a rociar con abundante cantidad de alcohol la llave de la cual se va a tomar la

muestra. Si es una manguera, el alcohol se rocía desde la punta hacia dentro de la

manguera. Si la muestra es de un estanque, laguna, río o mar, se omite este procedimiento.2. Se rocían las manos con guantes con gran cantidad de alcohol.3. Se abre la llave y se deja correr gran cantidad de agua por lo menos por 30 segundos.4. Se abre la tapa de la botella estéril y se llena la botella con la muestra de agua a analizar.

No se debe rebalsar de agua la botella de muestreo.5. Se tapa rápidamente la botella.6. Se refrigera la muestra entre 2 a 6 ºC o se almacena en cooler con gel-pack o hielo, por no

más de 24 horas antes del análisis.

Rotulado de la muestra:Cada frasco llevará un rótulo donde se hará constar el Nombre del establecimiento, No. degrifo dentro del plano presentado; lugar de toma de muestra, fecha, hora, responsable de laextracción y todo otro dato importante para su identificación.

Acondicionado y Transporte de la Muestra:La muestra debe estar debidamente acondicionada con hielo o conservadores de frío y serealizará lo más rápido posible su análisis. Se recuerda que con una adecuada refrigeraciónse evita la reproducción de bacterias, de allí su importancia.No se debe congelar la muestra.Chequear la debida identificación de todos los envases antes de analizarlos.La muestra debe llegar al Laboratorio lo antes posible (menos de 1 (un) día a partir delmuestreo).

Baci l lus cereus

Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo suhábitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremaspasteurizadas y especias, entre otros alimentos.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas poralimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios más difundidos en laactualidad. Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados ocontaminados por este microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que sonperfectamente evitables; la primer descripción de un brote de gastroenteritis data de principiosde 1900.

Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la toxinadiarreica y la toxina emética que dan lugar a dos formas clínicas distintas de intoxicación





alimentaria. Los síntomas de la toxicoinfección tienen dos formas de presentación conpresencia de diarrea, dolores abdominales y vómitos. Su período de incubación varía de 4 a16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.

La resistencia térmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de aguavuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicación, si lasmedidas higiénico sanitarias y de elaboración no son las adecuadas.

La intoxicación alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidossin la adecuada refrigeración durante horas antes de ser servidos. El consumo de alimentosque contienen 105 B.cereus/g o más puede provocarla. Los alimentos vinculados a brotes hansido carne y verduras cocidas, arroz frito o hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes devegetales crudos.

El síndrome emético está producido por una toxina preformada y termoestable, al igual que lade S.aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado, tiene un período de

incubación corto, habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los síntomas gastrointestinalesaltos manifestados por náuseas y vómitos. Este hecho ha llevado a confundir la intoxicaciónpor B.cereu y atribuirla a S.aureus. El síndrome diarreico por el contrario, está producido por laingestión de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulación delorganismo in vivo y de la producción de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada ytermolábil tiene un período de incubación más largo que promedia entre 10 y 12 horas y lasmanifestaciones se relacionan con la afectación gastrointestinal baja similar a la intoxicaciónpor Clostridium perfringens

Los síntomas son dolor abdominal, diarrea acuosa profusa, tenesmo y nauseas quegeneralmente duran 12-24 hrs. y en algunos pacientes pueden durar más tiempo, de 2 a 10días. La intoxicación alimentaria por Bacillus cereus es autolimitada y no requiere tratamientoantimicrobiano, el tratamiento es sintomático y ocasionalmente es necesario rehidratación.

3. MATERIALES

tubos para diluciones (con diluyente) pipetas estériles tubos con BGBL con campana de Durham pera gradilla BGBL EMB Pruebas bioquímicas: RM, VP, Indol y Citrato Asas y agujas de inoculación Caldo lactosado Frasco y tubos con diluyente Agar MYP

Equipos:

Vortex Balanza

incubadora





4. MÉTODO

Preparación de diluciones

- Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente- Preparar diluciones, 10-1 , 10 -2 y 10-3 utilizando los tubos con 9 ml de

diluyente

Recuento de bacterias del grupo coliforme según la técnica de NMP

I) COLIMETRÍA PRESUNTIVA1- Disponer de 1 serie de tres tubos con 9 mL cada uno de Caldo BGBL (Bilis Lactosa

Verde Brillante). Todos deben poseer en su interior una campana de Durham.2- Realizar tres diluciones sucesivas de la muestra.3- Sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de los tubos.

4- Incubar los tubos durante 24 horas a 37°C.5- Contar los tubos que posean gas en el interior de la campana de Durham. Dichos

tubos serán considerados positivos.6- Buscar en la tabla el NMP de bacterias coliformes totales/100 mL de muestra.

En caso de NO encontrar tubos positivos dejar las muestras 24 horas más deincubación.

II) COLIMETRÍA CONFIRMATIVA1. De los tubos positivos de la colimetría presuntiva sembrar por estriado en Agar EMB.2. Incubar 24 horas a 37ºC.3. Ver colonias aisladas y sospechosas de E. coli. 4. Realizar una tinción Gram de estas colonias.

III) COLIMETRÍA COMPLEMETARIA1. A las colonias aisladas y sospechosas de E. coli resembrar en agar Mac Conkey e

incubar a 37ºC durante 24 horas.2. De estas últimas realizar las pruebas de IMViC: Indol, Rojo Metilo, Voges-Proskauer,

Simmons citrato. Para ello preparar tubo de Caldo nutritivo, RM-VP y Simmons citrato.3. Incubar 24 horas a 37ºC.4. Leer resultados.

Baci l lus cereus

RECUENTO

1. Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente2. Hacer diluciones, 10-1 , 10 -2 y 10-3 3. Inocular por la técnica de EXTENSION 0,1 ml de cada dilución en las placas Petri con

agar MYP.4. Incubar 24h – 37ºC5. Contar las colonias típicas de B. cereus

IDENTIFICACIÓN

1. Realizar tinción coloración Gram

2. Realizar tinción de esporas3. Resistencia al NaCl y consumo de manitol: resembrar en Agar Sal y Manitol, incubar

24H/37°C Leer los resultados





4. Licuefacción de la gelatina: sembrar por picadura en agar gelatina, incubar 24H/37°C,retirar de la incubadora y colocar 30 minutos en la heladera. Si el medio se mantienelíquido el resultado es positivo, caso contrario es negativa la licuefacción de la gelatina.

5. Hidrólisis del almidón: hacer una estría en una placa con agar almidón, incubar

24H/37°C. añadir unas gotas de lugol para revelar la presencia de almidón alrededorde la estría, si se tiñe de color morado alrededor de la estría es un resultado negativodebido a que la bacteria no consumió el almidón.


1. Cuál es la diferencia entre colonias manitol + y manitol - en agar MYP?

2. Cuál es la diferencia entre indicador e índice microbiológico?

3. Cómo se identifica la E. coli H7 O157?

4. Qué significado tiene la H y la O de la clasificación bacteriana?

6.BIBLIOGRAFÍA

- Apella y Araujo (sin fecha). Solar safe water. Microbiología del agua. Conceptosbásicos. En línea: www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm

- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Pérez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prácticas.Laboratorio Microbiología General. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana.

- Anónimo. (sin fecha). Manual de Microbiología. Departamento de Microbiología yGenética. Universidad de Salamanca.


E. coli

Descripción de la muestra

DATOS GENERALESMuestraCondiciones de conservaciónNombre y lugar del expendedorFecha y hora de toma de lamuestra.Responsable de muestreoCARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICASConsistenciaOlorColor

TRANSPORTE DE LA MUESTRA Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta

http://www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm








el análisis:CARACTERISTICAS DE LA MUESTRAProceso tecnológico al que fuesometido

ANALISIS REALIZADO

COLIMETRÍA PRESUNTIVA (NMP):Combinación de tubos positivosNMP =

COLIMETRÍA CONFIRMATIVA:Características de las colonias (Agar Mac Conkey):

COLIMETRÍA COMPLEMENTARIA:

PRUEBA RESULTADOProducción de IndolUso del citratoRojo metiloVoges Proskauer

Baci l lus cereus


DATOS GENERALES

MuestraCondiciones de conservaciónNombre y lugar del expendedorFecha y hora de toma de lamuestra.Responsable de muestreoCARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICASConsistenciaOlorColorTRANSPORTE DE LA MUESTRA

Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hastael análisis:CARACTERISTICAS DE LA MUESTRAProceso tecnológico al que fuesometido ANALISIS REALIZADO

Recuento







REPORTE GENERAL DE RESULTADOS

ANÁLISISSOLICITADO

MUESTRA MÉTODODE ANÁLISIS


NORMA

Coliformes

totalesColiformesfecalesE. coli

B. cereus

*Metodo de análisis: el nombre del método aplicado*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES*Norma: nombre o número de la norma.





MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS AALIMENTOS

CADA GRUPO DEBE TRAER LAS MUESTRAS DESIGNADAS y deberán sertraídas en un recipiente con control de temperatura - coolers a temperatura derefrigeración en frascos estériles (frascos de vidrio -gatorade- limpios ysometidos a un proceso de desinfección por ebullición que se puede hacer encasa).



SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDAD

SINO DEBEN CONSEGUIRSE EN MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DEALIMENTOS DE PREFERENCIA EN FORMA ARTESANAL

TRAER DOS BISTURIES (NUEVOS ESTÉRILES)






MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A ALIMENTOS – Salmonella y S. aureu s

1. OBJETIVOS:

Realizar el recuento aislamiento e identificación de Salmonella y S. aureus en diferentesmuestras de alimentos

Comparar los resultados obtenidos con las normas de requisitos microbiológicos respectivos.


Salmonella

Salmonella pertenece a la Familia Enterobactereaceae, al Género Salmonella.

Es un bacilo Gram (-) aerobio y anaerobio facultativo, producen ácido a partir de la glucosa y songeneralmente aerogénicos.

ClasificaciónSalmonella entérica

I-S.entérica Subsp entéricaII-S.entérica Subsp salamaeIII a-S.entérica Subsp arizonaeIII b S.entérica Subsp diarizonaeIV.-S.enterica Subsp houtenae

VI.-S.entérica Subsp indica

Los miembros del grupo Salmonella son gérmenes patógenos causantes de síntomas clínicos enhumanos y en animales. No todos los serotipos son igualmente patógenos para humanos y animalespor lo que desde el punto de vista de salud pública es importante su identificación final.

La naturaleza de la enfermedad varía de acuerdo al serotipo y es así que S.typhi y S. parathyphi producen cuadros septicémicos y fiebres entéricas y otros serotipos producen síntomas como nauseasvómitos, dolor abdominal, fiebre y diarrea.El período de incubación de la enfermedad es desde las 6 hasta 48 horas dependiendo de la dosisinfectiva, la que puede ser desde 15 a 20 UFC para algunos serotipos. No todos los serotipos sonpatógenos para el hombre y animales.

La incidencia de salmonelosis se ha visto incrementada en los últimos 20 años estimándose que loscasos anuales van desde 740.000 a 5.000.000 de los cuales no más del 1% es detectado.

Los factores más importantes para su control se basan en una adecuada educación al consumidor y porla implementación y mantenimiento de adecuados controles de calidad por parte del laboratorio de laindustria de alimentos, la que preferentemente utiliza métodos rápidos para realizar screening en susproductos mediante kits rápidos los que son eficientes en detectar partidas negativas pero en el caso dereacciones presumiblemente positivas se debe confirmar con los métodos convencionales.

Una de las fuentes principales son los alimentos contaminados con éste microorganismo,especialmente los alimentos de origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas.Los alimentos se analizan para detectar la presencia/ausencia de Salmonella por las siguientesrazones:

- Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la ETA.- Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Salmonella.





La fuente de contaminación pueden ser: huevos crudos y mal cocidos, pollos y carnes mal cocidas,productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales.

Los alimentos comúnmente asociados a infecciones son:- carne (vacuno, cerdo, pollo),- productos cárnicos (jamón, salame, vienesas),- ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),- productos de pastelería (cremas) y- productos lácteos (queso, queso de cabra, etc.).

Fundamento de la MetodologíaLos métodos para su detección en alimentos están basados fundamentalmente en que generalmentesu presencia está en un menor número que el de la flora acompañante que es muy diversa.En el laboratorio, los métodos convencionales para su recuperación consideran todos estos factorespermitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de:- preenriquecimiento- enriquecimiento- siembra en agar selectivo (aislamiento)- pruebas bioquímicas y- serotipificación

Existen Métodos Rápidos que han sido aprobados por AOAC y algunos han sido reconocidos por elFDA como buenas alternativas a los métodos convencionales. Sin embargo los resultados positivos deestos métodos deben confirmarse con el método convencional.

PreenriquecimientoDependerá del grado de injuria de las células, lo cual está relacionado con los procesos tecnológicosaplicados. (deshidratación, congelación, calor etc.) y en aquellos alimentos en que se espera un bajonúmero.El preenriquecimiento es realizado en medios líquidos (agua peptonada, caldo nutritivo, caldolactosado, etc.) que son medios no inhibidores del resto de la flora acompañante. Sin embargo esimportante que en la elección del medio a utilizar se considere el grado de injurias subletales derivadasdel proceso tecnológico.

En el caso del agua peptonada tamponada (pH 7.2) ésta asegura la mantención del pH durante24horas, lo que sumado al período de incubación permite el incremento de células que son sensibles ala disminución del pH. A éstos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten lassustancias inhibidoras que están presentes en algunos alimentos; así mismo se debe asegurar el pHque es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

Enriquecimiento SelectivoEl enriquecimiento selectivo está destinado a inhibir la flora acompañante. Al estar adicionados desubstancias químicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura de incubación óptimas permite

su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos opor otras pruebas de identificación. Normalmente el rango de Tº de incubación va de 35ºC a 43ºC porperíodos de 16 a 24 h. Comúnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verdebrillante, tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesio-verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis(RV).

Aislamiento o Detección en Agares SelectivosLa detección en agares selectivos cuyos agentes principales de inhibición son sales biliares,desoxicolato, verde brillante, bismuto de sulfito y antibióticos, la diferenciación de Salmonella de otrosmicroorganismos es usualmente determinado por los cambios de color del indicador que se detecta porcambio de pH y que corresponde a la fermentación de lactosa o sacarosa; asimismo la producción deH2S o la descarboxilación de lisina y de la ornitina.

En microbiología alimentaria comúnmente se utiliza agares como xilosa-lisina desoxicolato (XLD),bismuto sulfito, verde brillante con o sin sulfadiazina, Hecktoen, Mac-Conkey, desoxicolato citrato ySalmonella-Shigella (SS).





IdentificaciónEn los procedimientos de identificación final es recomendable que, los cultivos con colonias pocoaisladas o con variedad de flora, realizar un reaislamiento en un agar nutritivo y posteriormente sembraren TSI y LIA además de MIO (movilidad, indol, ornitina).

En general Salmonella es negativa a las pruebas de ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a laspruebas de descarboxilación de lisina y ornitina, así como generalmente producen H2S, pero existenvariantes atípicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilación de lisina.

La serotipificación es importante sobre todo desde el punto de vista epidemiológico en que además elestudio se completa con determinación de biovariedades y fagotipificación.

Staphyloco ccus aureus

Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos difíciles de eliminar quecolonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y lasfosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Staphylococcus aureus es un coco Gram positivoaerobio o anaerobio facultativo que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa positivo. Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría componentes de la pared celular, y unavariedad de exoproteínas que facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas propiedades, hacenque los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que van desde afeccionessuperficiales de la piel a patologías severas como neumonías, meningitis, intoxicaciones alimentarias,shock séptico y desórdenes autoinmunes.

Al cabo de 1-6 horas de la ingestión de toxina preformada de Staphylococcus, aparecen náuseasintensas, vómitos, calambres abdominales y diarrea acuosa. La toxina se forma en alimentospreparados y conservados en forma indebida.

Los alimentos más frecuentemente implicados en la intoxicación estafilocócica son principalmente los

proteicos (carne, pollo, pescado, lácteos, cremas y natas de pastelería) y en particular: alimentoscocinados que se recontaminan posteriormente (se ha eliminado la flora competitiva y se producecontaminación post-cocinado), alimentos de Aw reducida por adición de azúcar o sal (cremas y natas),productos cárnicos curados tratados térmicamente (jamón cocido) y embutidos crudos fermentados.

No todas las cepas de S. aureus son capaces de producir la intoxicación estafilocócica. Solo las cepasque producen una enterotoxina y que se conocen como S. aureus enterotoxigénico. La intoxicación seproduce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S. aureus enterotoxigénico y haproducido toxinas en el propio alimento. Es necesario que S. aureus enterotoxigénico se encuentre enniveles de al menos 106 /g para que se produzca suficiente cantidad de toxina para provocar síntomasen el consumidor. Estas cifras de 106 /g se alcanzan con facilidad si los alimentos una vez elaboradosno se mantienen a temperaturas adecuadas (o refrigeración o por encima de 60ºC) o bien si sealmacenan durante demasiado tiempo.

3. MATERIALES

tubos para diluciones (con diluyente) pipetas estériles incubadora pera gradilla Asas y agujas de inoculación Caldo lactosado Caldo selenito cistina Caldo tetrationato Kit determinación rápida de Salmonella Frasco y tubos con diluyente Agar Baird Parker

http://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining

http://en.wikipedia.org/wiki/Aerobic_organism

http://en.wikipedia.org/wiki/Facultative_anaerobic_organism

http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_fermentation

http://en.wikipedia.org/wiki/Catalase

http://en.wikipedia.org/wiki/Coagulase

http://en.wikipedia.org/wiki/Virulence_factor

http://en.wikipedia.org/wiki/Virulence_factor

http://en.wikipedia.org/wiki/Coagulase

http://en.wikipedia.org/wiki/Catalase

http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_fermentation

http://en.wikipedia.org/wiki/Facultative_anaerobic_organism

http://en.wikipedia.org/wiki/Aerobic_organism

http://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining





4. MÉTODO

Salmonella sp.

ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO1- Pesar 25 gramos de muestra en un frasco que contiene 225 mL de caldo lactosado.2- Incubar a 35°C durante 24 horas.

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO1. Pipetear 1 ml del cultivo de enriquecimiento no selectivo en un tubo que contiene 10 ml de

caldo tetrationato y 1 mL en un tubo con 10 mL de caldo selenito cistina, incubar a 43°C,durante 24 horas.

IDENTIFICACIÓN

1ra opción – KIT Salmonella1. Adquirir el kit de determinación rápida de Salmonella2. (Inocular e incubar según las indicaciones del fabricante3. Interpretar los resultados

2da opción

1. Divida cada placa con agar Bismuto Sulfito en dos mitades2. Siembre por agotamiento en estrías en la primera mitad la muestra enriquecida en caldo

Selenito Cistina y en la otra mitad la muestra enriquecida en Caldo Tetrationato3. Incube las placas a 35ºC durante 24 horas

RECUENTO DE S. aureu s

1. Pesar asépticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente2. Hacer diluciones, 10-1 , 10 -2 y 10-3 3. Inocular por la técnica de EXTENSION 0,1 ml de cada dilución en las placas petri con agar

Baird Parker.4. Deje reposar las placas durante minutos y asegúrese de que el inóculo se ha absorbido en el

agar.5. Incubar 24h a 48h – 37ºC6. Contar las colonias típicas de S. aureus

IDENTIFICACION DE S. aureu s

1. Coloración Gram

2. Prueba de catalasa3. Resistencia al NaCl y consumo de manitol: resembrar en Agar Sal y Manitol


5. Cuál es la composición del agar Baird Parker?

6. Por qué se realiza recuento S. aureus e identificación de la presencia/ausencia deSalmonella en alimentos?

7. Qué importancia tienen el análisis de Listeria en ambientes y en alimentos?

8. Cómo se realiza la identificación serológica de Salmonella





6.BIBLIOGRAFÍA

- Apella y Araujo (sin fecha). Solar safe water. Microbiología del agua. Conceptos básicos. Enlínea: www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm

- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Pérez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prácticas. LaboratorioMicrobiología General. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana.

- Anónimo. (sin fecha). Manual de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética.Universidad de Salamanca.


Salmonella


DATOS GENERALESMuestraCondiciones de conservaciónNombre y lugar del expendedorFecha y hora de toma de la muestra.

Responsable de muestreoCARACTER STICAS ORGANOL PTICASConsistenciaOlorColorTRANSPORTE DE LA MUESTRA Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta elanálisis:CARACTERISTICAS DE LA MUESTRAProceso tecnológico al que fuesometido ANALISIS REALIZADO

Reporte de resultados

BANDA CARACTERÍSTICA DE Salmonella(resultado positivo)

Resultado encontrado

Describa las características de las colonias en el medio Bismuto Sulfito Agar









S. aureu s


DATOS GENERALESMuestraCondiciones de conservaciónNombre y lugar del expendedorFecha y hora de toma de la muestra.

Responsable de muestreoCARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICASConsistenciaOlorColorTRANSPORTE DE LA MUESTRA

Congelada _______ Refrigerada ________ Tº ambiente ______Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta elanálisis:CARACTERISTICAS DE LA MUESTRAProceso tecnológico al que fuesometido ANALISIS REALIZADO

Recuento



REPORTE GENERAL DE RESULTADOS

ANÁLISISSOLICITADO

MUESTRA MÉTODODE ANÁLISIS


NORMA

Salmonella

S.aureus

*Método de análisis: el nombre del método aplicado*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES*Norma: nombre o número de la norma





LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 5

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MANIPULADORES, UTENSILIOS,AMBIENTES, EQUIPOS Y SUPERFICIES (MÉTODOS RÁPIDOS DE ANÁLISIS

MICROBIOLÓGICO)

Cada grupo debe seleccionar un lugar para la toma de muestras (restaurantes,puestos de comida rápida, o de comida elaborada, donde se tenga la apertura para

que se les permita realizar el análisis)

Antes de irse a muestrear deben ir al laboratorio con el cooler para que recojan elmaterial (quick swab y petrifilms) y recibir la clase

Para el día de la práctica deben traer un marco de madera o cartón que tenga 50cmcuadrados internos (10cm * 5 cm)

SINO TRAEN LAS MUESTRAS BAJO ESTAS INSTRUCCIONES NO PODRÁN HACER ELPROYECTO – el cooler es individual, uno por grupo

AL FINAL DEL TRABAJO SE EVALUARÁ:

- TRABAJO DE LABORATORIO- PRESENTACIÓN DE LA HOJA DE ACTIVIDADES CON SELLOS DIARIOS- ENTREGA DEL ARTÍCULO FINAL

El trabajo final escrito no va como informe sino como artículo científico






ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MANIPULADORES, UTENSILIOS, AMBIENTES,EQUIPOS Y SUPERFICIES

2. OBJETIVOS

- Realizar el análisis microbiológico de manipuladores, aplicar técnicas para ladeterminación de S. aureus en la cavidad naso-faríngea y manos.

- Realizar el análisis microbiológico de los utensilios que están en contacto con losalimentos procesados.

- Realizar el análisis microbiológico de ambientes, equipos y superficies que entran encontacto con los alimentos procesados.

- Comparar y analizar los resultados obtenidos entre todos los grupos de trabajo.

3. CONCEPTOS

Los consultores y responsables de calidad en las industrias alimentarias precisan cadavez más los análisis microbiológicos de sus productos como una herramienta de trabajoinsustituible en el control de los puntos críticos ya que es la única vía para detectarcontaminaciones fecales, ambientales o por otros patógenos y tomar las medidascorrectoras adecuadas en cada caso. La lectura detallada de los informes emitidos por ellaboratorio ofrece una guía de las desviaciones que se van produciendo en el sistema.

El muestreo se debe realizar con las manos limpias y secas. Si el manipulador estáresfriado es recomendable esperar una semana después de la desaparición de lossíntomas. Abrir los hisopos sólo en el momento de su uso y cerrarlos lo antes posible,evitando el contacto de la torunda de algodón con el suelo, superficies, etc.

La toma de muestra de las manos de los manipuladores se realiza para detectarportadores de Staphylococcus aureus tanto en manos como en cavidad naso-faríngea.Esta técnica de toma de muestra puede utilizarse para detectar otros microorganismos enmanipuladores, como E. coli o coliformes fecales en manos.

El análisis microbiológico de utensilios se puede realizar por hisopado o lavado.Dependerá de las características de los instrumentos a ser controlados.

Actualmente se considera que la mayoría de los alimentos son peligros potenciales para elconsumidor, cuando no se siguen las buenas prácticas de fabricación y por lo tanto no hayuna manipulación adecuada de los alimentos en las diversas operaciones que se realizan,

previas al servido de los mismos. Los factores que han contribuido a los brotes de ETApueden ser: la refrigeración inadecuada, combinada frecuentemente con la preparación dealimentos mucho antes de ser servidos, el mantenimiento de los alimentos encalentadores con temperaturas que permiten el crecimiento de los microorganismos, malahigiene de las personas que manipulan los alimentos cocinados y el recalentamientoincorrecto de los alimentos previamente cocidos.

Las prácticas generales de higiene se desarrollan en la manipulación de alimentos para el





consumo humano con el objetivo de garantizar un producto inocuo, saludable y sano.Estas actividades se cumplen desde el cultivo y recolección, preparación, elaboración, elvaciado, almacenamiento, soporte, distribución y venta.

Limpieza: La eliminación de residuos de alimentos, polvo, grasa u otra materia objetableContaminación: Presencia de cualquier material objetable en el producto.Desinfección: Acción por la cual se busca disminuir el número de microorganismosmediante procesos físicos y químicos satisfactorios aplicados en superficies limpias deforma que se reduzca a un nivel tal que no dé lugar a la contaminación peligrosa de losalimentos que contactan con la superficie desinfectada (Codex Alimentarius).

Para la desinfección debemos tomar en cuenta factores como: Tipo de microorganismos y alimentos en cuestión. Tipo de superficies Tipo de suciedad

Dureza del agua Rotación de los productos utilizados

El control microbiológico del ambiente de instalaciones permite gestionar de una maneramás eficaz el control de los puntos críticos de un proceso de producción. Para esto serealizan los siguientes ensayos:

Control microbiológico de superficies (microorganismos totales, indicadores,patógenos)

Control microbiológico de aire (equipo de filtración) Control microbiológico de manipuladores de alimentos (Staphylococcus,

enterobacterias, Salmonella)

Por estas razones es importante conocer las condiciones microbiológicas en las que seencuentran las zonas en las que se procesan alimentos. El análisis microbiológico deambientes incluye el control con filtros de aire y/o el recuento de bacterias mesófilasaerobias, coliformes, mohos y levaduras que pueden afectar al producto contaminándolo oproduciendo defectos en el mismo. Mientras que las superficies y equipos que están encontacto con el alimento no deben representar una fuente de contaminación para elalimento procesado o terminado.

MUESTREOSe puede utilizar un sistema de hisopado de superficies para verificar la eficacia delproceso de sanitización previo a la liberación de líneas de producto, monitorear los nivelesde bacterias durante la producción o medir los niveles bacterianos post-operacionales.

Los hisopos pueden utilizarse secos o húmedos para muestrear superficies e inocularrápida y directamente la muestra sobre una placa.

En vista de lo antes señalado, es importante analizar la calidad microbiológica de losalimentos, determinar las causas de la contaminación, y adicionalmente analizar la calidadmicrobiológica del agua, de los equipos, utensilios, superficies, ambientes y del personalque están en contacto con el procesado de alimentos.





MÉTODOS RÁPIDOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

El desarrollo de métodos rápidos y automatizados para la detección, aislamiento,

identificación y enumeración de microorganismos (y/o sus metabolitos) relacionados conla alteración y seguridad de los alimentos es una subdivisión del área de la microbiologíaaplicada con una importancia cada vez mayor.

Los métodos microbiológicos “convencionales”, empleados actualmente en numerososlaboratorios de todo el mundo y establecidos en muchos casos como métodos estándaresde análisis microbiológico de los alimentos, se caracterizan por ser laboriosos, empleargrandes volúmenes de medios de cultivo y requerir un tiempo considerable para laobtención y el análisis de los resultados. Por el contrario, los métodos rápidos requierenun tiempo reducido para la obtención de los resultados y/o permiten procesar un númeroelevado de muestras por unidad de tiempo, y son en general fáciles de usar, precisos(sensibilidad y especificidad adecuadas y límites de detección bajos) y económicamente

rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversión económica inicialconsiderable). Conviene destacar que, en la mayoría de los casos, el empleo de métodosrápidos no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana (buscado) ni lanecesidad de obtener cultivos puros, así como que los resultados positivos obtenidos conmétodos alternativos (distintos del método de referencia) no validados deben serconfirmados. Asimismo, es de suma importancia, al igual que en el caso de los métodostradicionales, una adecuada toma y preparación de las muestras a analizar.

Los métodos rápidos utilizados en microbiología de alimentos pueden dividirse en cincograndes grupos, incluyendo los empleados para el recuento de células viables, para lamedición de la biomasa, los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, losinmunológicos y los genéticos.

Medida de la biomasa microbiana

Puesto que el método “convencional” de recuento de microorganismos en placa es muylaborioso, se han desarrollado métodos para estimar de manera indirecta el número demicroorganismos presentes en los alimentos. El desarrollo de dichos métodos estáíntimamente ligado al de la instrumentación necesaria para detectar las señalesrelacionadas con el crecimiento microbiano. El principio en el que se basan estos sistemases que dichas señales (niveles de ATP, enzimas específicas, pH, impedancia,conductancia y capacitancia eléctrica, etc.) se modifican paralelamente con el crecimientomicrobiano.

Todas las células vivas contienen ATP, que se degrada muy rápidamente medianteautolisis al morir las células. En presencia de la enzima luciferasa y el sustrato luciferina(procedentes de la luciérnaga), oxígeno y magnesio, el ATP facilita el paso de la luciferinaa oxiluciferina, generándose luz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante unluminómetro. La cantidad de luz emitida en esta reacción es directamente proporcional ala cantidad de ATP presente en la muestra, es decir, al número de células vivas, y estácorrelacionada con la biomasa celular (la cantidad de ATP de 1 unidad formadora decolonia (UFC) oscila entre 0,22 y 1,03 fg. Este método puede emplearse para la detecciónespecífica de ATP microbiano en productos líquidos tales como leche UHT, zumos,





postres, lácteos, etc., en los que es necesario determinar la presencia/ausencia demicroorganismos. No obstante, la principal aplicación de este principio en la industriaalimentaria se encuentra en la monitorización de la higiene de superficies. En este caso, la

presencia de altos niveles de ATP de cualquier origen (microbiano o no) es indicativa deuna limpieza deficiente.

Recuento de células viables

El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las superficies en contactocon los mismos y del aire de las industrias alimentarias, es uno de los parámetros másimportantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los alimentos.Tradicionalmente, el recuento de células viables se ha realizado mediante el métodoestándar de recuento en placa, que, aunque sencillo, es laborioso, requiere un volumenconsiderable de tubos de ensayo y medio de dilución, y espacio para el almacenamiento yla incubación de las placas de cultivo. En lo que se refiere a la preparación de placas de

cultivo, destacan las siguientes mejoras: autómatas para la preparación y distribución demedios de cultivo (Masterclave, AES Chemunex); sistemas que incluyen pectina comoagente gelificante en lugar de agar, evitando así la necesidad de calentar el medio parafundirlo (Redigel, 3M); y medios liofilizados que utilizan como soporte una película plásticade tamaño y grosor similar al de una tarjeta de crédito que contiene geles solubles enagua fría que se rehidratan al depositar la muestra en su superficie y que requieren unespacio mínimo para su almacenamiento e incubación (Petrifilm, 3M), existiendo asimismoinstrumentos para la lectura rápida y automática de los resultados (Lector de placas 3MPetrifilm, 3M).

TÉCNICAS DE MUESTREO RÁPIDO DE SUPERFICIES:

a) Método de la placa en contacto (Placa Rodac):

El método de contacto directo del agar con los microorganismos que se multiplican(RODAC= Replicate Organisms Direct Agar Contact) utiliza placas Petri especiales,ideales para la investigación de gérmenes en superficies. Se añade a una placa de Rodac,un medio de cultivo sólido (seleccionado en función de los microorganismos buscados), enligero exceso, para que la superficie quede convexa. Es el método ideal para examinarsuperficies lisas, duras y no porosas, pero no es muy recomendable en casos desuperficies muy contaminadas, donde es más práctico el uso de medios selectivos. Si sedesea controlar un grupo de microorganismos en concreto, también recurriremos a mediosselectivos.

Modo de empleo: La placa se coloca sobre la superficie a muestrear de una formadirecta, manteniéndola inmóvil y presionando. Cerrar e invertir la placa para su incubación,a temperatura y tiempo adecuados según el medio y determinación realizada.





b) Laminocultivos:

Los laminocultivos son sistemas prácticos, estudiados y diseñados especialmente para ladeterminación cuantitativa y cualitativa de los microorganismos en todos aquellos sectoresproductivos en los cuales es necesario el control de la microbiota contaminante.

Este sistema analítico ofrece las siguientes ventajas:

• Permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de los microorganismos.• La presencia de dos medios de cultivo en un solo soporte permite efectuar muestreosseparados con un solo laminocultivo.• El cierre hermético con tapón roscado disminuye la posibilidad de contaminaciónaccidental y mejora la estabilidad del producto.• Su reducido volumen facilita el transporte, almacenamiento y permite una mejor gestióndel espacio siempre escaso de la estufa de incubación.

Los laminocultivos se presentan en dos versiones:

• Una estudiada para el muestreo y control de líquidos: laminocultivos con dos o tres

medios de cultivo,• Y otra pensada para el control de superficies: laminocultivos con dos superficies. En estecaso poseen un soporte flexible que con la simple presión de la mano puede doblarse enángulo de 90° respecto al tapón, permitiendo así una posición perfectamente paralela conla superficie a muestrear.

Laminocultivos Mini incubadora

4. MATERIALES Y METODOS3.1 MATERIALES





- Hisopos estériles (Quick swab)- Tubos para diluciones- Pipetas estériles

- Agua peptonada- Placas petrifilm- Plantilla metálica- 2 Placas de Agar Saboraud- 2 Placas de Agar Nutritivo

3.2 MÉTODOS

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE MANIPULADORES

Toma de muestras de manos y uñas- Utilizar el hisopo para lavar la superficie de la palma de la mano haciendo rotar el

hisopo- Lavar la zona entre los dedos, repetir la limpieza del hisopo y pasar el hisopo entrelas uñas.

- Repetir la misma operación para la otra mano.

Recuento de S. aureus - Trasvasar el caldo Letheen del hisopo a 9 ml de diluyente, esta es la dilución 10-1 - Realizar la dilución 10 -2 .Si es necesario.- Sembrar en las placas petrifilm de S. aureus - Incubar las placas a 35ºC durante 24 horas.- Leer los resultados.

Toma directa de muestras de manos- En una placa petrifilm para S. aureus, pedir a la persona de la que se tomará lamuestra que presione ligeramente sus dedos sobre el agar (con cuidado de noromper)

- Incubar (35ºC/24H)- Contar la bacterias existentes (Staphylococcus)

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE UTENSILIOS

Toma de muestra por hisopado- Sostener el hisopo en un ángulo de 30° con respecto al utensilio a muestrear.

Frotar lenta y completamente con el hisopo por toda la superficie deseada. Frotar

bien en las superficies rugosas del utensilio (Ej: colador, tabla de picar, cuchillo,abrelatas, entre otros).- Realizar diluciones 10 -1 , 10 -2 y 10-3.- Sembrar en las placas petrifilm de enterobacterias- Incubar las placas a 35ºC durante 24 horas- Leer los resultados

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AMBIENTES POR EXPOSICIÓN





- Exponer en el ambiente designado a cada grupo - Mantener las placas destapadas durante 30 minutos

- Tapar e incubar: o Mohos y levaduras – agar saboraud: 3 – 5 días/25ºC. o Bacterias – agar nutritivo: 24-48 horas/ 35ºC (según el crecimiento

obtenido) - Recuento

ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE EQUIPOS

- Tomar las muestras por hisopado.- Sostener el hisopo en un ángulo de 30° con respecto a la superficie a muestrear.

Hisopar en el equipo seleccionado. Frotar lenta y completamente con el hisopo portoda la superficie deseada. Para las superficies, hisopar un área de 50 cm 2.

Realizarlo en 3 direcciones distintas.- Regresar el hisopo al tubo.- Realizar diluciones 10 -1 , 10 -2 y 10-3.- Sembrar en las placas petrifilm de coliformes- Incubar las placas a 35ºC durante 24 horas.- Leer los resultados

Hisopado de equipos y superficies

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES

- Humedecer el hisopo en el diluyente y sosteniéndolo en un ángulo de 30º, lavar lasuperficie determinada por la plantilla, pasando por toda el área en diferentesdirecciones (50 cm2).

- Enjuagar el hisopo en el diluyente. Drenar el exceso de líquido en la pared del tuboy repetir la operación de muestreo para otra superficie. Repetir el proceso 5 veces.

- Realizar diluciones 10 -1, 10 -2 y 10-3.Si es necesario.

- Sembrar en las placas petrifilm de aerobios mesófilos y mohos y levaduras- Incubar 3-5 días/ 25°C para mohos y levaduras; 48 h/ 35ºC las de aerobiosmesófilos

- Leer los resultados





Toma de muestra de superficies. Uso de plantilla metálica.Superficie de muestreo: 50 cm2


7. Qué es un stomacher? qué ventajas y desventajas tiene su uso en laboratorio demicrobiología?

8. ¿Qué es un hisopo Quick Swab y como se usa?

9. Qué diferencias hay entre un método rápido y un método muy rápido para elanálisis microbiológico?

10. Cómo se realiza la identificación rápida automatizada de microorganismos?

6. BIBLIOGRAF A- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Pérez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prácticas.

Laboratorio Microbiología General. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana.

- Anónimo. (s/f). Manual de Microbiología. Departamento de Microbiología yGenética. Universidad de Salamanca.

- Scharlab, (s/f). Control microbiológico ambiental y de superficies. Recuperado el 03de Marzo del 2015 de:http://www.cienytech.com/catalogos/Microbiologia/Controlsup.pdf

7. REGISTRO DE RESULTADOS7.1. MANIPULADORES

7.1.1. DATOS DEL MANIPULADOR

DATOS GENERALESNombre del manipulador

Actividad que realizaFecha y hora de toma de la muestra.Observaciones y datos adicionalesCondiciones de incubación





7.1.2. RECUENTO DE S. aureus:

REPORTE DE RESULTADOS: MUESTREO HISOPADO

DILUCIÓN No. colonias Resultado

PROMEDIORESULTADO No. UFC

REPORTE DE RESULTADOS: MUESTREO DIRECTO



7.2. UTENSILIOS

7.2.1. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA:

DATOS GENERALESLugar de muestreoCaracterísticas de los utensiliosFecha y hora de toma de la muestra.Observaciones y datos adicionalesCondiciones de incubación

7.2.2. RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS :

DILUCI N No. colonias Resultado


7.3. AMBIENTES





7.3.1. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA

DATOS GENERALESLugar de muestreoCaracterísticas del lugar de muestreoFecha y hora de toma de la muestra.CARACTERISTICAS DE LA MUESTRAFecha y hora de análisisObservaciones y datos adicionalesCondiciones de incubación

7.3.2. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS (Saboraud):

PLACA No. colonias Resultado

PROMEDIORESULTADO No. UFC / 3 m2

7.3.3. RECUENTO DE BACTERIAS (Nutritivo):

PLACA No. colonias Resultado

PROMEDIO

RESULTADO No. UFC / 3 m2

7.4. EQUIPOS


DATOS GENERALESLugar de muestreoCaracterísticas los equiposFecha y hora de toma de la muestra.CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA

Fecha y hora de análisisObservaciones y datos adicionalesCondiciones de incubación

7.4.2. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES:

DILUCI N No. colonias Resultado





PROMEDIO

RESULTADO No. UFC / g de muestra

7.4.3. RECUENTO DE E. coli :



7.5. SUPERFICIES


DATOS GENERALES

Lugar de muestreoCaracterísticas del lugar de muestreoFecha y hora de toma de la muestra.CARACTER STICAS DE LA MUESTRAFecha y hora de análisisObservaciones y datos adicionalesCondiciones de incubación Aerobios totales: Mohos y Levaduras:

7.5.2. RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS TOTALES:


PROMEDIORESULTADO No. UFC / 50 cm2

7.5.3. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS:


PROMEDIORESULTADO No. UFC / 50 cm2





7.6. REPORTE DE RESULTADOS

AN LISISSOLICITADO

M TODODE

ANÁLISIS

MUESTRA RESULTADO VALORESREFERENCIALES

NORMA

ManipuladoresUtensilios

AmbientesEquiposSuperficies

*Análisis solicitado: colocar los ensayos realizados en el laboratorio*Método de análisis: el nombre del método aplicado*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES*Norma: nombre o número de la norma. Si se consulta en normas que no constan en ellaboratorio, debe adjuntarse el documento en el informe.

guia de laboratorio microbiologia de alimentos

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