manual practicas microbiologia alimentos

Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

(Guión de Prácticas)

1° INGENIERO TÉCNICO AGRÍCOLA INDUSTRIAS AGRARIAS Y ALIMENTARIAS

CURSO 2005-2006

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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS (PRÁCTICAS) Profesor: Cristina Solano Goñi (Profesora Asociada) e-mail: [email protected] Tfno. Contacto: 948-168024 Dirección: Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales. UPNA/CSIC Objetivo Se pretende conseguir que los alumnos conozcan: .- las buenas prácticas de trabajo en el laboratorio de Microbiología .- aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo - familiarizarse con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad .- familiarizarse con el manejo del microscopio óptico para la visualización de microorganismos así como las tinciones más habituales en el laboratorio de Microbiología .- aprender otras técnicas como las de transformación bacteriana, infección de bacterias con bacteriófagos, así como aprender a realizar un antibiograma .- determinar el grado de contaminación microbiológica de los alimentos. Ejemplo: contenido de gérmenes por gramo de alimento a 30 °C .- verificación de las buenas prácticas de fabricación (BFP). Ejemplo: recuento de indicadores en alimentos procesados (coliformes, enterobacterias, gérmenes totales, etc.) .- determinación de microorganismos testigos de falta de higiene. .- comprobación de la salubridad de un alimento mediante la determinación de la ausencia o presencia de gérmenes patógenos o toxinas que provocarían riesgos al consumidor (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, toxina estafilocócica, etc). .- descripción de técnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en la producción de alimentos. Metodología

Lecciones prácticas en el laboratorio de Microbiología (en grupos reducidos). Cada grupo realizará las prácticas a lo largo de cuatro semanas (3 días /semana; 2horas/día). La realización de las prácticas es obligatoria para aprobar la asignatura.

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Prácticas de Microbiología General Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios

de cultivo. Esterilización. Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de

diferentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la

importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además también se

pretende que el alumno se familiarice con las técnicas empleadas en

Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en

condiciones de esterilidad.

Práctica 2: Obtención de cultivos puros.

Con esta práctica se pretende estudiar las diferentes técnicas de aislamiento

de un microorganismo a partir de una población mixta para obtener un cultivo

puro.

Práctica 3: Cultivo de bacterias anaerobias.

El objetivo de esta práctica es conocer el fundamento y la técnica más

comúnmente empleada en el aislamiento de bacterias anaerobias.

Práctica 4: Observación de bacterias teñidas. Tinción Simple y Tinción de

Gram.

Con esta práctica se pretende familiarizar al alumno con el manejo del

microscopio óptico para la visualización de microorganismos. Se observarán

preparaciones bacterianas bajo diferentes técnicas de tinción que permitan

establecer diferencias morfológicas y estructurales entre y dentro de los

microorganismos.

Práctica 5: Recuento del número de bacterias por mililitro de un cultivo líquido.

El objetivo de esta práctica es dar a conocer al alumno otra de las técnicas de

obtención de cultivo puros así como el aprendizaje para hacer diluciones y

recuentos bacterianos.

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Práctica 6: Antibiograma.

El objetivo de esta práctica es estudiar qué son los antibióticos y cómo se

realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto químico

(antibiótico) mediante la técnica de Kirby-Bauer.

Práctica 7: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano

El objetivo de esta práctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de

un cultivo bacteriano a altas temperaturas.

Práctica 8: Transformación bacteriana por resistencia a ampicilina.

En esta práctica se hablará de los fenómenos de transformación,

conjugación y transducción y se realizará un ensayo de transformación bacteriana por

adquisición de plásmidos resistentes al antibiótico ampicilina.

Práctica 9: Aislamiento y características de un bacteriófago (virus de bacterias)

El objetivo de esta práctica consiste en visualizar la presencia de

bacteriófagos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso sobre bacterias de

Staphylococcus aureus.

Práctica 10: Observación de levaduras.

El objetivo de esta práctica es el cultivo de diferentes levaduras y la

posterior identificación de las mismas de acuerdo a sus características morfológicas a

través de su observación al microscopio.

Práctica 11: Tinción de esporas.

En esta práctica se estudiará el género Bacillus por su capacidad para la

formación de endosporas y se procederá a la realización de la correspondiente tinción

diferencial para poder visualizar al microscopio dichas estructuras.

Práctica 12: Tinción de cápsula.

En esta práctica se estudiarán las cápsulas bacterianas y se procederá a

una tinción diferencial para la visualización de la misma al microscopio.

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Prácticas de Microbiología de Alimentos

La gran versatilidad metabólica de los microorganismos hace que los podamos

encontrar prácticamente en cualquier entorno. Los alimentos son fácilmente

colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el

procesamiento y la manipulación. La multiplicación de los microorganismos en el

alimento puede implicar desde una alteración inapreciable hasta su deterioro

completo y puede ser, en cualquier caso, una vía de transmisión de enfermedades.

Por el contrario, en otras ocasiones, la alteración resulta beneficiosa debido a la

adquisición de nuevas propiedades fisicoquímicas de interés organoléptico o de

conservación (que impidan la colonización por otros microorganismos).

Las siguientes prácticas se centran en la detección de microorganismos en el propio

alimento y además se describen técnicas sencillas para estudiar el papel de los

microorganismos en la producción de alimentos.

Práctica 13: Análisis microbiológico de alimentos frescos-cocinados.

Investigar tanto la presencia de microorganismos patógenos que representan

un riesgo para la salud del consumidor como la de aquellos que producen

alteraciones en el alimento durante el periodo de conservación. Para ello, se

realizarán los siguientes ensayos tras haber preparado convenientemente la muestra:

Preparación de la muestra:

Tomar la muestra en condiciones asépticas. Para ello se pueden emplear

cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la

toma de muestra y el análisis, se mantendrá la muestra en refrigeración.

Homogeneización del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial

de paletas para que la distribución de los microorganismos en el medio sea

homogénea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plástico estéril

(especial para el homogeneizador) y se añaden 90 ml de caldo de peptona

estéril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos,

aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.

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Realizar una serie de diluciones decimales seriadas: en tubos con 9 ml de

caldo de peptona. En función de la carga microbiana esperada en el alimento

se realizan las diluciones que se crean convenientes.

NOTA: Al añadir 90 ml de caldo de peptona a los 10 g de muestra, se está

realizando la primera dilución decimal (los 10g de la muestra van a implicar

aproximadamente 10 ml de volumen).

13-A INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES

Recuento de microorganismos mesófilos totales

Recuento de enterobacterias en placa

Recuento de mohos y levaduras

13-B DETERMINACIÓN DE INDICADORES DE FALTA DE

HIGIENE

Recuento de coliformes totales en placa

Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia

Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos

13-C INVESTIGACIÓN DE PATÓGENOS

Presencia de Salmonella

Presencia de Listeria monocytogenes

Práctica 14: Recuento de formas vegetativas y esporuladas

El objetivo de esta práctica consiste en determinar la presencia de esporas en

un alimento y confirmar su resistencia a las altas temperaturas.

14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS

14-B RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y

ANAEROBIAS

Práctica 15: Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de

manipuladores de alimentos

Determinar el grado de contaminación ambiental y del propio manipulador

para estudiar la influencia en el número y tipo de microorganismos que luego pueden

desarrollarse en un alimento.

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15-A ANÁLISIS DEL AIRE

15-B ANÁLISIS DE SUPERFICIES

15-C ANÁLISIS DE MANIPULADORES

Práctica 16: Utilización de los microorganismos en la industria alimentaria

Descripción de dos técnicas sencillas para estudiar el papel de los

microorganismos en la producción de alimentos.

16-A PREPARACIÓN DE YOGUR

16-B PREPARACIÓN DE CERVEZA

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NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado

donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biológica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).

Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad.

Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS: 1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus

recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.

2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras.

Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD: 1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio. 2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y

jabón. 3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada

práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

3. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben

evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan

microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

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6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados,

que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.

8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. 9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos,

etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.

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CALENDARIO DE PRÁCTICAS 1a SEMANA 1er DIA- práctica 1

¿Qué es un medio de cultivo en microbiología?. Preparación de medios de cultivo generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales

• sólido en placa • sólido en tubo (slant) • líquido (caldo)

Esterilización: Diferentes técnicas, aparatos y formas de trabajo para lograr la

esterilización del material y para desechar el material una vez contaminado. 2º DIA- prácticas 1, 2 y 3

-Siembra de los medios preparados el día anterior: • siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estrías. • siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estrías en una placa de

LB y otra de agar McConkey. • siembra de un caldo de LB. • siembra de dos cultivos en slant de TSI. • siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies

para demostrar la ubicuidad de los microorganismos • siembra de levaduras en agar sabouraud: incubación a temperatura ambiente.

Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilización de la jarra de anaerobiosis 3er DIA- práctica 4. Resultados prácticas 1, 2 y 3.

Tinción de Gram: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma

Ver los resultados del agotamiento por estrías y del crecimiento en medio líquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y diferencial.

Comprobar la ubicuidad de los microorganismos Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.

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2a SEMANA 1er DIA- prácticas 5, 6 y 7.

Dilución de un caldo con E. coli para calcular el nº de U.F.C./ ml. Estudio del efecto de antibióticos sobre el crecimiento bacteriano mediante la

técnica del Antibiograma (Cuantitativo y Cualitativo) Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento bacteriano

2o DIA- prácticas 8 y 9. Resultados prácticas 5, 6 y 7.

Transformación bacteriana: Realización de la técnica de transformación de un cultivo de E. coli (por resistencia a un antibiótico) como ejemplo de transferencia horizontal de DNA.

Estudio de un virus (bacteriófagos): Cómo se pueden visualizar los virus. Ensayo de infección de bacterias con virus en medio sólido

Ver los resultados de las diluciones seriadas del caldo de E.coli y cálculo del nº

de U.F.C./ml. Ver los resultados de los antibiogramas Ver los resultados del efecto de las temperaturas sobre el crecimiento

bacteriano 3er DIA- prácticas 10, 11 y 12. Resultados prácticas 8 y 9.

Tinción de Esporas: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma Tinción de cápsula: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma Observación de levaduras al microscopio: Diferencias entre organismos

procariotas y eucariotas al microscopio. Cómo es la célula levaduriforme. Observación de varias especies de levaduras al microscopio.

Ver el resultado de la transformación bacteriana Ver placas de lisis de los virus infectando a las bacterias en medio sólido

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3a SEMANA 1er DIA- práctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3, 16-B Aprender a preparar, homogeneizar y diluir convenientemente la muestra a analizar para

el análisis de alimentos frescos-cocinados. Comenzaremos por la investigación de microorganismos indicadores (mesófilos, enterobacterias) y la determinación de indicadores de falta de higiene (coliformes totales, Escherichia coli y Staphylococcus coagulasa positivos).

Comprobar la transformación de una suspensión de harina de malta que la levadura Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo mediante una fermentación alcohólica para dar lugar a cerveza.

Recuento de microorganismos mesófilos totales: Preparación de la muestra. Siembra

de diluciones en PCA. Recuento de Enterobacteriaceae: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en

VRBG. Recuento de coliformes totales en placa: Preparación de la muestra. Siembra de

diluciones en VRBL. Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Preparación de la muestra.

Siembra de dilución en caldo EC de doble concentración. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Preparación de la muestra. Siembra

de diluciones en Agar Baird Parker. Preparación de cerveza: Preparación de la suspensión de harina de malta, activación de

las amilasas e inoculación con Saccharomyces cerevisiae. 2º DIA- práctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3 Recuento y tinción de Gram de colonias características. Pase de colonias características

a medios para su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas. Recuento de microorganismos mesófilos totales: Recuento de placas. Tinción de

Gram de colonias con diferentes morfologías. Recuento de Enterobacteriaceae: Recuento de placas y reconocimiento de colonias

características. Pase a agar nutritivo. Recuento de coliformes totales en placa: Recuento de placas. Tinción de Gram de

colonias características. Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Pase de tubos positivos de EC

a tubos con caldo de triptona.

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Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Recuento de placas y reconocimiento de colonias características. Pase de colonias típicas y no típicas a BHI.

3er DIA- práctica 13-A-2, 13-A-3, 13-B-2, 13-B-3 Tinción de Gram de colonias características. Pruebas bioquímicas confirmatorias. Investigación de la presencia de mohos y levaduras. Recuento de Enterobacteriaceae: Prueba de la oxidasa. Siembra en agar KIA. Tinción

de Gram. Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Adición de reactivo de Kovacs

y confirmación. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Adición de plasma de conejo con

EDTA. Resultado de la prueba de la coagulasa. Recuento de mohos y levaduras: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en

OGA. 4a SEMANA 1er DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C Análisis de alimentos frescos-cocinados: investigación de patógenos en alimentos como

posible causa de toxiinfecciones. Comenzaremos utilizando una muestra ya preenriquecida y procederemos a enriquecer en medios líquidos selectivos.

Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de manipuladores de alimentos.

Presencia de Salmonella: Muestra preenriquecida en agua de peptona tamponada.

Enriquecimiento en caldo Mueller Kauffmann tetrationato y Rappaport-Vassiliadis Soja.

Presencia de Listeria monocytogenes: Muestra preenriquecida en caldo Fraser-demi. Enriquecimiento en caldo Fraser.

Análisis del aire: Contaminación en placas de PCA para determinación de mesófilos totales.

Análisis de superficies no planas: Siembra mediante método del hisopo en placas de PCA y VRBG.

Análisis de superficies planas por placas de contacto Rodac: Análisis de la superficie elegida con placas Rodac.

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Análisis de manipuladores: Contaminación en las manos y en el interior de la nariz. Siembra en placas VRBG y Agar Manitol Sal.

13-A-2: Ver el resultado de la siembra de KIA a partir de colonias

características en el recuento de enterobacterias. 13-A-3: Recuento de colonias en placas OGA. 16-B: Comprobar el resultado de la fermentación alcohólica.

2º DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C, 14-A, 14-B, 16-A Análisis de alimentos frescos-cocinados: investigación de patógenos en alimentos como

posible causa de toxiinfecciones. Continuaremos la práctica procediendo a aislar los patógenos en medios selectivos.

Estudio de la resistencia de esporas a los procesos de conservación utilizados en la industria alimentaria mediante comparación del recuento de formas vegetativas y recuento formas esporuladas tras tratamiento de la muestra a 80 °C.

Comprobar la transformación de la leche que los microorganismos presentes en un yogur llevan a cabo mediante una fermentación láctica para dar lugar a otro yogur.

Presencia de Salmonella: Agotamiento en XLD y BGA. Presencia de Listeria monocytogenes: Agotamiento en Oxford y Palcam. Recuento de formas vegetativas: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en

PCA. Recuento de formas esporuladas aerobias y anaerobias: Calentar el mismo tubo de

muestra utilizado para el recuento de formas vegetativas. Siembra de diluciones en PCA (recuento de esporos aerobios) y en Schaedler (recuento de esporos anaerobios).

Preparación de yogur: Siembra de un tubo de leche con un cultivo iniciador.

15-A, 15-B, 15-C: Ver el resultado del análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de manipuladores de alimentos.

3er DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 14-A, 14-B, 16-A Análisis de alimentos frescos-cocinados: investigación de patógenos en alimentos como

posible causa de toxiinfecciones. Finalizaremos la práctica procediendo a realizar pruebas bioquímicas específicas para la identificación del patógeno y tinción de Gram.

Identificación de bacterias formadoras de esporas según tinción de Gram y prueba de la catalasa.

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Comprobar el resultado de la fermentación láctica. Presencia de Salmonella: Enseñar galería API. Explicar pruebas serológicas. Tinción

de Gram. Presencia de Listeria monocytogenes: Explicar prueba de CAMP, iluminación de

Henry. Realizar prueba catalasa y tinción de Gram. Recuento de formas vegetativas, esporuladas aerobias y anaerobias: Discernir entre

los géneros Bacillus y Clostridium según la prueba de la catalasa. Preparación de yogur: Tinción de Gram del cultivo iniciador y del yogur preparado.

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Práctica 1: PREPARACION DE MEDIOS Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO Fundamento:

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:

1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.

2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.

3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.

4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.

5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.

6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos.

7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio.

8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.

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9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

Tipos de medios de cultivo.

Por su CONSISTENCIA: a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.

Por su COMPOSICIÓN: a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. Siembra de microorganismos

En términos microbiológicos se entiende por SIEMBRA el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento.

PARA UNA CORRECTA REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES:

1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiológico.

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• La esterilización

Se utilizan dos tipos principales de esterilización: Por MÉTODOS FÍSICOS (calor, filtración, radiaciones). Por MÉTODOS QUÍMICOS (empleo de soluciones químicas).

Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso

del calor húmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126ºC, manteniéndolo en estas condiciones durante 20 minutos.

Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc..) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato más empleado (se somete a temperaturas de 140-180 ºC durante 2h-3h).

En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso.

2) Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya:

Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente.

3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo.

Esto se resuelve con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.

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Material de la Práctica: Mechero bunsen o similar Asa de siembra Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus. Material a preparar por el alumno:1 Tubo con medio líquido estéril (caldo común): Luria Bertani (LB) 2 Tubos con medio sólido estéril (agar inclinado): TSI Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud. Métodos: 1º) PREPARACIÓN DE MEDIOS • Preparación de un medio sólido en placa. 1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos añadirlo a una concentración de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella. 2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca. 3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en un baño a 40ºC al menos durante 30 minutos. 4. Distribuir el medio en las placas de Petri que están estériles dentro de una campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5. Dejar que el medio solidifique. • Preparación de medio sólido en tubo (slant). 1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz. 2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe hervir hasta que se vuelva transparente. 3. Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar. Para ello se empleará una pipeta y los tubos no se llenarán más de un tercio de su volumen. 4. Autoclavar. 5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con medio en slant. • Preparación de medio líquido en tubo (caldo). 1. Pesar y rehidratar el medio.

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2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos más de 1/3 de su volumen). 3. Autoclavar. 4. Sacar del autoclave y dejar enfriar. Todos los medios se guardan en nevera a 4ºC. 2º) REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA 1.- Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo. 2.- Realizar la siembra, como sigue:

a) Siembra en medio líquido: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo que se lleva al tubo estéril con medio líquido (agitándola en el seno del medio), tomando las precauciones mencionadas anteriormente.

b) Siembra en placa: Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inóculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.

c) Siembra en agar inclinado: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis). 3º) INCUBACIÓN de los medios sembrados a 37 ºC hasta que haya habido crecimiento bacteriano. 4º) OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS:

En primer lugar, observar a simple vista diversas características como el color y el borde de las colonias crecidas en el agar así como el olor y la turbidez del medio ya que en algunos casos suelen ser típicos de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificación.

El siguiente paso sería la observación al microscopio, que será objeto de otra práctica.

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Práctica 2: OBTENCION DE CULTIVOS PUROS Introducción

Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas.

Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente iguales y constituyen un clon.

En esta práctica emplearemos dos métodos para obtener un cultivo puro: • Aislamiento por agotamiento por estrías • Aislamiento por siembra de diluciones seriadas (que será el objeto de

otra práctica más adelante). •

• Agotamiento por estrías.

Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del

inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es

obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas

distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas

bacterias originará una colonia.

Procedimiento:

1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.

2. Tomar el inóculo como se ha descrito anteriormente.

3. Transferir el inóculo a un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al

borde. Extenderlo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción

pequeña de la placa.

4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estrías sembradas la

primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de

estrías que no toque la primera.

5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operación descrita en el apartado anterior, pero

rozando al empezar la segunda tanda de estrías.

6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37ºC.

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Práctica 3: CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

Las bacterias anaerobias se pueden cultivar eliminando el oxígeno del

medio ambiente o estableciendo un potencial rédox bajo, mediante la adición de los

suficientes materiales reductores al medio de cultivo.

La protección de los cultivos anaerobios del oxígeno libre se puede

conseguir por varios métodos diferentes, el más empleado en clínica es sembrar la

bacteria en placas o tubos de cultivo e introducirlos en las llamadas jarras de

anaerobiosis donde se genera una atmósfera libre de oxígeno. Estas jarras constan de

un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética. Las

placas y los tubos sembrados se colocan dentro del soporte en el interior de la jarra

junto al sobre comercial abierto. Para crear la atmósfera anaerobia se utiliza el sobre

comercial que contiene una tableta de borohidrato sódico, otra de bicarbonato sódico

y ácido cítrico y un catalizador de paladio. Cuando se añade agua al sobre, el

borohidrato sódico, bicarbonato sódico y ácido cítrico reaccionan para formar

hidrógeno y dióxido de carbono. El catalizador de paladio cataliza la reacción entre el

hidrógeno y el oxígeno presente dentro de la jarra. Esta reacción produce agua, que se

condensa en las paredes de la jarra. Para confirmar que la atmósfera es anaerobia se

coloca dentro de la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. Éste es

azul en presencia de oxígeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio.

Esquema tomado de :http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p14.pdf

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Práctica 4: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS TEÑIDAS Para observar las bacterias teñidas es necesario, en primer lugar, hacer un

frotis de las bacterias y fijarlo. Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio

líquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden sobre el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio sólido, debe depositarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuación, se toma con el asa una pequeña parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua, realizándose la extensión como en el caso anterior.

La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.

Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar. Material: Portaobjetos. Mechero Bunsen. Asa de siembra. Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Cubetas de tinción o similar. Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y Safranina. Método: 1º) Realización del frotis y la fijación de los diferentes cultivos de bacterias Se

procederá tal y como se ha descrito anteriormente.

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2º) Tinciones: A) La TINCIÓN SIMPLE es la tinción en que se utiliza un solo colorante.

Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza básica. La técnica es la siguiente: 1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo. 2. Cubrir con colorante la preparación y dejarlo actuar durante un minuto. 3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. 4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) empleando el aceite apropiado.

Esta técnica permite observar la morfología y tamaño de las bacterias, así como los tipos de agrupaciones que forman.

B) La TINCIÓN DE GRAM es la tinción diferencial más utilizada en Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:

1. Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.

2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo.

3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol-acetona (1:1).

4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.

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El método de tinción es el siguiente:

1. Se prepara el frotis, se seca y se fija. 2. Se cubre con cristal violeta durante un minuto. 3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. 4. Se traza con lugol un minuto. El lugol actúa como mordiente aumentando la

afinidad del colorante por la bacteria. 5. Lavar con agua el exceso de lugol. 6. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparación deje de

perder color y se lava enseguida con agua abundante. 7. Se cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina,

durante un minuto. 8. Se lava con agua y se seca al aire, observándose a continuación con el

objetivo de inmersión. 3º) Observación de las tinciones de bacterias al microscopio.

Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras que las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram-positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la reacción es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas.

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Práctica 5: RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO Introducción

El método que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originará colonias separadas. Contando el número de colonias, el volumen sembrado en la placa y la dilución correspondiente, podremos calcular el número de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra inicial. Material - Muestra - Pipetas automáticas. - Tubos eppendorf. - Placas de agar LB. Método A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de esterilidad. Extender 25 µl de las diluciones 10

-2, 10

-4 , 10

-6 y 10

-8 en una placa e incubar toda la

noche. A partir del número de colonias presentes en cada dilución, calcular el número de bacterias por ml en el cultivo original.

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Práctica 6: ANTIBIOGRAMA Introducción

En nuestros días han sido puestos a nuestra disposición para la lucha contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos.

Los antibióticos son sustancias químicas producidas por microorganismos o derivados semisintéticos de éstas, mientras que los quimioterápicos son productos de síntesis química, pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana.

Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos. La evaluación de esta sensibilidad nos va a ayudar en la selección del compuesto más adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las pruebas más utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano están basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.

• Concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada.

• Concentración mínima bactericida (CMB) se define como la menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.

Fundamento

El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solución antibiótica absorbida en discos de papel de filtro. Este método está estandarizado y los halos de inhibición han sido obtenidos correlacionándolos con las CMI y aparecen en unas tablas.

Hay varios factores que afectan al halo de inhibición: la carga del antibiótico en los discos, la difusión del antibiótico en el medio de cultivo, el tamaño del inóculo bacteriano, la composición y grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de incubación.

Los discos de antibióticos son adquiridos comercialmente. Deben contener la cantidad establecida de antibiótico y ser conservados a 4ºC protegidos de la humedad.

El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland, aproximadamente 10

8 UFC/ml y ser preparado en solución salina

estéril o caldo de cultivo.

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Objetivos Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una metodología sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiología. Material necesario - Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. - Placas de LB agar. - Discos comerciales de antibióticos. - Hisopos estériles - Pinzas de laboratorio. Realización 1. Preparación del inóculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inóculo debe equivaler al estándar 0,5 de McFarland. 2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasándolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por último, pasar el hisopo por el reborde de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibióticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de inhibición. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibióticos. 3. Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18-24 horas. 4. Medir los diámetros de los halos de inhibición con una regla. Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibióticas. Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un sólo antibiótico, preparado a distintas concentraciones.

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Esquema: preparación de los discos impregnados de antibiótico para realizar un antibiograma. Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/microbi3.htm Interpretación de los resultados

Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de resistente (R), intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S).

Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg

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Práctica 7: EFECTO DE LAS ALTAS TEMPERATURAS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO Fundamento Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que normalmente crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos nucleicos. Estos primeros daños impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme una colonia sobre un medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto en duración y se efectúa a una temperatura no excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son reparables y, por eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura o en duración, los daños se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de formar colonias. Se habla entonces de efecto letal. Material necesario 3 matraces con un cultivo de la bacteria problema. 1 placa de Petri de agar LB. Micropipeta y puntas estériles. Mechero Bunsen. Baño termostático a 60ºC. Realización Se dispondrá de tres matraces con un cultivo de la bacteria problema y de una placa de Petri con agar LB. 1.- Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con el tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 15 y 30 minutos. 2.- Tomar, con una punta estéril, 25 µl de uno de los cultivos y extenderlos sobre la parte de la superficie de la placa correspondiente al tiempo t=0. 3.- Colocar los otros dos matraces en el baño de agua e incubar a 60ºC. 4.- A t= 15 y 30 minutos tomar 25 µl de muestra del matraz que corresponda y extenderlos sobre la parte de la placa correspondiente. 5.- Incubar la placa a 37ºC durante una noche. 6.- Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos (a t=0 será imposible porque se tratará de un césped).

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Práctica 8: TRANSFORMACION BACTERIANA POR RESISTENCIA A AMPICILINA

Las bacterias pueden transmitir la información genética verticalmente (de "madres" a "hijas") o de una manera horizontal (entre bacterias que coexisten al mismo tiempo).

La transferencia vertical se realiza mediante el proceso de división celular y el reparto equitativo del cromosoma bacteriano replicado. La transferencia horizontal se realiza entre células vecinas y es el mecanismo a través del cual las bacterias diseminan los genes de resistencia a antibióticos. Los vehículos mediante los cuales se transfiere el DNA horizontalmente son los plásmidos o los fagos. Un plásmido es un elemento extracromosómico con capacidad de autoreplicación y los fagos son virus de bacterias. Los mecanismos de la transferencia horizontal son: 1.-La TRANSFORMACION: por este mecanismo una célula es capaz de tomar un

fragmento de ADN del medio extracelular y expresar los genes en él contenidos.

2.-La CONJUGACION: las bacterias capaces de formar el "pelo F" pueden transferir una copia de parte de su cromosoma a otra bacteria receptora. Es un procedimiento de transmisión sexual de información genética.

3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el

ADN viral está integrado en el de la bacteria (ciclo lisogénico) se escinde del cromosoma bacteriano (pasa a ciclo lítico) puede llevarse consigo parte del genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que infecte.

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Esquemas tomados de: http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg

Para que se produzca la transformación de un bacteria ésta debe encontrarse en un estado fisiológico especial denominado "competencia". Las células competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar un ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede expresar sus genes en la bacteria transformada. Si este ADN externo tiene un origen de replicación funcional en la bacteria competente puede perpetuarse al pasar a las células hijas (plásmidos). Objetivo Demostrar como podemos conferir a una bacteria la resistencia a un antibiótico mediante transformación con DNA exógeno. Material: 1 placa de Petri con medio de agar LB con ampicilina. 1 tubo eppendorf conteniendo 100 µl de células de E. coli competentes. 1 tubo eppendorf conteniendo 1µg de plásmido pGEMt portador de un gen de resistencia a ampicilina. 1 pipeta de 0´1 ml limpia. Metodología A.-Preparación de células competentes: Las células de E. coli se cultivan en medio LB y cuando están en fase exponencial se centrifugan y se resuspenden en una disolución de CaCl2 50 mM. La concentración de las células es 10 veces la inicial.

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B.-Transformación 1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio. 2. Extender con la punta de la pipeta 50 µl de las células competentes en una

mitad de la placa. 3. Añadir el resto de las células sobre el ADN del segundo tubo. 4. Mantener 20 minutos en hielo. 5. Colocar el ADN con las células a 42º durante 1 minuto. 6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos. 7. Incubar las células a 37ºC durante 15 minutos. 8. Extender las células transformadas en la segunda mitad de la placa. 9. Incubar 20 horas a 37ºC

Observación y discusión de resultados.

Se observará que algunas de las células tratadas han adquirido resistencia a ampicilina como se puede comprobar por la aparición de colonias en la placa en que se sembraron.

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Práctica 9: AISLAMIENTO Y CARACTERISTICAS DE UN BACTERIOFAGO (VIRUS DE BACTERIAS)

Los virus son demasiado pequeños para poder ser vistos con el microscopio óptico y únicamente son visibles gracias al mayor poder de resolución que ofrece el microscopio electrónico. Los virus están compuestos de un genoma, bien en forma de DNA o RNA, y de proteínas. Son parásitos obligados y necesitan de la maquinaria metabólica de la célula huésped para la replicación de su material genético. En esencia un virus consta de ácido nucleico rodeado por una cubierta de proteína, llamada cápsida.

Los bacteriófagos son virus de bacterias que presentan todas las

características de estructura y ciclo vital que presentan los virus animales o vegetales. Se han descubierto especies de bacteriófagos que atacan selectivamente a prácticamente todas las bacterias importantes conocidas. El bacteriofago Lamba (λ) es uno de los bacteriófagos más estudiados de los específicos de E. coli. Infecta la célula uniéndose al receptor de la maltosa (proteína que permite que la maltosa entre

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en la célula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la célula bacteriana. En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisogénico y en el segundo de ciclo lítico. Objetivo La presencia de virus pasaría desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes infecciosos y que se hacen evidentes a través de los síntomas de las enfermedades que producen. El objetivo de la práctica consiste en visualizar la presencia de bacteriófagos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso. Material Dos placas de medio phage base precalentadas a 37°C. Dos tubos de vidrio con 300 µl de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4 competentes diluidas en phage broth. 10 ml de phage top agar a 55 °C. Eppendorf con 200 µl del fago φ 85 diluido en phage broth. Pipeta automática Pipeta de 5 ml estéril Pipeteador automático Metodología Tomar un tubo con 300 µl de células competentes y añadirles 200 µl de una dilución del fago. Mezclar por agitación. A partir de aquí, hacer lo mismo con el tubo con 300 µl de células competentes al que no le hemos añadido el fago. Incubar 30 min a temperatura ambiente. Añadir 5 ml de phage top agar a 55 °C. IMMEDIATAMENTE mezclar y añadir sobre la placa de phage base precalentada a 37°C. Dejar solidificar y meter en la estufa a 37°C.

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Práctica 10: IDENTIFICACION DE LEVADURAS Introducción

Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse asexualmente por gemación o fisión. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la periferia de la célula, una protuberancia (yema) que aumenta de tamaño hasta que finalmente se desprende de la pared celular, constituyendo una nueva levadura. Unas pocas especies se multiplican por escisión.

Algunas especies pueden formar micelio, y la mayoría de ellas fermentan uno o varios azúcares. Intervienen en fermentaciones beneficiosas como la fabricación del pan, vino, cerveza y quesos. También pueden intervenir en alteraciones de zumos y frutas, miel, almíbares, jaleas, carnes, vino, cerveza y otros alimentos.

Su identificación se basa en criterios morfológicos y fisiológicos. En esta práctica nos centraremos en la identificación de levaduras siguiendo pruebas morfológicas lo que nos permitirá aproximarnos al género al que pertenecen teniendo en cuenta que la identificación definitiva se hace en base a pruebas bioquímicas.

Definimos algunos términos habituales en micología. 1. Blastospora: Célula fúngica que se forma como consecuencia de un proceso de gemación. 2. Clamidospora: Espora esférica formada en las hifas, ya sea en posición intercalar o terminal, de pared gruesa y cuyo diámetro es mayor que el de los filamentos en los que se forma. 3. Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo. Las pruebas morfológicas utilizadas para la identificación de levaduras son:

• Aspecto de las colonias. • Observación microscópica de los cultivos.

Microscópicamente, es difícil distinguir en cultivos sobre agar las colonias de levaduras de las bacterianas. La mayor parte son blanquecinas y algunas cremosas o rosadas. Objetivos 1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras. 2. Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las levaduras, tales como presencia de micelio, blastosporas y clamidosporas.

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Material necesario. 1. Cultivos puros en agar Sabouraud de:

Candida pseudotropicalis Saccharomyces cerevisiae

Realización 1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras. 2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se

inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una porción de la placa. Se incuban las placas durante tres días a temperatura ambiente.

3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequeña cantidad del cultivo en medio sólido a la gota. Remover hasta formar una suspensión homogénea. Colocar un cubreobjetos

4. Observación microscópica de los cultivos. Se empleará el objetivo X10.

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Práctica 11: TINCIÓN DE ESPORAS Fundamento:

Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de formar endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.), formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. La formación de endosporas es un carácter de gran importancia en la biología de un microorganismo. La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana frente a la tinción, por lo que se utilizan técnicas especiales de coloración con verde malaquita o fucsina básica (en caliente) como colorantes.

Material: -Cultivo de Bacillus en medio sólido. -Portaobjetos. -Asa de siembra. -Mechero Bunsen. -Papel de filtro. -Verde malaquita (solución acuosa al 2%). -Safranina. -Microscopio. Método: 1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor. 2. Colocar el porta sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro de aproximadamente el mismo tamaño que la extensión (tienen por objeto mantener húmeda la preparación y evitar que los bordes del porta se manchen de colorante). 3. Añadir la solución de verde malaquita (solución acuosa al 2%), calentar con el mechero nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisión de vapores blancos.

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Continuar calentando durante 5 minutos. Añadir más colorante si éste se evapora. Es importante que la muestra no se seque. 4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro. 5. Teñir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto. 6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Se verá la endospora teñida de color verde y las células vegetativas de color rojo.

Interpretación de los resultados: La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Por ejemplo, Bacillus sphaericus posee una endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un abombamiento característico denominado en huso.

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Práctica 12: TINCIÓN DE CÁPSULA Fundamento

La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan

muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de

material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular.

Las cápsulas se pueden clasificar en función del grado de asociación con

la superficie celular, o por su consistencia:

Cápsula rígida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la

entrada de partículas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un

límite exterior definido.

Cápsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partículas.

Además, es deformable y carente de límites precisos.

Cápsula integral: íntimamente asociada con la superficie celular, con la pared

celular

Cápsula periférica: asociada a la superficie celular sólo en determinadas

condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.

Hay una cierta confusión en la nomenclatura de las cápsulas. Por eso cabe destacar

que CÁPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rígido e integral. Capas

mucilaginosas son las de tipo flexible y periférico.

Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de papel activo (metabólico)

pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:

• Adhesión a otras células: microcolonias y consorcios

• Adhesión a sustratos inertes o vivos: colonización de sus nichos

ecológicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores)

• Protección contra agentes antibacterianos

La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenación regular

radial, o a veces en láminas concéntricas. El material capsular se compone de

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macromoléculas asimétricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades

repetitivas: polisacáridos o polipéptidos.

Material

- Cepas bacterianas: Klebsiella en medio líquido

- Tinta china

- Portaobjetos y cubreobjetos

- Microscopio óptico

Método

La observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de

refracción es similar al del medio. Se recurre a tinción negativa por medio de

nigrosina o tinta china.

1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir una

gota de tinta china y mezclar bien.

2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta

china. Evitar que se formen burbujas.

3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes.

Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será

absorbido por los papeles.

4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las

manos con jabón.

5. Observar al microscopio, se debe de ver la célula teñida de negro y la cápsula

en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar

el contraste de las células.

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Práctica 13: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS FRESCOS-COCINADOS

Los alimentos son fácilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural,

en origen o durante el procesamiento y la manipulación. La multiplicación de los

microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteración inapreciable

hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una vía de transmisión de

enfermedades. Por lo tanto, el alimento puede ser vehículo de microorganismos

patógenos o de sus toxinas, con riesgo para el consumidor.

En esta práctica nos centraremos en algunas bacterias y hongos que pueden ser causa

tanto de toxiinfecciones, al ser ingeridas por el hombre, como de alteraciones

durante la conservación del alimento.

13-A: INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES

13-A-1. Recuento de microorganismos mesófilos totales (NF EN ISO 4833)

La determinación de este grupo nos da idea de la calidad de la materia prima y del

proceso de elaboración del producto. Cifras altas en este recuento pueden indicar un

proceso de alteración del alimento, aunque no necesariamente hay que relacionarlo

con la presencia de gérmenes patógenos.

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri estériles vacías PCA fundido estéril para recuento en placa

Método

1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,

10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a una serie de tres placas de Petri vacías estériles.

2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 45-

50 °C.

3. Incubar durante 24 h-72 h a 30 °C. Recuento de placas en las que el número

de colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.

4. Tinción de Gram de colonias con diferentes morfologías.

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13-A-2. Recuento de Enterobacteriaceae (NF EN ISO 7402)

Las bacterias pertenecientes a la familia Enerobacteriaceae son bacilos Gram

negativos que se caracterizan por ser:

. Bacilos Gram negativos

. Citocromo c oxidasa negativos

. Fermentadores de la glucosa

. Reductores de nitratos a nitritos

Se aíslan del intestino del hombre y de los animales, y su presencia en los alimentos

en niveles altos hace pensar en una elaboración inadecuada y/o contaminación

posterior. En esta práctica se hace un recuento de Enterobacteriaceae totales sin

llegar a identificar los géneros.

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri estériles vacías VRBG fundido para recuento en placa Placas de agar nutritivo Tubos KIA Reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio

Método

1. Añadir con pipetas estériles, a partir de dos de las diluciones decimales y por

duplicado (10 -2, 10 -3), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.

2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBG fundido y atemperado a 45-

50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).

3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de

colonias esté comprendido entre 30 y 300. Las colonias características son de

color violeta con un halo de precipitación alrededor.

4. Confirmar las colonias típicas aisladas mediante pase a agar nutritivo

(incubación 24h a 37 C) y a partir de ahí, realizar la prueba de la oxidasa y

siembra en agar KIA y tinción de Gram. Cálculo de ufc/gramo.

13-A-3. Recuento de Mohos y levaduras (NF ISO 7954:1988)

Se investiga la presencia de mohos y levaduras por ser potencialmente productores

de micotoxinas y porque pueden llevar a cabo procesos de alteración del alimento.

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En esta práctica se aísla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibiótico

oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano.

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio OGA

Método


10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA.

2. Incubar durante 5 días a 25 °C. Recuento de placas en las que el número de

colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.

13-B: DETERMINACIÓN DE INDICADORES DE FALTA DE HIGIENE

13-B-1. Recuento de coliformes totales en placa (NF ISO 4832,1991)

Los coliformes es un grupo perteneciente a las enterobacterias que además de

fermentar la glucosa también fermenta la lactosa. A este grupo pertenece E. coli que

es un indicador de contaminación fecal.

Características estructurales y fisiológicas de los coliformes:

. Bacilos Gram Negativos

. Citocromo C oxidasa negativos


. Fermentadores de la lactosa


Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio VRBL

Método


10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.

2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBL fundido y atemperado a 45-

50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).

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3. Incubar durante 24 horas a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de

colonias esté comprendido entre 30 y 300. Tinción de Gram. Cálculo de

ufc/gramo.

13-B-2. Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia

Escherichia coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo

coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con producción de ácido y gas

a 37°C. Además, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentación a 44°C.

Es de interés su investigación en alimentos por ser indicador de contaminación

fecal, que implica una mala manipulación del producto.

Características estructurales y fisiológicas:




. Fermentadores de la lactosa

. Productores de indol a 44°C


Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Tubos con caldo EC con campana Tubos con caldo de triptona Reactivo de Kovacs

Método

1. Siembra de 10 ml de muestra (dilución 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble

concentración con campana, precalentados a 44°C.

2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44°C.

3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la

campana.

4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con

caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44°C

durante 24-48 horas.

5. Añadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol.

45


13-B-3. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos (ISO 6888,1999)

Staphylococcus aureus pertenece a la familia Micrococaceae y es coco Gram

positivo, catalasa positivo y anaerobio facultativo, que se caracteriza por la presencia

de coagulasa (coagula soluciones de plasma). Es un germen ubicuo que se encuentra

en la piel y cavidad nasofaríngea del hombre y de numerosas especies animales,

especialmente en las mamas de vacas y ovejas de donde contamina leche y otros

alimentos. Esta bacteria es el agente etiológico de la intoxicación estafilocócica,

aunque no todas las cepas de esta especie son enterotoxigénicas (capacidad de formar

enterotoxinas).


. Coco Gram positivo

. Aerobio-anaerobio facultativo

. Catalasa positivo

. Coagulasa positivo

. Fermenta el manitol

. Posee enzima lecitinasa

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Placas de Petri con medio agar Baird Parker Tubos con caldo BHI y tubos con plasma de conejo/EDTA

Método


10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio Agar Baird Parker.

2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. Recuento de placas en las que el número

de colonias esté comprendido entre 15-150 (típicas y no típicas).

3. Confirmar tres colonias típicas y 3 no típicas mediante siembra en caldo BHI.

Incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.

4. Añadir 0,1 ml a tubos estériles que contienen 0,3 ml de plasma de conejo con

EDTA. Incubar durante 4-6 horas para observar la aparición del medio

solidificado por la acción del enzima coagulasa

5. Los resultados Staphylococcus coagulasa + se expresan como ufc/g o ml

multiplicando el número de colonias confirmadas positivas, por 10 (porque

hemos sembrado 0,1 ml por placa) y por el factor de dilución.

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13-C: INVESTIGACIÓN DE PATÓGENOS

Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al

ser ingeridos por el hombre.

13-C-1. Presencia de Salmonella (NF EN ISO 6579,2002)

Salmonella es una enterobacteria patógena causante de importantes trastornos

gastrointestinales, por lo que resulta de interés su investigación en Microbiología de

los alimentos. La legislación española actual no admite la presencia de esta bacteria

en los alimentos, por lo que se lleva a cabo un análisis de presencia o ausencia.

Los animales son el reservorio principal de la enfermedad humana, excepto para las

bacterias responsables de las fiebres tifoidea y paratifoidea en las que el único

reservorio es el hombre. La manifestación de la enfermedad puede ser subclínica

(portadores asintomáticos) o bien producir cuadros de enteritis, septicemia o fiebre

intestinal.

La transmisión se lleva a cabo por ingestión de alimentos contaminados

(especialmente pollos, huevos y productos lácteos).

Control: Preparación y refrigeración adecuadas de los alimentos. Mejora de la

higiene.



. No forman esporas


. Anaerobios facultativos

. Catalasa positivos


. No fermentadores de la lactosa


. Móviles por flagelos peritricos, excepto S. typhi y S. paratyphi.

. Requerimientos nutricionales simples

. No tienen actividad ureasa

. Son lisina y ornitina positivos

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Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml Agua de peptona tamponada (BPW) Placas de Petri con medio XLD Placas de Petri con medio BGA Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja

Método

1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril

y añadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el

stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 °C.

2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,

1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann

tetrationato e incubar a 37 °C durante 24 horas. Por separado, añadir 0,1 ml

de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis

Soja en incubarlo a 42 °C durante 24 horas.

3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar los caldos de

enriquecimiento y a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por

estrías en medio selectivos para Salmonella (XLD y BGA). Incubar las placas

a 37°C durante 24-48 horas.

Nota: Salmonella crece en XLD formando colonias rosas con centro negro

salmón. En BGA las colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el

medio a un rosa intenso.

4. Confirmación bioquímica y serológica: Si se considera conveniente, se

pueden realizar a partir de las colonias presuntivas de Salmonella pruebas

confirmativas bioquímicas y/o serológicas

13-C-2. Presencia de Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1, 1997)

Listeria es una bacteria ubicua que se encuentra principalmente en los pastos, desde

donde contamina vegetales y animales y posteriormente alimentos. Por ser una

bacteria psicotrofa y osmotolerante es capaz de multiplicarse en condiciones en las

que otros microorganismos quedan inhibidos. El género Listeria incluye 7 especies,

de las cuales la única patógena para el hombre el L. monocytogenes.


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. Bacilos Gram positivos

. Oxidasa negativos

. Esculina positivos

. Catalasa positivos


. Móviles

. Sulfhídrico negativos

Las distintas especies se pueden diferenciar por:

. Hemólisis

. Prueba de CAMP

. Producción de ácido a partir de xilosa

. Producción de ácido a partir de ramnosa

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml caldo Fraser demi caldo Fraser Placas de Petri con medio Oxford Placas de Petri con medio Palcam

Método

1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril

y añadir 225 ml de caldo Fraser demi. Homogeneizar con el stomacher.

Incubar la bolsa 24 horas a 30 °C.

2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,

0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Fraser e

incubarlo a 37 °C durante 24 horas. Los tubos que contienen Listeria se

ponen de color negro.

3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar el tubo de Fraser y realizar

un agotamiento por estrías en medio selectivos para Listeria (Oxford y

Palcam). Incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas.

Nota: Listeria crece en Palcam formando colonias pequeñas, negras-grisáceas,

rodeadas de un halo negro y deprimidas en el centro. En Oxford las colonias de

Listeria son verde grisáceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro y

deprimidas en el centro.

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4. Confirmación bioquímica: Para confirmar las colonias sospechosas como

pertenecientes al género Listeria, se realizarán las siguientes pruebas:

iluminación de Henry (positiva), tinción de Gram (bacilo Gram positivo) y

catalasa (positivo). Si las pruebas son positivas continuar la identificación de

la especie. L. monocytogenes es hemolítica, CAMP positiva, y fermenta la

ramnosa, pero no la xilosa.

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Práctica 14: RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS

Algunas bacterias productoras de esporas (Bacillus, Clostridium) resisten algunos

procesos de conservación utilizados en la industria alimentaria en los que las formas

vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. También especies de estos

géneros provocan enfermedades alimentarias.

14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 Placas de Petri estériles vacías PCA fundido para recuento en placa

Método

1. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a

placas de Petri vacías estériles.


50 °C.

3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de

colonias esté comprendido entre 30 y 300. Tinción de Gram y de esporas de

los distintos tipos de colonias.

14-B RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y

ANAEROBIAS

Material

Muestra Balanza de precisión Pipetas automáticas de 1 Placas de Petri estériles vacías PCA fundido para recuento en placa Medio Schaedler fundido para recuento en placa Jarra de anaerobiosis

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Método 1. Calentar el tubo de muestra (dilución 10 -1) a 80 °C en el baño durante 10

minutos. Este tratamiento térmico destruye las formas vegetativas pero lo

resisten las esporas.

2. Hacer una dilución decimal en caldo de peptona del tubo previamente

sometido a calor.

3. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a

placas de Petri vacías estériles.


50 °C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y

atemperado a 45-50 °C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso

añadir doble capa).

5. Incubar durante 24 h a 37 °C. Las placas de anaerobios se incuban en una

jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el número de colonias

esté comprendido entre 30 y 300. Comparación con el recuento de aerobios

mesófilos. Tinción de Gram y esporas.

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Práctica 15: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Y DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS

Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en

el agua, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. Cuando el tema a

tratar es la microbiología de alimentos, es importante determinar el grado de

contaminación ambiental, ya que las condiciones higiénicas del lugar de trabajo

(utensilios, superficies, etc.) y del propio manipulador van a influir en el número y

tipo de microorganismos del alimento.

15-A ANÁLISIS DEL AIRE

El aire, además de partículas en suspensión, es portador de bacterias o sus esporas.

Por ello, puede ser causa tanto de contaminación de alimentos y superficies como de

infecciones en el hombre (patologías respiratorias, etc.). Existen distintos métodos

para el análisis del aire: sedimentación, filtración, choque en líquidos y precipitación

electrostática, entre otros. En esta práctica vamos a explicar el primero, por ser uno

de los métodos más empleados. El método de sedimentación en placa es uno de los

más sencillos para la determinación de microorganismos del aire. A pesar de ello, los

resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en

el aire, ya que estos niveles varían en función de las corrientes de aire y del tamaño

de las partículas en suspensión.

Material

Placas de PCA Método

1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminación se desee

examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas.

2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 °C.

3. Determinar el número de aerobios mesófilos totales ambientales.

15-B ANÁLISIS DE SUPERFICIES

Para llevar a cabo una correcta manipulación de los alimentos es necesario mantener

una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios que

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hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los

productos llevarán microorganismos. En la manipulación, el envasado y el

almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo

momento en niveles que aseguren la calidad microbiológica del alimento. El objetivo

de los análisis microbiológicos de superficies es comprobar el estado higiénico del

lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el

procesado de los alimentos. Existen distintos métodos para el examen microbiológico

de las superficies: método del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar,

de la lengüeta (o película pegajosa), etc. En esta práctica se describen el método del

hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac

(para el estudio de superficies planas).

15-B-1. Análisis de superficies no planas (método del hisopo)

Este sistema es el más antiguo y el más utilizado en el examen microbiológico de

superficies, ya que sirve para el análisis tanto de superficies planas como no planas.

Es especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios

(máquinas picadoras de carne, cubiertos, etc.). Además, se pueden estudiar

superficies muy contaminadas, ya que a partir de la solución salina estéril es posible

realizar las diluciones decimales precisas.

Material

Plantilla de papel de aluminio estéril Hisopo estéril 10 ml de solución salina estéril Placa de PCA y VRBG

Método

1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de

aluminio estéril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm2).

2. Humedecer el hisopo estéril en una solución de 10 ml de solución salina

estéril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla.

3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solución salina estéril y dejar

durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodón

al caldo.

4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA y VRBG.

5. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. El resultado se expresa en ufc/9 cm2

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15-B-2. Análisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC: replicate

organisms direct agar contact)

Material

Placas Rodac Medio PCA fundido y atemperado a 55°C

Método

1. El medio PCA, una vez fundido y atemperado a 55°C, se vierte en las placas

de manera que sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con

la superficie a examinar.

2. Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida.

3. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. La superficie delimitada por las placas

es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en ufc/25 cm2

Nota: el principal inconveniente de este método es su ineficacia en superficies muy

contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes

en la superficie. Sin embargo, se obtienen buenos resultados en los casos en los que

la carga microbiana es baja.

15-C ANÁLISIS DE MANIPULADORES

Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador

quien lo contamine durante el procesado. Consideramos normal que el manipulador

tenga una abundante carga microbiana en su piel, pero nunca deberán aislarse de ella

bacterias patógenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la

necesidad de que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene

durante el procesado de los alimentos. El objeto de un análisis de manipuladores es

comprobar que la persona que procesa el alimento no es una fuente de contaminación

de éste. Se pueden estudiar: manos, uñas y fosas nasales.

Material

Hisopo estéril Placa de VRBG y Agar Manitol Sal.

Método

1. Para realizar esta práctica el alumno no se lavará las manos. Pasar los dedos

por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.

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2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la

mitad restante de la placa.

3. Tomar con un hisopo estéril muestra del interior de la nariz y sembrar el

hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.

4. Incubar durante 24 horas a 37 °C.

5. Observar el crecimento de las colonias características en cada medio de

cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de

Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus

aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y

Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).

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Práctica 16: UTILIZACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

No todos los microorganismos son patógenos o alterantes, sino que algunos de ellos

pueden ser aprovechados por el hombre en la fabricación de diferentes productos.

Éste es el caso de las levaduras que se emplean por ejemplo, en la elaboración del

pan y bebidas alcohólicas como vino y cerveza. También se utilizan bacterias en la

fabricación de productos lácteos, embutidos, etc.

El objetivo de esta práctica consiste en comprobar la transformación que algunos

microorganismos llevan a cabo sobre diferentes materias primas para dar lugar a

productos aprovechables para la alimentación humana. Se propone la realización de

dos tipos de fermentación que se caracterizan por subproductos finales, de ahí los

nombres de fermentación láctica y fermentación alcohólica.

16-A PREPARACIÓN DE YOGUR

La fermentación láctica es producida por bacterias capaces de transformar azúcares

en ácido láctico, disminuyendo de tal manera el pH del medio, que impiden el

crecimiento de otros microorganismos. De este modo, la fabricación de yogur y de

otros productos lácteos fermentados tuvo su origen como un método de conservación

de la leche. La leche fresca tiene un pH de aproximadamente 6,6. A este pH, la

caseína (proteína de la leche) está formando una suspensión coloidal de caseinato

cálcico. Conforme las bacterias lácticas van fermentando los azúcares, con

producción de ácido láctico, el pH disminuye y, al llegar a 4,6 la caseína se

desnaturaliza y la leche se coagula formando un producto semisólido, que es el

yogur.

Material

2 tubos estériles con 5 ml de leche pasteurizada yogur comercial

Método 1. Inocular uno de los tubos mediante el asa de siembra con el cultivo iniciador

de la fermentación procedente de un yogur comercial. El otro tubo no se

inocula y queda como control.

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2. Incubar los dos tubos durante 16 horas a 46-48 °C para favorecer el

crecimiento de estas bacterias, ya que son termófilas. Nota: también se

pueden incubar a 37 °C durante 24 horas.

3. Comprobar que se ha producido una fermentación láctica si la leche ha

coagulado en el tubo inoculado. En el tubo control no inoculado se mantienen

las características iniciales: la leche es líquida.

4. Mediante tinción de Gram se confirma la presencia de bacilos y cocos

responsables de la fermentación. En el tubo control no se observa ninguna

bacteria.

Fermentación láctica

16-A PREPARACIÓN DE CERVEZA

La cerveza es el producto que se obtiene de una fermentación alcohólica llevada a

cabo por levaduras sobre distintos cereales: cebada, maíz, arroz. Estos cereales

contienen almidón que no es fermentable por levaduras, por lo que previamente debe

ser hidrolizado a azúcares más sencillos: glucosa y maltosa. La harina de malta es la

cebada germinada y contiene gran cantidad de amilasas, enzimas responsables de la

hidrólisis del almidón. La activación de estas enzimas se produce a 75 °C, actuando

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sobre el almidón para romperlo en sus azúcares fermentables. De esta forma, la

levadura puede llevar a cabo la fermentación alcohólica para dar Co2 y etanol.

Material

2 tubos con harina de malta al 5% Saccharomyces cerevisiae

Método 1. Preparar en un vaso de precipitados una suspensión en agua de harina de

malta al 5%. Es necesario mantener la suspensión en agitación, ya que la

harina no es perfectamente soluble en agua.

2. Llenar dos tubos de tapón de rosca prácticamente hasta el borde, de manera

que se genere una atmósfera microaerófila.

3. Incubar los dos tubos durante 1 hora a 75 °C para que se activen las amilasas

y rompan el almidón.

4. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 min para eliminar los posibles

microorganismos presentes y asegurar que la fermentación se debe

únicamente a la levadura.

5. Una vez enfriados los tubos a temperatura ambiente, inocular uno de ellos con

Saccharomyces cerevisiae mientras que el otro tubo no se modifica en

absoluto (tubo control). Nota: el inóculo se prepara resuspendiendo 29 mg de

levadura en 1 ml de solución salina estéril.

6. Incubar los dos tubos a temperatura ambiente durante varios días. En función

del inóculo añadido varía el tiempo necesario para la producción de la

cerveza.

7. Solamente en el tubo que contiene la levadura se producirá la fermentación

alcohólica, que se visualiza mediante la aparición de burbujas de CO2. Nota:

la cerveza así obtenida se puede filtrar y beber, aunque su sabor no es el de

una cerveza comercial, ya que no se le ha añadido lúpulo.

Fermentación alcohólica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Prueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son proteínas que forman

parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo

respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo

Enterobacterias (carecen del citocromo c) del género Pseudomonas (poseen

citocromo c).

Procedimiento: Añadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-p-

fenilendiamonio (incoloro). Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas

en placa y mezclar con el colorante. El colorante se oxida rápidamente en

presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul). Si la prueba es

negativa no habrá viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo).

Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima

triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros

coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es

el compuesto que se detecta en este ensayo.

Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de

proteínas animales es especialmente rico en triptófano) con una colonia. Incubar a

37 °C durante 24 horas. Añadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de

color rojo en la superficie del caldo, la prueba será considerada positiva.

El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede

reaccionar tanto con el indol como con el triptófano, produciendo compuestos de

coloración rojiza. Para evitar la interferencia del triptófano, el p-

dimetilaminobenzaldehido está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua.

A diferencia del triptófano, el indol es soluble en alcohol isoamílico, y por tanto,

sólo él reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado.

Galería API 10S: es una galería de varias pruebas bioquímicas simultáneas que

identificarán/confirmarán la enterobacteria que hemos aislado del producto

alimenticio.

Procedimiento: Añadir agua a la cámara de incubación (5 ml aproximadamente).

Coger 5 colonias y resuspender en 5 ml de agua destilada estéril (esto da una

turbidez aproximada de 0,5 en la escala de Mc Farland). Rellenar los pocillos del

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API (no la cúpula) con una pipeta Pasteur. El símbolo significa que el pocillo ha

de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la

cúpula del pocillo. Incubar a 37 °C durante 24 horas.

Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qué pocillos la prueba

correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un

cambio de color, la aparición de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de

fenilalanina necesitan reactivos apropiados (Kovacs y cloruro férrico

respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los números que

hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como éstos se encuentran

agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de números o código

que nos permitirá identificar la bacteria.

Prueba de CAMP: Permite distinguir la especie de Listeria que hemos aislado,

ya que L. monocytogenes potencia la β-hemólisis producida por S. aureus,

mientras que L. innocua no.

Procedimiento: sembrar en una placa de agar sangre una estría vertical de una

cepa beta-hemolítica de S. aureus. En una de las dos mitades, sembrar las cepas

control de dentro hacia fuera (sin llegar a tocar la estría central) en dos estrías

perpendiculares a la estría de S. aureus. En la otra mitad, sembrar una estría de la

muestra. Incubar a 37 °C durante 24 horas. Si la cepa aislada es CAMP positiva,

se observará una potenciación de la hemólisis en la zona de intersección, con

forma en punta de flecha.

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manual practicas microbiologia alimentos

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