microbiologia d alimentos

8/6/2019 microbiologia d alimentos

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Elaborado por: Mnica Mara Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos.Alba Manuela Durango Villadiego. MSc.

TABLA DE CONTENIDO


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1. INTRODUCCIN 12. GUA N 1: Tcnica Ecomtrica. 23. GUA N 2: Estudio microbiolgico a manipuladores, utensilios ymedio superficies, ambiente. 74. GUA N 3: Cuantificacin de microorganismos por el

mtodo de recuento en placa. 145. GUA N 4: Tcnica del nmero ms probable (NMP). 226. GUA N 5: Recuento de mesfilos aerobios y facultativos viables. 317. GUA N 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de

origen animal o vegetal. 338. GUA N 7: Recuento deStaphylococcus aureus coagulasa positiva. 369. GUA N 8: Recuento de Mohos y levaduras. 3910. GUA N 9: Investigacin deSalmonell a en alimentos. 4111. GUA N 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 4412. GUA N 11: Recuento deBacillus cereus . 4713. GUA N 12: Investigacin deListeria monocytogenes . 5014. GUA N 13: Investigacin deVibrio parahaemolytico . 5315. GUA N 14: Control microbiolgico de conservas no alteradas. 5616. GUA N 15: Recoleccin de muestras de agua para

Anlisis acteriolgico. 5917. GUA N 16: Cuantificacin de microorganismos por el

mtodo de filtracin por membrana. 6318. GUA N 17: Nmero ms probable dePseudomona aeruginosa . 6719. GUA N 18: Presencia-ausencia de coliformes en muestras de

agua (mtodo del sustrato definido). 6920. GUA N 19: Prueba del tiempo de reduccin del azul de

metileno (T.R.A.M.). 7121. GUA N 20: Microbiologa de leche y derivados. 7322. GUA N 21: Microbiologa de crnicos. 7623. GUA N 22: Microbiologa de ovoproductos. 7924. GUA N 23: Microbiologa de pescados y mariscos. 8225. GUA N 24: Microbiologa de frutas y hortalizas. 8526. GUA N 25: Microbiologa de cereales y panificacin. 8827. GUA N 26: Microbiologa de bebidas. 91

28. GUA N 27: Microbiologa de aguas. 9429. ANEXOS 96

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LISTA DE TABLAS


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1. TABLA No.1: Tabla de NMP y lmites de confianza cuando se usan

5 tubos con 10 ml de muestra. 262. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos paramuestras puras. 26

3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos paramuestras diluidas. 27

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LISTAS DE FIGURAS


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1. Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica. 52. Figura No. 2 Diluciones decimales. 193. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. 204. Figura No. 4: Siembra en Superficie. 215. Figura No. 5: Tcnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras

lquidas) 28.6. Figura No. 6: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras

lquidas). 297. Figura No. 7: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas

lquidas o slidas) 30

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La calidad de los alimentos est constituida por tres reas de estudio, lascuales son: calidad microbiolgica, calidad fsico-qumica y calidad sensorial.Entre estas reas la que revista mayor importancia es la calidad microbiolgica,puesto que a travs de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos,

es decir, su capacidad de no producir dao (enfermedad) a las personas que loconsumen.

Para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de los alimentos es necesariodisponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materiasprimas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo(envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de laempresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente).

En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se deben contar con unadotacin mnima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras,baos termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro;con una dotacin de medios de cultivo y reactivos, los cuales se debenencontrar en ptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de materialde vidriera.

El laboratorio adems debe contar con un sistema de calidad en el cual secontemplen los procedimientos de preparacin de medios de cultivo yreactivos, los procedimientos de limpieza y desinfeccin de materiales, equiposy reas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cualdebe contar con una formacin en el rea donde se desempear.

En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo elanlisis microbiolgico de los alimentos.

UNIVERSIDAD DE CRDOBA


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FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLASPROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

GUA N 1: TECNICA ECOMETRICA1. INTRODUCCIN

En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se debe realizar una evaluacinsistemtica de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en ellaboratorio y an los comerciales, ya que stos varan ampliamente segn sucomposicin, modo de preparacin, etc. Es muy importante el control que setenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de losresultados.

Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado unatcnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimientoefectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y lainhibicin de la flora acompaante. Esta tcnica se ha denominadoecomtrica porque evala la susceptibilidad de los medios de cultivo a lacolonizacin por cepas interferentes.

Esta tcnica implica una siembra por estra con ayuda de un asa bacteriolgica,obtenindose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en nmerodecreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura N 1 seilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismosque se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar coloniasvisibles, an en la estra central. En cambio los microorganismos que sesuponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formar colonias mas all del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante(Ver figura 1).

2. OBJETIVO

Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediantela tcnica ecomtrica.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos y cepas Materiales*6 cajas de agar selectivo ( EMB,hektoen, BPLS,salado manita,Baird Parker)

3 suspensiones de cepas demicroorganismos que deben crecer enel medio de cultivo

asasbacteriolgicas

3 suspensiones de cepas demicroorganismos que no deben crecer en el medio de cultivo

incubadoraMecherosCinta deenmascarar

* Algodn y alcohol al 70%4. PROCEDIMIENTO


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1. Tomar 6 cajas del medio a analizar.2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como seobserva en la figura 1.3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que

supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo.4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismosque supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo.5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5estras en cada cuadrante y una estra central (Ver figura 1), sin quemar elasa y tomando inculo slo una vez.6. Incubar a 37C por 24-48 horas.

5. RESULTADOS

1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantesde cada caja.

2. El resultado se expresa como un nmero de 6 cifras. Se anota un nmerode 0 a 5 segn el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estracentral considerada como la quinta.

3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmenteel microorganismo utilizado.

4. Al final se informar un nmero de 6 cifras.

6. INTERPRETACIN Y REPORTE

Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismosque deben crecer y las tres ltimas cifras los sectores positivos de crecimientopor parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. As un medioselectivo perfecto dara un resultado de 555000, pero en la prctica se aceptala frmula 55001 o an otra ms desfavorable. Se reporta segn lasindicaciones de la hoja de informe.

7. BIBLIOGRAFA

1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. EditorialPanamericana. Buenos Aires, Argentina.2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos

para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995.3. ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual de

Bioseguridad. Editorial Ginebra. 2 edicin, 1994.4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiologa de los alimentos. Fundamentos

ecolgicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de losalimentos. Editorial Acribia.

5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.

38. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO


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Todos los grupos deben traer:

Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.

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CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVOTCNICA ECOMETRICA

INFORME

1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________ 2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________

_________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________

No de caja Sectores positivos Microorganismo1 _______________ ___________________ 2 _______________ ___________________ 3 _______________ ___________________ 4 _______________ ___________________ 5 _______________ ___________________ 6 _______________ ___________________

La frmula final obtenida ser: _____________________________________

Conclusin: ____________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

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Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica

Microorganismos que SI crecen Microorganismos que NOcrecen

6UNIVERSIDAD DE CRDOBA


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GUA N 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES,SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE.

1. INTRODUCCINPara asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atencin tanto a losmicroorganismos patgenos como a los alterantes, que pudieran llagar a lasmaterias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), delos equipos, tuberas, superficies, aire, etc.

Segn el Ministerio de la Proteccin Social se denomina manipulador a todapersona que trabaje a cualquier ttulo y aunque sea ocasionalmente, en unlocal o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan,procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos omaterias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, elmanipulador juega un papel importante en la fabricacin de sus productos, yaque se puede convertir en una fuente de contaminacin.

Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, lossitios de importancia donde residen los microorganismos saprfitos y que seconstituyen en una fuente de contaminacin para manipuladores de alimentosson la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismomas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, estemicroorganismo reside tambin en las fosas, tracto nasofarngeo y la mayorade las veces se encuentra asociado a furnculos, heridas y lesiones de la piel.Debido a sus condiciones metablicas, esta bacteria puede crecer y/oreproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine losalimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado comoindicador de contaminacin por manipuladores. La presencia deStaphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indicacontaminacin a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. Laimportancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad quetiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causar

intoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es elagente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicacinalimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir enuna fuente de contaminacin.

Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, puedentransferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son loscoliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal,especficamente de la regin anal, la presencia de estos tambin se investigaen las manos dedos y uas de los manipuladores e indican contaminacin deorigen fecal.

7Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos:


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1. No presentar heridas, ni afecciones cutneas en brazos o manos.2. No padecer enfermedades infectocontagiosas.3. Practicar buena higiene personal.4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las reas de envasado se

hace indispensable el uso de mascarilla.

5. Recibir capacitacin sobre manejo higinico de alimentos.Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricacino preparacin de alimentos, deben estar diseados, construidos, instalados ymantenidos de tal forma que se evite la contaminacin del alimento y se faciliteel proceso de limpieza y desinfeccin de los mismos. Igualmente es importanteel estudio microbiolgico del aire (ambiente), ya que este se pone en contactocon los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambienteadecuado, debidamente desinfectado o esterilizado.

2. OBJETIVOS

1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva enfosas nasales y zona farngea de los manipuladores, mediante la realizacinde frotis y cultivos.

2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparacin delnmero de UFC antes y despus del lavado.

3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos,dedos y uas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos.

4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equiposy las superficies.

5. Evaluar la contaminacin del ambiente.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram Escobillones estrilA. Ogy Aceite de inmersin Baja lengua estrilA. Plate count Plasma fresco Gasa estrilA. EMB Reactivo de Kovacs Portaobjetos estrilesA. Prpura Bromocresol Microscopio

Caldo BHI IncubadoraCaldo Brilla Bao serolgicoCaldo Indol Tubo taparosca estrilCaldo lactosado Asa bacteriolgica* Algodn y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO


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4.1. MANIPULADOR

4.1.1. Fosas nasales y Faringe

1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestrafarngea y nasal respectivamente.2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua.3. Frotar con un escobilln los pilares amigdalianos, realizar un frotis y

sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol).4. Introducir un escobilln en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las

paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar BairdParker (Salado de Manitol).

5. Incubar por 24-48 horas a 37C.6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar

colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros quecontrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halosamarillos).

7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de inters ycolorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupadosen racimos.

8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusincerebro corazn (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales yfaringe.

9. Incubar por 24 horas a 37C.10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml

de plasma fresco, incubar a 37C en bao serolgico por 4 horasobservando cada hora la formacin de coagulo.

4.1.2. Manos

4.1.2.1. Evaluacin del mtodo de desinfeccin

1. Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Prpura deBromocresol.

2. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace.3. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Prpura de

Bromocresol.4. Incubar ambas cajas a 37C por 24-48 horas.5. Observar y contar el nmero de UFC en las cajas de Agar Prpura de

Bromocresol, antes y despus del lavado.

4.1.2.2. Evaluacin de contaminacin fecal

1. Frotar un escobilln humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uasdel manipulador.

2. Introducir el escobilln dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubodurham.

93. Tapar bien el tubo.


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4. Incubar a 37C por 24-48 horas.5. Realizar la lectura (turbidez y produccin de gas indican presencia de

coliformes totales).6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de

Agar EMB.

7. Incubar a 37C durante 24 horas.8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas decoliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metlico).

9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubodurham) y a uno con caldo indol.

10. Incubar en bao serolgico a 45C por 24-48 horas, asegurndose de queel nivel del agua cubra el medio de cultivo.

11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para ladeterminacin de indol.

12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la produccin deindol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales).

Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia deColiformes fecales .

4.2. ESTUDIO MICROBIOLGICO A UTENSILIOS, EQUIPOS YSUPERFICIES.

Procedimiento de la esponja o gasa estril.

1. Con la ayuda de una bolsa de plstico, a manera de guante, tomar laesponja estril, evitando posibles contaminaciones.

2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear elutensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda elrea.

3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operacin yagregar el resto del caldo lactosado.

4. Cerrar y marcar la bolsa.5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente.6. Incubar la bolsa con la espoja a 37C durante 24 horas.7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla.8. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez.

10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2.4.3. ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE.

4.3.1. Evaluacin de la Contaminacin Bacteriana.

1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos.2. Cerrar la caja e incubar a 37C por 24-48 horas.3. Contar y reportar el nmero de colonias.

104.3.2. Evaluacin de la Contaminacin Fngica.


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4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos.5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 das a 22C.6. Contar y reportar el nmero de microorganismos.


5.1. Fosas nasales y zona faringea

La determinacin del Staphylococcus aureus en estos casos es consideradauna prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva onegativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva.

5.2. Manos

Evaluacin del mtodo de desinfeccin.

Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos enmanipuladores y se reporta la diferencia entre las UFC antes y despus dellavado.

Evaluacin de la contaminacin fecal.

La determinacin de coliformes totales y fecales, en este caso es una pruebade presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales ofecales; indican que el proceso de sanitizacin no es el ideal o contaminacinde origen fecal.

5.3. Estudio microbiolgico a utensilios, equipos o superficies.

La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpiezay desinfeccin no es el adecuado o contaminacin de origen fecal.

5.4. Evaluacin microbiolgica al ambiente.

Se reporta el nmero de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos,

si es mayor indica que el ambiente est contaminado y se debe repetir elproceso de desinfeccin o esterilizacin del ambiente.

6. BIBLIOGRAFA

1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. EditorialPanamericana. Buenos Aires, Argentina.

2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentospara el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995.

3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobremanipuladores, 1997.

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4. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos.Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos.Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez.Medelln, 1994.

7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIOTodos los grupos deben traer:

Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar



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GUA N 3: CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODODE RECUENTO EN PLACA.

1. INTRODUCCINEl recuento en placa es el mtodo ms utilizado y ms recomendado por laComisin Internacional sobre especificaciones Microbiolgicas en los alimentos(ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificacin de la poblacinmicrobiana presente en los alimentos slidos o lquidos, sembrando enprofundidad o en superficie. La mayora de los alimentos no son estriles, sinoque contienen una poblacin microbiana, que vara ampliamente en nmero,dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan dilucionespara su cuantificacin, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir,presentaran un recuento tan alto que sera imposible realizar su conteo. Paraeso se utilizan las diluciones logartmicas en base 10 (10 -1, 10-2, 10-3, 10-4), lascuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicandopor el factor de dilucin, que es el inverso de la dilucin. La dilucin inicialsiempre ser 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestrava a depender del tipo de alimento y de los parmetros que existan, pero loimportante que se guarde la relacin: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partesde diluyente.

2. OBJETIVOS1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos

slidos o lquidos.2. Realizar diluciones logartmicas en base 10 a partir de los homogenizados.3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate

count.4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar

correspondiente.5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, despus de evaluar la

calidad de los controles y de las diluciones.6. Informar el nmero de UFC/g ml de alimento.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar Plate count BalanzaAgar leche Cuchillos-cucharasAgar EMB IncubadoraAgar Tributirina Contador de colonias

Asa bacteriolgicaBolsas de polipropilenoCajas petri estriles

* Algodn y alcohol al 70%


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4. PROCEDIMIENTO

4.4. PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES

1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse enrefrigeracin a 4C por un tiempo mximos de 24 horas.

2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento.3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla

como dilucin 10-1.4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilucin 10-2 y dilucin 10-3,

adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%.5. Agitar unas 25 veces las muestras lquidas, formando un arco con el

antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si elrecipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra ytomar una parte representativa del producto. Para muestras slidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes.

6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco quecontiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta ms de 10 veces,hasta homogenizar la mezcla; as se obtiene la dilucin 10 -1.

7. Tomar 1 ml de la dilucin 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml deagua peptonada al 0.1% marcado con la dilucin 10 -2. Mezclar unas 10veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilucin 10 -2.

8. Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilucin10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. As se obtiene ladilucin 10-3.

9. De esta forma se tienen las diferentes diluciones, el nmero de ellas va hadepender del alimento y de los parmetros que existan, pero debensembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 )

4.5. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.

1. Tomar 5 cajas de petri estriles y marcarlas en la tapa como dilucin 10 -1,10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; adems escribir en cada

una de ellas el N del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y elnmero de la muestra.2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilucin 10 -1 y tomar 1ml de la

dilucin y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), lasdiluciones deben sembrarse por duplicado.

3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilucin 10-2, tomar 1ml yadicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-2.

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4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilucin 10-3, pipetear 1ml yadicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-3. El tiempo transcurridoentre la realizacin de las diluciones y la siembra en la ltima caja, no debeser mayor de 20 minutos.

5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control

del diluyente.6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45C, a cada una de las cajas,incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio.

Segn la temperatura de incubacin, se obtienen los mesfilos aerobios a37C, los termfilos cuando se incuban las cajas a 55C, los psicrfilos a 7Cpor 10 das. La temperatura elegida depender del objetivo que se pretendacon la realizacin del recuento.

Tambin dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesfilosaerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelticos,utilizando agar leche; lipolticos, utilizando al agar tributirina; coliformes,utilizando agar EMB o VRBD.

Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio decultivo, se pueden detectar loa mesfilos anaerobios y facultativos viables,utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones deanaerobiosis.

a. Mesfilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo lasmarcadas como control del diluyendo y como control del medio;mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajase incubar a 37C por 24 a 48 horas.

b. Termfilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C acada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control deldiluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55C por 24 a 48horas.

c. Psicrtrofos : Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a

cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control deldiluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7C por 10 das.

d. Proteolticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45C a cadauna de las cajas, incluyendo las marcadas como control deldiluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22C por 72 horas.

e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45C a cadauna de las cajas, incluyendo las marcadas como control del

diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral


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7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48horas.

157. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en direccin de las manecillas del

reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener

una distribucin homognea de la muestra en el medio de cultivo.8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C de 24 a 48 horas.

4.6. PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE.

1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones.2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del

alimento, fecha, dilucin y No. del grupo.3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del

diluyente y otra como control del medio.4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente

en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio decultivo.

5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie delmedio, hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C (ver figura 4).7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias.8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilucin y por 10.


1. Sacar las cajas de la incubadora.2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del

medio.3. Organizar las cajas de la dilucin menor a la mayor.4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el

recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilucin.5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC).

6. INFORMES DE RESULTADOS

1. Se reportan solamente dos dgitos, el primero y el segundo de izquierdaa derecha, los otros dgitos deben reemplazarse por ceros.

2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas prximonmero si el tercer dgito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco.

3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptacin o rechazo deun alimento, porque es til solo como una aproximacin primaria en lacalidad bacteriolgica de un alimento.

7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS


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161. Cajas entre 30 -300 UFC

Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y semultiplican por el inverso del factor de dilucin. Ej:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 > 300 UFCDil: 10-3 80 UFCDil: 10-4 10 UFC

Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, sepromedia el valor y se multiplican por el factor de dilucin.

Se reporta Recuento Estndar en placa 80x10 3 UFC /g o mL

Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contenganentre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199).

2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC.

Se hace el recuento para cada dilucin y se promedian los resultados. Ej:

a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otracaja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 300 UFCDil: 10-3 38 UFCDil: 10-4 10 UFC

Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor es manos del doble de la dilucin menor, entonces se reporta el promedio delrecuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC 34x103.Se reporta Recuento Estndar en placa 34x10 3 UFC /g o mL

b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o ms del conteo de la otra caja,se informa el recuento menor. Ejemplo:Dil: 10-1 >300 UFCDil: 10-2 200 UFCDil: 10-3 60 UFCDil: 10-4 15 UFC

Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor esmas del doble de la dilucin menor, entonces se reporta la dilucin menor o sea20000UFC 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estndar en placa 20x10 3UFC/ g mL.


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173. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC

En estos casos se elige la caja con el recuento ms cercano a 300, semultiplica por el factor de dilucin y se reporta como Recuento Estimado enPlaca.

4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC.

Se cuentan las colonias de la caja con menor dilucin y se reporta comoRecuento Estimado en placa.

5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento.

Despus de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia desustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de ladilucin mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g mL. o menos de 10 UFC /g mL ( para siembra en profundidad) y menos de 10 2 UFC /g mL o menos de100 UFC /g mL ( para siembra superficial). Se reporta como RecuentoEstimado en placa: 16x105 UFC/g mL.

7. Presencia de Spreader

Es el crecimiento de un microorganismo en forma de pelcula, la cual puedeocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar las

colonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado enplaca. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportar presencia de spreader o accidente de laboratorio.

8. INVESTIGAR

1. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los alimentos o productos donde lacontaminacin es esencialmente superficial?

2. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los productos grasos y que se hacecuando el contenido graso es mayor del 20%?

3. Qu precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir dealimentos congelados, deshidratados o pasteurizados?


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4. Cul es la importancia y utilidad del recuento en placa?

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9. BIBLIOGRAFA



3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisisMicrobiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa,1984.


Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallasabsorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador.

Grupo 1: 100 mL de lecheGrupo 2: 100 g de quesoGrupo 3: 100 mL de suero costeoGrupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta frescaGrupo 5: 100 g de chorizo.

Figura No. 2 Diluciones decimales

Dilucin 10-1

1ml

Dilucin 10-2

1ml

Dilucin 10-3

10 g

10 ml

90 mlAgua

peptona

9 mlAguaPept .

9 mlAguaPept.


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19Figura No. 3: Siembra en Profundidad

10 -2 10 -3 C.D

C.D.10 -1 10 -2 10 -3

1ml

1ml

1ml

1ml

10 -1

C.M.

Agar 45C 1 5

m l

15ml

M e z c l a r

Y S o l i d i f i

c a r

Incubar


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20Figura No. 4: Siembra en Superficie

Agar

10 -1

10 -2

1ml

10 -3 C.D

1ml

1ml

1ml

10 -1 10 -2 10 -3 C.D. C.M.

Incubar


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FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS

PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOSMICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

GUA N 4: TECNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)

1. INTRODUCCIN

Esta tcnica sirve para estimar la poblacin de microorganismos viables en unamuestra de alimento. En contraste con el recuento estndar en placa, el NMPes un mtodo indirecto y solo da recuentos estimados de la poblacinmicrobiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata dealimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz enpoblaciones bajas porque permite el anlisis de muestras de tamao massignificativo. Se usa principalmente para la determinacin de coliformes, perovariando el medio de cultivo tambin se puede utilizar para la cuantificacin deStaphylococcus aureus , Bacillus subtilis, etc.

La metodologa de la tcnica se basa en la siembra de volmenes secuencialesde base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la dilucionesdecimales. El nmero de diluciones depender del grado de contaminacin delalimento y/o de los estndares microbiolgicos establecidos para ese producto:La relacin muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio decultivo.

Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivoutilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida dela confirmacin de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante osiembra por estra en EMB; el britnico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer mtodo emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristalvioleta rojo neutro bilis lactosa. La utilizacin del mtodo depender deltratamiento a que ha sido sometido el alimento.

2. OBJETIVOS

1. Conocer el fundamento de la tcnica del nmero ms probable.2. Sembrar muestras puras y diluidas por la tcnica del NMP utilizando

diversas modalidades y medio de cultivo.3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes.4. Informar los resultados de la tcnica del NMP.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*


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uno de los dos.

238. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a

determinar usando pruebas complementarias.

9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria.10.Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando sesiembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y0.1mL de muestra en los ltimos tres tubos. El resultado del NMP se daen 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100.

TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LQUIDAS OSLIDAS.

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo.2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a

utilizar.3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma

que para el recuento en placa.4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que

contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados aconcentracin simple (ver figura 7).

5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C.6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez.

Negativo los que no presentes estos parmetros opresente solamente uno de los dos.

7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria(Ver figura 7).

8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa por mL.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS

Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado elmicroorganismo buscado

Examen microscpico directo:1. realizar frotis a partir de los tubos positivos.2. Colorearlos con Gram.3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X.Este mtodo no es til ya que no permite distinguir los microorganismosmuertos de los vivos.

Subcultivos:1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, mac-

Konkey Endo).2. Incubar por 24-48 horas a 37C.

3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar.


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5. RESULTADOS E INTERPRETACIN.

Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g mL dealimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP =No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un anlisis de NMP, estndirectamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una seriede resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando unnmero dado de organismos estn presentes en una muestra de alimentos.

En caso de realizar ms diluciones que las que posea la tabla empleada, sepuede usar la siguiente frmula para hallar el NMP por g mL:

(NMP de la tabla x Factor de dilucin intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g mL

6. BIBLIOGRAFA






Todos los grupos deben traer:Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta paraenmascarar, Marcador.

Grupo 1: 100 mL de leche crudaGrupo 2: 100 g de quesoGrupo 3: 100 mL de suero costeoGrupo 4: 100 mL de jugo preparado en casaGrupo 5: 100 g de chorizo.

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TABLA No. 1TABLA DE NMP Y LMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOSCON 10 ML DE MUESTRA

NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95%Mnimo Mximo

0 2.2 0 6.01 2.2 0.1 12.62 5.1 0.5 19.23 9.2 1.6 29.44 10.0 3.0 52.95 16.0 8.0 Infinita

TABLA No. 2TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS

NMERO DE TUBOS POSITIVOS10mL 1mL 0.1mL

NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95%Mnimo Mximo

000 2400


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TABLA NO. 3TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS

DILUIDASNMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/g mL LIMITES DE CONFIANZA

10-1 10-2 10-3 99% 95%000


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Figura No. 5: Tcnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras lquidas)

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10 ml(doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

10 ml(Doble)

Litro

10 ml

Incubar


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Figura No. 6: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras lquidas)

Litro

1 ml0.1 ml

1 0 m l

Incu

bar


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Figura No. 7: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas lquidas oslidas)

10 ml10

Gramos

90 mlAgua pepto

na

10 -1

9 mlA.Pep

10 -2

9 mlAPep10 -3

1ml 1ml

1ml1ml1ml

Incu

bar


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UNIVERSIDAD DE CORDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS

PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOSGUA N 5: RECUENTO DE MESOFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES1. INTRODUCCINEl nmero de microorganismos mesfilos aerobios encontrados en losalimentos por el mtodo del recuento en placa es uno de los indicadoresmicrobiolgicos de la calidad de los alimentos mas frecuentemente usados.Este ndice no es utilizado en productos alimenticios obtenidos por medio deprocesos fermentativos como el queso y ciertos embutidos porque losrecuentos de microorganismos son muy elevados. (Luna, 1991, p 49).

Este recuento es utilizado para determinar si la limpieza, desinfeccin y elcontrol de temperaturas durante los procesos de tratamiento industrial,transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada; tambinpermite obtener informacin sobre alteraciones incipientes en los alimentos, laprobable vida til del producto, la descongelacin incontrolada de los alimentoscongelados o las fallas en el mantenimiento de las temperaturas derefrigeracin en alimentos fros. Adems es el mtodo utilizado para poner demanifiesto el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracinde los alimentos. (Luna, 1991, p 49).

El recuento en placa de mesfilos aerobios se puede desarrollar a travs decuatro mtodos:

1. Mtodo de recuento en placa profunda. (Mayor uso).2. Mtodo de recuento en placa superficial.3. Mtodo de recuento en placa por siembra de gotas en superficie.4. Mtodo de recuento en placa por siembra con asa de platino

calibrado (Para leche principalmente).

2. OBJETIVOS1. Realizar recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos

viables a partir de alimentos de origen animal o vegetal.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar plate count Balanza

Cuchillos-cucharasIncubadoraPipetas 1 y 10mLAsa bacteriolgicaBolsas de polipropilenoGradillaCajas de petri



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4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE MESFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES

1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo.3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del

diluyente.4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml

del diluyente.5. Verter 15ml de agar plate count fundido a 45C en cada una de las

cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Invertir las cajas e incubar por 24-48 horas a 35-37C.9. Luego de cumplido el tiempo de incubacin, sacar las cajas y evaluar el

control del medio y del diluyente; posteriormente proceder al conteo delas cajas con las diluciones si no se presentan problemas en loscontroles y si se observa mayor poblacin de microorganismos en lascajas menos diluidas.

5. BIBLIOGRAFA



3. LUNA CORTES, Gilma Yaneth, Manual operativo de anlisismicrobiolgicos para alimentos. Fundacin Universidad de Bogot JorgeTadeo Lozano, 1 ed. I.S.B.N. 958-9029-00-0, Bogot 1991.


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UNIVERSIDAD DE CRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS



GUA N 6: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN ALIMENTOSDE ORIGEN ANIMALO VEGETAL

1. INTRODUCCIN

El trmino habitual de coliformes comprende E.coli y otras especiespertenecientes a otros gneros de la familia Enterobacteriaceae, sonmicroorganismos ubicuitarios; se les puede encontrar ampliamente distribuidosen la naturaleza, el suelo, agua y tambin son carga normal del tracto intestinaldel hombre y animales de sangre caliente (Escobar, 1994, p 66).

En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienizacineficaz que asegure su inocuidad al consumidor, est indicado por regla general,la determinacin de coliformes totales o grmenes del grupo coli-aergenes,incubados a 37C, que fermentan la lactosa con produccin de gas en el mediocaldo lactosa bilis verde brillante (2%), su presencia no tiene necesariamenterelacin con una contaminacin de origen fecal, y consiguientemente, con laposible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos denaturaleza entrica, sino que es solo una indicacin de deficiencias o fallos enel tratamiento industrial, recontaminaciones despus del procesos de losalimentos y en ltima instancia de su calidad higinica; mala calidad higinicaen el proceso, falta de higiene de los manipuladores. Ello es debido a ladiversa procedencia de los miembros que integra este grupo demicroorganismos (Escobar, 1994, p 66).

E.coli es un germen cuyo habitat natural es el tracto entrico del hombre y losanimales. La mayora de las bacterias del grupo E.coli son comensalesinocuos entricos, pero algunas cepas pueden causarle dao a la saludhumana o animal. Su presencia en un alimento indica generalmente unacontaminacin directa o indirecta de origen fecal y por consiguiente, existe elriesgo de que hayan podido llegar al alimento en cuestin microorganismos

patgenos de procedencia entrica (Escobar, 1994, p 68).Resulta claro que E.coli es el indicador de contaminacin fecal universal y dehecho es el marcador sanitario ideal en el anlisis microbiolgico de losalimentos crudos o que no han sido sometidos a ningn tratamiento paraasegurar su inocuidad. As por ejemplo, si este microorganismo se encuentraen alimentos tales como verduras, hortalizas, moluscos bivalvos, etc., puedeinferirse que ha tenido lugar una contaminacin de origen fecal y que por lotanto, han podido llegar a estos alimentos microorganismos patgenos deprocedencia entrica (Escobar, 1994, p 68).

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3. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillantelactosa: se le por turbidez y gas.Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo deKovacs y se lee por formacin de un anillo rojo en la superficie delmedio.

Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubospositivos.4. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP.5. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de

bacterias / g ml

5. BIBLIOGRAFA





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GUA N 7: RECUENTO DESTAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASAPOSITIVA

1. INTRODUCCIN

La intoxicacin estafiloccica se produce por el consumo de alimentos en losque se ha multiplicado S.aureus , produciendo toxinas muy termorresistentes,activas por va oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento(Escobar, 1994, p 94).

Los estafilococos enterotoxignicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en losalimentos en el momento de su obtencin, en especial en los de origen animal,o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de losmanipuladores.

Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosasnasales y faringe, tambin se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobretodo en procesos cutneos (acn, furnculos, heridas infectadas) (Escobar,1994, p 94).

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir dealimentos de origen animal o vegetal.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Coloracin de gram Homogenizador

Agar Baird Parker Plasma fresco BalanzaInfusin cerebro corazn Cuchillos-cucharasAgar azul de O-Toluidina DNA Incubadora

Pipetas 1 y 10mLAsa bacteriolgicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petri


364. PROCEDIMIENTO


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4.1. RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASAPOSITIVA

1. Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones.

2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha,muestra, dilucin y No. del grupo.3. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como

control del medio y otra como control del diluyente.4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en

las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio Baird-Parker.

5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio,hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C.7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas

colonias caractersticas (negras, lustrosas, convexas, rodeadas de unhalo claro dentro de anillos opacos). Realizar el conteo finalmultiplicando por el inverso de la dilucin y por 10.

4.1. CONFIRMACIN E IDENTIFICACIN DE STAPHYLOCOCCUSAUREUS.

4.1.1. Prueba de coagulasa.

1. Realizar la coloracin de gram a varias colonias caractersticas (razcuadrada del total y no menos de 3 colonias).

2. Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos.3. Sembrar en igual nmero de tubos que contienen infusin cerebro

corazn las colonias caractersticas y grampositivas.4. Incubar a 37 C por 24 horas.5. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como

prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano(o plasma de conejo).

6. Incubar a 37 C por 4 horas, observar cada hora hasta la formacin delcogulo. Si despus de este tiempo da negativo, incubar hasta 24

horas.7. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y elnmero de confirmadas positivas, ejemplo:

Total de colonias contadas en la dilucin 10-2 = 30 3000Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7Positivas en la prueba de la coagulasa= 5Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva:

3000 x 5X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ml.

7374.1.2. Determinacin de termonuclesa.


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MICROBIOLOGA DE ALIMENTOSGUA N 8: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

1. INTRODUCCIN

Los mohos y las levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pHy Aw, alto contenido de slidos como sal o azcar, temperaturas bajas dealmacenamiento o presencia de antibiticos, pues son capaces dedesarrollarse en las condiciones mas adversas (Escobar, 1994, p 198).

Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas,hidratos de carbono, cidos orgnicos, protenas, lpidos, etc.

Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor,decoloracin o pigmentacin de la superficie de los alimentos, son los grandesalteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubrculos y granos (Escobar,1994, p 198).

2. OBJETIVOS

1. Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal yvegetal

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar Ogy Balanza

Cuchillos-cucharasIncubadora

Pipetas 1 y 10mLAsa bacteriolgicaBolsas de polipropilenoGradillaTubos de ensayoCajas de petri


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4. PROCEDIMIENTO

DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS

1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo.3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del

diluyente.4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml

del diluyente.5. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a

45C en cada una de las cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Invertir las cajas e incubar a 22C por 5 a 7 das (envolver las cajas con

papel Kraft).9. Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente.10. Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso

de la dilucin.

5. INVESTIGACIN

1 Fundamento del agar OGY2 Importancia de la determinacin de mohos y levaduras y en qu tipo de

alimentos se determinan.

6. BIBLIOGRAFA







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GUA N 9: INVESTIGACIN DESALMONELLA EN ALIMENTOS1. INTRODUCCIN

Todas las Salmonellas deberan ser consideradas como potencialmentepatgenas para el ser humano y los animales. La nica forma de transmisines la oral, por lo que es de suma importancia el anlisis de los alimentos paradetectar su presencia en ellos (Escobar, 1994, p 79).

Los alimentos ms contaminados son los de origen animal, incluye huevoscrudos, ovoproductos, leche cruda y productos lcteos, carnes y derivados,aves. La infeccin se disemina en los animales por los alimentos concentradospara animales como por ejemplo harinas de pescado y de sangre (Escobar,1994, p 79).

El hombre, los animales domsticos y salvajes, incluidos las aves de corral,porcinos, bovinos, roedores y animales caseros como tortugas, polluelos,perros y gatos son reservorios importantes de Salmonellas (Escobar, 1994, p79).

2. OBJETIVOS

1. Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de origen animal yen derivados vegetales (harinas de cereales)

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona tamponada Coloracin de gram Homogenizador Agar Hecktoen Reactivo de Kovacs BalanzaAgar BPLS Griess Cuchillos-cucharas

Caldo tetrationato de sodio Alfa naftol IncubadoraCaldo selenite- cistina KOH 40% Pipetas 1 y 10mLCaldo nitrato Rojo de metilo Asa bacteriolgicaCaldo MR-VP Peroxido hidrogeno 3% Bolsas de polipropilenoAgar citrato GradillaAgar urea Tubos de ensayoAgar kligler Cajas de petriAgar LiaAgar SIMAgar XLD* Algodn y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. DETERMINACIN DESALMONELLAS

Enriquecimiento no selectivo

a. Pesar 25g del producto y disolverlo en 225 ml de caldo lactosado oagua peptonada tamponada.

b. Mezclar e incubar a 37C por 18-24 horas.

Enriquecimiento selectivo

1. Pipetear 1ml del anterior cultivo en 10 ml de Caldo Selenite-Cistina eincubar en bao serolgico a 43C por 24 horas.

2. Pipetar otro mililitro y adicionarlo en un tubo que contenga 10 ml decaldo tetrationato verde brillante e incubar en bao sexolgico a 43Cpor 24 horas.

Siembra en agar selectivo

1. Repicar en dos de los siguientes medios selectivo: agar Hecktoen /XLD / BPLS,a partir de los caldos de enriquecimiento selectivo

2. Incubar de 35 a 37C por 24-48 horas.

Identificacin bioqumica

1. Observar las colonias tpicas: en agar Hecktoen vedes con o sincentro negro oscuro, en BPLS rojas o rosadas con halos rosados.

2. Sembrar las colonias tpicas de Salmonellas de cada uno de losagares en medio SIM, Kligler o TSI, LIA, Citrato, Caldo MR-VP,Urea, Nitrato y realizar la prueba de oxidasa.

3. Incubar las pruebas y buscar en las tablas de identificacinbioqumica.

5. INVESTIGACIN

1 Importancia de la determinacin de Salmonellas en los alimentos.

6. BIBLIOGRAFA


2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos.Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos.Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez.

42Medelln, 1994.


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GUA N 10: RECUENTO DE ESPORASCLOSTRIDIUM SULFITORESDUCTOR1. INTRODUCCIN

El gnero Clostridium se define como bacilos gram positivos, al menos en lasetapas tempranas del crecimiento, usualmente mviles por flagelos peritricos,con excepcin de Clostridium perfringes , presentan esporas termoresistentesovoides subterminales que deforman el cuerpo del bacilo (Acosta y Gonzlez,1995, p 298).

Son anaerobios estrictos y algunas cepas presentan aerotolerancia. Sutemperatura ptima de crecimiento es 37C; crecen a pH entre 4,7 y 9,0 perosu ptimo es de 7,0. Se desarrollan a niveles de Aw entre 0,94 y 0,97dependiendo de la cepa (Acosta y Gonzlez, 1995, p 298).

Clostridium perfringes es un bacilo corto, gram positivo inmvil con esporassubterminal y oval, anaerobio y aerotolerante, fermenta rpidamente la glucosay lactosa; tiene pH ptimo de 7,0, temperatura de 46C, nivel de Aw de 0,93 a0,95 y resiste concentraciones de 3% de NaCl y 100 mg de nitrito de sodio(Acosta y Gonzlez, 1995, p 299).

Es un microorganismo proteoltico, sacaroltico productor de exotoxinasantignicas de naturaleza proteica (Acosta y Gonzlez, 1995, p 299).

2. OBJETIVOS1. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito

reductor a partir de productos crnicos.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Agua peptona 0.1% Coloracin de gram Homogenizador

Agua triptona Reactivo de Kovacs BalanzaCaldo nitrato Griess Cuchillos-cucharasCaldo MR-VP Perxido hidrgeno 3% IncubadoraAgar citrato Oxidasa Pipetas 1 y 10mLAgar urea Asa bacteriolgicaAgar kligler Bolsas de polipropilenoAgar SIM GradillaAgar SPS Tubos de ensayoCaldo tioglicolato Cajas de petriAgar gelatina* Algodn y alcohol al 70%

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4. PROCEDIMIENTO

4.1. RECUENTO DE ESPORASCLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR

Recuento en placa1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual que para el recuento

en placa, tener cuidado de que al homogenizar no se aumentedemasiado la temperatura.

2. Marcar tres (3) cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No delgrupo.

3. Marcar dos (2) cajas, una como control del diluyente y otra como controldel medio.

4. Pipetear en las cajas de petri 1ml de cada una de las diluciones y 1mldel diluyente en la caja marcada como control del diluyente.

5. Verter 15ml de agar SPS fundido a 45C en cada una de las cajas.6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.7. Dejar solidificar.8. Colocar las cajas con las tapas hacia arriba en la jara de anaerobiosis.9. incubar a 37C por 48 horas.10.Sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente.11.Seleccionar las cajas entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias

negras, calcular el nmero de esporas Clostridium sulfito reductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilucin.

4.1.2. Recuento en tubo

1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual forma que para elrecuento en placa.

2. Marcar tres (3) tubos con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo.3. Pipetear en los tubos 1ml de cada una de las diluciones.4. Calentar en el bao serolgico a 80C durante 10 minutos cada una de

las diluciones.5. Enfriar en un beaker con agua y hielo.6. Verter 12 ml de agar SPS fundido a 45C en cada uno de los tubos.7. Dejar solidificar.

8. Adicionar una segunda capa (de aproximadamente 3ml) de agar SPSfundido a 45C.9. Dejar solidificar.10. Incubar a 37C por 72 horas.11. Seleccionar los tubos entre 30 y 300 colonias y contar todas las

colonias negras, calcular el nmero de esporas Clostridium sulfitoreductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso dela dilucin.

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4.1.3. Confirmacin de las colonias de Clostridium perfringes

1. Elegir como mnimo tres (3) colonias caractersticas (negras) y sembrar cada una en tubos con caldo tioglicolato.

2. Incubar en bao setolgico a 46C por 3-4 horas.

3. Realizar un extendido de cada uno de los cultivos y colorearlos congram.4. Observar al microscopio, bacilos grandes con extremos redondeados

gram positivos con esporas subterminales.5. Realizar la prueba de la catalasa a partir del cultivo de tioglicolato:

tomar 3ml del cultivo y adicionarle 0.5 ml de perxido de hidrgeno al3%, mezclar y observar desprendimientos de burbujas de gas, lo queindica una reaccin positiva.

6. Inocular a partir del cultivo de tioglicolato en SIM, caldo nitrato, agar gelatina y agar Kligler.

7. Incubar a 37C por 18-24 horas.8. Considerar positivas las pruebas para Clostridium perfringes cuando se

presentan los siguientes resultados:Catalasa NegativaMovilidad NegativaNitratos PositivaLicuefaccin de la gelatina PositivaLactosa Positiva

9. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y elnmero de confirmadas positivas. Ejemplo:Total de colonias contadas en dilucin 10 -2 = 3 300Elegidas para realizar las pruebas = 6Colonias que resultaron positivas = 4

300 x 4Reporte de Clostrium perfringes = = 200 bacterias / g ml

6

5. INVESTIGACIN

1. Fundamento del agar SPS.2. Importancia de la determinacin de Clostrium perfringes en alimentos.

6. BIBLIOGRAFA1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentospara el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995.


3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. AnlisisMicrobiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10Santa fe de Bogot, 1998.



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GUA N 11: RECUENTO DEBACILLUS CEREUS 1. INTRODUCCIN

Bacillus cereus , es un bastn aerobio esporulado, ubicuitario y habitualmentese le encuentra en alimentos crudos, secos y elaborados.

Los alimentos no deben permanecer a temperatura ambiente una vez cocidos,ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios estncontaminados hasta cierto punto (


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2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Cereus segn Mossel confecha, muestra, dilucin y No. del grupo.

3. Marcar dos cajas que contienen agar Cereus segn Mossel, una comocontrol del medio y la otra como control del diluyente.

4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en

las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio agar Cereus segn Mossel.5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio,

hasta que la superficie quede seca.6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C.7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas

colonias caractersticas (colonias rosadas con bordes regulares eirregulares, con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinasa).Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilucin y por 10.

8. Tomar al menos tres UFC caractersticas, realizarles la prueba de lacatalasa y la coloracin de gram; si son catalasa positiva y a lacoloracin de gram se observan bastones gram positivos con extremosmas o menos cuadrados encadenas cortas o largas y entrelazadas conespora subterminal, central o elipsoidal que no deforman el cuerpobacteriano realizar la identificacin bioqumica.

4.2. IDENTIFICACIN BIOQUMICA DEBACILLUS CEREUS

1. Subcultivar tres colonias caractersticas en caldo cerebro corazn.2. Realizar la siguientes pruebas bioqumicas:

Hidrlisis de la gelatina: Siembre dos lneas paralelas enagar gelatina e incubar a 37 por 24 horas Hidrlisis de almidn: Siembra dos lneas paralelas en agar almidn e incubar a 37C por 24 horas. Agar Urea: Inocular el fondo por picadura y el bisel por estrae incubar 37C por 24 horas. Agar Citrato Simmons: Inocular el fondo por picadura y elbisel en lnea e incubar 37C por 24 horas. Movilidad: Inocular el fondo (Agar SIM) por picadura eincubar 37C por 24 horas.

Reduccin de nitratos: Caldo Nitrato Produccin acetona: Caldo MR-VP Fermentacin de carbohidratos: Glusoca, Xilosa, Arabinosa

3. Comparar los resultados con las caractersticas bioqumicas deBacillus cereus:

Hidrlisis de la gelatina: Zonas claras alrededor de lascolonias luego de cubrir las colonias con reactivo sublimado deHg. Hidrlisis de almidn: Zonas claras alrededor de las coloniasluego de cubrir las colonias con lugol. Agar Urea: Tubos con reaccin cida (amarillos), urea-

negativos.


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Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citratonegativo.

48 Movil: Crecimiento desplazado a travs de la lnea desiembra. Reduccin de nitratos: Aparicin de un color rojo despus deagregar el reactivo Griess Produccin acetona: aparicin de un color rojo luego deadicionar el alfa naftol y el hidrxido de potasio. Fermentacin de carbohidratos (Glusoca, Xilosa, Arabinosa)por medio de viraje del medio a amarillo.

5. INVESTIGACIN

1. Fundamento del agar Cereus segn Mossel.

6. BIBLIOGRAFA






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UNIVERSIDAD DE CRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLASPROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS


GUA N 12: INVESTIGACIN DELISTERIA MONOCYTOGENES

1. INTRODUCCIN

Listeria monocytogenes es un pequeo bastn de 0,5 a 2 , que se presentaen empalizada, no capsulado, no espurado, mvil, se multiplica a temperaturasentre 3 y 45C, crece a pH entre 5,6 y 9,6, se destruye por calor a 70C durantealgunos segundos, catalasa positivo, oxidasa negativo y anaerobio facultativo(Escobar, 1994, p 224).

Es un germen ubicuitario, se encuentra en el suelo, aire, vegetales, aguasresiduales, afluentes, lodos, etc. El reservorio lo constituyen los mamferosdomsticos y silvestres, aves y el hombre infectados (Escobar, 1994, p 224).

Se han notificado casos de listeriosis asociados a la ingestin de hortalizascontaminadas y productos lcteos en especial quesos supuestamentecontaminados y leche cruda. Tambin se ha aislado de carne y productoscrnicos.

2. OBJETIVOS

1. Realizar investigacin de Listeria monocytogenes a partir de productoslcteos o crnicos.

3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales*Agar Mac Bride modificado Coloracin de gram Homogenizador Caldo de enriquecimiento EB Griess BalanzaAgar soya tripticasa (6%estrato levadura)

Peroxido hidrogeno3%

Cuchillos-cucharas

caldo soya tripticasa (6%estrato levadura)

Incubadora

Agar sangre Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mLAgar TSI KOH 40% Asa bacteriolgicaAgar SIM Rojo de metilo Bolsas de polipropilenoCaldo MR-VP GradillaCaldo nitrato Oxidasa Tubos de ensayoAgar Urea


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Caldo prpura debromocresol + 0.5% glusosaCaldo prpura debromocresol + 0.5% esculinaCaldo prpura debromocresol + 0.5% maltosaCaldo prpura debromocresol + 0.5% manitolCaldo prpura debromocresol + 0.5%ramnosaCaldo prpura debromocresol + 0.5% Xilosa* Algodn y alcohol al 70%

4. PROCEDIMIENTO

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

1. Pesar o medir aspticamente 25 g o ml de la muestra.2. Agregar 225 ml de caldo de enriquecimiento EB.3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher.4. Incubar a 30C durante24 horas y reincubar hasta 7 das.

SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

1. A partir del caldo de enriquecimiento EB aislar sobre la superficie deuna placa de agar Mac Bride modificado.2. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (las que observadas en

microscopio con transiluminacin oblicua se observan azuladas) ysembrar cada una en una placa de agar soya tripticasa (6% deextracto de levadura).

4. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.5. Examinar bajo la luz oblicua, hacer Gram y catalasa a las U.F.C.

tpicas.6. Comparar con los siguientes resultados: pequeos bastones gram

positivos en empalizada y catalasa positivo.7. A partir de las colonias tpicas sembrar en caldo soya tripticasa (6%de extracto de levadura).

8. Incubar a 37C durante 24 horas para realizar pruebas bioqumicas yde fermentacin.

PRUEBAS BIOQUMICAS

1. Sembrar en Agar Urea a partir del caldo soya tripticasa (6% extractode levadura), incubar a 37C durante 5 das y observar el virajehacia un color amarillo que indica que el microorganismo no hidrolizala urea.


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2. Sembrar en caldo nitrato, incubar a 37C durante 5 das y observar resultado negativo (no hay viraje hacia el color rojo).

3. Sembrar en agar SIM, incubar a 37C durante 48 horas y observar la

51movilidad del microorganismo en forma de paraguas.4. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, icubar a 37C durante 48 horas

para la reaccin del Voges proskauer y 5 das para el rojo de metilo(Listeria monocytogenes es MR positiva y VP positiva).

5. Sembrar en agar TSI, incubar a 37C durante 5 das y observar lafermentacin de la glucosa y lactosa pero no la produccin de gas ysulfuro.

6. Sembrar en tubos de caldo prpura de bromocresol conteniendo0.5% de los siguientes carbohidratos: glucosa, esculina, maltosa,manitol, ramnosa y xilosa; sembrar a 37C durante 7 das y observar la fermentacin de la glucosa, esculina, maltosa y ramnosa por unviraje al amarillo del medio de cultivo.

7. Sembrar en agar sangre una cepa de S. aureus de manera vertical ysembrar en forma horizontal Listeria monocytogenes ; incubar a 37Cdurante 24-48 horas y observar la hemlisis en la zona adyacente alS.aureus .

5. INVESTIGACIN

1. Fundamento del agar Mac Bride modificado.

6. BIBLIOGRAFA






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52UNIVERSIDAD DE CRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS


MICROBIOLOGA DE ALIMENTOSGUA N 13: INVESTIGACIN DEVIBRIO PARAHAEMOLYTICO

1. INTRODUCCINV. parahaemolytico es un germen halfilo, gram negativo anaerobio facultativode crecimiento rpido a temperaturas entre 15 y 43 C, a pH entre 5 y 9 y aconcentraciones de sal entre 0.5 y 8% (Escobar, 1994, p 240).

Es un enteropatgeno de origen marino. Su relacin con enfermedadesasociadas al consumo de alimentos fue descubierta en el Japn por Fujino en1950 despus del consumo de pescados y mariscos crudos (Escobar, 1994, p240).

2. OBJETIVOS1. Realizar investigacin de Vibrio Parahaemolytico a partir de productos de

origenmarino.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Caldo glucosa sal teepolbroth (GSTB)

Coloracin de gram Homogenizador

Agar TCBS Griess BalanzaAgar sangre Perxido hidrogeno

3%Cuchillos-cucharas

Agar soya tripticasa (6%NaCl)

Reactivo Kovacs Incubadora

Agar TSI con 3% NaCl Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mL

Caldo nitrato con 3% NaCl KOH 40% Asa bacteriolgicaAgar SIM con 3% NaCl Rojo de metilo 0.5% Bolsas de polipropilenoCaldo MR-VP con 3% NaCl GradillaAgar Hugo Leifson con 3%NaCl

Oxidasa Tubos de ensayo

Agar LIA con 3% NaCl Aceite mineralCaldo Indol con 3% NaClCaldo soya tripticasa (0%NaCl)Caldo soya tripticasa (3%NaCl)Caldo soya tripticasa (6%NaCl)


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Caldo soya tripticasa (8%NaCl)Caldo soya tripticasa (10%NaCl)* Algodn y alcohol al 70%

534. PROCEDIMIENTO

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

1. Pesar o medir aspticamente 25 g o ml de la muestra.2. Agregar 225 ml de caldo GSTB (glucosa sal teepol broth).3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher.4. Incubar a 30C durante18 a 24 horas.

4.2. SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

1. A partir del caldo GSTB (glucosa sal teepol broth) aislar sobre lasuperficie de una placa de agar TCBS.

2. Incubar a 37C durante 18 a 24 horas.3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (colonias pequeas con

centro verde azulado).

PRUEBAS BIOQUMICAS

1. Sembrar en el bisel de un tubo con agar soya tripticasa, incubar a37C durante 24 horas y apartir de este cultivo realizar la prueba deoxidasa (V. parahaemolytico es oxidasa positivo).

2. Sembrar en agar TSI por picadura en el fondo y por estra en el bisel,incubar a 37C durante 24 horas y observar la fermentacin de laglucosa (fondo cido), pero no de la lactosa (bisel alcalino), ni laproduccin de gas y de H 2S.

3. Sembrar en agar LIA por picadura en el fondo y por estra en el bisel,incubar a 37C durante 24 horas y observar la descarboxilacin de lalisina (bisel y fondo alcalino).

4. Sembrar en agar nitrato, incubar a 37C durante 24 horas y observar

la reduccin de nitritos a nitratos.5. Sembrar en agar SIM, incubar a 37C durante 24 horas y observar lamovilidad positiva.

6. Sembrar en indol, incubar a 37C durante 24 horas y observar laproduccin de indol.

7. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, incubar a 37C durante 48 horaspara la reaccin del Voges proskauer y 5 das para el rojo de metilo(Vibrio parahaemolytico es MR positiva y VP negativa).

8. Sembrar en dos tubos de agar Hugo Leifson por picadura profunda,agregar en uno de los tubos 1ml de aceite mineral estril, incubar a37C durante 48 horas y observar el metabolismo fermentativo


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9. (cambio de color en ambos tubos de verde a amarillo) o elmetabolismo oxidativo;Vibrio parahaemolytico tiene un metabolismofermentativo con respecto a la glucosa.

10. Inocular un tubo de gelatina nutritiva a partir del TSI, incubar a 37Cdurante 1 a 7 das; refrigerar el medio durante 10 minutos, si el medio

continua lquido, la gelatina es licuada, si ella se solidifica no lo es(Vibrio parahaemolytico licua rpidamente la gelatina).54

11. Inocular un tubo con caldo soya tripticasa por suspensin, incubar enbao termostatado a 42C durante 24 horas y observar el crecimientopor turbidez del medio (Vibrio parahaemolytico crece a 42C).

12. Realizar el test de halofilismo sembrando en tubos con caldo soyatripticasa con 0, 6, 8 y 10% de NaCl, incubar a 37C durante 24horas, observar el crecimiento positivo por turbidez del medio en lasconcentraciones de 6 y 8% de sal.

13. Sembrar en gar sangre a partir de un cultivo de soya tripticasa con3% de NaCl, incubar a 37C durante 24 horas y observar la -hemlisis que se presenta como una zona transparente

5. INVESTIGACIN

1. Fundamento del agar TCBS.

6. BIBLIOGRAFA



3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisisMicrobiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa,

1984.4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. AnlisisMicrobiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10Santa fe de Bogot, 1998.


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GUA N 14: CONTROL MICROBIOLGICO DE CONSERVAS NOALTERADAS.

1. INTRODUCCIN

El enlatado (conserva) se define como la conservacin de alimentos enrecipientes cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamientotrmico como principal agente que evita su alteracin.

El proceso trmico como mtodo de conservacin puede ser aplicado acualquier producto alimenticio siempre que se envase en un recipienteadecuado. La principal exigencia es que el envase, una vez cerradohermticamente no se deteriore durante la manipulacin o el almacenamiento.

La alteracin de los alimentos que han sido sometidos a tratamiento trmico,puede ser debida a causas qumicas o biolgicas o a causas de ambos tipos.La alteracin qumica ms importante de los alimentos enlatados es elabombamiento por hidrgeno, consecuencia de la presin del hidrgenoliberado al actuar el cido de un determinado alimento sobre el hierro de la lata.

La acidez de los alimentos enlatados es importante para determinar eltratamiento trmico necesario para conseguir su esterilizacin y el tipo de

alteracin a esperar en caso de que el tratamiento trmico se insuficiente o deque se produzcan fugas.

2. OBJETIVOS1. Realizar el control microbiolgico a conservas no alteradas.

3. MATERIALESMedios de cultivo Reactivos Materiales*Infusin cerebro corazn Coloracin de gram Abrelatas

Parafina esteril BalanzaAlmidn Cuchillos-cucharas


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Agua tibia IncubadoraAsa bacteriolgicaCajas de petriTubos estrilesToallas desechables

.. Algodn y alcohol al 70%

564. PROCEDIMIENTO

4.1. PRE-INCUBACIN

1. Retirar las etiquetas de las latas (en caso de tenerlas).2. Lavar bien las latas con agua tibia jabonosa y escobillones en caso de

ser necesario.3. Enjuagar con agua tibia.4. Secar las latas con toallas de papel desechables.5. Envolverlas en papel filtro o en toallas desechables con el fin de

descubrir microfugas durante el perodo de preincubacin.6. Marcar las latas con el No de identificacin, fecha y temperatura de

preincubacin.7. Incubar una lata a 35C y la otra a 55C durante 10 das.8. Agitar en invertir la posicin de las latas diariamente.9. Observar todos los das con el fin de descubrir microfugas y

abombamiento, si una lata presentase microfugas o abombamientos, sedebe examinar inmediatamente.

4.2. PREPARACIN DE LAS LATAS PARA SU ANALISIS

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y las latas aanalizar.

2. Flamear rpidamente la parte a ser abierta, en el caso de estar las latasabombadas tomar precauciones para evitar un peligro.

3. Abrir las latas con ayuda de un abrelatas, preferiblemente en un cubculoo campana asptica; no se debe abrir la lata por la tapa del fondo, dondelleva impresa su fecha de vencimiento.

4. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de petri la superficie

expuesta al aire.4.3. ANALISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA

1. Pesar 2 gramos de cada lata, tomando de todas las partes del contenidoa fin de que la muestra sea representativa.

2. Disponer de 6 tubos con caldo Cerebro Corazn adicionado de almidnal 0.1% para las latas incubadas a 35C y 6 tubos para la lata incubadaa 55C.

3. Adicionar los 2 gramos de cada lata en cada uno de los tubos con caldocerebro corazn adicionado de 0.1% de almidn.


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4. Verter una capa de 1cm de parafina estril en seis tubos (tres de laslatas a 35C y tres de las latas a 55C), con el fin de crear condicionesde anaerobiosis.

5. Incubar los seis tubos de la lata a 35C y los seis tubos de la lata a 55C(tres en aerobiosis y tres en anaerobiosis) durante 72 horas.

6. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez enel tubo.7. Considerar que el producto es estril comercialmente o satisfactorio,

cuando mximo un tubo en aerobiosis muestra desarrollo. (sinembargo57

si esto ocurre mejorar la asepsia durante las manipulaciones.8. Hacer un frotis directo del producto, desengrasar si es necesario con

xilol.9. Efectuar coloracin de gram en el producto para determinar el tipo de

grmenes presentes.10.Contar el nmero de clulas bacterianas por campo; un nmero elevado,

indicar malas condiciones de higiene durante su proceso o la utilizacinde materias primas muy contaminadas.

4.4. PRUEBAS ADICIONALES

1. Evaluar el color, olor, aspecto y pH del producto.2. Vaciar el contenido del producto.3. Lavar la lata en la estufa a 37C para secarla.4. Observar si tiene o no la capa protectora.

5. INVESTIGACIN

1. Criterios de clasificacin de las conservas.2. Cules son las causas de alteraciones biolgicas en las conservas?3. Clases de alteraciones fsicas y qumicas en las conservas.

6. BIBLIOGRAFA

1. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Programa de Microbiologa e higiene delos alimentos. Medelln, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional desalud pblica Hector Abad Gmez, 1990. ca. 150h. QW85 E8-90.



Todos los grupos deben traer:Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta paraenmascarar, Marcador.

Grupo 1

microbiologia d alimentos

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