Microbiologia de alimentos

Dely Rubi Chavez Garay

HectorRoberto Jimenez Campos

Identificación bacterianaCada género, inclusive especie, tiene diferentes reacciones

cuando se les enfrentan diferentes reactivos, esto se hace a partir de un cultivo puro, ya la bacteria aislada, con estas pruebas podremos decir casi con exactitud de que género y qué especie es esta bacteria.

Cada género de bacteria, inclusive especie, tiene diferentes reacciones cuando se les enfrentan a diferentes reactivos, esto se hace a partir de un cultivo puro, ya la bacteria aislada, con estas pruebas podremos decir casi con exactitud de que género y qué especie es esta bacteria. A estas pruebas se les ha como primarias, secundarias y complementarias.

Tinción de GramRevela la forma de la bacteria, agrupación y grupotaxonómico al que pertenece: Gram (+) o Gram (-).Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre lasparedes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Gram (+) Staphylococcus

Gram (-) E. coli cells

se deshidratan los poros cerrándolos, impidiendo que escape el complejo cristal violeta/yodo,

no retiene el complejo de cristal violeta/yodo

Pruebas Primarias (identificación)

Tinción de Ziehl NeelsenEs una técnica de tinción diferencial rápida y

económica, para la identificación de microorganismos patógenos.

Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

Utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación

Tinción de esporas La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los

géneros Bacillus y Clostridium.

Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas.

Están descritos varios métodos para teñir esporas.El de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita. Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como mordiente. La fase de decoloración en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tiñen con el colorante de contraste (fucsina o safranina).

Prueba de catalasaLa catalasa es una enzima que descompone al

peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al género Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo.

El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.

Catalasa (+): Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp.

Catalasa (-): Streptococcus spp.

Prueba de oxidasa Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la

identificación de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de electrones.

El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos. Utilizando un tubo capilar con tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, se adiciona una pequeña cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones:

Oxidasa(+), presencia de oxidasa se indica por un color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 seg.Ej. Pasteurella multocida

Oxidasa (-), que consiste en una ausencia de colorpúrpura.Ej. Escherichia coli

Ácido de la Glucosa muchas de las bacterias de interés médico usan la glucosa como

fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de dicho carbohidrato.

En un tubo con agua peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitación teniendo cuidado de no mover el tubo de Durham e incubándolo 24 horas y 37°C se obtienen los siguientes resultados.Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observará rosa, si produce gas, se observará Una burbuja en el tubo de Durham.

(+) Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli (-)Negativo a producción de gas: Proteus stuartii.

Prueba de O/Fpara realizar esta prueba se usa el medio básico

de Hugh y Leisfon con un pH de 7.1. Es un medio semisólido de color verde que se inocula por picadura, contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro con acetie o vaselina sellándolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37°C por 24 horas, obteniéndose:

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación

de la ornitina.

Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro

organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:bacterias fermentadoras de la glucosa, lactosa, sacarosa, aerogénicas, productoras de SH2.

Prodedimiento:Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina HierroEsta prueba permite diferenciar los

microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento: Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37°

Agar CitratoLa utilización de citrato como única fuente de

carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Indol El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido

triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados:(+) Escherichia coli( - ) Klebsiella pneumoniae

Rojo Metilo Una de las características taxonómicas que se utilizan para

identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.  El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 hr. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Vogues Proskauer En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del

butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del

microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia  luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:(+) Enterobacter aerogenes (-)Escherichia coli

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento.

-Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales.

Contaje de PlacaConsiste en el plaqueo de una muestra de volumen

conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la muestra.

Filtros de membranaUtilizados cuando el número de bacterias es

bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).

Microcolonias en DEFTDEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables.

Contaje de microcolonias al microscopioSe añade un pequeño volumen de agar-

cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

Gotitas de agarSe hacen diluciones de la muestra (solución

madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación.

Films secos (Petrifilm)Son películas deshidratadas de medios de

cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.

Método del número más probableBasado en series de diluciones y cálculo

estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exácto.

Métodos basados en la reducción de colorantesUsando azul de metileno o resazurina.

Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).

Tubos rodantesSon tubos herméticamente cerrados en los

que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

Contaje microscópico directoUsando cámaras de cuenta, se coloca un

volumen determinado y se recuentan las bacterias.

Nucleasa TermoestableS. aureus produce una nucleasa termoestable

con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.

Lisado de LimulusUsado para detección de endotoxinas

(derivadas del lipopolisacárido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no-viables. Es muy rápido.

Sondas de ácidos nucleicosSirven para identificar microorganismo

desconocidos por medio de Southern.

PCRMétodo para detectar número

extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo en cuestión.

Medida de ATPSe detecta la presencia de ATP usando

luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

RadiometriaMedida de la transformación de un substrato

con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente.

Substratos Fluoro y CromogénicosSe añaden como aditivos a los medios de

cultivos para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.