FARMACIA Y BIQUIMICA

CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

DOCENTE : DRA. TERESA GALLARDO

TEMA : NUMERACIÓN DE MARCADORES DE INOCUIDADMICROBIOLOGICA BACTERIAS COLIFORMES

TOTALES Y COLIFORMES TERMOTOLERANTESPOR EL MÉTODO DEL NMP

ALUMNA :

CICLO : VIII

TURNO : NOCHE

2011

PRÁCTICA Nº 5

NUMERACIÓN DE MARCADORES DE INOCUIDAD MICROBIOLOGICA BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES

TERMOTOLERANTES POR EL MÉTODO DEL NMP

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

MUESTRA: Queso

MÉTODO: Número más probable (NMP)

DILUYENTE: Agua peptonada al 0.1%

NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES.MÉTODO I : (AMERICANO)

DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

MÉTODO: Número más probable (NMP)

MEDIO DE CULTIVO: Caldo LST

TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas

DILUCIONES REALIZADAS: Dil. 10 –1, Dil. 10-2, Dil. 10-3

FACTOR DE DILUCIÓN CON POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES:

- 10-1 (1 tubo)

- 10-2 (2 tubos)

PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

MEDIO DE CULTIVO: Caldo brila y agar EMB

TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas

COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES)

MEDIO DE CULTIVO: Caldo E. Coli

TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 44.5ºC durante 24 - 48 horas

NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO II:(EUROPEO)

DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

MÉTODO: Número más probable (NMP)

MEDIO DE CULTIVO: Caldo Brila

TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 hora.

DILUCIONES REALIZADAS: Dil. 10 –1, Dil. 10-2, Dil. 10-3

FACTOR DE DILUCIÓN CON POSIBLE PRESENCIA DE COLIFORMES:

10-1 (2 tubos)

PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

MEDIO DE CULTIVO: agar ENDO

TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 35 – 37ºC durante 24 - 48 horas

COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES)

MEDIO DE CULTIVO: Caldo Brila y caldo triptonado.

TEMPERATURA Y TIEMPO INCUBACIÓN: 44.5ºC durante 24 - 48 horas

RESULTADOS:

NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO I

LECTURAS EN CALDO LST

Dil 10 –1: Hubo formación de gas (1 tubo)

Dil. 10-2: Hubo formación de gas (2 tubos)

Dil. 10-3: No hubo formación de gas.

Se obtuvo 11 números más probables por gramo de la muestra.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

En agar EMB: Hubo presencia de colonias típicas de color rosadas con brillo metálico.

En caldo E. Coli: Hubo formación de gas.

Al fermentar la lactosa a una temperatura de 44,5o , confirma la presencia de coliformes termotolerantes.

NUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES. MÉTODO II

LECTURAS EN CALDO BRILA

Dil 10 –1: Hubo formación de gas en 2 tubos de la siembra por triplicado.

Dil 10 –2: No Hubo formación de gas en ningún tubo de la siembra por triplicado.

Dil. 10-3: No Hubo formación de gas en ningún tubo de la siembra por triplicado.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE PRESENCIA DE COLIFORMES TOTALES

En agar ENDO: Se observo colonias rojas con brillo metálico.

Caldo Brila: Hubo producción de gas

Caldo Triptonado: Con el reactivo de Kovacs se observo la presencia de un anillo rojo por producción de indol en la parte superior del tubo.

Se confirma la presencia de coliformes termotolerantes

PRUEBAS BIOQUÍMICAS E.Coli:

Medio: TSA

INDOL: se le agrega Gtas de Kovacs se observa Anillo rojo (Positivo)

RM VP: Se le agrega Gtas de Rvo Rojo de Metilo: Se observa coloración

roja

INDOL

RM VP

RM VP

CITRATO

RM VP: Se le agrega Gtas de Rvo Alfa Naftol + Gtas KOH: Se observó

color amarillo anaranjado.

CITRATO: Se observó coloración verde.

CUESTIONARIO

1.- Describa los métodos de los medios de cultivo empleados en la práctica.

Fundamento de los medios de cultivo

Caldo Lauril Sulfato triptosa

Fundamento

Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los

microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.

La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la

lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un

sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico

Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la

flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas,

éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.

E. C. Agar

Fundamento

El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias

lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran

parte de la flora acompañante. Este caldo es recomendado por el Standard

Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975), y por Hajna y

Perry (1943), para el recuento de coliformes en alimentos.

E.M.B. Agar

Fundamento

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine,

para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de

enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación

entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que

son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de

metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram

positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un

característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro

oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son

incoloras. Este medio permite el crecimiento de Cándida spp. Como colonias

rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de

clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este medio como

colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. Y otras

bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede

ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al

0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.

En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de

Salmonella y Shigella.

Verde Brillante Bilis 2% Caldo

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el

adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes

selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram

negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono

fermentable.

Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con

producción de ácido y gas.

Agar Endo .

Fundamento

En el medio de cultivo, la pluripeptona junto con la peptona, la tripteína y el

extracto de levadura, aportan los nutrientes necesarios para el adecuado

desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El

fosfato dipotásico y el fosfato monopotásico otorgan la capacidad buffer, y el

cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Es un medio selectivo debido al lauril sulfato de sodio y al desoxicolato de

sodio que inhiben el desarrollo de la flora acompañante, y es diferencial debido

a la fermentación de la lactosa.

Las bacterias fermentadoras de lactosa producen durante la fermentación

aldehídos, que en combinación con la fucsina y el sulfito presentes en el medio

le confieren a la colonia un brillo metálico, mientras que las colonias de las no

fermentadoras son rosadas.

2.- Describa los métodos modernos para el recuento de coliformes totales

y termotolerantes

Sistemas de Identificación Microbiana Existen muchos métodos, algunos de ellos son:

1.- Sistema ColiTrak da un resultado presuntivo de cuentas de coliformes, reemplazando al NMP y especialmente aplicado a ensayos de aguas.

2.- Sistema Vitek automático que iidentifica en 2 a 24 h y realiza también confirmación de Patógenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 ó 480 exámenes y además realiza el antibiograma y CMI.

3.- El sistema PASCO es semejante al sistema Vitek.