Laboratorio de MicrobiologiaTincin de GramINTRODUCCINDe gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado conetanol que arrastrar al coloranteslo en las Gram (-), mientras que en lasGram (+) elcolorante queda retenidoy las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Objetivos Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias (importancia del objetivo de inmersin) Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Materiales Mechero Bunsen o de Alcohol Asa de Siembra o aguja enmangada Pinzas Portaobjetos Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc. Palillos Microscopios Aceite deinmersin Soporte deTinciones Goteros Pinzas Agua destilada Colorantes paraTincin:Solucinde cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%

ProcedimientoI. prepara las muestras siguiendo estos pasos:1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequea cantidad de yogur con ayuda de un palillo higinico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental extrado de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensin (frotis), en otros portas, dejndolos secar.3. Fija este frotis dndole varios pases a los portas sobre la llama del mechero, con la muestra hacia arriba.

II Tie ahora los frotis fijados mediante los siguientes pasos:1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirar el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y despus se realizar otro lavado suave. Todas las clulas se teirn de violeta.2. Se retirar el colorante con etanol, gotendolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las clulas Gram- pierden el colorante violeta y quedarn incoloras. Las Gram + seguiran violeta.3. Aade una gota de agua a la preparacin y cubre las preparaciones 2 min. con safranina (colorante de contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante slo entrar en las bacterias Gram , que quedarn rojas. Las Gram + seguirn violetas.Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsrvalas con microscopio utilizando el objetivo de inmersin. En esta tincin diferencial las bacterias Gram aparecen rojas y las Gram + violeta. Observar(100).LugolTincin negativa1. colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar una gota de muestra2. realizar frtis, 3. dejar secar.

Resultados

Preguntas de anlisis

1) Cules son las fuentes de errores ms comunes de error en laTincinde gram.Los peores obstculos de laTincin, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin describimos algunas de las fuentes de error:Impurezas en los reactivos deTincin. Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin. pH inadecuado. El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado. Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros. Tiempo deTincinincorrecto. Temperatura suficiente.2) Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estos tendrn la misma importancia que para las bacterias.El color depende de lacomposicinde la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda unaclasificacinpor medio del gram lo que no sucede con las levaduras.

3) Explique el fundamento de laTincinnegativa realizada en la prctica. Qu tipo de informacin se obtiene.LaTincinnegativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. LaTincinnegativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.

4) Investigue otra tcnica deTincinselectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de lasclulas gracias a su mayorafinidad por los colorantes utilizados.

5) A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram+ o Gram-?El distinto comportamiento en laTincinse piensa que es debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos deClulas).

6) Para que se necesita el aceite deinmersin?El aceite deinmersintiene un indice derefraccinsimilar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

ConclusinAunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren muchoqumicamenteesta diferenciaqumicaes los que permitedistinguir las bacterias porTincin, pues generalmente, el colorante reacciona con laclulabacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.

Debido a eso laTincines importante para lamicrobiologadebido a que: Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios tiposmorfolgicos. Permite el estudio de las estructuras internas de laclulabacteriana, tales como paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares. Permite el empleo de mayores amplificaciones.