4° laboratorio de microbiologia ii

Universidad Nacional Federico VillarrealLaboratorio de Microbiología II – Recuento de Coliformes: Análisis Microbiológico de Bebidas

El control del agua y alimentos como bebidas se lleva a cabo comprobando si la

operación o el proceso al cual se someten, cumplen con los requisitos comerciales y las

leyes vigentes. Examinándose habitualmente la operación o el proceso para asegurarse

que se adoptan buenas prácticas. El control de alimentos y bebidas se basa en dos

pilares: la inspección y el análisis de laboratorio.

El objetivo de este 4° Laboratorio de Microbiología II al realizar esta practica

es el análisis microbiológico, se utiliza para establecer si el agua o alimento es inocuo y

tomar decisiones acertadas para proteger la salud pública. Haciéndose necesaria una

adecuada interpretación y análisis de resultados, para poder brindar soluciones frente a

determinados problemas de la industria y brindar seguridad al productor y consumidor

final.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial


I.- OBJETIVOS

Determinar la presencia coliformes.

Realizar un recuento de colonias aerobias

mésofilas.

Investigar y realizar recuento de Escherichia coli.

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II.- GENERALIDADES:

Se consideran como bebidas alcohólicas o refrescantes las bebidas no

fermentadas, carbónicas o no, preparadas basándose en agua potable y con los

ingredientes característicos de esa bebida. Dichos ingredientes pueden ser: zumos de

frutas, extractos de fruta o partes de plantas comestibles, frutas, semillas y tubérculos

disgregados, esencias naturales o agentes aromatizantes, edulcorantes naturales y ácido

carbónico.

Según los componentes de estas bebidas, se pueden distinguir las siguientes

clases:

Agua gaseosa ; se elabora con agua potable y anhídrido carbónico. Se le conoce

también como agua de celta. Si se añade bicarbonato de sodio recibe el nombre de agua

de soda.

Bebidas Gaseosas; se prepara con agua potable, anhídrido carbónico

edulcorantes, aromas y acidulantes como los ácidos tartarico, cítrico, málico, láctico y

fosfórico. Los edulcorantes pueden ser naturales o artificiales.

Bebidas refrescantes aromatizadas, se elabora con los insumos detallados en el

párrafo anterior. Además pueden contener zumos de frutas y en el caso de las bebidas

de cola, pueden contener cafeína en una cantidad máxima de 0,015% en peso. Las



aguas tónicas y los amargos no alcohólicos pueden contener quinina en una cantidad

máxima de 0,01%.

Bebidas refrescantes de extractos, se elaboran como las bebidas refrescantes

aromatizadas, pero añadiendo extractos o agentes aromáticos naturales de origen

vegetal.

Bebidas refrescantes de zumos de frutas, la característica principal en su elaboración

es el uso de zumos de frutas, además de los componentes antes indicados.

Evidentemente el agua debe reunir las características organolépticas, físicas, químicas y

microbiológicas de máxima calidad .El anhídrido carbónico ha de tener una pureza

mínima de un 99.8%% estar exento de otros gases como ácidos nitroso y sulfúrico y

carecer de otras impurezas como aire u óxido de carbono.

En general, para el análisis de las aguas embotelladas se utilizan los métodos y los

medios de cultivo estándar. Sin embargo hay algunas discrepancias en relación con la

temperatura de incubación y el medio de cultivo mas adecuados para la determinación

del número de viables totales. Por ello nosotros trabajaremos con una temperatura de

incubación de 37°-C por 48 horas.

La microflora de las bebidas recién preparadas es muy variada, pero con la posterioridad

desaparecen numerosas especies bajo el efecto de los agentes selectivos existentes en

el medio, especialmente el pH bajo y la gran concentración de C02 .

Los microorganismos que se pueden detectar se pueden incluir en tres grupos:

1. Agentes alterantes típicos; se encuentran levaduras que producen una

fermentación rápida en orden decreciente de importancia, estas levaduras son

Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces ovarum, S. Microelliosoides y S.

Florentinus.

De fermentactón lenta Saccharomyces intermedius, S Bisporus. Torulospsis

stellata, S. Montanus y Candida parapsilopsis.

2. Microorganismos alerantes, pero sólo para condiciones específicas; las

bacterias principales agentes de alteración son las acido lacticas, gram

positivas. catalasa negativas del género Leuconostoc que suelen soportar bien

las condiciones del entorno de !as bebidas.



Cabe citar como agentes potenciales de alteración a las levaduras tales como

Hansenula y Pichia, bacterias como Gluconobacter y Lactobacillus, y diversos

mohos como Penicillium, Aspergillus, Mucor, Fusarium y Oospora.

3. Microorganismos no alterantes, son aquellos microorganismos que pueden

sobrevivir en las bebidas sin provocar efectos evidentes en ellas. Este es el

caso de levaduras aerobias como Rhodotorula y el de bacterias aerobias como

las de los géneros Bacillys y Acetobacter. Así como microorganismos de

interés higiénico como Escherichia coli y otros coliformes: streptococos del

grupo D, incluso otros agentes como Salmonellas. Estafilococos y Clostridios

que pueden sobrevivir durante un cierto tiempo en las bebidas.

III.- TECNICA (ICMSF 2000)



3.1 Protocolos a tener en cuenta

BEBIDAS GASEOSAS

Una tomada la muestra se procederá con degasificar la muestra, para (o cual se

toman unos 50 ml del producto y se vierten en un matraz con perlas de vidrio. Se disuelve

y elimina el gas mediante agitación durante unos minutos a temperatura ambiente. Si el

producto es muy ácido se neutraliza con fosfato tripticasa al 20%. Una vez preparada (a

muestra se realizan (as diluciones decimales correspondientes usando agua peptona

(agua triptona) como diluyente.

REFRESCOS

Los recuentos totales deben ser bajos y estar ausentes los bacilos coliformes,

como en el agua potable. No son raras las alteraciones por levaduras y mohos y pueden

causar la elevación del pH permitiendo se desarrollen otros gérmenes menos ácido -

tolerantes.

En refrescos no carbónicos de frutas, no se inhiben las levaduras por la cantidad

de conservante autorizado legalmente La alteración se controla generalmente mediante

acidez. Tanto en éstos como en tos refrescos carbónicos, el contenido microbiano

disminuye con el tiempo.

ZUMO DE FRUTA

Los hongos termorresistentes pueden producir problemas en los zumos

concentrados. Se investigan mediante calentamiento a 77°C durante 30 minutos. Se

enfrían y se vierten con Agar al 2%. Se incuban hasta durante 30días.

BEBIDAS ALCOHOLICAS

En las industrias dé las sidras de manzana y de pera pueden producir problemas

los métodos de producción y recolección. No suelen desecharse los frutos del suelo y los

podridos, lo que introduce una fuerte carga de organismos productores de alteraciones.

La sidra, la cerveza y el vino pueden alterarse por las bacterias acéticas que convierten el

etanol en ácido acético.

La cerveza, especialmente sin lúpulo, puede estropearse por pedicoccus,

enfermedad debida a sarcina.

3.2 Reactivos, Materiales y Equipos



Agar nutritivo

Agua de peatonal al 0.1%

Caldo brilla 2% bilis verde

Agua destilada

Pastilla antimicótica

Probeta (50ml , 10 ml)

Lunas de reloj

Vaso de precipitado 250 ml.

Varillas de vidrio

Botellas

Tubos de ensayo

Tubos durham

Placa petri esterilizadas

Pipetas (5,10 ml)

Espátulas

Baño María

Estufa

Balanza analítica



CALDO BRILLA 2% BILIS VERDE AGUA DE PEPTONA AL O, 1%

T UBOS

DURHAM

INVERTIDOS BAÑO MARIA



3.3.- Procedimiento

3.3.1.- Recuento de microorganismos viables totales (muestras liquidas u

homogeneizadas)

Se trata de conocer el número tota! de microorganismos presentes en las

muestras analizar. Este número no guarda relación con e! de microorganismos patógenos

por !o que no puede usarse como Índice de su presencia y sólo debe considerarse un

indicador de las características higiénicas generales del alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado

en nutrientes para medido de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las

condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán

miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de

microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos)

PREPARACION DE LA MUESTRA

La muestra se diluye por lo menos dos veces (1:10 y 1:100) con agua peptona en

botella especial que se agitan con la muestra.

Seguidamente, con pipetas esterilizadas, se procede a la Siembra en los medios

de cultivo trabajados.

CONTAJE EN PLACA:

Se toma un mililitro de la muestra y se coloca en la placa estéril.

Luego se vierte de 10 - 12 ml. Del medio sobre la muestra y mover en forma

circular buscando homogeneidad. (Siembra por inoculación) incubar a 37 °C por

48 horas.

Proceder a la lectura de las placas.



LECTURA DE LAS PLACAS

Cuadricular las placas en 1 cm2.

Colocar la placa sobre el microscopio o

con la ayuda de una lupa contar y

caracterizar las colonias existentes.

Luego del conteo multiplicar el numero

de colonias por el (área de la placa,

dicho resultado será el numero total de

colonias en la placa, luego se multiplica

el numero obtenido de la operación

anterior por la dilución de la muestra, obteniéndose finalmente el numero de

colonias por mililitro de muestra.

PRUEBA PRESUNTIVA DE COLIFORMES

Preparar 9 tubos cada uno incluyendo un tubo de Durham, con

caldo brilla 2% bilis verde brillante.

Esterilizar y enfriar tos tubos.

Proceder a la siembra de las muestras.

Añadir a los tres (3) primeros tubos 1 ml de muestra de la

dilución 1:10

Añadir a los siguientes tres (3) tubos 1 ml de muestra de la

dilución 1:100

Añadir a los últimos tres (3) tubos 1 ml de muestra de la dilución 1; 1000.

Incubar a 37 °C por 48 horas

Realizar la lectura correspondiente.



IV. RESULTADOS Y DISCUSION

La formación de gas confirma presencia de coliformes, además también se

observo turbidez en los tubos los cuales 7 viraron de color y los 2 restantes

cambiaron de color a medias. Inclusive algunos formaron películas.

El diluyente general siempre debe contener agua de peatonal al 0,1% en agua

destilada o solución salina, en este laboratorio utilizamos agua destilada

respetando esa proporción.

En el análisis de aguas y bebidas utilizamos como muestra: chicha morada el cual

el resultado fue

10-1 10-2 10-3 NMP /100ml

Tubos positivos a 37°C 2 1 0

Tubos positivos a 44°C 2 1 0

La prueba confirmativa se realizo tonel caldo bilis verde brillante al 2%.

El NMP de organismos coliformes por gramos de muestra es 15 x10 = 150 gramo

V.- CONCLUSION

Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes,

puede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras liquidas si puede

observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez o producción de

ácido.



VI.- CUESTIONARIO

GRUPO I:

1. Definir: Microcalorimetría, jugos de fruta, bacterias termoduricas

Microcalorimetría

Es una técnica que se maneja en el control de la calidad químico. La

fundamentación se basa en el uso de las propiedades de las diferentes presentes en los

alimentos y en el de instrumentos especiales para la determinación cualitativa y

cuantitativa. En la microcalorimetría, la concentración de una sustancia colorada se mide

comparándola con otra.

Se puede decir que es el estudio de los pequeños cambios de calor

producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de

microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la

microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un

medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse

diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de

los azúcares presentes en el medio.

Jugos de frutas

Se trata de productos obtenidos de frutas frescas los cuales han sido

sometidos a un proceso preparación mecánica previa y tratados y posteriormente

conservadas con un proceso adecuado.

Bacterias termodúricas

Son microorganismos capaces de proliferar a altas temperaturas, con óptimos que

oscilan ente 55ºC y 75ºC. Tienen una tasa de crecimiento muy alta, pero muy corta. Se

pueden encontrar tanto en el aire como en el agua o suelo. En los alimentos los

principales géneros bacterianos son Bacillus y Clostridium, entre los mohos Aspergillus,

Cladosporium y Thamnidium.



Dentro de esta clase es posible incluir los termòtrofos que son mesófilos que se

pueden desarrollar a temperaturas elevadas como ocurre con algunas bacterias lácticas,

por ejemplo estreptococcus thermophilus o Streptococcus faecalis.

2. ¿Para que sirve y que es el agar Caldo Mosto?

Es un medio de enriquecimiento para la proliferación de microorganismos que se

utiliza en el a análisis microbiológico de cervezas.

3. ¿Qué métodos de Recuento de microorganismos se realiza en la industria

cervecera?

Un método adecuado de investigación es el agar de recuento de placa enriquecido

con glucosa y extracto de malta. Deben incubarse series de placas en aerobiosis y

anaerobiosis a 30ºC. Entre las bacterias altamente habituales están pediococos,

lactobacilos y productoras de ácido acético. Un microorganismo importante en la industria

cervecera es Zymomonas anaerobia, que origina turbidez y sabores extraños y crece

exclusivamente en anaebiosis. El protocolo de análisis comprende.

- Recuento de colonias aerobias mesófilas (31 +- 1ºC)

- Investigación y recuento de E. coli

- Investigación de Salmonella-Shigella.

- Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores.

- Investigación y recuento de mohos y levaduras.


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