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DIAGNOSTICO DE LABORATORIO EN MICROBIOLOGIA

UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDESMEDICINA VETERINARIA.

MICROBIOLOGIA VETERINARIA.JOHN JAIRO URIBE GONZALEZ

OBJETIVOS GENERALES

EVALUAR ASPECTOS DE LA SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRASNPORTE DE MUESTRAS.

CRITERIOS DE IDENTIFICACION DE BACTERIAS PATOGENAS.

CARACTERISTICAS DE CULTIVOS Y PRUEBAS BIOQUIMICAS.

DETRMINAR AGENTES ANTIMICROBIANOS MECANISOS DE ACCION ANTIMICROBIANA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA COLONIZACION, INVASION Y ENFEREMEDAD

CLINICA.

{ IDENTIFICACION DEL AGENTE

ETIOLOGICO. DETRMINAR SUCEPTIBILIDAD

ANTIMICROBINA.

• HISTORIA CLINICA• EDAD• SEXO• ESPECIE• NUMERO DE ANIMALES

AFECTADOS.• TRATAMIENTO

ADMINISTRADO.

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LAS MUESTRAS DEBEN OBTENERSE DE ANIMALES VIVOS O ANTES DE CAMBIOS AUTOLITICOS O PUTREFACCION.

COLONIZACION DEL PATOGENO, MINIMIZANDO LA CONTAMINACION.

REFRIGERACION DE MUESTRAS. CONTENEDORES INDEPENDIENTES

A PRUEBA DE ESCAPES. IDENTIFICACION DEL ANIMAL, TIPO

DE MUESTRA Y FECHA DE RECOLECCION.

EXACTITUD Y VALIDEZ DE LOS RESULTADOS ESTA INFLUENCIADA

POR LA RECOLECCION Y ENVIO DE LAS

MUESTRAS.

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TINCION DE GRAM: GRAM POSITIVAS (VIOLETAS) GRAM NEGATIVAS (ROJO). CRISTAL VIOLETA LUGOL DE GRAM DECOLORANTE DE GRAM SAFRANINA. GRAM POSITIVAS (VIOLETAS). GRAM NEGATIVAS (ROJO).

• GIEMSA: OBSERVACION Rickettsias y Trypanosomas.• COLORANTE GIEMSA• ALCOHOL ABSOLUTO• XILOL

• FUCSINA CARBONICA: RECONOCIMIENTO Campylobacter y fusobacterium, color rojo.

• FENOL• ALCOHOL AL 1005%• FUCSINA BASICA• AGUA DESTILADA.

• AZUL DE METILENO POLICROMO: Bacillus anthracis en ESP, coloracion azul.• TINCION ZIELHL NEELSEN: Bacilos acido alcohol resistentes como

mycobacterias.• FUCSINA BASICA• CALENTAR HASTA EMISION DE VAPORES 5 MIN.• DECOLORAR POR 3 MIN.• AZUL DE METILENO 1 MIN.

TECNICAS DE COLORACION• PRESENCIA DE BACTERIAS

PATOGENAS SE CONFIRMA CON EXAMEN DE FROTIS TEÑIDOS.

• CULTIVOS CELULARES.• PRUEBAS BIOQUIMICAS.• METODOS INMUNOLOGICOS.• PRUEBAS MOLECULARES

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AGAR NUTRITIVO: MEDIO BASICO, DEMSTRACION MORFOLOGICA Y PIGMENTACION, RECUENTO DE VIABILIDAD.

AGAR SANGRE: CRECIMIENTO PATOGENAS, AISLAMIENTO PRIMARIO, EVALUACION HEMOLISISNAS.

AGAR MAcCONKEY:SELECTIVO DE ENTEROBACTERIAS Y ALGUNAS GRAM NEG. EVALUACION DE FERMENTADORES DE LACTOSA (ROSADAS) Y NO FERMENTADORES.

CALDO SELENITO: ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO, AISLAMIENTO Salmonella A PARTIR DE MUESTRAS CON MICROORGANISMOS ENTRICOS GRAM NEG.

AGAR CHOCOLATE: FACTORES DE CREMIENTO (XYV) PARA AISLAMIENTO Haemophilus.

AGAR VERDE BRILLANTE: MEDIO INDICADOR PARA Salmonella (rosado).

AGUA PEPTONADA:ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO, POTENCIAMIENTO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN BAJO NUMERO.

• SELECCIÓN MEDIO • CONDICIONES ATMOSFERICAS• CARACTERISTICAS Y LAS

REACCIONES PERMITEN IDENTIFICACION PRELIMINAR.

CRITERIOS DE INTIFICACION• MORFOLOGIA Y COLOR DE LAS

COLONIAS.• PRESENCIA O AUSENCIA DE HEMOLISIS• COLORACION DE GRAM• MOVILIDAD• CAPACIDAD DE CRECER EN

MAcCONKEY• REACCION EN PRUEBAS DE OXIDACION

Y FERMENTACION.• REACCION PRUEBAS DE CATALASA Y

OXIDASA.

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PRUEBA INDICADOR OBSERVACION

AZUCAR EN AGUA PEPTONADA

ANDRADE Streptococcus

HIERRO TRIPLE AZUCAR TSI.

ROJO DE FENOL Salmonella

SULFURO DE HIDROGENO

COMPUESTOS DE HIERRO

Salmonella y Brucella

DECARBOXILASA PURPURA DE BROMOCRESOL

Enterobacterias

UREASA ROJO DE FENOL Proteus y corynebacterium

PRUEBA DE INDOL DE ROJO DE METILO

Y VOGES PROSKAUER

REACTIVO DE KOVAC Y ROJO DE

METILO OXIDACION ACETONINA

Enterobacterias

UTILIZACION DEL CITRATO

AZUL DE BROMOTIMOL

Enterobacterias

TECNICAS BIOQUIMICAS• CATALASA: AEROBIOS Y

ANAEROBIOS FACULTATIVOS, PRESENCIA CITOCROMO OXIDASA.

• RELACIONAN LAS ACTIVIDADES CATABOLICAS Y UN INDICADOR PARA DEMOSTRAR UTILIZACION DEL SUSTRATO.

• RANGO DE AZUCARES PERMITE IDENTIFICACION.

• METODOS COMERCIALES API.

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TECNICAS INMUNOLOGICAS : LA SEROTIPIFICACION ES LA IDENTIFICACION INMUNOLOGICA DE LOS ANTIGENOS BACTERIANOS. UTILIZAN ANTICUERPOS FLUORESCENTES INMOVILIZADOS EN FASES SOLIDAS ELISA.

TIPIFICACION DE FAGOS:ESPECIFICOS PARA # LIMITADO DE ESPECIES BACTERIANAS SUCEPTIBLES. UTILIZADA EN INVESTIGACION EPIDEMIOLOGICA.

TECNICAS MOLECULARES: HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS Y REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).HIBRIDACION UTILIZO SONDAS SINTETICAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE SE APLICAN AL MATERIAL GENETICO DEL PATOGENO. SONDAS ARN – ADN.NUMERO PEQUEÑO DE BACTERIAS SE UTILIZA PCR, AMPLIACION ACIDO NUCLEICO DEL MICROORGANISMO, LUEGO SE UTILIZAN PATRONES DE ADN O ARN, EL PRODUCTO SE IDENTIFICA POR ELECTROFORESIS.

TECNICAS SEROLOGICASLA EXPOSICION A UN MICROORGANISMO PERMITE PRODUCCION DE ANTICUERPOS. LA EVIDENCIA DE ESTOS ANTICUERPOS EVIDENCIA LA EXPOSICION A UN AGENTE INFECCIOSO.

{AGENTES ANTIMICROBIANOS

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ANTIBIOTICOS: METABOLITOS MICROBIANOS DE BAJO PESO MOLECULAR O AGENTES ANTIMICROBIANOS SINTETICOS QUE ELIMINAN O INIBEN EL CRECIMIENTO BACTERIANO.

ALEXANDER FLEMING (1929) ACTIVIDAD ANTIBIOTICA Penicillium notatum SOBRE CEPAS ESTAFILOCOCOS. FLOREY Y CHAIN (1940) INDUSTRIA FARMACEUTICA.

USO DE ANTIBIOTICOTERAPIA TOXICIDAD SELECTIVAAMPLIOESPECTROPERFIL DE SEGURIDADADMINISTRACION EN DOSIS UNICAS DIARIAS.TIEMPO DE INFUSION BREVE.ESTABILIDAD A CAMBIOS DE TEMPERATURA.

Bacillus colistinus Colistina o polimixina E.

Bacillus polymyxa Polimixina B

Bacillus subtilis Bacitracina

Cephalosporium spp Cefalosporinas

Micromonosporas purpurea

Monobactamos

Penicillium notatum Gentamicina

Penicillium griseofulvin Penicilina G

Streptomyces spp Estreptomicinas y Tetraciclinas.

Streptomyces cattleya Carbapenemos

Streptomyces erythreus Eritromicina

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MODO Y LUGAR DE ACCIONINTERACCION CON LA ESTRUCTURA CELULAR O BLOQUEAR RUTA METABOLICA.BACTERIOSTATICO: INHIBEN EL CRECIMIENTO BACTERIANO PERMITIENDO ACCION SISTEMA INMUNE. CONCENTRACION DEL ANTB.BACTERICIDA: MUERTE CELULAR POR UNIN ESTRUCTURA DIANA. MODO ACCION INHIBICION SISNTESIS PARED CELULAR, SINTESIS DE PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS.

INHIBICION SINTESIS DE PARED CELULAR

PREVIENEN LOS ENLACES DE LAS CADENAS DE PEPTIDOGLICANO,SELECTIVAMENTE TOXICOS. CEFALOSPORINAS Y PENICILINAS.UNION PROTEINAS DE UNION A PENICILINAS ACTIVIDAD AUTOLITICA. RESITENCIA PRODUCCION DE β LACTAMASAS.

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INHIBICION DE LA FUNCION DE LA MEMBRANA.

RUPTURA DE LA INTEGRIDAD FUNCIONAL DE LA MEMBRANA, LAS MACROMOLECULAS Y IONES SE LIBERAN PRODUCIENDO MUERTE CELULAR. DEBIDO A TOXICIDAD SE USO ES GENERALMENTE TOPICO.

INHIBICION DE LA SISNTESIS DE PROTEINASUNEN A RECEPTORES DE LAS SUBUNIDADES DEL RIBOSOMA, AFECTANDO LA SINTESIS DE PROTEINAS. EL DESARROLLO DE RESISTENCIA ES MEDIADA POR FALTA DE RECEPTORES ESPECIFICOS Y PLASMIDOS DEGRADAN EL ANTB.TETRACICLINAS: PENETRA POR TRANSPORTE ACTIVO Y SE UNE SUBUNIDAD 30 S. BLOQUEA EL SITIO DE UNION DE LAS MOLECULAS DE ARNt PREVINIENDO LA INCORPORACION EN LOS AMINOACIDOS DE LA CADENA POLIPEPTIDICA.

INHIBICION DE LA SISNTESIS DE ACIDOS NUCLEICOS.

ACCION SOBRE ADN GIRASA, ENZIMA QUE SEPARA LAS CADENAS DE ADN EN LA REPLICACION. ACCION ARN POLIMERASA (QUINOLONAS Y NOVOBIOCINA), RIFAMPICINA PREVINIENDO LA SINTESIS ARN ACTIVO FRENTE MICOBACTERIAS.RUPTURA DE CADENAS DE ADN ANAEROBIAS OBLIGADAS (METRONIDAZOL).FORMACION DE ACIDO FOLICO DEBIDO A SU SIMILARIDAD AL PARA AMINOBENZOICO (SULFAMIDAS).TRIMETROPIM INHIBE ACTIVIDAD DIHIDROFOLATO REDUCTASA.

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TERAPIA ANTIBACTERIANA COMBINADA.CUANDO SE COMBINAN ANTIBACTERIANOS EL RESULTADO ESTA INFLUENCIADO POR LA ACCION COMBINADA DE LA SUMA DE LAS ACCIONES.EFECTO SINERGICO: CUANDO LA ACCION COMBINADA ES SIGNIFICATIVAMENTE MAS GRANDE.ANTAGONISMO: EFICACIA REDUCIDA CUANDO DOS FARMACOS SE UTILIZAN COMBINADOS.SUSTANCIAS BACTERICIDAS β LACTAMICOS EFICIENTES EN DIVION ACTIVA, SI SE UTILIZA UN BACTERIOSTATICO SU ACTIVIDAD PUEDE ELIMINARSE.

FACTORES QUE INFLUYEN LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.

IN VIVO POR EL LUGAR Y LA TASA DE ABSORCION, SITIO DE EXCRESION, DISTRIBUCION TISULAR.

INTERACCION FARMACO PATOGENO.LA RESPUESTA DE UN FARMACO IN VITRO PUEDE DIFERIR IN VIVO.AMBIENTE CONSTANTE DISTRIBUCION Y CONCENTRACION

LOCALIZACION (INTRACELULAR) MAS RESISTENTES. UNION A PROTEINASABSORCION MEDIADA POR PUS O TEJIDO NECROTICO.

INTERACCION HOSPEPADOR PATOGENO.

LA ADMINISTRACION DE UNA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA PUEDE ALTERAR LA RESPUESTA INMUNE DEL HOSPEDADOR.CAMBIA MICROBIOTA NORMAL.FAVORECIMIENTO SOBRECRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS RESISTENTES.

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RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS.USO INDISCRIMINADO DE ESTOS COMPUESTOS DA LUGAR A UNA SELECCIÓN DE BACTERIAS HEREDITARIAMENTE RESISTENTES.LA RESISTENCIA SE CODIFICA GENETICAMENTE EN CROMOSOMAS O PLASMIDOS.ENTEROBACTERIAS – PSEUDOMONAS.

MECANISMO DE RESISTENCIAPRODUCCION DE ENZIMASREDUCCION DE LA PERMEABILIDAD CELULARRUTAS METABOLICAS ALTERNATIVASELIMINACION POR EXPULSION DEL ANTIBIOTICOALTERACION DEL SITIO DIANA.

ESTRATEGIAS DE LIMITACION DE LA RESISTENCIA.

RESTRICCION DEL USO DE ANTIBIOTICOSBASE DATOS SOBRE MICROORGANISMOS RESISTENTES.EVALUACION DEL RIESGO Y BENEFICIOS DE LA TERAPIA.TERAPIA ANTIBIOTICA DEBE SUMINISTRARSE A LAS DOSIS TERAPEUTICAS RECOMENDADAS.RESPETAR LOS PERIODOS DE BLANQUEO DE LOS ANTIBIOTICOS.NO DEBEN UTILIZARSE COMO PROMOTORES DE CRECIMIENTO, MEJORAR MEDIDAS DE HIGUIENE.

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBACTERIANA.

DETERMINAR EL USO DEL ANTIBIOTICO MAS ADECUADO SE REALIZAN PRUEBAS IN VITRO.DILUCION EN CALDO, DIFUSION DE DISCOS, GRADIENTE DE AGAR.METODO DE DIFUSION DISCO KIRBY BAUER USADA HABITUALMENTE.

CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA.

CMI. ES LA DILUCION MAS ALTA DE UN AGENTE ANTIBACTERIANO QUE INHIBE EL CRECIMIENTO DE UN AISLAMIENTO.CMB CONCENTRACION MINIMA BACTERICIDA ES LA DILUCION MAS ALTA DE UN FARMACO QUE PUEDE ELIMINAR UNA BACTERIA.

COLONIZACION BACTERIANA, INVASION TISULAR Y ENFERMEDAD CLINICA.

SAPROFITAS CRECEN SOBRE MATERIA ORGANICA, LAS PATOGENAS INFECTAN ANIMALES Y HOMBRES.EL DESARROLLO Y LA GRAVEDAD ESTA INFLUENCIADA POR DETRMINANTES DEL HOSPEDERO.LA PIEL ES UN ORGANO DEFENSA QUE LIMITA EL INGRESO BACTERIANO.TRAUMATISMO O INFECCIONES OPORTUNISTAS.KOCH POSTULADO SOBRE MICRORGANISMOS CAUSANTES DE ENFERMEDAD. AISLAMIENTO EN CULTIVO A PARTIR DEL TEJIDO INFECTADO, DEBE CAUSAR ENFERMEDAD, DEBE SER AISLADO A PARTIR DE ANIMALES INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE.

INFECCION DE ANIMALES SUCEPTIBLESINFECCION EXOGENA: TRANSMISION DIRECTA O INDIRECTA DE UN ANIMAL INFECTADO.INFECCION ENDOGENA: BACTERIAS COMENSALES ANIMAL ES SOMETIDO A ESTRÉS. (VF)

LA INFECCION PUEDE ADQUIRIRSE POR DISTINTAS VIAS . LA VIRULENCIA SE RELACIONA CON LA CAPACIDAD DE INVADIR Y

PRODUCIR ENFERMEDAD FACTORES QUE INFLUYEN EN EL RESULTADO DE LA INTERACCION ENTRE

HOSPEDADOR Y PATOGENO. (VF) COLONIZACION Y CRECIMIENTO

REPLICACION EVITAR ELIMINACION = COLONIZACION LOS PATOGENOS DEBEN COMPETIR POR NUTRIENTES, FLORA NORMAL,

TOLERAR CONDICIONES MICROAMBIENTALES Y EVADIR MECANISMOS DEFENSA.

HIERRO COMPONENTE DEL CITOCROMOS Y PROTEINAS FERRO SULFURADAS = RESPIRACION BACTERIANA. COMPUESTOS QUELANTES DE HIERRO (SIDEROFOROS), LISAN GR .

DISEMINACION EN EL HOSPEDADOR EVASION DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA ÉXITO DE LA INVASION. PERMANENCIA PUNTO DE INFECCION RUPTURA DE TEJIDOS POR MEDIO

DE LAS COLAGENASAS, LIPASAS, HIALURONIDASAS Y FIBRINOLISINA. TORRENTE SANGUINEO LIBRES O INTRACELULARES. MECANISMOS DE SUPERVIVENCIA BACTERIANA.

MECANISMO OBSERVACION

Antígeno O de cadena del polisacáridoLa longitud de las cadenas del polisacárido impide la unión del complejo de ataque a la membrana externa de muchas bacterias Gram negativas.

Antígeno capsularLa incorporación de acido sialico por algunas bacterias Gram negativas posee un efecto inhibidor sobre la actividad del complemento.

Producción de capsula Papel antifagocitico en muchas bacterias.

Producción de proteína M Actividad antifagocitica en estreptococos.

Producción de proteínas de unión al Fc.Los estafilococos y estreptococos producen proteínas que se unen a la región Fc de IgG y previenen la interacción con el receptor Fc de las membranas de los fagocitos.

Producción de LeucotoxinasCitolisis de los fagocitos por las toxinas producidas por Mannheimia haemolytica, especies de Actinobacillus y otras bacterias patógenas.

Interferencia con la fusión fagosoma lisosoma Permite la supervivencia de las micobacterias patógenas dentro de los fagocitos.

Evasión de los fagosomas Los mecanismos de defensa utilizados por Listeria monocytogenes y ricketsias.

Resistencia al daño oxidativo Permite la supervivencia de la salmonelas y brucelas dentro de los fagocitos.

Imitación antigénica de los antígenos del hospedador

Adaptación de los antígenos de superficie por especies de Mycoplasma elude el reconocimiento por el sistema inmune.

Variación antigénica de antígenos de superficie Permite la supervivencia de especies de mycoplasma y borrelias. A pesar de la respuesta inmune del hospedador a estos patógenos.

Producción de coagulasas La conversión del fibrinógeno en fibrina por parte de staphylococcus áureas puede aislar el lugar de la infección frente a la respuesta inmune efectiva.

DAÑO A LOS TEJIDOS DEL HOSPEDADOR Y SIGNOS CLINICOS ASOCIADOS.LAS BACTERIAS LOGRAN DAÑAR LOS TEJIDOS DEL HOSPEDERO POR MEDIO DE EXOTOXINAS Y ENDOTOXINAS.

EXOTOXINAS: SE PRODUCEN DENTRO DEL CUERPO TIENEN EFECTO LOCAL O SISTEMICO Clostridium botulinum.MUERTE CELULAR POR DIGESTION DE LIPIDOS (LECITINASA Y FOSFOLIPASAS).ENDOTOXINAS: LIPOPOLISACARIDOS DE LA MEMBRANA EXTERNA DE GRAM NEGATIVAS SE LIBERAN A PARTIR DE LA LISIS CELULAR.EL DAÑO TISULAR ESTA MEDIADO POR ENZIMAS SECRETADAS Y RESPUESTA INMUNE.EFECTOS: INTERACCION CON FAGOCITOS PMN Y MACROFAGOS, PLAQUETAS Y LINFOCITOS B.LIBERACION DE INTERLEUCINA 1 QUE PRODUCE FIEBRE, ACTIVACION DEL COMPLEMENTO, CAMBIOS PROINFLAMATORIOS.

TIPOS DE INFECCION BACTERIANASCATEGORIZADAS COMO AGUDAS, SUBAGUDAS Y CRONICAS.AGUDAS: CORTO Y GRAVE (DIAS) ELIMINACION DE LA BACTERIA INVASORA POR SISTEMA INMUNE.SUBAGUDAS: EFECTOS CLINICOS DE MENOR INTENSIDAD.CRONICAS: FALLAS EN LA ELIMINACION DEL PATOGENO. REPLICACION CELULAR, NO HAY RESPUESTA CELULAR Y HUMORAL, ELIMINACION PERSISTENTE.