UNIVERSIDAD DE NARIÑO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS.

Asignatura: MICROBIOLOGÍA Docente: Alexandra España Jojoa - Bacterióloga.

LABORATORIO No 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

(Manipulación de instrumentos y equipos) JUSTIFICACION: DEFINICIÓN Conjunto de medidas y normas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos frente a riesgos que atentan contra la salud de las personas que trabajan en un laboratorio o en entidades prestadoras de salud, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la seguridad de los trabajadores, estudiantes y el medio ambiente. FACTORES DE RIEGO Se conocen como Factores de Riesgo todos los elementos, sustancias, procedimientos y acciones humanas presentes en el ambiente laboral que de una u otra forma ponen en riesgo al trabajador teniendo la capacidad de producirle lesión. Estos factores de riesgo pueden encontrarse en la fuente, en el medio o en las personas mismas. Tienen como característica fundamental que son fácilmente controlables.

Los diferentes factores a los que está expuesto un trabajador del laboratorio se pueden clasificar en factores físicos, químicos, ergonómicos, eléctricos y psicosociales.

OBJETIVOS GENERALES Conocer la importancia de implementar medidas de Bioseguridad en un laboratorio. Cambiar la actitud de los estudiantes frente a la bioseguridad. OBJETIVOS ESPECIFICOS Exigir implementos de protección personal y crear cultura de autoprotección en las actividades diarias para evitar accidentes. Mantener el área de trabajo en condiciones de orden y limpieza. Detectar y relacionar los factores que intervienen en la confiabilidad de los resultados. Manejar todas las muestras como potencialmente patógenas para disminuir riesgos de contaminación.

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

PRECAUCIONES QUE SE DEBEN ADOPTAR EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA:

- No se permitirá comer, beber, fumar y/o almacenar comidas así como cualquier otro item personal (maquillaje, cigarrillos, etc.) dentro del área de trabajo.

- Usar bata de manga larga dentro de laboratorio, la cual se pondrá al momento de entrar y deberá ser quitada inmediatamente antes de abandonar el laboratorio.

- Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de que así sea cubrir la herida de manera conveniente.

- Usar guantes de látex de buena calidad para todo manejo de material biológico o donde exista, aunque sea de manera potencial, el riesgo de exposición a sangre o fluidos corporales. Cambiar los guantes toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios.

- No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.

- No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos.

- Bajo ninguna circunstancia se pipeteara sustancia alguna con la boca, para ello se utilizaran peras plásticas o pipeteadores automáticos.

- Lavar las manos con jabón y agua inmediatamente después de realizar el trabajo. Descartar los guantes de látex en un recipiente con solución desinfectante.

- No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar.

- No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus implementos de bioseguridad adecuados.

- Todos los objetos que se deban utilizar se deben preparar con anterioridad y tener listos sobre la mesa en un orden determinado. Todas las manipulaciones se deben realizar con rapidez y exactitud.

- Flamear siempre las aberturas de los tubos antes y después de cada siembra.

Utilizar las pipetas de mayor exactitud, tomar la cantidad exacta y no dejar muestra en la punta de la pipeta.

- Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

- Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aquí expuesta y las adoptadas por la Universidad de Nariño.

DERRAMES Y ACCIDENTES

- Todos los derramamientos y accidentes se deben informar inmediatamente al docente y Laboratorista. Seguir el protocolo respectivo.

ELEMENTOS PROTECTORES Y SU USO ADECUADO

Se usaran guantes de látex en todo procedimiento que implique el manejo de material biológico o donde exista el riesgo de exposición a sangre o fluidos corporales, así mismo deberán usarse en los procesos de descontaminación y eliminación de residuos contaminados.

Los guantes deberán ser descartados una vez hayan sido contaminados en los sitios dispuestos para los residuos contaminados, y luego reemplazados por otros.

Usar mascarilla en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de material biológico en las mucosa bucal y nasal.

El uso de la bata es obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual debe ser retirada antes de salir del laboratorio. Esta debe ser de manga larga para protegerse de cualquier reactivo o agente químico, o material biológico manipulado en el laboratorio.

Debe usarse zapatos cerrados dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel con material contaminado o cualquier producto químico peligroso, por derramamiento o salpicadura.

Debe usarse gorro de tela para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado o sustancias químicas peligrosas.

MANIPULACION Y EVACUACION DE DESECHOS

Todo el equipo reusable (puntas de micropipeta, cánulas, , tubos, etc.) deberá ser ubicado en un recipiente metálico o de plástico resistente a punciones y cortaduras, que contenga liquido descontaminante y debe estar localizado en el mismo lugar de trabajo.

Después es preciso desinfectar el material con sustancias químicas antes de limpiarlo e introducirlo en el autoclave.

Todo elemento descartable (agujas, jeringas, etc.) debe ser colocado en un recipiente de material resistente a punciones y cortaduras. Estos recipientes deben ser preferiblemente amplios de paredes rígidas y semirrígidas, con tapa asegurada para su posterior descarte y estar ubicados lo más cerca posible del lugar de uso de los instrumentos.

Para la eliminación de todo material contaminado, el método de elección es la incineración de los mismos, o el material puede ser auto clavado y luego destruido o enterrado.

Los residuos líquidos que se sospechen estén contaminados deben ser tratados con desinfectantes antes de su eliminación o colectados en recipientes que sean eliminados en forma segura.

Realizar adecuadamente la segregación de desechos según lo indica cada recipiente ubicado en el laboratorio.

CUESTIONARIO

1. Cuál es la diferencia entre desinfectante, antiséptico, esterilizante.

2. Menciones cinco riesgos biológicos, químicos, físicos, ergonómicos en un laboratorio. 3. En qué momentos se debe realizar el lavado de manos en un laboratorio? 4. Cuáles son los desinfectantes más utilizados en el laboratorio y por qué? 5. El hipoclorito se utiliza en diferentes diluciones para la descontaminación, cuales son las diluciones y que se descontamina en cada una. Que desventajas tiene la utilización de hipoclorito?

BIBLIOGRAFIA:

GUIA DE METODOS EFICACES DE ESTERILIZACION Y DESINFECCION CONTRA EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) 2da Edición. Organización Mundial de la Salud (OMS) NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO E INVESTIGACION QUE TRABAJEN CON EL VIH ARC COPY Organización Mundial de la Salud Serie OMS sobre SIDA Ginebra MANUAL DE GARANTIA DE CALIDAD EN BANCOS DE SANGRE Migel A. Rodriguez, Lorena Carboni Costa Rica VIH/SIDA Y HEPATITIS: PREVENCION Y CONTROL DE FACTORES DE RIESGO BIOLOGICO Leonor Quinceno, Yaneth Sanchez

LABORATORIO No. 2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA.

PRIMERA PARTE : Preparación de medios de cultivo. INTRODUCCION: Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas). TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO: Se pueden clasificar teniendo en cuenta: a) Su consistencia: Sólidos, líquidos, semisólidos.

b) Su utilización: Comunes, de enriquecimiento, selectivos, inhibidores, diferenciales, de identificación, de multiplicación, de transporte. c) Su composición: complejos, sintéticos, semisinteticos. d) Su origen: Naturales y químicos o sintéticos. ESTERILIZACION Es un método del control del crecimiento microbiano que involucra la eliminación de todas las formas de vida, incluidos virus y esporas. Es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad mediante la destrucción de todos los microorganismos contenidos en un objeto, área específica o sustancia, acondicionando de tal modo la posterior propagación o contaminación a otros objetos o al medio ambiente. Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más. OBJETIVO: Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: Envasar los medios de cultivo de manera adecuada en los diferentes recipientes de acuerdo al uso que se les dará. Preparar adecuadamente medios de cultivo deshidratados y por componentes. Indicar el método de esterilización y almacenamiento apropiado. Comprobar la efectividad del proceso de esterilización. Relacionar la composición de los diversos medios de cultivo con sus características y aplicaciones.

MATERIALES Y REACTIVOS: Cajas de petri grandes, tubos de ensayo, pipetas de 5 y 10 ml, erlenmeyer de 200 ml, probeta de 100 ml, mezcladores de vidrio, mecheros, Autoclave, balanza analítica, estufa, cinta de esterilización, papel indicador de pH, papel aluminio o empaque, agua destilada. Medios deshidratados: agar base sangre, Mueller Hinton, agar nutritivo, agar sabouraud, caldo nutritivo, SIM, TSI, citrato simons. PROCEDIMIENTO Cada grupo preparará un medio diferente:

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado. Realizar los cálculos teniendo en cuenta la cantidad de medio a preparar. (regla de tres). 2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes (medio natural). Medir la cantidad exacta de agua destilada. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo. 3. Marcar el erlenmeyer con el nombre del medio. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar y evitar derrames, no descuidar el medio.

4. Medir el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C). De ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. 5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor. 6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha de preparación. 7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas por el docente. Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

RESULTADOS MEDIO DE CULTIVO: ____________________________________ CANTIDAD PREPARADA: _______________________ CANTIDAD PESADA: ____________________________ CÁLCULOS: ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO: _______________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________ ESTADO FÍSICO: Sólido__________ Líquido_________ Semisólido___________ TIPO DE MEDIO DE CULTIVO • Según la naturaleza de los ingredientes: Natural __________ complejo_________ Sintético_________________ • Según el propósito de uso Enriquecimiento____________ Selectivo__________ Diferencial_________ Otro_____________________________ DISTRIBUCIÓN: __________________________________________________ CONDICIONES DE ESTERILIZACIÓN: __________________________________________________________________ CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: _______________________________________________________________ CUESTIONARIO 1. Cuál fue el aporte de los medios de cultivos en el establecimiento de la microbiología como ciencia. 2. Qué ventajas ofrecen los medios sólidos para el cultivo de microorganismos? 3. Qué es el solidificante de un medio? 4. Explique tres tipos de esterilización utilizados en la preparación de medios de cultivo. 5. Explique y de ejemplos de los tipos o clases de medios de cultivo.

LABORATORIO No 3 UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS, CARACTERISTICA CULTURALES Y AISLAMIENTO.

JUSTIFICACION: Toda superficie inerte o viva esta colonizada, tiene presente microorganismos, es decir: las mesas, ventanas, pisos, lapiceros, la piel, el cabello, las uñas, todo lo que nos rodea contiene bacterias, hongos, virus y hasta parásitos, todos estos microorganismos no deseados son contaminantes, por ello cuando trabajamos en un laboratorio de microbiología debemos asegurarnos que el material de trabajo esté ESTERIL, lo que nos asegura un trabajo optimo, que los microorganismos aislados representan un cultivo puro indispensable para realizar estudios de identificación, fisiología, genética propios de él. INTRODUCCION: La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres características principales: su tamaño pequeño, que les permite una gran capacidad de dispersión, su variabilidad y flexibilidad metabólica, que les permite tolerar y adaptarse rápidamente a condiciones ambientales desfavorables, y su plasticidad genética (o gran capacidad de transferencia horizontal de genes), que les permite recombinar y recolectar los caracteres positivos y persistir durante largo tiempo adaptándose a condiciones ambientales cambiantes. MICROBIOTA: El cuerpo humano presenta una gran superficie cutánea y mucosa por la que entra en contacto con el medio ambiente. En esta superficie existen diversos sectores, donde residen microorganismos con diferentes características de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes. La flora humana normal es el conjunto de gérmenes que conviven con el huésped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composición es característica para la especie humana, tanto en los gérmenes que la componen como en su número y distribución en el organismo. Sitios colonizados y sitios estériles: La flora normal coloniza las superficies cutáneo-mucosas. Por otro lado, en el organismo existen sectores que son estériles en condiciones normales: por ejemplo, pleura, meninges, cavidad peritoneal, pericardio, etc. OBJETIVOS

- Identificar microorganismos contaminantes, para evitarlos en el desempeño de actividades en el laboratorio de microbiología.

- Identificar las bacterias de nuestro cuerpo y reconocer que hacen parte de la flora Normal o Microbiota.

- Aplicar normas de bioseguridad necesarias para garantizar la calidad la calidad de nuestro trabajo.

MATERIALES Y REACTIVOS: (POR GRUPO) 2 Cajas de agar nutritivo. 2 cajas de agar sangre. 5 Hisopos estériles, 2 ml solución salina estéril, 1 bajalenguas estéril. Cada estudiante debe llevar blusa, guantes, tapabocas.

PROCEDIMIENTO: A temperar los medios de cultivo: sin destapar las cajas pasar con mucho cuidado la base de cada caja sobre la flama del mechero, secarlas con una franela o<papel absorbente. Marcar la base de cada caja con marcador en el borde, no en el centro para permitir la observación de cambios o interpretaciones. (grupo, fecha, tipo de medio- iniciales-muestra que se sembró)

1. Sembrar las cajas de agar nutritivo así: Primera caja: humedecer un hisopo en solución salina, escoger una superficie del laboratorio (mesón, ventana, piso, etc) y frotarlo sobre un área de 10 x 10 cm, luego frotarlo suavemente sobre el agar haciendo estrías (deslizarlo de lado a lado: zig zag). Segunda caja: seleccionar un implemento de uso diario ( lapicero, celular, monedas, cosmético, etc) y realizar el procedimiento anteriormente descrito.

2. Sembrar las cajas de agar sangre así: Primera caja: con un escobillón humedecido en solución salina frotarlo dentro de la oreja o cuero cabelludo, o piel alguna superficie seca de su cuerpo. Sembrarlo en forma de estrías sobre el agar sangre. Segunda caja: con un escobillón seco frotarlo dentro de la boca o nariz y sembrarlo en forma de estrías.

Cada caja debe ser marcada correctamente para identificación posterior. Llevar las cajas a incubar a 37 ° C por 24 horas. Realizar el informe. RESULTADOS: 1. Examine cada una de las cajas y cuente el número de colonias desarrolladas, puede utilizar el cuenta colonias. 2. Utilizando los criterios siguientes describa las colonias desarrolladas en cada caja. Y anexe la fotografía respectiva. 3. Que caja presento mayor desarrollo y justifique la respuesta. Criterios para describir las colonias observadas a. Forma: -Regular/irregular -Redondeada/difusa/estrellada/ramificada. b. Aspecto superficial: -Pulida (lisa y regular) -Áspera (con pequeñas irregularidades) -Con anillos concéntricos. -Con radios en su interior c. Color y transparencia: identificar el color. d. Consistencia (se percibe como): -Mantecosa –Fibrosa –Viscosa –Seca -Quebradiza e. Elevación: -Difusa –Plana –Elevada –Conexa –Umblicada f. Borde: -Entero –Ondulado –Lobulado –Erosionado -Filamentosa

CUESTIONARIO 1. Qué es una colonia bacteriana? 2. Porque en nuestro cuerpo se presentan aéreas colonizadas por bacterias, que representa esta situación? 3. Especifique por áreas corporales los tipos de microorganismos que normalmente se encuentran, microbiota. 4. Que precauciones se deben tener para evitar contaminaciones en microbiología- cultivos. 5. Qué es un cultivo puro y como se obtiene?

LABORATORIO No 4 TECNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCION: Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cult ivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cult ivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio ye n l o s i n s t r u m e n t o s y r e c i p i e n t e s u s a d o s e n l o s e x p e r i m e n t o s . E s t o s m i c r o o r g a n i s m o s n o d e s e a d o s o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o l iquido, esteri lizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un Clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. OBJETIVOS

Manipular adecuadamente los cultivos puros.

Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.

Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas bacterias.

Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.

MATERIALES Y REACTIVOS: (POR GRUPO) 1 tubo tioglicolato, 1 tubo con medio SIM, 1 caja de agar sangre, una caja de EMB, 80 ml de agar Plate Count fundido, 4 tubos con 9 ml de solución salina estéril, 1 tubo con medio TSI en pico de flauta, 1 caja con Mueller Hinton, 4 pipetas de 1 ml estériles, 1 pipeteador automático, 1 asa en argolla, 1 asa recta, 2 escobillones estériles, 4 cajas petri estériles, sensidiscos (varios para todo el grupo), mecheros, Tubo No. 1 de la escala de Mc Farland, una pinza o depilador. Cultivos de E. coli, Staphylococcus, otros, 1 erlenmeyer con un cultivo activo de E. coli. PROCEDIMIENTO: Limpiar y esterilizar el área de trabajo Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que ésta presente un cono azul bien marcado. Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo. Marcar el material con iniciales de la cepa a sembrar, fecha y grupo. a) Siembra en medio líquido: caldo tioglicolato. Transferir asépticamente, con el asa de argolla o redonda, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en incubadora, durante 10 a 20 minutos a 37°C, este será utilizado en el literal f). b) Siembra en medio semisólido: (SIM ó MIO)Cualquier medio de movilidad. La siembra en este t ipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y q u e s e e n v a s a e n t u b o s , s e l l e v a a c a b o c o n u n h i l o d e s i e m b r a ( a s a r e c t a ) esterilizada, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar c) Técnicas de estriado: Estriado simple: EMB ó McConkey (cualquier medio selectivo) Esteriliza el asa de siembra en argolla (redonda) y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa, tapa el cultivo inicial, ahora, toma una placa con agar estéri l (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.

Siembra para aislamiento por estría (cuadrantes): agar sangre. El objetivo es esta técnica es extender lo más posible el inoculo con el fin de obtener colonias aisladas (separadas). 1° Paso: Esterilizar el asa, dejar enfriar, tomar una colonia y hacer una estría en un borde de la caja sobre el agar; a continuación quemar el asa para evitar una mayor carga bacteriana en el cultivo. 2°: luego estriar el segundo plano perpendicular a nuestro primer estriado, y repetir lo mismo con el último estriado logrando completar todo el espacio de la placa.

d)Siembra por diluciones: Tubos con solución salina estéril, agar Plate Count. A partir de un cultivo fresco de bacterias realizar una serie de 4 diluciones: marcar los tubos como 10

-1 , 10

-2 , 10

-3 , 10

-4 ,

cada tubo contiene 9 ml de solución salina estéril al primer tubo se agrega 1 ml del cultivo inicial, mezclar, transferir del primer tubo al segundo 1 ml, mezclar y transferir al tercer tubo 1 ml… como indica la gráfica. Marcar 4 cajas petri estériles una para cada dilución y agregar de la dilución respectiva 1 ml a cada caja luego agregar medio fundido Plate Count mezclar según indicación del docente.

e)Siembra en agar inclinado: (TSI) Se toma una colonia del cultivo puro con el asa recta previamente esterilizada, se destapa el tubo con agar inclinado o en pico de flauta, se flamea la boca y se introduce el asa sin tocar las paredes del tubo, picar el fondo y sacar el asa deslizándola suavemente por su superficie en zig-zag. Este tipo de siembre sirve para identificar bacterias: en superficie (aerobias) y en la profundidad del agar (anaerobias).

f) Siembra masiva (antibiograma): Mueller Hinton (MH). a) disco-placa. Con este sistema se puede probar la eficacia de varios antimicrobianos al mismo tiempo realizando una siembra de una suspensión bacteriana, con un inóculo normalizado sobre la superficie de un medio sólido, colocando sobre la misma discos de papel impregnados de una cantidad conocida de antibiótico. Por el agua del medio los antimicrobianos difunden y se crea un gradiente de concentraciones decrecientes a medida que nos alejamos del disco. Tras un periodo de incubación se obtiene, alrededor del disco, una zona de inhibición del crecimiento bacteriano. La valoración del halo se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el diámetro del halo de inhibición y la carga del antibiótico del disco. Los resultados se expresan en términos de categoría clínica (S, I, R). Es un método sencillo y útil para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rápido, no se debe usar en bacterias de crecimiento lento y anaerobios. Es el método que vamos a utilizar en las prácticas. Marcar la caja, tener todo el material listo: escobillones estériles, el medio liquido sembrado en el literal a) y llevado a

incubar, compara la turbidez con el tubo No. 1 de la escala de McFarland. 4 tubos de sensidiscos ó antibióticos, pinza. Destapar el tubo sembrado con microorganismos, flamear la boca del tubo, introducir los escobillones estériles, humedecerlos en el medio, sacarlos haciendo presión en las paredes del tubo para retirar el exceso de liquido, flamear el tubo, taparlo, con los escobillones hacer estrías muy pegadas en toda la caja sobre el agar de arriba abajo, luego de abajo arriba y por los bordes. Quemar los escobillones, cerciorarse que estén bien apagados y descartar en recipiente rojo. Con ayuda de una pinza depositar 4 sensidiscos sobre el agar hacer un poco de presión pero no romper el agar, observar la imagen.

3º) INCUBACIÓN: Verificar que todas las cajas estén correctamente marcadas, llevar a incubar a 37 °C durante 24 horas 48 horas. (observar al día siguiente). RESULTADOS: 1. Examine cada una de las cajas y cuente el número de colonias desarrolladas, puede utilizar el cuenta colonias. 2. Utilizando los criterios siguientes describa las colonias desarrolladas en cada caja. Y anexe la fotografía respectiva. 3. Que caja de la siembra por diluciones presento mayor desarrollo y justifique la respuesta.

Realizar el recuento de colonias en caja: Escoger la caja que contenga entre 30 y 300 UFC y multiplicar por el factor de dilución, reportar con dos dígitos y potencia de 10, cuando el tercer digito es igual o mayor de 5 se aproxima a la unidad al digito anterior si es menor se anula. Ejemplos:

dilución Numero de colonias

reporte

10-2

128 = 12800 1.3 x 103

10--3

262 = 262000 2.6 x 104

4. Interprete el antibiograma realizado. 5.Anexe las fotografías de sus cultivos. Criterios para describir las colonias observadas a. Forma: -Regular/irregular -Redondeada/difusa/estrellada/ramificada. b. Aspecto superficial: -Pulida (lisa y regular) -Áspera (con pequeñas irregularidades) -Con anillos concéntricos. -Con radios en su interior c. Color y transparencia: identificar el color. d. Consistencia (se percibe como): -Mantecosa –Fibrosa –Viscosa –Seca -Quebradiza e. Elevación: -Difusa –Plana –Elevada –Conexa –Umblicada f. Borde: -Entero –Ondulado –Lobulado –Erosionado -Filamentosa CUESTIONARIO 1. Qué es una colonia bacteriana? 2. Qué características tiene un cultivo puro? 3. Especifique por áreas corporales los tipos de microorganismos que normalmente se encuentran, microbiota. 4. Que precauciones se deben tener para evitar contaminaciones en microbiología- cultivos. 5. Cuando tomas un inoculo de un cultivo bacteriano. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? 7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas

durante la incubación?

LABORATORIO No. 5 AISLAMIENTO SELECTIVO Y DIFERENCIAL DE MICROORGANISMOS

BACTERIAS GRAM POSITIVAS.

Introducción Es importante conocer los microorganismos Gram Positivos que forman parte de la biota normal de nuestro organismo e identificar su forma patógena. Son habitantes de nuestro organismo y se encuentran dispersos en el medio ambiente, se encuentran en piel, mucosas, intestino de animales. Son saprofitos habituales de piel y mucosas, y desempeñan un efecto positivo en el proceso de maduración de las carnes. Pueden contaminar alimentos, suelos y agua (Micrococcus). Hay otros como los Staphylococcus, los cuales, se encuentran en tejido habitual de las vías respiratorias altas: faringe, laringe, senos nasales. Muchos de ellos son agentes secundarios, pero también los hay patógenos (agentes primarios). También se encuentran en el tracto urogenital, y de allí pasan a algunos órganos internos, en especial articulaciones y el corazón (son agentes complicantes de las endocarditis), y también el tejido renal. La identificación bioquímica debe hacerse partiendo de un cultivo puro o colonias perfectamente aisladas. Tras observar la morfología de las colonias, el tipo de crecimiento en medio líquido, la morfología bacteriana y la tinción de Gram, se procede a la identificación empleando diversas pruebas bioquímicas. Enzimas que producen los Gram Positivos:

Hialuronidasas, proteinasas, estreptoquinasas (Enzima que destruye coágulos sanguíneos). Cuando se produce la ruptura de un vaso sanguíneo se produce una hemostasia, para que el animal no se desangre. Aquí es donde actúan estas enzimas.

Estreptolisinas O y S. Responsables de la �-hemólisis Hemolisina: � hemólisis-completa BETA / � hemólisis-

incompleta ALFA Estreptolisinas (S. pyogenes): tipo 0 / Tipo S

Pruebas comunes para Gram Positivos

Bacitracina: permite diferenciar entre Streptococcus pyogenes (sensible) de los Streptococcus pneumoniae y agalactiae (son resistentes)

Sensibilidad SXT.

Prueba de la Catalasa

Morfología de la colonia.

Fermentación de Carbohidratos

Coagulasa.

Hemólisis

Novobiocina: Es un antibiótico que inhibe el crecimiento del Staphylococcus aureus y los E. C. N. permite el crecimiento único de S. saprophyticus.

Ureasa

Hidrólisis del hipurato

Tolerancia a la sal

Prueba de la bilis esculina

Prueba de CAMP

Utilización de Sistemas Comerciales de identificación (API)

OBJETIVOS: 1. Identificar e interpretar los fundamentos de las pruebas para Gram positivos. 2. Realizar aislamiento e identificar los microorganismos en estudio, identificando el metabolismo, características culturales. Materiales: Para cada Grupo: 1 tubo con plasma humano. 1 portaobjetos, 1 caja con agar manitol-salado, 1 caja de agra sangre, 1 tubo con bilis esculina. Asa en argolla, escobillón estéril. Para todo el grupo: Agua oxigenada, mecheros, sensidiscos de SXT, pinzas. Cepas de Staphylococcus aureus, epidermidis, saprofiticus, Streptococcus sp. PROCEDIMIENTO 1. Realizar la prueba de catalasa: dependiendo del resultado trabajamos según la siguiente tabla:

Positivo:(Staphylococcus) Negativo: ( Streptococcus)

Coagulasa Bilis esculina

Tolerancia a la sal CAMP

Sensibilidad al SXT

Prueba de catalasa: Los microorganismos que tienen la enzima catalasa descomponen el agua oxigenada en agua y oxígeno. Al depositar sobre una colonia bacteriana (de un medio sin sangre) una gota de agua oxigenada se observarán burbujas (de oxígeno) si la bacteria produce catalasa.

Prueba de coagulasa: La coagulasa es una enzima que tiene la facultad de coagular las proteínas séricas del plasma. Se utiliza para la identificación de estafilococos coagulasa positiva ( S. aureus).

Tolerancia a la sal: Manitol salado: La utilización del manitol formando ácido en altas concentraciones de NaCl 35%es la capacidad que tiene el S. aureus y le permite diferenciarlo de otros Staphylococcus. Forma de siembra: Tomar una colonia y hacer una estría radial en la placa. Lectura: cambio de color del medio de rojo a amarillo (S. aureus.)

Prueba de la Bilis Esculina: los Strept. del grupo D hidrolizan la esculina en presencia de bilis dando como productos esculetina y glucosa. El medio que se usa es el Medio Bilis Esculina que es sólido y se deja enfriar inclinado. La siembra se realiza a partir de un caldo, depositando dos gotas con una pipeta o un asa. La incubación se hace a 35-37ºC durante 48-72 horas. Si la prueba resulta positiva se observa un color negro en la mitad o más de la superficie. Si la prueba resulta negativa no hay ennegrecimiento o aparece en menos de la mitad del medio.

Prueba de CAMP: sembramos en una placa de Agar Sangre estreptococos de forma perpendicular y sin tocarse a una siembra de S. aureus. Si el m.o se trata de un Strept. del grupo B se producirá una sustancia llamada CAMP que en presencia de los Estafilococos producen una zona de lisis en forma de punta, agrandando la zona de hemólisis. Demuestra el sinergismo de hemolisinas entre el Streptococcus y el S. aureus.

Sensibilidad a SXT:<el trimetropim sulfa es un antibiótico que nos permite clasificar y diferenciar al grupo de los Streptococcus Beta hemolíticos. En un agar sangre sembrar en forma masiva una colonia de la bacteria a estudiar y colocar un sensidisco de SXT en el centro, incubar a 37 °C – 24 horas. Sensible: halo de inhibición superior a 14 mm (Streptococcus no Alfa, no Beta) Resistente: Streptococcus pyogenes, S. agalactiae. RESULTADOS: 1. Para cada cepa estudiada hacer un diagrama de las pruebas realizadas, los resultados obtenidos, las características culturales de las colonias, y la identificación de cada una. 2. Anexar las fotografías. Cuestionario: 1. Que bacterias Gram Positivas provocan con mayor frecuencia intoxicaciones alimentarias? 2. Que bacterias Gram positivas presentan Endosporas y cual es la importancia en la industria alimentaria.

3. Realice un esquema en el que se indiquen los grupos bacterianos Gram positivos de acuerdo a la forma (géneros y especies)

LABORATORIO 6 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS.

Introduccion Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasas, coagulasas, decarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc) involucradas en el metabolismo bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los substratos (DNA, hidratos de carbono, aminoácidos, etc) sobre los cuales ellas actúan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradación del substrato o la presencia de un metabolito específico (ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico, indol, etc). Las pruebas bioquímicas también evalúan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a férrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la producción o no de hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores especiales (proteínas séricas), la producción o no de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftérica, toxina botulínica, etc). IMPORTANCIA CLINICA Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioquímica o metabólica. Del microorganismo aislado dependerá el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente. Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clínicamente significativos, producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las infecciones urinarias. Son causa importante de contaminación de alimentos, el agua, utensilios, medio ambiente en general. OBJETIVOS 1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de bacterias bacilares Gram negativas. 2. Determinar género y especie de la cepa problema. MATERIALES • Cepas bacterianas: cepas de bacterias bacilares Gram negativas • Medios de cultivo: Una batería sembrada con una cepa diferente para cada grupo: Agar TSI (triple azúcar hierro), agar LIA (lisina, hierro, agar) agar UREA, agar CITRATO DE SIMMONS, caldo MR (rojo metilo), caldo VP (voges proskauer), medio SIM (sulfuro, indol, movilidad). • Otros: reactivo de oxidasa (dimetil para fenilne diamina o tetrametil para feniline diamina), rojo de metilo, KOH 40%, alfa naftol 5%, Kovacs o Erlich. PROCEDIMIENTO: • Sembrar la cepa problema en toda la batería disponible de acuerdo a la siguiente instrucción: 1- AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estría en superficie.

Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con producción o no de gases (CO2 y H2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se lee un quebrado, la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo) Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas: • Fermentación de la glucosa (K/A). • Fermentación de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A) • No fermentación de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aeróbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo. • Producción de gas: ruptura del medio. • Producción de H2S: ennegrecimiento del medio LECTURAS AGAR TSI

A/A K/A K/K A/A K/A El agar TSI tiene tres azúcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L). Como indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S, se requiere de un medio ácido por lo que dicha producción generalmente está limitada al fondo del medio, razón por la cual un fondo negro debe

leerse como A (ácido), aunque el color amarillo usual esté tapado por el color negro . 2- AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en superficie. Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para atacar el aminoácido LISINA descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de glucosa, laproducción o no de gases (CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas si es necesario) a 37ºC. Se lee un quebrado, la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color púrpura). Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas: a- Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminoácido solo fermenta la glucosa. b- Descarboxilación de la lisina: (K/K) c- Desaminación de la lisina: R/A) rojo/ amarillo d- Producción de gas: ruptura del medio e- Producción de H2S: ennegrecimiento del medio El indicador del PH del medio es PÚRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color púrpura. Por contener pequeña cantidad de Glucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina. LECTURAS DEL LIA.

R/A K/K K/K K/A Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminoácido lisina, con liberación de aminas de reacción alcalina y con producción de CO2. Para que actúen las descarboxilasas se requiere PH ácido que se obtiene por la fermentación de la glucosa que tiene el medio. La desaminación de la lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparición de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentación de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S produciendo un precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S se requiere de un medio ácido por lo que dicha producción

generalmente está limitada al fondo del medio, razón por la cual un fondo negro debe leerse como A (ácido), Aunque el color amarillo usual esté tapado por color negro. 3- AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como única fuente de carbono en ausencia de fermentación de azúcares o de producción de ácido láctico. Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas sí es necesario) a 37ºC. Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene también sales de amonio inorgánicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono también es capaz de utilizar las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH_) con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero sí hay crecimiento la prueba es DUDOSA. LECTURAS AGAR CITRATO

+ +d - 4- AGAR UREA: Sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 moléculas de amoniaco. Lectura. Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Fundamento: El sustrato urea es una diamina del ácido carbónico, denominada carbamida. Todas las amidas (RCO- NH2) son Rápidamente hidrolizadas. La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica que es la ureasa es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposición de los compuestos orgánicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato específico. La ureasa es una

enzima constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. LECTURAS AGAR ÚREA

+ +d - 5- AGAR SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo. Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse (presencia e flagelos), de producir INDOL y H2S. Lectura: Se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Agregar 10 gotas de reactivo de ERLICH o Kovacs. Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminoádico TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. El indol se puede detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color rojo después de agregar el reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba POSITIVA, debido a que el indol reacciona con el grupo aldehído del p- dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL SIM es un medio semisólido sin hidratos de carbono que inhiban la producción de H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de H_S, lo que lo hace más sensible en la detección de H2S por producción de un precipitado negro de sulfuro ferroso. La MOVILIDAD BACTERIANA es otra característica importante en la identificación final de especie, se realiza en medios semisólidos como el SIM, debiéndose leer antes que la prueba de indol porque al agregar el reactivo de Erlich ésta se puede enmascarar. La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscópico del medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación. LECTURAS AGAR SIM

Movilidad: + + + + +

Indol: + - - + - H2S: - + - + - 6- CALDOS MR-VP: sembrar en cada caldo con asa recta. Principio: En el caldo MRVP se determina por qué vía metabólica fermenta la glucosa la bacteria. Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Agregar 10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparición inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva para MR, la aparición de un color amarillo indica que la prueba es NEGATIVA. Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar fuerte después de la adición de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparición de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la aparición de un color amarillo o café indica una prueba de VP NEGATIVA. Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con producción de metabolitos como ácido láctico, fórmico y succínico, los cuales van a hacer descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el indicador de pH ROJO DE METILO, el cual a pH ácido vira a un color rojo. La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con producción de productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el 2,3 BUTILEN GLICOL y el DIACETIL. El producto final más frecuente es el 2,3 BUTILEN GLICOL, que es fácilmente oxidado a ACETIL METIL CARBINOL y luego a DI-ACETIL. El VP realmente es una búsqueda de DI- ACETIL. El VP realmente es una búsqueda de DI-ACETIL, ya que las condiciones de la prueba convierten fácilmente los otros dos componentes en diacetil. Las 3 sustancias son neutras con el resultado de que PH del medio no baja sensiblemente y por lo tanto la bacteria es MR negativa y VP positiva. La bioquímica de la fermentación de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP positivos. Lo sí es más probable es encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras. LECTURAS CALDO MR-VP

+ - sr. 7- CALDO FENIL ALANINA- MALONATO: Sembrar con asa recta. Principio: En el caldo FENIL ALAININA – MALONATO se determina la capacidad que tiene una bacteria de desaminar la FENILALANINA y de utilizar el MALOTO como única fuente de carbono.

Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Primero se lee la prueba de malonato si cambia al color azul indica que la PRUEBA es POSITIVA, si continua de color verde la PRUEBA es NEGATIVA. Para leer la prueba de la FENIL ALANINA agregar 10 g0tas de CLORURO FERRICO al 10%, MEZCLAR FUERTE. La aparición de un color verde oscuro indica que la prueba es FENIL ALANINA POSITIVA. Si el color es amarillo castaño la PRUEBA es NEGATIVA. Fundamento: la bacteria puede utilizar el MALONATO de SODIO como única fuente de carbono con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es AZUL DE BROMOTIMOL que en alcalinidad vira al color azul. Algunas bacterias tienen la capacidad de desaminar la FENIL ALANINA produciendo ACIDO FENIL PIRUVICO por su actividad enzimática, con la consiguiente acidez resultante. Este ácido se visualiza al agregar el cloruro férrico. 8- MEDIO OF GLUCOSA (OXIDACIÓN FERMENTACIÓN de HUGH Y LEIFSON) : sembrar por duplicado con asa recta POR PICADURA CENRAL. A uno de los dos tubos agregar 1 ml de aceite mineral estéril. Principio: Determinar si una bacteria presenta metabolismo FERMENTATIVO u OXIDATIVO de un hidrato de carbono. Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Fundamento: Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (producción de ácido) solo en condiciones aeróbicas, mientras que otras producen ácido aeróbica y anaeróbicamente. La FERMENTACIÓN es un proceso ANAERÓBICO que requiere la fosforilación inicial de la glucosa previa a su egradación, mientras que la OXIDACIÓN en ausencia de compuestos inorgánicos como nitrato y sulfatos es un proceso estrictamente AEROBIO, que comprende la oxidación directa de una molécula de glucosa no fosforilada (inicialmente). La fermentación produce una acidez más elevada que la producida por la oxidación. El medio OF contiene una elevada concentración de hidrato de carbono, con una baja concentración de peptona, para obviar la posibilidad de que un organismo aeróbico utilice la peptona, produciendo así una condición alcalina que neutraliza la más ligera acidez producida por una bacteria oxidativa. La baja concentración de agar permite observar la movilidad del microorganismo, además de la capacidad oxidativa o fermentativa, ya que permite la difusión por todo el tubo de la acidez. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color azul. Cuando la bacteria es fermentadora los 2 tubos el tapado (tubo con aceite mineral) y el destapado van a presentar color amarillo).Cuando la bacteria es oxidadora el tubo tapado permanece de color verde y la superficie del medio destapado vira al color amarillo. Si la bacteria es NO SACAROLITICA (ni oxida ni fermenta) los dos tubos son de

color verde, aunque el tubo destapado en una superficie puede presentar un color azul por degradación de peptonas produciéndose aminas. 9- GLUCOSA, LACTOSA y SACAROSA: sembrar cada tubo de hidrato de carbono con asa recta. Principio: Determinar si una bacteria FERMENTA o no éstos hidratos de carbono. Con o sin producción de gas. Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Se debe observar cuidadosamente la campana de fermentación o campana de DURHAM, para precisar si hay o no producción de gas por desplazamiento de líquido de la campana. Fundamento: algunas bacterias pueden metabolizar (fermentar) diversos hidratos de carbono con producción de ácido, anaeróbicamente. El indicador de PH es el ROJO DE FENOL que en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color rojo. 10- PRUEBA DE OXIDASA: coloque sobre las colonias 5 gotas de reactivo de OXIDASA. Observe la reacción. Principio: determinar la presencia de las enzimas OXIDADAS. Lectura: se efectúa después de 10 a 15 SEGUNDOS después de agregado el reactivo. Fundamento: la prueba de la oxidasa está basada en la producción bacteriana de una enzima OXIDASA. Esta reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema CITOCROMOOXIDASA que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones. Todas las bacterias aeróbicas obtienen su energía por la respiración, proceso responsable de la oxidación de algunos sustratos . El oxígeno molecular oxida un sustrato con la intervención del sistema de transporte de nectrones. El oxígeno es el aceptor de hidrógeno final, produciendo a partir del H_ agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático. El sistema citocromo sólo se encuentra por lo general en los aerobios, lo que los hace capaces de utilizar el 02 como un aceptor de H2 final para reducir el O2 molecular en H202, el último enlace de la cadena de la respiración aeróbica. Los diversos colorantes para la prueba de oxidasa son aceptores de electrones artificiales. La aparición de un color violeta a negro indica la POSITIVIDAD de la prueba. RESULTADOS Compare sus resultados con los de sus compañeros, observe las diferentes lecturas en cada uno de los medios de identificación. Identificación del microorganismo: identifique el microorganismo que le correspondió con la ayuda de la tabla anexa. Cuestionario: 1. Cuál es la prueba básica que nos permite diferenciar los bacilos Gram Negativos fermentadores de lactosa de los que no lo son?

2. Consulte los géneros y especies Gram negativos más importantes en la industria alimentaria y en salud pública. 3. Para la identificación temprana de la E. coli que pruebas se realizan (no es necesario hacer toda la batería). 4. Qué enterobacterias se utilizan como indicadores de calidad del agua, por qué? 5. Que medios selectivos se utilizan para Salmonella, Vibrión, Shiguella, Klebsiella. Cuál es la importancia de estas bacterias en la salud pública. BIBLIOGRAFIA - Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5ª. Edición,

Washington Square: Lippincott – Raven Publishers, 1997: 173- 203 - Mac Faddin J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Panamericana , 1980 -Koneman Elmer W. Anexo: Tabla para identificación Enterobacterias. Al final de las guias.

LABORATORIO No. 7 TINCION O COLORACION DE ESTRUCTURAS.

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM INTRODUCCIÓN: La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante primario. La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacárido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de estas células. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de la safranina que es el colorante de contraste.

OBJETIVOS: 1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. 2. Conocer y aplicar las coloraciones de cápsula y esporas. 3. adquirir destreza en la realización de frotis óptimos para coloraciones. 4. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. 5. Describir el fundamento de cada coloración. MATERIAL POR EQUIPO: - Microscopio óptico, - Colorantes para tinción de Gram - 1 mechero, - asa microbiológica, gradilla para coloraciones - Recipiente de plástico para las tinciones, asa redonda, portaobjetos limpios. - Aceite de inmersión, Papel absorbente, lápiz de cera, Cultivos bacterianos jovenes: Gram positivos, Negativos, Klebsiella, Bacillus . PROCEDIMIENTO: 1. Marcar un portaobjetos con el número de la caja a observar. Cada equipo deberá hacer obligatoriamente una tinción por cada caja. 2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar: en una gota de agua diluir una colonia, expandirla circularmente hasta que quede fino, si el extendido es grueso descartarlo y volver a realizarlo, pasarlo dos o tres veces sobre el mechero (fijación). 3. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. 4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con agua sobre el recipiente de plástico para tinciones. 5. Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lava. 6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante 10 segundos. 7. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lavar.

8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la técnica de la práctica anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersión. RESULTADOS: describe brevemente los resultados obtenidos. Dibuja tus observaciones Género o especie: Aumento: ____× Morfología: Gram: DISCUSIÓN • Investiga qué tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan resultados no deseables cuando se realiza una tinción de Gram (por ejemplo que una bacteria Gram negativa se colore de morado). 2. COLORACION DE ESPORAS Método de Schaeffer y Fulton:

Preparar un frotis de Bacillus cereus. Fijar con calor. Cubrir la placa con Verde de malaquita al 5%. Pasar la lamina 1 mn. sobre el mechero, hasta emitir vapores (no hervir, porque el colorante se evapora totalmente). Dejar la lamina con el colorante durante 3 mn más sin calentar. Lavar con abundante agua. Cubrir el extendido con Safranina durante 2 mn. Lavar con abundante agua, dejar secar, limpiar la lamina por debajo y bordes. Observar con objetivo de inmersión. Interpretación: Las esporas se ven de color verde y las bacterias de color rosado fucsia. 3. COLORACION DE CAPSULA:

i..Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. II..Método de Hiss: Realizar un frotis con Klebsiella pneumoniae. Fijarlo. Cubrirlo con fuscina básica. Llevarlo al calor hasta emitir vapores por 30 seg. Lave la preparación con sulfato de cobre. Dejar secar, observar con 100 X. Procedimiento 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión). CUESTIONARIO: a) Glosario. Defina los siguientes términos. 1. Colorante 2. Mordiente 3. Tinción diferencial 4. Tinción simple 5. Peptidoglicano. b) Cuál es la función y estructura de la capsulas y esporas? c) Cuál es el fundamento de la coloración de capsulas y esporas?.

LABORATORIO No. 8 CUANTIFICACION DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL

La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos, y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.

CRECIMIENTO MICROBIANO: La división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula, duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática. De ésta manera una célula da nacimiento a dos células hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades. En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es la gemación o botón. Se forma una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño, luego se produce la división en el núcleo y migra hacia el botón. Finalmente crece hasta un tamaño suficiente y posteriormente se separa formando otra célula idéntica a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimiento de división celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticas.” MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO: El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos. Métodos directos:

Recuento del número de células en una cámara.

Peso seco celular

Determinación de nitrógeno o de proteínas totales

Determinación de DNA Métodos indirectos:

Recuento de colonias en placa

Recuento sobre filtro de membrana

Consumo de oxígeno

Liberación de dióxido de carbono

Concentración de un enzima constitutivo

Decoloración de un colorante

Incorporación de precursores radiactivos

Medida de la turbidez

ABSORCIÓN:

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetría: Mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. RECUENTO MICROSCÓPICO: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono). Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.

OBJETIVOS:

1. Determinar la cinética de crecimiento de E. coli, en caldo tripticasa de soya TSB.

2. Trazar la curva de crecimiento del microorganismo utilizando el método turbidimetrico.

3. Calcular el tiempo de duplicación, el coeficiente de correlación y la ecuación de la recta de la fase exponencial.

MATERIALES Y REACTIVOS: Para cada grupo:

Erlenmeyer con 45 ml de caldo TSB. (a 36°C)

Tubo con 5 ml de caldo TSB inoculado con E. coli. (mantenido a 36°C)

8 tubos tapa rosca estériles.

1 pipeta 10 ml estéril.

Pipeteadores automáticos.

Cronometro. Para todo el curso:

Cámara cuenta células.

Microscopio.

Espectrofotómetro.

50 ml de TSB estéril para realizar los tubos blanco.

PROCEDIMIENTO: Iniciar el equipo ubicando el filtro UV (650 aprox.) colocando en cero con el tubo blanco (caldo TSB estéril) Marcar los tubos con el nombre del grupo y enumerarlos de 1 a 8. Siembra: Agregue al erlenmeyer con 45 ml de TSB los 5ml del medio activo con E. coli. Registrar esta hora (t=0) pipetear 6 ml en el tubo 1 y medir inmediatamente la absorbancia (No). Pipetear en los 7 tubos restantes 6 ml de TSB cultivo activo y llevar a la incubadora a 36°C.

Determine la DO. de cada caldo inoculado, teniendo en cuenta que la cubeta esté libre de huellas dactilares o sustancias que impidan la real lectura. Completar la siguiente tabla teniendo en cuenta los siguientes tiempos:

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 LECTURA A 5

mn 10 mn

20 mn

30 mn

60 mn

90 mn

120 mn

150 mn

Hora lectura

absorbancia Recuento cámara

RECUENTO EN CAMARA:

Procedimiento:

Limpiar la cámara y colocar el cubreobjetos en la parte central, agregar una gota del cultivo de bacterias, teniendo cuidado de no inundar la parte central. Enfocar con objetivo de exploración para ubicar la cuadricula, pasar a 10X, 40 X y 100X. Seleccionar 4 cuadriculas centrales (de 25 cuadritos cada uno) y contar el numero de bacterias sacar el promedio: Media 14+15+13+14 / 4 = 14 bacterias en 25 cuadros. Y aplicar la fórmula genérica siguiente: Si se encuentran 14 bacterias en 25 cuadros en la cámara ¿cuantas bacterias habrá en 16 cuadros? X = 16 * 14 / 25 = 224 / 25 = 8,96 Volumen de la cámara = 0.2mm x 0.2mm x 0,1mm x 25 = 0,1 mm3

8.96 bacterias X 400 cuadros X inverso dil.(10) =bacterias /ml 16cuadros 0.1mm3 1ml = Otra fórmula más sencilla es: Promedio bacterias contadas X 25 X 10 X 10= bacterias/ml Donde 25 numero de cuadritos 10= factor de corrección de la cámara 10= inverso de la dilución. RESULTADOS: Trazar la curva de crecimiento por los dos métodos. Calcular el tiempo de duplicación (g) Encontrar la ecuación de la recta en fase exponencial. Cuestionario: 1. por qué el crecimiento exponencial origina grandes poblaciones celulares en cortos periodos de tiempo? 2. Que es una representación semilogaritmica? 3. Cuando no se presenta fase de latencia? 4. Por que entran las bacterias en fase estacionaria? 5. Que métodos se utilizan para la cuantificación de células? Qué ventajas y desventajas tiene cada uno? 6. Por qué un recuento de viables es mas sensible que un recuento microscópico? 7. Cuál es la diferencia entre la constante de la velocidad de crecimiento (k) de un organismo y su tiempo de generación (g).

LABORATORIO No. 9 y 10

CULTIVO DE HONGOS Y LEVADURAS INTRODUCCION: Los dermatofitos son el grupo de hongos más homogéneo según sus requerimientos y su poder patógeno. Según su hábitat se han clasificado en geofílicos, zoofilicos y antropofilicos lo cual es importante para saber de donde proviene la infección que se está estudiando. También son capaces de invadir diferentes sitios: el género Trichophyton ataca la piel, pelo, uñas; Microsporum lesiona piel y pelo Epidermophyton ataca piel y uñas. La identificación de las especies de dermatofitos se hace a partir de los cultivos, los cuales se realizan cuando se sospecha enfermedad y a pesar de que en el examen directo KOH no se hayan observado hongos. Las muestras se siembran en agar sabouraud modificado, se incuban de 22 a 27° C, se mantienen en la oscuridad de 5 días a 3 semanas. OBJETIVOS:

1. Realizar técnica de siembra de hongos macro y microcultivos, y reconocer la importancia de estos en el logro de la esporulación de los dermatofitos.

2. Realizar placas de hongos: examen directo con KOH y teñidas con azul de lactofenol.

3. Reconocer microscópicamente estructuras morfológicas de los hongos filamentosos y mohos: micelio (septado y aseptado), micro y macroconidias, artrosporas, clamidosporas.

4. Reconocer las estructuras de levaduras: pseudomicelios, blastoconidias.

MATERIALES: Cultivos puros de: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton, Aspergillus, Fusarium, Penicillum, Cándida. Porta y cubreobjetos, agujas de disección, mecheros. KOH al 10% y azul de lactofenol. Para cada grupo: 1 Caja de agar sangre. Tres cajas de agar sabouraud. 1 caja Petri estéril, 1 porta y cubreobjetos estériles, una cuchilla de bisturí estéril, palillos, 1 pinza o depilador estéril, papel absorbente. Para todo el grupo 5 cajas con agar sabouraud de 18 mm de grosor. Agua destilada estéril. PROCEDIMIENTO:

1. TECNICAS DE SIEMBRA DE HONGOS A. MACROCULTIVOS.

Las cajas deben estar a temperatura ambiente, se beben marcar en el borde, en la base de la caja. En cada caja sembrar un hongo diferente. Con el asa recta, previa esterilización y enfriamiento, coger de la parte externa de la colonia una porción del cultivo suministrado.

Inocular la muestra tomada en el agar sabouraud, haciendo un pinchazo en el centro. Garantizando que se sembró en profundidad. Sellar la caja con papel microfilm o cinta. Incubar las cajas en un sitio oscuro preferiblemente, a temperatura ambiente (22 a 25°C) más de cinco días o hasta la próxima práctica de microbiología.

B. MICROCULTIVOS: Técnica Ridell o en Bloque. Esta técnica de cultivo induce al hongo a la esporulación necesaria para su identificación. Los medios utilizados para esta técnica son: agar arroz, agar sémola de maíz. Ubicar cerca al mechero todos los materiales necesarios, los cuales deben estar estériles. Marcar las cajas de la manera indicada. En la caja Petri estéril, colocar el papel absorbente (o filtro) humedecerlo con unas gotas de agua destilada estéril, colocar dos palillos en los lados opuestos de la caja los cuales serán el soporte del portaobjetos estéril para que no que en contacto directo con el papel humedecido. Con el bisturí estéril cortar un cuadro de 1 cm de lado del agar, con el mismo bisturí sacar cuidadosamente el cuadro y colocarlo en el centro del portaobjetos estéril. Con el asa recta (esterilizada y fría) coger una muestra del hongo suministrado, y sembrarlo picando los lados y el centro del cuadro de agar. Con ayuda de una pinza o depilador colocar el cubreobjetos sobre el cuadro de agar. Tapar la caja Petri, con mucho cuidado sellarla con cinta o papel microfilm. Incubarla a temperatura ambiente, revisando periódicamente si hay desarrollo del hongo (1 semana a 1 mes).

C. Cultivo de levaduras: En la caja de agar sangre sembrar en estría para aislamiento una colonia de levaduras. RESULTADOS. Una vez se haya desarrollado el hongo en la técnica de: A.MACROCULTIVO: 1- Observar y describir las características macroscópicas de las colonias, dibujar o fotografiar y realizar un cuadro comparativo entre los tres géneros que sembró. 2- Observación microscópica:

a. En un portaobjetos colocar una porción del hongo tratando de expandirlo, adicionar una gota de KOH al 10%, cubrir con el cubreobjetos. Observar en 40 X.

b. En un portaobjetos limpio colocar una gota de AZUL DE LACTOFENOL, coger con la aguja de disección una porción del hongo y extenderlo en la gota, no macerar la muestra ni disolverla. Colocar el cubre hacer una ligera presión y observar en 40X.

Dibujar o fotografiar identificando las estructuras observadas en cada una de las preparaciones.

B.MICROCULTIVO: Para observar el desarrollo de la esporulación: con ayuda de una pinza colocar el cubreobjetos del microcultivo en otro portaobjetos con una gota de azul de lactofenol. Observar en 40X, dibujar o fotografiar e indicar las estructuras observadas.

D. LEVADURAS: Del cultivo de levaduras realizar una lámina y colorear con Gram. Observar en 100X, fotografiar indicar estructuras observadas. De un tubo germinal realizar un montaje húmedo, observar en 40X fotografiar e indicar estructuras observadas.

CUESTIONARIO

1. Cite 10 indicaciones se deben seguir para evitar la contaminación con hongos del ambiente.

2. Qué es y que función cumple el micelio aéreo y el vegetativo?

3. Cuáles son las levaduras de interés industrial. 4. Cuáles son los hongos del ambiente del laboratorio.

Anexar los resultados de esta práctica: descripciones, características, fotografías, identificación de estructuras: conidias, fialides, esparangioforos, macroconidias, tipo de hifa, esterigmas, clamidosporas, etc.

LABORATORIO No 11 Y 12. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS.

CARACTERIZACION FENOTIPICA.

Principios de garantía de la calidad microbiológica de los

alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el

análisis microbiológico de los productos finales: Principios

ecológicos, Fundamentos de los procedimientos analíticos

(heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los

alimentos, transporte de muestras, confianza en los

procedimientos, daño o lesión subletal, evaluación

sistemática de los medios de cultivo): Necesidad de valores

de referencia. Muestreo: muestra única, toma de muestras

representativas. Utilización de microorganismos como

marcadores (índices e indicadores).

1. Principios de garantía de la calidad microbiológica de los

alimentos.

El análisis microbiológico de alimentos no tiene carácter

preventivo sino que simplemente es una inspección que

permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede

lograr un aumento de la calidad microbiológica mediante el

análisis microbiológico sino que lo que hay que hacer es

determinar en la Industria cuáles son los puntos de riesgo de

contaminación o multiplicación microbiana (los llamados

Puntos Críticos del proceso) y evitarlos siguiendo un código

estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribución del

alimento (BPE).

La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar

productos de baja calidad microbiológica y no en comprobar

la calidad microbiológica de los ya elaborados (lo que, por

otra parte, presenta una relación coste - beneficio muy baja

por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar).

Fundamentos de los procedimientos analíticos:

B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en

los alimentos: El factor más importante en el análisis es el

muestreo, que incluye: (a) Evaluación de la muestra necesaria

para evitar la distorsión producida por los microorganismo

que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por

ejemplo de las canales o de las máquinas, sistemas de

alimentos heterogéneos (ensaladas, platos congelados, etc.);

(b) Determinación del modo óptimo de remoción del

micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La

evitación de la contaminación ambiental durante la toma o

transporte de muestras.

B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que

durante el transporte de las muestras se produzca: (a)

Multiplicación de los microorganismos presentes y (b)

Inactivación de algún microorganismo.

En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas

del entorne de 0º C por un tiempo no superior a las 24 horas,

excepto en el caso de gérmenes termotrofos.

B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es

necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4

y 10-7

de

la flora normal del alimento, flora ésta inocua. Es necesario

utilizar medios selectivos para detectar estos

microorganismos presentes en proporciones tan bajas.

Como norma general conviene probar experimentalmente los

medios usados para determinar su selectividad y su

productividad; así como no debe usarse un medio diseñado

para un producto en otro producto diferente porque las

condiciones ecológicas pueden ser diferentes dando lugar a

una distorisión de los resultados.

B.4.- Daño o lesión subletal: Tratamientos tecnológicos

pueden producir daños subletales en los microorganismos

que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos

rigurosamente a medios seléctivos. Son necesarios medios de

recupe-ración en los que hay que considerar: (a) El tipo de

microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carácter

y la intensidad del daño infligido, (c) El tipo de alimento en el

que esté el microorganismo y (d) El medio selectivo final.

Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a

seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de

recuperación: recuperación en líquido (2 h. 25º en agua

peptona) o en sólido (>6 h. en agua LB o similar, incubando

luego 4 - 6 h. a 25º C) seguido del tratamiento selectivo

(siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando

selectivo).

3. Muestreo.

El muestreo consiste en separa una serie de muestras

representativas del lote para someterlas al análisis

microbiológico.

A. Muestreo único

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida única de

alimento hay que considerar que los datos de mayor

importancia los proporcionan las normas de elaboración y

conservación del alimento. Esto es especialmente importante

en partidas de alimentos importados, sobre todo los

enlatados.

Como norma general, si se trata de un lote desconocido es

conveniente analizar un número de muestras equivalente al

1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. Aunque estos

valores hay que adecuarlos a las condiciones reales.

Cuando se analiza una muestra única el mejor criterio de

seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las

muestras únicas están siempre sometidas a una gran

probabilidad de falsos negativos.

B. Análisis repetido.

Se pueden definir dos tipos de riesgo microbiológico: (a) el

riesgo del consumidor: probabilidad de aceptación de lotes

substándar y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de

rechazo de lotes substándar.

Un sistema de muestras basado en el análisis de 10 muestras

al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa

obligará al fabricante a establecer medidas de seguridad

suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.

C Planes de muestreo de tres categorías.

Se aceptan con condiciones algunos alimentos que

sobrepasen la norma microbiológica establecida conforme a

los valores microbiológicos de referencia. Clase: aceptable,

grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el

obtener valores más altos que los de referencia no hace

inaceptable el alimento].

D. Toma de muestras representativas.

Una vez decidido el número de muestras que hay que tomar,

han de seleccionarse éstas de forma estadísticamente

representativa utilizando tablas de número al azar. Dentro de

cada unidad hay que tomar muestras representativas de

todos los constituyentes del alimento, para ello se debe

homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher.

4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores

(indices e indicadores).

A. Introducción histórica, terminología y bases de su

utilización.

Historicamente, desde hace un siglo se estudia la detección

de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes

(enterobacteriaceas) como índice de contaminación final en

lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi.

En todo Control Microbiológico de calidad destacan dos

aspectos :

Calidad Higiénico - Sanitaria : que no se distribuyan

microorganismos patógenos para la salud .

Calidad Comercial : presencia de microorganismos

alterantes , que alteren el producto haciéndolo no comestible

( aunque no sean patógenos )

OBJETIVOS: 1. Conocer y aplicar el protocolo adecuado para el

procesamiento de muestras para análisis

microbiológico.

2. Determinar el grado de contaminación de un alimento a partir del análisis microbiológico.

3. Establecer el tipo y el número de microorganismos presentes en el alimento analizado.

MATERIALES: Cada grupo debe traer al laboratorio aproximadamente 12 gr de un alimento. Para cada grupo

1 erlenmeyer con 99 ml de agua peptonada al 0,1%

3 tubos con 9 ml cada uno de agua peptonada (gradilla)

9 tubos con caldo Bilis verde brillante ( cada tubo con campana de Durham)

2 cajas de agar E.M.B.

3 tubos con caldo Brilla. (campana de durham)

3 tubos con caldo Triptona . (campana de durham)

1 erlenmeyer con 90 ml de agar Plate Count fundido.

1 erlenmeyer con 90 ml de agar Ogy o saboraud Fundido.

8 cajas petri estériles

5 pipetas de 1 ml estériles.

20 puntas amarillas estériles

Pipeteador automático, perilla plástica.

Pipeta automática (micropipeta) de 100 ul. (rotar para todos los grupos)

1 mortero completo

1 bisturí nuevo (ó estéril)

Mechero, incubadora a 37 °C, baño María a 44,5 °C (esta temperatura es critica), Reactivo de Kovacs (gotero) balanza analítica,

PROCEDIMIENTO.

1. DILUCIÓN DE LA MUESTRA (ALIMENTO): 1.1. Tener en cuenta las normas de bioseguridad y asepsia

en el sitio de trabajo, Iniciar lo antes posible. Pesar 11 gr del alimento (en papel aluminio) el alimento debe estar descongelado y a temperatura ambiente en el momento de iniciar.

1.2. Desinfectar el área de trabajo y los empaques que contienen el alimento (bolsa plástica, lata, embase, etc) si el alimento es liquido mezclar antes de hacer la dilución.

1.3. Si el alimento es liquido se hacen las diluciones en tubo midiendo 1 ml de la muestra y transfiriendo a un tubo con agua peptonada, se mezcla y se transfiere 1 ml al siguiente tubo, así sucesivamente.

1.4. Si el alimento es sólido: en un mortero estéril colocar los 11 gr de alimento y partirlo en pedazos muy pequeños (triturar).

1.5. Se preparan las diluciones 10-1

hasta 10-4

Alimento 11 gr + 99 ml 1ml 1 ml 1 ml

Diluciones sucesivas

10-1

10-2

10-3

10-4

2. INOCULACION DEL ALIMENTO: 2.1. PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES:

Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones en tubos con caldo Verde Bilis Brillante (Brilla) utilizando tres tubos por cada dilución.

Asegurarse que las campanas de Durham estén libres de burbujas. Incubar los tubos a 37°Cpor 24 – 48 horas.

Los tubos con producción de gas se deben sembrar en agar EMB, incubar a 37 °C por 24 – 48 horas.

2.2 PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES Y FECALES:

Confirmar que los tubos con producción de gas (burbujas o desplazamiento tubo de Durham) son positivos, inoculando 100 ul de cada tubo positivo en un nuevo tubo con caldo Brilla y otro con caldo Triptona (+ tubo Durham)

Incubar estos tubos en baño María a 44,5 °C por 24 horas.

Pasadas las 24 horas registrar los tubos que presentaron producción de gas.

Al caldo triptona agregar 4 gotas de reactivo de kovacs mezclar suave y observar la formación de un anillo rojo en la superficie del tubo, reacción que indica que la prueba es positiva.

2.3 RECUENTO DE MESOFILOS: (: agar cuenta gérmenes) Indica contaminación durante la elaboración o empaque.

Marcar dos cajas petri por dilución.

En cada caja petri (duplicado) colocar 1 ml de cada dilución.

Inmediatamente agregar a cada caja petri agar fundido PLate Count .

Mezclar haciendo círculos hacia la derecha, izquierda, arriba y abajo garantizando que el inoculo quede bien diluido en el agar ( tener cuidado de no manchar la tapa de la caja)

Dejar solidificar el agar e invertir las cajas, incubar a 37 °C por 24 horas.

Observar los resultados. 2.4 RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS (agar Ogy o Sabouraud)Indica contaminación por manipulación de personas contaminadas, contaminación por el aire durante el empaque o almacenamiento inadecuado.

Realizar el mismo procedimiento que en recuento de mesofilos pero agregar agar fundido Ogy o Sabouraud.

Dejar solidificar , invertir las cajas, incubar a temperatura ambiente durante 5 a 8 días

3. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

3.1 DETERMINACION DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Registrar el número de tubos positivos por cada dilución e interpretar en la tabla NMP. Anexo.

Ejemplo:

10-1

10-2

10-3

NMP

2 0 1 0.68

Las cajas de agar EMB: observar si hay crecimiento de colonias con brillo verde metálico, deben coincidir con la

prueba de Kovacs (caldo triptona) de la prueba confirmativa para coliformes totales y fecales.

Realizar el recuento de colonias para mesofilos y hongos: Escoger la caja que contenga entre 30 y 300 UFC y multiplicar por el factor de dilución, reportar con dos dígitos y potencia de 10, cuando el tercer digito es igual o mayor de 5 se aproxima a la unidad al digito anterior si es menor se anula. Ejemplo:

dilución Numero de colonias

reporte

10-2

128 = 12800 1.3 x 103

10--3

262 = 262000 2.6 x 104

4. CUESTIONARIO:

A. Qué importancia tiene el análisis microbiológico de los alimentos, de tres ejemplos concretos.

B. Qué valor tienen las pruebas presuntiva y confirmativa en un análisis de alimentos?

C. Que pruebas (medios de cultivos) se realizan para la determinación de Staphylococcus coagulasa positivo, Salmonella, Vibrio cholerae.

D. Cuáles son los parámetros que establece el INVIMA sobre la presencia de microorganismos en los alimentos, (escoja cuatro alimentos) ejemplo: NORMA INVIMA

Pescados y mariscos min. MAX

Coliformes Fecales 4 400

Staphylococcus C.P. 100 1.000

Salmonella 0 0

V. cholerae 0 0

E. Anexar la evidencia de los resultados del

laboratorio.

REACCION

E. Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Serratia Enterobacter Proteus Providencia

Esch

eric

hia

co

li

dis

ente

riae

flex

ner

y

bo

ydii

son

nei

typ

hi

ente

rid

itis

freu

nd

y

div

ers

us

ariz

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neu

mo

nia

e

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rin

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om

a

tis

mar

cesc

ens

liqu

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ien

s

rub

idae

clo

acae

aero

gen

es

haf

nia

e

mir

abili

s

vulg

aris

mar

sum

i

alca

lifac

ien

s

stu

arti

i

ratg

eri

TSI A/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A KA/A KA/A KA/A A/A A/A A/A A/K A/K A/K A/A K/A KA/A A/A A/A A/A KA/A KA/A KA/A

TSI (H2S) N N N N N d P P-N N P N N N N N N N N N P P N N N N

TSI GAS P N N N N N P P P P P P P P-N P-N d P P P P P P-N d N P-N

LIA K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K R/A R/A R/A R/A R/A R/A

C. SIMONS N N N N N N P-d P P P P d N P P P P P d P d N P P P

UREASA N N N N N N N d d N P d N d d d P-N N N P P P-N N N P

MOVILIDAD P-N N N N N P P P P P N N N P P P P P P P P P-N P P-N P

INDOL P N-P P-N N-P N N N N-P P N N N N N N N N N N N P P-N P P P

ROJO DE METILO

P P P-N P P P P P P P N-P P P N-P N-P N-P N N N-P P P P-N P P P

VOGES P. N N N N N N N N N N P N N P N-P P P P P N-P N N N N N

RESULTADOS:

Cultivo No._____________

Pruebas Bioquimicas. TSI________ H2S________ Gas_______ LIA__________ C.Simons_____________ SIM: Indol_________ Movilidad__________ Ureasa__________ Rojo de metilo__________ Voges Proskawer__________ Microorganismo: género_____________________especie________________