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CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNICA PRIMERA ACREDITADA A NIVEL NACIONAL

Prof. Responsable | MV. SIEVER MIGUEL MORALES CAUTI

CMVZ.2015 GUA DE PRACTICA DE MICROBIOLOGA

VETERINARIA

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

MV. Siever Miguel Morales Cauti

2

i

GGLLOOSSAARRIIOO

Acidfilo Bacterias que desarrollan mejor a pH menor a 5.5

Aerbico requiere oxgeno libre para la respiracin.

Aerobio facultativo crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de oxigeno libre.

Alcalofilo bacterias que desarrollan mejor a pH mayor a 8.0

Anaerobio no requieren oxigeno libre para la respiracin.

Anaerobio obligado muerte de bacterias en presencia de oxigeno, crecimiento solo

en ausencia del mismo.

Antibacteriano agente que destruye a las bacterias.

Bactericida con actividad letal antibacterial.

Bacteriosttico agente que detiene el crecimiento bacterial.

Colonia bacteriana agrupacin de un tipo de clulas bacterianas sobre un medio de

cultivo.

Cultivo diferencial Crecimiento de los microorganismos, causando un cambio

visual en el medio de cultivo.

Cultivo selectivo permite el crecimiento particular de una bacteria, por que hace

uso de inhibidores.

Fisin binaria proceso a travs del cual, las clulas bacterianas se replican.

UFC unidad formadora de colonias (en gramo o mililitro), esta es la

forma estndar de medir a nivel bacteriano.

Mesfilos ptimo crecimiento entre 25 y 40 C

Microaerfilos ptimo crecimiento en bajas concentraciones de oxigeno.

Psicrfilo ptimo crecimiento entre 4 y 20 C algunos hasta 0C.

Termfilo ptimo crecimiento entre 50 y 60 C algunos hasta 100 C

Sensibilidad susceptibilidad de una bacteria hacia un antibacteriano.

Serologa parte de la medicina que estudia los sueros y sus propiedades,

especialmente las inmunolgicas.



El trabajo con los microorganismos se clasifican segn cuatro grupos de riesgo individual y

comunitario, a saber: Grupo de nivel de riesgo 1. (Riesgo individual y comunitario escaso o nulo).

Grupo de riesgo constituido por microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en humanos o en animales.

Grupo de nivel de riesgo 2. (Riesgo individual moderado, riesgo comunitario

bajo). Grupo de riesgo constituido por agentes patgenos que pueden

provocar enfermedades en humanos o en animales, pero que tiene pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin, pero aplicando medidas eficaces de tratamiento y prevencin, el riesgo de propagacin es limitado.

Grupo de nivel de riesgo 3. (Riesgo individual elevado, riesgo comunitario

moderado). Grupo de riesgo constituido por agentes patgenos que pueden

provocar enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo riesgo de propagarse en la comunidad. Se aplicar al diagnstico, investigacin y produccin en el cual se trabaja con agentes que pueden causar una enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposicin a aerosoles. Puede disponerse o no de medidas eficaces de tratamiento y de prevencin.

Grupo de nivel de riesgo 4. (Riesgo individual y comunitario elevado).

Grupo de riesgo constituido por agentes patgenos que pueden provocar enfermedades graves en las personas o en los animales, con alto riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y prevencin.

A su vez los tipos de actividades u operaciones que se pueden realizar con los microorganismos se definen como:

A: Actividad que no multiplica ni disemina el microorganismo B: Actividad que multiplica y/o disemina el microorganismo. C: Trabajo con animales potencialmente infectados.



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De la interrelacin entre las dos clasificaciones anteriores se establece, para un listado de microorganismos, el nivel de bioseguridad necesario entre los siguientes cuatro posibles:

Nivel de bioseguridad 1: Debe contemplar lo siguiente:

a) El trabajo es generalmente realizado sobre mesadas abiertas y se usan tcnicas microbiolgicas adecuadas.

b) No se requiere equipamiento de contencin ni diseo especial de infraestructura. c) El personal de laboratorio debe tener capacitacin continua y supervisin de un

profesional habilitado. d) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.

Nivel de bioseguridad 2: Debe contemplar lo siguiente:

a) El personal de laboratorio debe tener entrenamiento especfico para manipular agentes patgenos y estar supervisado por un profesional habilitado.

b) El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado. c) Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto-punzantes. d) Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser

realizadas con equipamiento y/o procedimientos de contencin fsica. e) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.

Nivel de bioseguridad 3: (Laboratorios de contencin). Se debe aplicar al diagnstico, investigacin y produccin cuando se trabaja con

agentes que puedan causar una enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposicin a aerosoles. Debe contemplar lo siguiente:

a) La capacitacin debe ser especfica. b) Todos los procesos que involucran manipulacin de este nivel de material infeccioso

deben ser realizados en cabinas de seguridad biolgica. c) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada y disponer de vestuario

doble con ducha. d) El laboratorio debe tener diseo e instalaciones adecuadas para la contencin. e) Es necesario el tratamiento de los efluentes lquidos. f) Se debe usar filtracin absoluta HEPA del aire extrado y presin negativa en el

laboratorio. Nivel de bioseguridad 4: (Laboratorio de mxima contencin) Debe contemplar lo siguiente:

a) El acceso al laboratorio debe ser estrictamente controlado (ingreso y egreso documentados) y debe estar aislado del resto de las instalaciones.

b) Dentro de las reas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de seguridad biolgica Clase 3 o gabinetes de seguridad biolgica Clase 2 con traje presurizado para el operador.

c) Se debe realizar el tratamiento in situ de los efluentes. d) Se debe usar filtracin absoluta doble HEPA del aire extrado, y aplicar presin negativa

en el laboratorio.

Cada nivel de bioseguridad incluye las medidas del nivel anterior. La norma aclara que en el caso que durante una investigacin microbiolgica se produzca evidencia de la presencia de un microorganismo que requiera un nivel de bioseguridad superior al del mbito donde se efecta el trabajo, toda manipulacin posterior con dicho microorganismo se realizar nicamente en un mbito de nivel de bioseguridad correspondiente o se proceder a su destruccin de acuerdo con las reglamentaciones legales vigentes.



PPRRCCTTIICCAA NN 11

BBIIOOSSEEGGUURRIIDDAADD,, RREECCOONNOOCCIIMMIIEENNTTOO DDEE MMAATTEERRIIAALLEESS YY EEQQUUIIPPOOSS DDEE

LLAABBOORRAATTOORRIIOO

BIOSEGURIDAD: Es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la salud de adquirir infecciones en el

medio laboral. Son todos aquellos principios, normas y estrategias de disminucin de riesgos.

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estndares rutinariamente

para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que

puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro

fluido corporal del paciente (muestras orgnicas), cultivos bacterianos vivos, etc.

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros

fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, mediante la utilizacin de materiales

adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras (Ej.

Guantes, mascarillas) no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen

las consecuencias de dicho accidente.

C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de

dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales utilizados en la

obtencin de muestras y procesamiento de las mismas, son depositados y eliminados sin

riesgo.

Seal de

peligro

biolgico



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RECOMENDACIONES A SEGUIR EN EL LABORATORIO:

1. Proteccin de la piel: Usar guantes limpios, no necesariamente estriles, previo al

contacto con: sangre, fluidos corporales, secreciones, excreciones, mucosas y

materiales contaminados. Para procedimientos invasivos se deben usar guantes de

ltex, estriles y luego descartarlos.

2. Proteccin ocular: La proteccin ocular y el uso de mascarillas tiene como objetivo

proteger membranas mucosas (ojos, nariz y boca) durante procedimientos que puedan

generar aerosoles y salpicaduras de sangre, de fluidos corporales, secreciones y

excreciones. Los lentes y mascarillas deben ser amplios y ajustados al rostro para

cumplir eficazmente con la proteccin

3. Proteccin corporal: A travs del mandil blanco de manga larga.

4. No comer, beber, ni fumar en el laboratorio

5. No manipular el sistema elctrico con las manos hmedas.

6. Las mesas de trabajo deben estar desinfectadas antes de inicio y trmino de la prctica.

Para ello, se puede emplear amonio cuaternario, bicloruro de mercurio al 1%, formol

al 2%, cido fnico al 5%, alcohol yodado, etc. Las cuales son soluciones

desinfectantes no corrosivas para la piel.

7. Ser cuidadosos en el manejo de los equipos y material de trabajo.

8. Coordinar permanentemente con el responsable de la prctica el manejo de material

infeccioso.

9. Antes de realizar observaciones en el microscopio, analizar previamente las

condiciones en que se encuentra el microscopio (espejo, diafragma abierto o cerrado,

etc.) Para la observacin, usar el objetivo de 100 x con aceite de inmersin. Al finalizar

las observaciones limpiar el objetivo de 100x con papel lente.

10. Revisar que los grifos queden cerrados.

11. Tomar atencin de las zonas protegidas para casos de sismos.



RECOMENDACIONES PARA ALUMNOS: 1.- La asistencia a las prcticas es obligatoria: si pierde una prctica no tendr oportunidad de

repetirla. 2.- El estudiante ingresar al saln de prctica llevando consigo, mandil blanco y el manual

de prcticas. 3.- El alumno deber leer con anticipacin la prctica correspondiente a la fecha, a fin de

verificar el material necesario. 4.- Los alumnos se agruparn en las mesas de trabajo y realizarn las experiencias bajo la

direccin de un profesor instructor. 5.- No efectu las experiencias mecnicamente, sino entendiendo el fundamento de las

mismas. 6.- No se debe comer, fumar ni beber agua de los grifos.

7.- Debe cuidarse el equipo y material, cumpliendo las instrucciones del profesor para evitar

accidentes y rotura de material.

8.- Cualquier accidente como rotura de tubos con medios o derrame de alguno de los

cultivos deber comunicarse a la persona responsable de la prctica, para que se tomen

las medidas adecuadas.

9.- Durante la prctica anotar todas las ocurrencias en el manejo de las tcnicas utilizadas. 10.- Las mesas de trabajo deben mantenerse libres de material innecesario (prendas de vestir,

libros y otros). 11.- Etiquetar el material cuando sea necesario para que pueda ser fcilmente identificado. 12.- Tener especial cuidado cuando maneje material contaminado y descartarlo en los

recipientes que se colocarn para este fin. 13.- Al finalizar la prctica deber ordenar el material utilizado sobre la mesa de trabajo y,

cuidar que los grifos de agua estn cerrados as como las llaves de gas.



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EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO

Para trabajar en las prcticas de microbiologa, se requiere de equipos y materiales

especiales, as como de un comportamiento y normas estrictas.

OBJETIVO:

Reconocer el material y la utilidad de los mismos en el laboratorio.

EQUIPOS: Microscopio ptico, Flujo laminar, Refrigeradoras, Congeladora, Lector de ELISA, Centrfuga, Bao Mara, Autoclave, Estufas, Homogenizador, Potencimetro, Agitador magntico, Contador de colonias, Balanza, Estereoscopio, Equipo de PCR en tiempo real

MATERIAL DE VIDRIO: Laminas portaobjetos, Campana de Anaerobiosis, Laminillas, Placas petri, Tubos de ensayo, Tubos de centrfuga, Pipetas graduadas, Pipetas, Micro pipetas, Beakers, Pipetas Pasteur, Erlenmeyer, Embudos, Probetas. MATERIAL DE CIRUGA Tijera punta recta y curva, Pinza simple, Pinza ranurada, Esptula, Bistur, Mango de bistur, Bandejas, Bolsas estriles, Guantes OTROS Filtros, Frascos con desinfectante, Ansas de siembra, Gradillas, Mecheros, Medios de cultivo, Porta lminas, Magnetos, Papel lente, Goteros, Colorantes, Papel toalla, Jeringas, Gas pack, Refrigerante, Reactivos.




DDEESSCCOONNTTAAMMIINNAACCIINN,, LLIIMMPPIIEEZZAA,, DDEESSIINNFFEECCCCIINN YY EESSTTEERRIILLIIZZAACCIINN

1. ESTERILIZACIN:

Puede definirse la esterilizacin la como destruccin completa de todas las

formas de vida microbiana (virus, bacterias y hongos), en trminos de la capacidad del

microorganismo para reproducirse, incluidas las esporas contenidas en un producto.

No existen grados de esterilidad. Un objeto es estril o no lo es. La esterilizacin se

consigue por una serie de agentes fsicos o qumicos.

ESTERILIZACIN POR MTODOS FSICOS:

CALOR SECO (HORNO)

Elimina bacterias y esporas por destruccin oxidativa de los componentes

celulares a temperaturas de 160 C por una hora, tiempo en el que las bacterias

ms resistentes y las esporas mueren.

CALOR HMEDO:

- Ebullicin: El agua hirviendo a temperatura de 100C por 10 minutos destruye

todos los microorganismos no esporulados.

- Autoclave: El vapor a 15 libras de presin y una temperatura de 121 C., el cual

es capaz matar a las esporas en 15 minutos.

FILTRACIN:

FILTROS:

Se realiza a travs de filtros de membrana. Estos poseen varios grados de

porosidad. El dimetro de los poros oscila desde 0.22 a 0.10 um. Se emplean para

la purificacin de medios a travs de la retencin de bacterias. Ej: filtros Seitz.



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RADIACIN:

La luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas vegetativas de los

microorganismos que carecen de proteccin. La accin bactericida de la luz solar

se debe a la banda ultravioleta del espectro.

LUZ ULTRAVIOLETA:

Es utilizada en flujo laminar, quirfanos y otras zonas, con el fin de disminuir las

infecciones transmitidas a travs del aire.



ESTERILIZACION POR MTODOS QUMICOS

Pueden utilizarse como desinfectantes muchas sustancias qumicas, dado que el

nmero y la variedad de productos es cada vez mayor; deben elegirse cuidadosamente las

formulaciones de acuerdo a las necesidades concretas.

La actividad germicida de muchas sustancias qumicas pueden ser modificadas u optimizadas

por factores externos como: La temperatura, pH, tiempo de actividad, naturaleza del

microorganismo, presencia de material extrao, etc.

2. DESINFECCIN:

Proceso mediante el cual un agente qumico destruye microorganismos capaces

de producir una infeccin, eliminando o disminuyendo a cantidades mnimas los

microorganismos patgenos existentes. Todos los desinfectantes son eficaces frente a

las formas vegetativas, pero no necesariamente actan frente a las esporas.

Pasteurizacin: En la pasteurizacin lenta, la temperatura alcanza los 63C y debe

permanecer durante 30 minutos y en la pasteurizacin rpida la temperatura debe estar

a 72 C durante 15 minutos. Sobreviven algunas bacterias en forma vegetativa que

resisten al calentamiento.

OBJETIVOS:

Aprender a utilizar las tcnicas de esterilizacin.

Controlar y verificar la esterilizacin de los materiales usados.

TRABAJO PRCTICO:

1. Caldo tripticasa de soya (TSB)100 ml 2. 08 Tubos de ensayo con algodn 3. Ansas de siembra 4. Lminas portaobjeto 5. Inoculo bacteriano 6. 04 Placas petri 7. Filtros Seitz para lquidos 0.22 u 8. Algodn 9. Papel craft 10. Cinta de autoclave 11. Autoclave 12. Horno 13. Flujo laminar



12

1. ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE:

PROCEDIMIENTO:

Hacer coloracin Gram a partir del tubo con Escherichia coli.

Observar al microscopio.

Autoclavar (15 lbs/15m) los tubos para su esterilizacin.

Hacer la coloracin Gram del cultivo ya esterilizado.

Observar al microscopio.

Sembrar los tubos con el cultivo ya esterilizado en tubos con caldo Trypticasa de

soya (TSB).

Utilizar un tubo con caldo nutritivo e inoculo sin autoclavar (control)

Incubar a 37 C por 24 horas.

Observar y evaluar las diferencias, causas y efectos.

2. ESTERILIZACIN EN EL HORNO:

MATERIAL DE CIRUGA:

Envolver por separado (tijeras, pinzas, etc.) con papel kraft.

Placa petri

Porta placas

Pipetas

Porta pipetas

Tubos

Algodn

Papel kraft

Cinta de autoclave

PROCEDIMIENTO:

- Envolver con el papel kraft las placas individualmente.

- Tapar los tubos con algodn y luego envolverlos en grupos.

- Llevar al horno a 160 C por una hora.

- Evaluar las causas y efectos del procedimiento.

Cuestionario

1. Enumere las utilidades de uso de tres mtodos de esterilizacin respecto a materiales

y equipos de laboratorio?

2. Cules son los factores externos que afectan la potencia desinfectante de los

diferentes agentes qumicos y como modifican su actividad?

3. Recomendaciones de uso de desinfectantes comerciales (principios activos) en

actividades pecuarias.




MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO YY TTIIPPOOSS DDEE SSIIEEMMBBRRAA

MEDIOS DE CULTIVO

Estos contienen una base mineral, fuente de carbono, nitrgeno y azufre, atmsfera

adecuada y factores de crecimiento necesarios para el desarrollo de las diferentes especies

bacterianas u hongos. La mayora de estos desarrollan en medios neutros o ligeramente

alcalinos, mientras que existe un grupo minoritario que prefiere un medio cido. La

temperatura adecuada para el desarrollo de microorganismos mesfilos vara entre los 15 y 43

C. En cambio, los microorganismos psicrfilos desarrollan hasta los 0C; y otros, como los

termfilos, pueden crecer hasta los 80 C. Los microorganismos patgenos en general, estn

limitados por una escala de temperaturas, comparativamente estrecha, alrededor de 37C.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. POR SU CONSISTENCIA

a) MEDIOS LQUIDOS (CALDO)

Es un medio de cultivo lquido, libre de Agar que contiene productos crnicos

o proteicos (peptonas, extractos), con adicin de algn tampn para mantener el pH

adecuado. Ej.: Caldo Trypticasa de Soya, Caldo Infusin Cerebro-Corazn, Caldo

Thyoglicolato.

En la siembra de medios lquidos se observan, pelcula,

sedimento y turbidez



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b) MEDIOS SLIDOS (AGAR)

Es un medio para verter en placas petri o en tubos, donde un el 1 a 2% es agar.

En estos medios, se obtienen colonias aisladas (conjunto de bacterias que provienen

de una clula madre), las cuales presentan las mismas caractersticas morfologicas,

genticas y fisiolgicas.

Ejemplo: Agar trypticasa de soya, Agar sangre, Agar chocolate, Agar Mac Conkey y

Agar Salmonella-Shigella.

c) MEDIOS SEMISLIDOS (MEDIO)

Un medio es semislido cuando contiene menos del 1% de Agar en su composicin.

Ej.: Medio SIM.

2. POR SU ESPECIFICIDAD

a) MEDIOS GENERALES

Son medios que carecen de inhibidores, por tanto, permiten el desarrollo en el

cultivo de un sin nmero de bacterias, tanto grampositivas como gram negativas. Ej.:

Agar TSA.

b) MEDIOS SELECTIVOS

Son medios que contienen sustancias inhibidoras o antibiticos, que permiten

el desarrollo selectivo de determinados microorganismos.

Ejemplo: Agar Mac Conkey (permite unicamente el crecimiento de bacterias

gramnegativas).

Agar sangre, Agar Trypticasa, Agar Mac Conkey



c) MEDIOS ESPECFICOS

Son medios que permiten el desarrollo de un microorganismo determinado a

partir de poblaciones mixtas, ya que contienen nutrientes que favorecen el desarrollo

de microorganismos especficos.

Agar SS.

Baird Parker.

Agar Corynebacterium.

Agar Verde Brillante.

Agar SPS.

Agar XLD.

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA PREPARACIN DE DIVERSOS

MEDIOS DE CULTIVO

a) En una probeta medir 100ml de agua destilada.

b) Pesar el medio de cultivo segn indicacin del frasco y colocarlo en un

Erlenmeyer.

c) Agregar los 100 ml de agua destilada al Erlenmeyer y mezclar.

d) Hervir el medio hasta disolver los ingredientes agitando suavemente.

e) Ajustar el pH a 7.3 +/- 0.2 a temperatura de 25 C, o segn la indicacin.

f) Tapar y rotular el frasco con el medio de cultivo.

g) Esterilizar (si es necesario) en autoclave a 15lbs de presin durante 15 minutos

a 1210 C.

PROCEDIMIENTO PARA EL LLENADO DE PLACAS PETRI.

Se vierte el agar en placas petri con mucho cuidado, esta operacin se realiza en el

flujo laminar y/o al lado del mechero, sin hablar (de preferencia con mascarilla), para

evitar que se contamine.

Inmediatamente despus (antes que comience a solidificarse) se flamea la superficie

del agar con la llama del mechero. El fin de esta operacin es eliminar las burbujas

de la superficie del agar.

Cuando el agar este solidificado, invertir las placas e incubarlas a 37 C durante 24-48

horas y verificar la esterilidad; eliminando la placa que estuviera contaminada.

Las placas se conservarn a 4 C hasta el momento de ser utilizado.

MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL:



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a. MEDIO DE AGAR SANGRE

Es un medio diferencial que permite revelar caractersticas de diversos

microorganismos. Permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no

exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin

para anaerobios.

Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies

bacterianas debido a la accin de sus hemolisinas sobre la sangre contenida en el agar. La

hemlisis observada puede ser completa (hemlisis beta, produce un halo transparente

alrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de

la colonia) o ausencia de hemlisis (hemlisis gamma).

Preparacin

Se prepara a partir de agar trypticasa de soya. Este se esteriliza, y cuando se

encuentre a una temperatura entre 40 a 45 C, se adiciona de 5% a 10% de sangre estril

preferentemente de ovino.

b. MEDIO AGAR MAC CONKEY

Generalmente es usado para el aislamiento selectivo de bacilos gramnegativos

(enterobacterias y coliformes). Las sales biliares y el cristal violeta inhiben bacterias

grampositivas

Para el cultivo en este medio se toma como muestra sobretodo rganos, muestra de

agua para contaje de coliformes y diferenciacin de bacterias patgenas en productos

lcteos, realizndose una siembra directa de dichas muestras.

La lactosa y el indicador rojo neutro presentes permiten diferenciar a las bacterias

fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de lactosa, las que le imparten un color

rosado transparente a un pH 8, como Salmonella spp. (lactosa -). Las colonias

Hemlisis producida por cepas

de Streptococcus sp.

Placa de agar sangre con

colonias de bacterias

hemolticas



fermentadoras de lactosa producen una cada localizada del pH a 6.8, seguido por la

absorcin del rojo neutro, lo que le imparte un color rojo-fucsia.

Ej.: colonia de Escherichia coli (lactosa +).

Preparacin.

Pesar 5g de agar mac conkey y colocar en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.

Calentar hasta disolver el Agar.

Medir el pH 7.1+/-0.2.

Esterilizar en autoclave.

c. MEDIO AGAR MUELLER HINTON

ste medio carece de inhibidores e indicadores, lo que permite el crecimiento

de una gran variedad de microorganismos, tanto grampositivos como gramnegativos.

Se utiliza para realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma).

Preparacin:

Pesar 3.8g de Mueller hinton y colocarlo en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.

Calentar hasta disolver agitndolo.



d. MEDIO AGAR SABOURAUD (Agar glucosado de Sabouraud)

Es un excelente medio basal, al cual se le puede aadir antibiticos y otros

inhibidores para el cultivo selectivo de varios grupos de hongos (levaduras y mohos).

El contenido de glucosa y el pH cido facilitan el crecimiento de los mismos.

Preparacin:



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Pesar 6.5g de Agar Sabouraud, colocarlo en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada.

Calentar hasta disolver agitndolo.



Antes de colocar en placas, adicionar antibitico si es necesario.

1. MTODOS DE SIEMBRA

Los mtodos de siembra varan de acuerdo al medio y al tipo de muestra a utilizar; por

ejemplo, se pueden utilizar agares en placas petri, caldos, medios semislidos y slidos en

tubos; y cada uno puede ser inoculado con la muestra de manera distinta.

A. Inoculacin de medios slidos en placas petri

La superficie del agar de las placas de petri se puede inocular con la muestra por varios

mtodos. El inoculo primario se puede efectuar con un ansa, un hisopo, o directamente con

una impronta del rgano. Una vez hecho el inoculo primario, se emplea un ansa a fin de

diseminar el material en toda la placa. La siembra puede realizarse de 2 maneras:

a. Por estras:

El inoculo se disemina en la placa a travs de estras sucesivas, con un movimiento

hacia los lados asemejando una S. El propsito de esta tcnica es reducir el inoculo lo

suficiente hasta obtener colonias bacterianas aisladas, las que posteriormente se podrn

cultivar en medios diferenciales para su posterior identificacin.

b. Por agotamiento

Esta tcnica se utiliza sobretodo en ocasiones donde las muestras son copiosas o densas

(moco, heces, etc.), se toma con el ansa una pequea cantidad de la muestra y se esparce

hacia los lados dndole la vuelta a la placa en ngulos de 90. El ansa se debe esterilizar

entre las sucesivas estras y esparciendo la muestra desde el ltimo punto donde se coloc;

de esa manera, tendremos colonias que crecern aisladas unas de otras, como se muestra

en el siguiente esquema.

Mtodos de Siembra: Por

agotamiento



B. Medios semislidos slidos en tubos

Los tubos con medios en picos de flauta se inoculan primero, atravesando el agar en

profundidad con un ansa recta y se contina sembrando por estras en la parte inclinada de

abajo hacia arriba. Cuando se inoculen medios semislidos para pruebas de movilidad el

ansa se sumergir en profundidad en ngulo recto y se retirar cuidando que sea por el

mismo trayecto de entrada.

C. Medios lquidos

Los medios lquidos se pueden inocular inclinando el tubo a un ngulo de

aproximadamente 30 y acercar un ansa con el inoculo a la superficie del vidrio justo en el

punto que se muestra en el esquema y diluir el inculo poco a poco con el caldo.

Cuestionario

1. Fundamente y esquematice los medios y mtodos de siembra para cinco diferentes

muestras de secreciones y excreciones de diferentes animales de importancia pecuaria.

2. Existen otros mtodos de aislamiento y cuantificacin de bacterias en muestras

microbiolgicas?

3. Enumere las utilidades de ocho diferentes medios de cultivo.

Siembra de medios slidos en tubos

A. Atravesar el agar con el ansa

recta.

B. Retirar el ansa y sembrar por

estras la superficie del agar

Inoculacin de un tubo con caldo

A. Inclinar el tubo e inocular en el sitio

indicado

B. Volver el tubo y diluir la muestra con

el caldo.



20

PPRRCCTTIICCAA NN 44 yy 55

TTCCNNIICCAASS DDEE CCOOLLOORRAACCIINN BBAACCTTEERRIIAANNAA.. RREECCOONNOOCCIIMMIIEENNTTOO DDEE

EESSTTRRUUCCTTUURRAASS BBAACCTTEERRIIAANNAASS..

Los mtodos de coloracin han servido en el conocimiento de las clulas, determinando

e identificando las diversas estructuras y componentes qumicos que poseen stas. En nuestro

estudio se utilizan para determinar la morfologa bacteriana por afinidad de algunas estructuras

por ciertos colorantes. Los colorantes normalmente son soluciones acuosas, por lo cual

utilizan alcohol y mayor proporcin de agua destilada, ya que el exceso del primero

deshidratara demasiado a las clulas objetivo. Estos compuestos qumicos son utilizados para

aumentar el contraste.

Para la observacin se usa el microscopio con el objetivo de 100X y aceite de inmersin,

observndose los microorganismos teidos. Casi todos los colorantes son sales (compuestos

formados por iones cargados). Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que

tie es el in cargado positivamente; mientras que en los cidos, el colorante es el in cargado

negativamente.

OBJETIVOS:

Realizar las coloraciones con la finalidad de observar caractersticas estructurales como

cpsula, espora, etc. de los diversos gneros bacterianos, as como, comprender el fundamento

de las reacciones qumicas que se presentan.

Existen 3 tcnicas de coloracin:

1. Coloracin simple:

Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. El empleo de ste colorante es

slo para incrementar el contraste. Ej. Azul de metileno

1. Preparar el frotis.

2. Fijar a la llama.

3. Colorear: colocando azul de metileno (2 3).

4. Lavar con agua corriente, secar.

5. Observando al microscopio con objetivo de 100x y aceite de inmersin las bacterias

se tien de color azul.

2. Coloracin diferencial

Se usa dos o ms colorantes para distinguir tipos de microorganismos, esta tcnica

consta de dos etapas, una tincin primaria seguida de una tincin de contraste. En la

tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie los microorganismos no teidas por

el primer colorante.

Ej. Tincin Gram, Tincin cido alcohol resistente.



2.1. Mtodo de coloracin GRAM

Este mtodo tiene utilidad prctica, porque nos permite diferenciar la morfologa

bacteriana (cocos, bacilos, espiroquetas). Sobre la base de su reaccin a la tincin de gram,

las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.

a. Si la muestra proviene de un lquido:

Se toma una gota del liquido con el aro de ansa de siembra y se coloca en el centro del

portaobjetos, se procede a extenderla en forma circular en un rea de 1 x 1cm; se fija a la

llama, pasando suavemente a unos centmetros por encima de ella evitando que no ebulla

o se queme (el calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus

protenas).

b. Si la muestra proviene de un slido:

Primero, se coloca una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y luego, con el ansa

de siembra se coloca una cantidad pequea de muestra (colonia bacteriana) y se hacen las

extensiones mezclando con el agua, luego se fija a la llama hasta secar. En caso de tratarse

de rganos se hacen improntas directamente a la lmina.

Pasos:

1. Preparar el frotis.

2. Fijar por calor (en la llama).

3. Colorear con cristal violeta, dejar un minuto.

4. Lavar con agua corriente.

5. Cubrir el preparado con lugol y dejar un minuto.

6. Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lmina con alcohol-acetona hasta observar que

ya no sale ms colorante.

7. Lavar la lmina con agua corriente.

8. Coloracin de contraste: colocar fucsina bsica o safranina por 1 minuto.

9. Lavar la lmina con agua corriente, secar y observar al microscopio con aceite de

inmersin (100X).

10.

FUNDAMENTO DEL MTODO DE GRAM

Las bacterias grampositivas protegen su membrana con una gruesa pared celular. El

principal constituyente de la pared es un polmero complejo de azcares y aminocidos

denominado murena o peptidoglucano.

La murena es el componente crtico para el mantenimiento de la forma y la rigidez de

los microorganismos grampositivos y gramnegativos, pero desempea un papel importante en

la proteccin de la membrana celular de los microorganismos Gram positivos, que poseen una

pared celular muy gruesa.



22

Los microorganismos gramnegativos han optado por una solucin radicalmente

diferente para el problema de la proteccin de la membrana citoplasmtica. Elaboran una

estructura totalmente diferente, una membrana externa, que es construida fuera de la pared

celular de murena. La membrana externa es qumicamente diferente de las membranas

biolgicas habituales y tiene la capacidad de resistir a las sustancias qumicas lesivas.

La membrana externa es una estructura de dos capas, pero su hoja externa contiene un

componente nico adems de los fosfolpidos. Se trata de un lipopolisacrido bacteriano o

LPS, una molcula compleja que no se halla en otros sitios en la naturaleza.

Pared celular bacteriana

Envoltura de una bacteria gramnegativa

Envoltura de una bacteria grampositiva

Membrana

Espacio Periplasmtic

o



Las bacterias gramnegativas poseen ms cantidad de lpidos en su pared celular.

Las bacterias grampositivas poseen una capa de glucopptido ms gruesa que las

hace ms resistentes a los agentes mecnicos.

a. Coloracin Alcohol-cido Resistente (Tincin de ZielhNeelsen Modificado)

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos

(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la

propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con

colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Tienen un alto

contenido lipdico, fundamentalmente fosfolpidos y ceras.

Es til para el diagnstico de Mycobacterium sp. y Brucella sp. El complejo

fucsina-fenol resiste la decoloracin (alcohol cido) porque est ligado a los lpidos y se

consigue por el calor o aumentando el tiempo de contacto para que la fucsina penetre

profundamente y pueda resistir la accin decolorante del alcohol-cido, resultando los

bacilos de color fucsia sobre un fondo azul.

Procedimiento

1. Hacer el frotis y fijar a la llama. 2. Colorear con Fucsina fenicada por 5 minutos.

3. Calentar a la llama hasta que empiece a desprender vapor, evitando que ebulla o

se seque.

4. Dejar enfriar, luego lavar con agua corriente.

5. Decolorar con alcohol-cido.

6. Coloracin de contraste: vertiendo azul de metileno, dejar por 30.

7. Lavar con agua, secar y observar al microscopio.

3. Coloracin especfica:

Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares,

entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y las cpsulas. Ej. Tincin de cpsula

(tinta china) y esporas de Wirtz-Conklin.

3.1 Coloracin de Cpsula por el Mtodo de la Tinta China:

Esta es una tcnica de coloracin considerada como tincin negativa, ya que, las

clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve,

por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un

material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente

rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono

coloidal).

Materiales



24

1. Lminas limpias

2. Tinta china

3. Suspensin bacteriana

4. Ansa de siembra

5. Laminilla cubre objetos

Procedimiento

1. Poner en una lmina una gota del microorganismo diludo, bien mezclado.

2. Aadir una gota de tinta china.

3. Mezclar bien.

4. Cubrir con una laminilla.

5. Observar al microscopio con lente de inmersin reduciendo la luz (bajando el

condensador).

3.2 Coloracin de Espora: Mtodo de Wirtz:

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior forma resistentes denominadas esporas. Estas se producen

cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,

temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una

espora en cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula

vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la

espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar

perdura durante aos.

Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores

ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el

microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.

La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con

agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo

colorante.

Materiales

1. Lminas porta objetos

2. Suspensin del microorganismo

3. Ansa de siembra

4. Colorante verde malaquita

5. Colorante safranina



Procedimiento

1. Hacer el frotis y fijarlo al calor.

2. Aadir verde Malaquita y calentar a llama dbil por 2 a 3 (evitar ebullicin).

3. Lavar con agua corriente ms o menos 30.

4. Aadir fucsina o safranina por 30. Lavar y observar con objetivo de 100x y

aceite de inmersin.

Se observarn las esporas de color verde brillante y el resto color rosado.

Cuestionario

1. Cules son las fases de la esporulacin?

2. Describa los tres tipos de esporas segn su localizacin y de ejemplos de estos.

3. Cual es el concepto de endoespora?

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus sp.



26


PRINCIPALES MTODOS Y TCNICAS UTILIZADOS EN LA

IDENTIFICACIN MICROBIANA

La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin

dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la

comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin

considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de

bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. El sistema de clasificacin de bacterias

mas comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology en el cual se

detallan los nombres cientficos y su relacin con otras bacterias.

La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes

combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Para

evaluar caractersticas bacterianas se pueden utilizar diversos mtodos, uno de los mas

conocidos son los ensayos bioqumicos, llamadas pruebas bioqumicas convencionales,

generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas)

a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer

transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para

demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o

ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va

metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de

inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo

bacteriano.

Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de

cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata

de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el

medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el

microorganismo en estudio es exigente.

REQUISITOS PARA IDENTIFICAR UNA BACTERIA MEDIANTE PRUEBAS

BIOQUIMICAS

La realizacin de una prueba bioqumica implica:

1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o

inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un

sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de

la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.



2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de

una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica.

3. Tener un cultivo fresco de la bacteria (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el

microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y

temperatura adecuados.

4. LLevar a cabo los correspondientes controles de calidad de los medios de cultivo

utilizados, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese

prueba.

MEDIOS UTILIZADOS PARA LA DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE LAS

BACTERIAS:

Citrato de Simmons

TSI y/o Kliger

Caldo de rea

Lisina

Rojo de Metileno (RM)

Voges-Proskauer (VP)

Caldo Malonato

Esculina

SIM

LIA

Nitratos

Medios de carbohidratos

Gelatina

Leche tornasolada

Prueba de oxidasa

Reactivo de Kovacs o James

Prueba de la Catalasa

PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUIMICAS UTILIZADAS EN LA

IDENTIFICACION BACTERIANA.

Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de

identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente,

agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente.

1) Enzimas vinculadas con la respiracin

a) oxidasa

b) catalasa

2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros

2.1) Requerimientos de oxgeno



28

a. OF (xido-fermentacin)

b. Crecimiento en caldo tioglicolato

2.2) Produccin de cido, o cido y gas

a. Fermentacin de carbohidratos

2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas

a. RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)

b. Gluconato

c. O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico)

d. Esculina

e. Hipurato

3) Fuente nica de carbono

a. citrato

b. malonato

c. hipurato para coliformes

4) Utilizacin de compuestos nitrogenados

4.1) Reduccin de nitrato

a. Asimilacin

b. Denitrificacin

4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros

a. Indol

b. H2S

c. Fenilalanina

d. Lisina, arginina, ornitina

e. Urea

5) Ensayos combinados

a. TSI (Agar Hierro Tres Azucares)

b. LIA (Agar Hierro Lisina)

c. Bilis esculina

6) Deteccin de exoenzimas

a. lecitinasa

b. proteasas, coagulasa

c. amilasas

d. celulasas

e. desoxirribonucleasas

f. accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7) Miscelneos

a. KCN

b. Bilis

c. Produccin de pigmentos



1. Prueba de la catalasa

La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin el perxido de hidrgeno en

agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y

anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos.

1.1. Material

Agua oxigenada de 30 volmenes, cultivo bacteriano y portaobjetos.

1.2. Interpretacin

La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con

desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y

oxgeno molecular.

Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros: Micrococcus y Staphylococcus (catalasa

positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).

2. Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de

electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al oxgeno, con la formacin

final de agua.

2.1. Material

Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipeta Pasteur y cultivo microbiano.

2.2. Tcnica

Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada de bacterias, se trazan rayas sobre una tira

de papel impregnada en solucin acuosa al 1% de cloruro de tetrametil para-fenilendiamina.

2.3. Interpretacin

En caso positivo el papel cambia de color pasando a prpura y negro en 10-20

segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en presencia de citocromo c oxidasa

formndose azul de Wuster. En caso negativo la tira de papel no cambia de color.

3. Fermentacin de azucares

Esta prueba se suele usar en la identificacin inicial de bacilos Gram negativos y

especialmente de enterobacterias.

En este estudio se observa la fermentacin de lactosa y/o glucosa y/o sacarosa con

produccin de cido y/o gas y la produccin de H2S.



30

3.1. Material

Asa e hilo de siembra, tubos con medio TSI y cultivo bacteriano.

3.2. Tcnica

Con el asa recto se toma de la colonia y se siembra en picadura; despus se siembra en

la superficie por estra. Incubar a 37C durante 24 horas. Observar los resultados.

3.3. Interpretacin

La interpretacin de los resultados se har de la forma siguiente:

Fermentacin de glucosa: fondo amarillo.

Fermentacin de sacarosa: parte central amarilla.

Fermentacin de lactosa: superficie amarilla.

Produccin de SH2: picadura negra.

Produccin de gas: burbujas o rotura del agar.

3.4. Fundamentos de la fermentacin de azucares

3.4.1. Fermentacin de glucosa

Se aprecia en el viraje a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol) nicamente en la

parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequea proporcin de glucosa que existe en el

medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de

anaerobiosis, produce suficiente cido para que vire el indicador, pero no a medida que nos

aproximemos a la superficie, donde las condiciones son ms aerbicas, all la bacteria respira y

la produccin de cido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo

sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo toma una coloracin

roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los

aminocidos, liberndose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser ms

intenso.

3.4.2. Fermentacin de lactosa

Se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador, tanto en el fondo del tubo

como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez veces mayor que la de glucosa, con

lo que la produccin de cido formado es tan elevada que hace virar el indicador en todo el

tubo. El hecho de que la fermentacin de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene

importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar

glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido

degradada, como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminocidos,

liberndose aminas, que neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en la porcin

inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecer de color

rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la fermentacin previa de la glucosa.



3.4.3. Produccin de gas

La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de burbujas,

rotura o elevacin del agar en el fondo del tubo.

3.4.4. Produccin de SH2

Para detectar la produccin de H2S a partir de tiosulfato sdico debe incorporarse al

medio de cultivo un indicador, dado que el H2S es incoloro. Para tal fin se suele utilizar alguna

sal de hierro que reacciona con el H2S, para producir un precipitado negro de sulfuro de

hierro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que el precipitado negro se

concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un fondo

negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya

enmascarado con el precipitado negro.

4. Reduccin de nitratos

La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de varios

microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiracin

anaerbica. Esta prueba es til en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las

enterobacterias aunque tambin sirve para identificar otros microorganismos.

4.1. Material

Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de cido sulfanlico al 8 por

mil y solucin de -naftilamina al 5 por mil (ambos en cido actico 5N) y polvo de zinc.

4.2. Tcnica

Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 24-48 horas. Pasado ese tiempo,

aadir al cultivo unas gotas de solucin de -naftilamina y unas gotas de solucin de cido

sulfanlico.

4.3. Interpretacin y fundamento

El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la adicin de los

reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reduccin de

nitratos se considera positiva. Este color se debe a la formacin de un compuesto coloreado,

denominado p-sulfobencenoazo--naftilamina.

Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se han reducido los

nitratos) o bien se han reducido originando otros compuestos (amonaco, nitrgeno

molecular, xido ntrico u xido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso

negativo. En este caso se puede aadir al medio de cultivo una pequea cantidad de polvo de

zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la

existencia de nitratos en el medio y confirma que la reaccin es negativa.



32

5. Produccin de indol

El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido

triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrlisis del

triptfano y su desaminacin, produciendo indol, cido pirvico y amonaco.

5.1. Material

Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich o kovac.

5.2. Tcnica

Inocular el caldo con el microorganismo e incubar a 37C durante 24-48 horas.

Transcurrido ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich (para-dimetilamino

benzaldehido en etanol), resbalando por la pared del tubo sin agitar.

5.3. Interpretacin

La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase

entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera

positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un

complejo de color rojo.

6. Movilidad

Es otra caracterstica til en la identificacin de los microorganismos. Se puede llevar a

cabo observando el crecimiento en un medio semislido.

6.1. Material

Hilo de siembra, medio semislido (agar movilidad), y cultivo bacteriano.

6.2. Tcnica

Sembrar, por picadura, con hilo de siembra en medio semislido, incubando a 37C

durante 48 horas.

Prueba del Indol

(Formacin del anillo)



6.3. Interpretacin

La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si

son mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los

lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.

7. Crecimiento en citrato

Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como

nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante en la identificacin de

microorganismos pertenecientes a las enterobacterias.

7.1. Material

Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivo bacteriano.

7.2. Tcnica

Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C durante 24-48 horas.


En caso positivo, el medio de cultivo vira de color verde a azul. Si el microorganismo

utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin utiliza las sales de amonio como fuente de

nitrgeno, con produccin de amonaco, lo que da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto

se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul

intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie.

8. Produccin de ureasa

La ureasa es una enzima presente en numerosos microorganismos. Esta enzima

cataliza la hidrlisis de la urea, con produccin de dixido de carbono y amonaco, lo que

causa una alcalinizacin del medio.

8.1 Material

Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.

8.2. Tcnica

Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e incubar a 37C durante 24

horas.


Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color

fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que

se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).



34

9. Descarboxilacin de aminocidos

Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato-especificas, capaces de actuar

sobre la porcin carboxilo de los aminocidos, con formacin de aminas de reaccin alcalina.

Esta reaccin conocida como descarboxilacin produce dixido de carbono como producto

secundario. Cada uno de las descarboxilasas es especfica para un aminocido lisina, ornitina y

arginina son los tres aminocidos ensayados habitualmente en la identificacin de las

enterobacterias y producen las siguientes aminas especficas:

Lisina cadaverina

Ornitina putrescina

Arginina citrulina

En la conversin de arginina a citrulina interviene una dihidrolasa ms bien que una

descarboxilasa ya que en primer trmino un grupo NH2 es eliminado de la arginina. La

citrulina es transformada en ornitina, que luego sufre descarboxilacin para formar putrescina.

9.1. Materiales

Caldo descarboxilasas, asa de siembra, cultivo bacteriano, parafina liquida

9.2. Tcnica

Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro al caldo lisina. Incube a

37C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estril.


Las enterobacterias, por fermentacin de la glucosa producen cido, el cual hace virar

el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la

descarboxilacin de la lisina se producir una amina, la cual neutralizar el cido producido

por la fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.

Cuestionario

1. Escriba el fundamento de las siguientes pruebas bioqumicas para la identificacin

bacteriana: Prueba de CAMP y Prueba de la Coagulasa, Prueba de la Esculina, Prueba

de Voges Proskauer, Hidrlisis de la Gelatina,



KKIITTSS CCOOMMEERRCCIIAALLEESS DDEE IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIIOONN BBAACCTTEERRIIAANNAA

Una de las pruebas que se utilizan para la identificacin de enterobacterias es el Kit API-

20E (Laboratorios Bio.Merieux), el cual las identifica en forma fcil y rpida. Esto es

importante porque el diagnstico es efectivo, permitiendo un tratamiento rpido y apropiado.

Ej. API 20E consiste en una tira de 20 microtubos conteniendo substratos deshidratados para

la demostracin de la actividad enzimtica o la fermentacin de estos azcares.

Los microorganismos reaccionan con el contenido de los microtubos entre 24 y 48

horas de incubacin.

MATERIALES

Kits API 20E (tira de 20 microtubos).

Suero fisiolgico 0.85%.

Bacteria problema.

Aceite mineral o parafina lquida.

Hidrxido de Potasio 40%.

Alfa naftol.

Reactivo de Kovac.

Manual para la identificacin del API 20E.

Estufa a 37 C.

Escala de Mc Farland.

Tiras para la prueba de oxidasa.

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar la cepa problema (previa determinacin de la prueba de oxidasa) y

colocarla dentro de un tubo con suero fisiolgico.

2. Observar que la turbidez del tubo con la cepa problema este en 0.5 de la escala

de Mc Farland.

3. Llenar los pocitos de la cmara de plstico con agua destilada.

4. Colocar la tira de API 20 E dentro del estuche.

5. Inocular la cepa problema a cada microtubo de la tira de API 20E, usar pipeta

Pasteur llenando la parte cerrada del micro tubo.

6. Para la prueba de citrato llenar todo el microtubo.

7. Las pruebas de LDC, ODC, URE se completa con aceite mineral.

8. Las pruebas de IND, VP llenarlas completamente.

9. Tapar el estuche de plstico e incubar a 37 por 24 horas segn indicacin del

Kit comercial.



36

LECTURA

1. Hacer la lectura de las reacciones observando el cambio de coloracin e

interpretar los resultados de acuerdo al manual.

2. Leer VP 5 a 10 minutos despus de la adicin de 1 gota de hidrxido de potasio

y Alfanaftol.

3. Adicionar 1 gota del reactivo de Kovacs al IND.

4. Anotar los resultados numricamente en la tarjeta de identificacin.

5. Sumar cada 3 reactivos, el cual nos dar un nmero con 7 dgitos (de acuerdo al

cdigo).

6. Usar la tabla de identificacin la cual contiene cdigos con el nombre de cada

enterobacteria correspondiente.

LECTURA DE RESULTADOS DEL SISTEMA DE IDENTIFICACION

BACTERIANO ESTANDARIZADO

RESULTADOS BIOQUIMICOS DE DIFERENTES AGENTES BACTERIANOS

Cuestionario

1. Indique los tipos de API que existen para la identificacin bacteriana.

2. Esquematice una tira de API con una bacteria inoculada indicando las reacciones

positivas y negativas para una bacteria.



PPRRAACCTTIICCAA NN 77

ACCIN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

SSIISSTTEEMMAA KKIIRRBBYY -- BBAAUUEERR

La prueba de sensibilidad, incluye el uso del medio Mueller Hinton y discos de

antibiticos. Se utiliza para determinar la sensibilidad o resistencia de bacterias patgenas que

poseen un crecimiento rpido en relacin a la difusin radial de los antibiticos elegidos.

OBJETIVO

Realizar pruebas de sensibilidad de microorganismo grampositivas y gramnegativas

patgenos, causantes de los procesos infecciosos. Determinando el halo de inhibicin que

permita conocer la sensibilidad o resistencia de estas bacterias frente a cada uno de los

antibiticos.

MATERIALES

Placa petri con agar Mueller-Hinton estril

Discos con antibiticos

Colonia bacteriana

Suero fisiolgico

Hisopo estril

Pinza estril

Mechero

Regla Kirby Bauer.

Tablas con los estndares de interpretacin

Escala de Mc Farland

Estufa.

PROCEDIMIENTO:

1. Trabajar con el mechero encendido

2. Seleccionar 1 colonia caracteristica y colocarlas dentro de un tubo con suero

fisiolgico, hasta obtener una turbidez de 0.5 en la escala de Mc Farland.

3. Introducir un hisopo dentro del tubo, esperar 5.

4. Sembrar toda la superficie de la placa con el hisopo y mantenerlo a

temperatura ambiente hasta por 20 minutos.

5. Utilizar una pinza estril y depositar los discos de antibiticos sobre la siembra

manteniendo una equidistancia entre ellos.

6. Incubar la placa a 37 C por 18 24 horas aproximadamente.



38

7. Lectura: Medir milimtricamente los halos de inhibicin, comparndolos con los

estndares de sensibilidad y resistencia.

AGENTE ANTIMICROBIANO SIGLA

POTENCIA

RESISTENCIA

SENSIBLE

AMIKACINA Ak 30mcg 14mm 17mm AMPICILINA A 10mcg 13mm 17mm AMOXICILINA AX 25mcg 11mm 14mm AMOX-AC.CLAV AMC 20/10mcg 13mm 18mm AC. NALIDIXICO W 30mcg 13mm 19mm CEFADROXILO CPH 30mcg 14mm 18mm CEFALOTINA CF 30mcg 14mm 18mm CEFUROXIMA CXM 5mcg 14mm 18mm CLINDAMICINA D 30mcg 14mm 21mm CLORANFENICOL C 1mcg 12mm 18mm CLOXACILINA CXM 10mcg 10mm 13mm COLISTIN CL 10mcg 8mm 11mm DIBEKACINA DK 30mcg 12mm 15mm DOXICICLINA DXS 10mcg 12mm 16mm ENOXACINO E 15mcg 14mm 18mm ERITROMICINA EM 10mcg 13mm 23mm ESTREPTOMICINA S 50mcg 11mm 15mm FOSFOMICINA FO 5mcg 11mm 15mm FLUCLOXACILINA FX 100mcg 10mm 18mm FURAZOLIDONA FZ 10mcg 14mm 17mm GENTAMICINA GE 30mcg 12mm 15mm KANAMICINA K 2mcg 13mm 18mm LINCOMICINA L 5mcg 14mm 21mm NEOMICINA N 30mcg 12mm 17mm NITROFURANTOINA NI 10mcg 14mm 17mm NORFLOXACINO NOR 1mcg 12mm 17mm OXACILINA OX 1mcg 10mm 13mm PENICILINA G P 10uof 28mm 29mm PENICILINA G (Enterococo) 10 uof 14mm 15mm RIFAMPICINA R 5cmg 16mm 20mm SULFATRIMETOPRIM SX 250mcg 10mm 16mm SULFONAMIDA SF 30mcg 12mm 17mm TETRACICLINA T 5mcg 14mm 19mm TRIMETOPRIM TMP 30mcg 10mm 16mm VANCOMICINA VA 30mcg 9mm 12mm VANCOMICINA (Enterococo) 30mcg 14mm 17mm

Cuestionario

1. Cul es el fundamento y utilidades de la prueba de sensibilidad?

2. Cul es la interpretacin, luego de la lectura de la prueba de una sensibilidad hecha a

una bacteria X con resultado sensible a una antibitico Y?




MMTTOODDOOSS DDEE AAIISSLLAAMMIIEENNTTOO EE IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIINN,, AA PPAARRTTIIRR DDEE

MMUUEESSTTRRAASS CCLLNNIICCAASS,, DDEE CCOOCCOOSS GGRRAAMMPPOOSSIITTIIVVOOSS..

2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN BACTERIANA DE MUESTRAS DE

LECHE MASTTICA

La leche es un excelente medio de cultivo para una gran variedad de microorganismos.

Tanto los patgenos, oportunistas y saprofitos pueden llegar a reproducirse en ella.

La leche masttica se caracteriza por sufrir diversas alteraciones:

Fsicas (color, consistencia, viscosidad, densidad, etc.)

Qumicas (pH, etc.)

Existe un gran nmero de agentes infecciosos productores de mastitis, siendo los ms

frecuentes en bovinos:

Streptococcus (cocos)

Staphylococcus (cocos)

Corynebacterium (bacilos)

OBJETVOS DE LA PRCTICA:

1. Sembrar las muestras de leche aplicando los mtodos de siembra.

2. Sembrar las muestras de leche en los medios de cultivo adecuados.

MATERIALES:

1. Placas con agar sangre (agar TSA (Merck) + 8% de sangre desfribrinada de ovino) 2. Placas de agar Mc Conkey 3. Ansas de siembra 4. Perxido de hidrogeno 5. Tiras reactivas de la prueba de oxidasa 6. Placa de agar DNAsa Oxoid/Merck 7. Laminas portaobjeto 8. Kit de coloracin gram 9. Muestra de leche con mastitis 10. Muestra de hisopado de otitis externa 11. Microscopio ptico

PROCEDIMIENTO

1. Prender el mechero.

Pseudomonas (bacilo)

Klebsiella (cocobacilo)

Escherichia coli (bacilo)



40

2. Agitar el frasco para homogenizar la muestra.

3. Abrir y flamear la boca del frasco que contiene la muestra de leche.

4. Flamear el ansa de siembra, introducir el ansa dentro del frasco la muestra, y tomar

la muestra.

5. Sembrar por estra o por agotamiento en el agar, luego flamear el ansa de siembra.

6. Incubar por 24 horas a 37oC para que se desarrollen las colonias.

7. Observar las caractersticas de las colonias.

8. Hacer tincin gram a las colonias que hayan crecido y observar al microscopio.

9. Determinar la morfologa de las colonias bacterianas y orientar el diagnstico.

Cuestionario

1. Por qu se dan los cambios fsicos y qumicos de la leche, en infecciones bacterianas de

la ubre?

2. Qu caractersticas metablicas se utilizan en la identificacin y diferenciacin de especies

de Staphylococcus sp.?




MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACILOS

GRAMPOSITIVOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS

Una de las principales bacterias causantes de enfermedades sistmicas, es el Bacillus anthracis,

que afecta principalmente a animales herbvoros y al hombre. Ocasiona un cuadro septicmico

de carcter grave caracterizado por la presencia de hemorragias por las aberturas naturales,

esplenomegalia y aspecto oscuro de la sangre (antrax=carbn).

Materiales:

Muestra (oreja).

Agar sangre.

Agar Tripticasa Soya (TSA).

Caldo Tripticasa Soya (TSB).

Ansa de siembra.

Mechero guantes.

Mascarilla

Cepa de Bacillus anthracis.

Procesamiento de la muestra:

Tomar con el ansa una gota de la muestra de sangre, ponerla en la lmina

portaobjeto y realizar la coloracin azul de metileno o Gram. Observar con lente de

inmersin bacilos de bordes rectos, espora central no deformante, pequeas cadenas.

Sembrar en caldo tripticasa de soya y en agar sangre.

A las 24 horas observar en agar sangre colonias tpicas en forma de medusa, en agar

sangre se observa la misma morfologa pero no presenta hemlisis.

Colonia tipo cabeza de medusa

Presencia de esporas



42

Las esporas son importantes porque pueden conservarse en estado de desecacin

durante muchos aos sin prdida de su viabilidad y se le puede encontrar en el suelo, agua o

aire de las zona contaminadas.

Los pastos conservan estos estadios durante aos; el heno producido en tales terrenos

puede transmitir la enfermedad; las esporas se difunden por aguas que inundan los campos

contaminados. Si bien hay variacin en la resistencia de las esporas de diferentes cepas de

Bacillus anthracis, todos ellas presentan resistencia extremadamente alta al calor. Soportan la

ebullicin durante varios minutos, de modo que para matarlos es necesario someterlos a una

temperatura de 135 C, sin humedad, durante 5 a 10 minutos.

El factor de virulencia del Bacillus anthracis est dado por una exotoxina que es la

actividad de los tres factores, el cual est constituido por:

Cuestionario

1. Enumere las especies ms susceptibles y resistentes a la infeccin por Bacillus anthracis.

2. Enumere 10 medidas de precaucin que se deben tener en cuenta en caso de

presentarse un animal sospechoso de ntrax.

3. Existe un programa de erradicacin de ntrax en el pas?, cuales son los aspectos ms

relevantes de esta norma



PPRRAACCTTIICCAA NN 1100 yy 1111

MMTTOODDOOSS DDEE AAIISSLLAAMMIIEENNTTOO EE IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIINN,, AA PPAARRTTIIRR DDEE

MMUUEESSTTRRAASS CCLLNNIICCAASS,, DDEE BBAACCIILLOOSS GGRRAAMMNNEEGGAATTIIVVOOSS..

FFAAMMIILLIIAA EENNTTEERROOBBAACCTTEERRIIAACCEEAAEE

Las enterobacterias son un grupo de bacilos gramnegativos aerbicos y anaerbicos

facultativos que se encuentran difundidos en la naturaleza, siendo su hbitat principal el

intestino del hombre y animales. Existen especies capaces de producir enfermedades debido a

las toxinas que poseen y otras que causan enfermedades debido a la accin directa de estas

especies patgenas.

Las excretas son consideradas una de las causas de contaminacin del medio ambiente;

estos microorganismos se encuentran en el agua, tierra, vegetales, alimentos y medio ambiente.

Entre las principales enterobacterias se encuentran: Escherichia coli, Salmonella spp.,

Klebsiella sp., Yersinia sp., Citrobacter sp., Proteus sp. y Shigella sp.

Objetivo:

1. Conocer diferentes medios y mtodos de cultivo para muestras procedentes del

contenido intestinal.

2. Identificar los microorganismos causantes de los procesos diarreicos en animales

domsticos.

Materiales:

- Placas con agar sangre (agar TSA (Merck) + 8 a 10% de sangre desfribrinada de ovino)

- Placas con agar Mc Conkey

- Tubos con caldo tetrationato activado

- Ansas de siembra

- Perxido de hidrogeno

- Tiras reactivas de la prueba de oxidasa

- Laminas portaobjeto

- Kit de coloracin gram

- Tubos de ensayo con pruebas bioqumicas: tres azucares, lisina, SIM, citrato de simmons, caldo urea.

- Muestra de intestino

- Cepas aisladas conservadas

- Microscopio ptico



44

SECUENCIA DE LAS TCNICAS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

DE ENTEROBACTERIAS

Heces, Intestino, Ganglio Mesentrico

PROCEDIMIENTO

1. Colocar el material biolgico en una fuente (intestino).

Lactosa

-

Lactosa

+ Resiembra en: Agar

VB, SS, XLT, Mac C,

Agar Mac Conkey

Agar sangre

Descartar

Salmonella Siembra

Directa

Siembra directa:

Agar

VB, SS, XLD,

Mac C,

Enriquecimiento

en Caldo

tetrationato,

Caldo selenito

Desarrollo de colonias tpicas

Sospecha de Salmonella

Aglutinacin

Pruebas Bioqumicas

confirmatorias

Ej: Escherichia coli Determinacin fimbrial

Salmonella Pruebas de aglutinacin



2. Observar si los rganos muestran lesiones macroscpicas.

3. Determinar la zona afectada de la muestra (lesiones).

4. Proceder a quemar esta regin con esptula incandescente.

5. Usar la pinza y tijera estril, hacer un piquete y sacar una muestra con una pipeta

Pasteur o ansa.

6. Realizar coloracin Gram del contenido intestinal y observar al microscopio con

objetivo de inmersin (G +, G -, cpsulas, esporas, etc.)

7. Colocar la muestra en el medio de cultivo adecuado (Agar Sangre, Mac Conkey, Caldo

tetrationato). Ver grfico.

8. Con un ansa sembrar por agotamiento en medios slidos.

9. Si el medio es lquido usar pipetas pasteur estril.

10. Si los microorganismos pertenecen al grupo entrico (Salmonella spp.), colocar en

medios de enriquecimiento (caldo tetrationato, caldo selenito) a 42 C y si se sospecha

de Escherichia coli llevar a estufa a 37 C (ver el grfico anterior).

1. Agar Mac Conkey, SS, XLD:

Observar las colonias (color). Diferenciar las colonias: lactosa + como

Escherichia coli y Klebsiella sp. (fermentadoras de lactosa).

Diferenciar las colonias: lactosa - como Salmonella sp y Shigella sp. (no

fermentadoras de lactosa).

Hacer coloracin Gram y observar.

Realizar la prueba de aglutinacin si se sospecha de Salmonella.

Sembrar las colonias en LIA, Agar Citrato de Simmons, TSI, Urea y SIM.

Hacer la lectura a las 24 horas.

Cuestionario

1. Cul es la importancia del uso de medios de enriquecimiento?, ejemplos

2. Cules son los medios de cultivo elegidos para el aislamiento e identificacin del agente

causal bacteriano en un proceso infeccioso del sistema digestivo? porque?

Coloracin GRAM:

Enterobacterias



46


MMTTOODDOOSS DDEE DDIIAAGGNNOOSSTTIICCOO

BBrruucceellllaa aabboorrttuuss,, BB.. ssuuiiss,, BB.. mmeelliitteennssiiss

Dentro de las enfermedades infecciosas del ganado, son de carcter importante dentro

de las explotaciones pecuarias, las que causan trastornos de tipo reproductivo como el aborto,

nacimiento de cras muertas, cras que se mueren en pocas horas de nacidas (12-24 h),

infertilidad, retenciones placentarias, reabsorciones fetales o muerte embrionaria. As como la

prdida econmica tan fuerte por la baja produccin de recra, ya que la nica justificante que

tiene una hembra dentro de la granja es que produzca un nmero de cras al ao. Todo esto

repercute en prdidas por retraso en el mejoramiento gentico y gastos por medicamentos,

siendo todo esto englobado a prdidas econmicas elevadas y baja eficiencia en la

productividad de las explotaciones.

La mayora de los problemas abortivos en el ganado y muerte de animales recin

nacidos se deben a problemas no infecciosos (que normalmente no se toman en cuenta)

desbalances nutricionales, problemas genticos, agentes teratognicos, plantas txicas, factores

traumticos, problemas hormonales, administracin de medicamentos, micotoxinas y

endotoxinas.

OBJETIVO

- Reconocer las diferentes bacterias que causan aborto

- Conocer tcnicas para el diagnstico de bacterias causantes de aborto y formas

adecuadas de remisin de una muestra.

MATERIALES:

- Placa de aglutinacin

- Suero sanguneo de canino, bovino, y caprino

- Frasco de Reactivo de rosa de bengala (INS)

Testculo ovino:

Superior: Normal

Inf: Epididimitis y orquitis B. ovis



- Homogenizadores

- Micropipetas de 20 a 200ul

- Racks de tips o puntas de 200ul

- Lmpara de lectura

PROCEDIMIENTO:

sta prueba de aglutinacin consiste en cuantificar por inmunodifusin radial, la

concentracin de las Igs G en la muestra problema, el agar gel difusin frente a las muestras y

patrones, mediante lavado, secado y tincin del gel, se determina por la medida de los aros de

precipitacin. Con estos resultados, se realiza una recta de calibrado para calcular la

concentracin de Igs G en los sueros problemas.

o REACCION POSITIVA: se identifica con el signo +

Los sueros que presentan formacin de arenilla a manera de

precipitados sern positivos.

o REACCION NEGATIVA: se identifica con el signo -

Los sueros que no presentan ningn tipo de precipitacin sern

negativos. No se admite la clasificacin de sospechoso.

Cuestionario

1. Que implica una reaccin positiva a una prueba de Rosa de bengala.

2. Existe un programa de erradicacin de Brucella en el pas?, cuales son los aspectos ms relevantes de esta norma

Antgeno de Brucella abortus utilizado en la

prueba de Rosa de Bengala.



48


TCNICA DE MICROAGLUTINACION PARA DIAGNSTICO DE Leptospira sp.

Esta tcnica se emplea para detectar anticuerpos anti-leptospiras en el suero, identificar

los aislamientos, clasificar cepas y servir de base para evaluar cualquier otro mtodo serolgico

para el diagnstico de esta enfermedad.

La batera que se usa como antgeno est representada por los serovares ms

prevalentes del rea. Sin embargo, en aquellas regiones en donde no se conoce los serovares

circulantes, la OMS recomienda por lo menos una cepa de referencia de los serovares ms

representativos de las especies ms frecuentes.

Se emplean como antgeno las cepas de referencia que deben ser replicados

semanalmente para realizar la prueba. Una vez revisado los cultivos, se eligen aquellos que

tengan buen crecimiento y no formen aglutinaciones entre ellas. Cuando los cultivos estn

muy densos se deben diluir con buffer fosfato salino PBS pH 7,2-7,4 o solucin salina

fisiolgica 0,85%.

Para que el antgeno sea ptimo para la prueba tiene que observarse en el microscopio

de campo oscuro entre 150 a 200 leptospiras por campo o hasta lograr una opalescencia de 0,5

de la escala de Mc Farland.

La prueba se basa en enfrentar diluciones seriadas de suero con igual volumen de una

suspensin de leptospiras (antgeno) para luego observarse en microscopio de campo oscuro

para estimar el 50% de aglutinacin como el punto final de la reaccin antgeno-anticuerpo.

REACTIVOS:

1. Suero fisiolgico estril.

2. Medio Fletcher (DIFCO)

3. Medio Stuart (DIFCO)

4. Na2HPO4 anhidro

5. KH2PO4

6. Glicerina

7. Agua destilada estril

MATERIALES Y EQUIPOS:

1. Erlemeyer de 1-2 litros

2. Pipetas serolgicas

3. Pipetas pasteur

4. Portapipetas

5. Micropipetas simples y multicanales

6. Tips o puntas



7. Estufa a 28 C

8. Medidor de pH

9. Bao mara

10. Autoclave

11. Recipientes para descarte.

12. Solucin desinfectante de hipoclorito de sodio

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACION

En una microplaca de 96 pozo, colocar en la columna No. 1 la primera dilucin de los sueros 1:50

Con una micropipeta multicanal realizar diluciones dobles de los sueros en las siguientes columnas

1.:100 1:200 Control

(Slo Leptospira) 1:1600 1:800 1:400

Aadir el antgeno (serovar) en volumen de 50l

Incubar la microplaca por 2 horas a 28 C

Sacar de cada dilucin y del control 50 l y colocarlo

sobre un portaobjetos limpio

Observar en un microscopio de campo oscuro a 10X. El

50% o ms de Leptospiras aglutinadas se considera (+)



50

HOJA DE TRABAJO DE LOS CONTROLES Y MUESTRAS EN LA

PRUEBA DE MICROAGLUTINACIN PARA EL DIAGNOSTICO DE

Leptospira sp.

Cuestionario

1. En base al fundamento de la prueba de Microaglutinacin, cuales son las utilidades en

Medicina Veterinaria.



PPRRAACCTTIICCAA NN 1144 yy 1155

MMOORRFFOOLLOOGGAA YY TTIIPPOOSS DDEE RREEPPRROODDUUCCCCIINN

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS DE IMPORTANCIA EN MEDICINA

VETERINARIA

El diagnstico especfico de los hongos requiere principalmente de un estudio

microscpico y macroscpico de las estructuras vegetativas y/o reprodutivas, las cuales varan

de forma, dimensin, color, textura, etc. Se presentan en muchos casos estructuras especficas

de funcin definida, adems, en la actualidad los datos morfolgicos se complementan con los

aportes bioqumicos, serolgicos y moleculares para permitir una mejor clasificacin de

algunos hongos.

Cuando se recolectan raspados de piel para cultivo de dermatofitos, la lesin se limpia

con alcohol al 70 %; se realiza un raspado de la porcin marginal de la lesin, los pelos se

retiran con pinzas para cultivarse, las uas se obtienen por corte y la superficie de las

estructuras muy queratinizadas se raspan para tener acceso a porciones ms profundas. El

contenido de la pstula, ndulos, vesculas, se obtiene con jeringa estril. Si los hongos no

crecen pueden requerirse de biopsia; sta incluir tejido normal y porciones de la zona de

lesin. La orina se obtiene mejor por cistocentesis, la cual asegura que la muestra no se

contamine con la flora bacteriana mictica del tracto genitourinario inferior.

Las muestras que no se procesen pronto se refrigeran sin congelarlos por perodos de

hasta 12 a 15 horas.

Entre los hongos ms comunes causantes de micosis en veterinaria se encuentran:

- Epidermophyton floccosum

- Microsporum canis y M. gypseum

- Trichophyton mentagrophytes,

T. rubrum, y T. tonsurans

- Malassezia pachydermatis

- Candida albicans

Entre los hongos que afectan a los insumos

alimenticios se encuentran:

- Aspergillus spp

- Fusarium spp

- Penicilium spp

- Rhizopus spp

Aspergillus



52

ESTUDIO MACROSCPICO:

La descripcin de las caractersticas de los hongos son usualmente basadas en el

crecimiento de la colonia fngica estndar como los que crecen en el agar Sabouraud

Glucosado.

Estas caractersticas de crecimiento pueden variar de acuerdo al pH, temperatura, etc.;

por lo que es necesario considerar todos estos factores para una identificacin correcta de los

hongos.

Caractersticas de la Colonia

a. ASPECTO:

Se refiere a las caractersticas de crecimiento del micelio areo: elevacin y densidad.

Ejemplos: lanoso, algodonoso, aterciopelado, borde irregular, etc.

b. SUPERFICIE:

Se refiere a las caractersticas de crecimiento en la superficie: prominencias y

depresiones de la colonia. Ejemplos: planas, rugosa, monticulada, cerebriforme,

crateriforme, etc.

c. COLOR:

Varan de acuerdo a la especie del hongo: blanco, amarillo, verde, pardo, gris, marrn,

negro, etc. Adems la colonia puede difundirse en el medio de diferentes colores.

e. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO: rpida, moderada o lenta.

ESTUDIO MICROSCPICO:

1. ESTRUCTURAS VEGETATIVAS

a. LEVADURAS:

Son hongos unicelulares que presentan una forma redondeada u ovalada;

reproducindose asexualmente por medio de yemas o blastosporas. Ej.: Candida,

Saccharomices, Rhodotorula.

Poseen pseudomicelio, que son e

guia de practicas microbiologia ucsur siever 2015.pdf

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