prÁcticas de microbiologia: curso 2004/2005
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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA: CURSO 2004/2005 Dra. Mª Teresa Tejedor Junco. ? NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
El estudio de bacterias, virus, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser
patógenos para el hombre y los animales comporta riesgos que varían según el agente
infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biológica pretenden
reducir a un nivel aceptable el riesgo derivado de la manipulación de material peligroso. Por
otra parte, el personal de Laboratorio de Microbiología está expuesto a riesgos no biológicos. El
equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología contribuyen a la seguridad sólo si las
personas que trabajan en él están motivadas, conocen las normas de seguridad y las aplican.
Los laboratorios de Microbiología se clasifican en niveles de contención (que van del 1
al 4) en función del tipo de microorganismos con que se trabaje. Los laboratorios de
Universidad suelen encontrarse en el nivel 1 o en el nivel 2. El nivel 1 corresponde a
laboratorios en los que se trabaja con microorganismos que no suelen causar enfermedades en
el hombre. En el nivel 2 se encuentran aquellos laboratorios en los que se trabaja con
microorganismos que pueden causar enfermedades al ser humano, pero con una baja
probabilidad de que se propague a la colectividad y para los que existe una profilaxis o
tratamiento eficaz.
El nivel 3 se corresponde con la manipulación de microorganismos que causan
patología grave, de tratamiento largo y difícil, que pueden causar secuelas. El nivel 4 se
requiere cuando se procesan agentes patógenos infectocontagiosos que producen alta
mortalidad y para los que no existe tratamiento o éste es poco fiable (virus Ebola, Lassa,
Machupo).
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación
a la que es sometido. Por ello, es básico:
a) Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
b) Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.
c) Conocer el equipamiento del laboratorio.
d) Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
e) Conocer las leyes de seguridad biológica.
f) Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.
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Existen unas normas básicas que permiten que el trabajo en el laboratorio sea seguro y
eficaz.
El espacio de trabajo debe estar libre de objetos que puedan interferir, lo mismo que el
suelo. Deben evitarse los movimientos bruscos.
El suelo debe ser plano y el material que lo revista será antideslizante, silencioso, de
limpieza fácil y resistente al contacto con sustancias químicas.
La ventilación es especialmente importante cuando se utilizan mecheros de gas.
Es imprescindible el uso de bata de laboratorio y ésta no debe llevarse cuando se
acceda a áreas “limpias” . Debe llevarse el pelo recogido. Está terminantemente prohibido
comer, beber o fumar en el Laboratorio.
Las manos deben lavarse cuidadosamente antes de abandonar el laboratorio y en
cualquier otro momento en que sospechemos que hemos podido contaminarnos.
En caso de derramarse accidentalmente alguna muestra contaminada, debe
desinfectarse inmediatamente la zona en cuestión.
La mayoría de los accidentes relacionados con el laboratorio de Microbiología pueden
evitarse si se combinan un adecuado entrenamiento, una buena realización de las técnicas, un
estado de los aparatos apropiado y unas medidas de seguridad correctas.
El material contaminado puede seguir dos vías, según sea de un solo uso o reutilizable.
Normalmente los artículos de un solo uso se depositan en bolsas especiales de polipropileno,
que luego se esterilizan. El material de vidrio contaminado suele dejarse doce horas en
desinfectante, y posteriormente se esteriliza en autoclave, se lava y se seca. Las jeringas,
portaobjetos de cristal, agujas, etc., deben depositarse en contenedores específicos y no
directamente en las bolsas ya que éstas pueden romperse o alguna persona pincharse.
Nunca se pipetean reactivos peligrosos o cultivos líquidos con la boca. Se emplea una
perilla de goma, una propipeta o se coloca algodón en el cuello de la pipeta.
Las placas de Petri deben estar en todo momento boca abajo, excepto en aquellos casos
en que se indique expresamente lo contrario. Deben rotularse adecuadamente en la parte que
contiene el agar, mientras que los tubos deben rotularse en el cristal y no en la tapa. Para
rotular debe emplearse un rotulador que escriba en vidrio y plástico, que sea impermeable al
agua y que no se borre con facilidad. Generalmente para borrarlo se frota con alcohol.
El asa de siembra se flameará antes y después de usarla, asegurándose de que se pone al
rojo vivo. Los hisopos deben meterse de nuevo en su funda. Las agujas de inyección se
depositan en recipientes especiales sin tocarlas con las manos.
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? MATERIAL DE LABORATORIO
1.- MICROSCOPIO:
El microscopio óptico permite observar objetos invisibles a simple vista, pero de
tamaño superior a 2 micras. Posee una fuente de iluminación con un condensador para
regularla, y un sistema de lentes para amplificar las imágenes, formado por el objetivo y los
oculares. La pletina es la superficie donde se coloca la preparación para ser observada.
Los microscopios poseen un revólver en el que se hallan dispuestos varios objetivos
con lentes de diferente capacidad de aumento que pueden intercambiarse.
Los aumentos obtenidos con el microscopio óptico son los siguientes:
Ocular Objetivo Aumento
x 10 x 10 100
x 10 x 40 400
x 10 x 100 1000
Para observar a mil aumentos debe ponerse una gota de aceite de inmersión entre la
preparación y el objetivo para unificar la refringencia del sistema.
Para enfocar se dispone de un tornillo macrométrico y otro micrométrico, que permiten
adecuar la distancia entre el objetivo y la preparación. Hay que tener cuidado al descender el
objetivo para enfocar ya que puede golpearse la preparación y romperse tanto ésta como la
propia lente.
La intensidad de la luz debe ajustarse a las necesidades de la observación, controlando
tanto la emitida por la fuente como su regulación por la altura del condensador y el ajuste de su
diafragma.
Al acabar la observación después de retirar la preparación debe limpiarse con cuidado el
aceite de inmersión del objetivo y la platina.
2.- ESTUFA:
Se emplea en el laboratorio de bacteriología, para producir la temperatura adecuada
para el crecimiento de los microorganismos. Generalmente se utilizan en bacteriología clínica
estufas de 37 grados, que es la temperatura óptima para el crecimiento de la mayoría de las
bacterias asociadas a mamíferos.
A veces se emplean otras temperaturas para hacer los medios selectivos, por ejemplo 42
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grados para Salmonella.
3.- NEVERA:
Se emplea en muchos casos para conservar determinados medios y reactivos. También
para mantener las muestras hasta el momento de su siembra, impidiendo que aumente mucho
el número de bacterias.
4.- Gradillas plásticas o metálicas para sostener los tubos.
5.- MECHERO BUNSEN:
Consiste en una base sólida y un tubo metálico vertical en cuya base está la entrada de
gas y un regulador de aire. Cuando se ajusta el regulador para cerrar completamente el orificio
de la base, se produce la llama luminosa. A medida que se gira el regulador para incrementar la
entrada de aire que se mezcla con el gas, la llama aparece no luminosa. Esta es la llama que se
emplea para calentar y contiene un cono interior de luz azul y, por encima de éste, otro cono
que rodea al anterior y es de color azul oscuro. La parte mas calurosa de la llama no luminosa
está situada justo encima del cono de luz azul interno. Cuando se calientan recipientes sobre la
llama de un mechero Bunsen es necesario colocarlos sobre un trípode metálico y colocar entre
la llama y el recipiente una rejilla metálica con una parte central de amianto. Debe tenerse
cuidado para que los tubos de goma del gas no entren en contacto con recipientes calientes o
con la base del mechero.
Se utiliza básicamente para flamear el asa de siembra, calentar medios, y esterilizar el
aire del área donde se trabaja.
4.- ARTICULOS DE VIDRIO Y PLASTICO:
Se emplean generalmente para medir y guardar reactivos y muestras, especialmente los
líquidos. El vidrio empleado suele ser vidrio borosilicado (ej. Pyrex) que es mas resistente y
soporta mejor los choques térmicos y mecánicos.
a) Material de vidrio volumétrico: Se emplea para medir volúmenes. El borde inferior del
menisco del líquido debe colocarse encima del borde superior de la marca del instrumento. Se
debe mirar al nivel de los ojos para evitar errores. Este material está calibrado a una
temperatura determinada, por tanto no debe emplearse cuando esté caliente.
1. Pipetas: Graduadas, micropipetas,...
2. Matraces aforados: Constan de un bulbo con una base plana y un cuello estrecho.
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Solo llevan una graduación. Suelen tener un tapón.
3. Probetas: Recipientes cilíndricos altos para medir volúmenes rápidamente y con una
exactitud razonable. No se deben medir volúmenes pequeños en probetas grandes.
b) Otro material de vidrio:
1. Vasos de Precipitado
2. Matraces: El modelo mas empleado es el Erlenmeyer, que es muy estable debido a su
amplia base. Pueden estar graduados o no.
3. Frascos, que pueden ser coloreados para evitar la acción de la luz en las soluciones
almacenadas, o con cuentagotas para reactivos.
4. Tubos de ensayo, con o sin tapón.
5. Tubos de centrífuga. Su fondo puede ser redondo o cónico. En los de fondo cónico
el sedimento se deposita en el fondo del tubo, lo que facilita la decantación del sobrenadante.
6. Embudos: Para transferir materiales o bien, recubiertos de papel de filtro, para filtrar
líquidos.
7. Portaobjetos y cubreobjetos, para observar muestras al microscopio.
8. Placas de Petri: Para contener los medios de cultivo sólido en que crecen las
bacterias.
c) Material de plástico:
Actualmente se utiliza mucho material de plástico en sustitución del material de vidrio
de uso general, pero no para medir. Es especialmente importante el uso de placas de Petri
desechables, así como de tubos de centrífuga.
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? DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO
El propósito fundamental del laboratorio de Microbiología clínica veterinaria es
colaborar estrechamente con los veterinarios clínicos y con otros miembros del equipo de salud
para proporcionar el diagnóstico y manejo óptimo de los animales con enfermedades
infecciosas y para prevenir la diseminación de la enfermedad. En general, es importante
documentar la presencia de una infección, determinar su naturaleza y administrar la terapia
adecuada. Tanto la morbilidad como la mortalidad se pueden reducir de forma significativa si
se inicia tempranamente el tratamiento.
Además de aislar e identificar los microorganismos y de estudiar su sensibilidad, el
microbiólogo debe informar al clínico de las técnicas de toma de muestras y transporte de las
mismas. También debe informar al personal responsable y a las autoridades sanitarias sobre la
aparición de determinadas infecciones.
Un veterinario clínico puede obtener tan solo una limitada cantidad de datos sobre un
animal a partir de su historia clínica (proporcionada por el dueño o cuidador: síntomas,
vacunaciones, enfermedades anteriores, etc.) y del examen clínico. Frecuentemente estos datos
son insuficientes para permitir al veterinario diagnosticar con seguridad. Deben utilizarse
métodos auxiliares de diagnóstico: radiografías, electrocardiogramas, y sobre todo, ANALISIS
CLINICOS. En las enfermedades infecciosas es fundamental un diagnóstico exacto, que
permita un tratamiento específico frente a la causa de la enfermedad y no de los síntomas
(tratamiento sintomático).
Los análisis microbiológicos permiten también seguir la evolución de la enfermedad (ej.
curva de aparición y desaparición de antígenos y anticuerpos en serología) o determinar la
eficacia de un tratamiento, cuando los síntomas de mejora no sean claros (ej. infección
urinaria).
* Podemos considerar dos tipos de diagnóstico microbiológico:
1) Directo, basado en la puesta de manifiesto de la presencia del microorganismo
(tinción y cultivo)
2) Indirecto, demostrar la "huella" que el microorganismo deja en el enfermo. Ej.
Técnicas serológicas o genéticas.
? RECOGIDA DE MUESTRAS
1.- VOLANTE:
Toda muestra que llega al laboratorio debe ir acompañada de un volante en el que se
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especifique como mínimo la siguiente información:
*Tipo de muestra, técnica de recogida, orientación diagnóstica, tratamiento.
*Datos del animal: especie, raza, edad, sexo,..
*Datos del dueño: Nombre, dirección y teléfono.
*Fecha de recogida de la muestra y de realización del análisis.
El procesamiento de la muestra y el tipo de medios que se utilizan varían según el
producto patológico de que se trate y la "sospecha" que se tenga.
2.- TOMA DE MUESTRAS:
El método de toma de muestra varía según el tipo de producto patológico de que se
trate. La valoración de los resultados también depende del tipo de muestras, ya que lo que
puede ser "Flora normal" en determinadas zonas del organismo, es en otras indicativo de
infección. Existen una serie de normas generales: Las muestras deben tomarse lo más pronto
posible en relación a la aparición de síntomas; deben recogerse antes de iniciar el tratamiento;
en general, es mejor tomarlas de los bordes de las lesiones (ya que es la zona de mayor
replicación de los microorganismos); deben tomarse de la forma más aséptica posible; debe
evitarse la desecación, especialmente en el material enviado al laboratorio en hisopos; si el
envío al laboratorio se demora, en general deberán refrigerarse (pero no congelarse) aunque
esto variará según el tipo de muestra; debemos enviar el tipo de muestra adecuado (orina,
sangre, heces....) en función del problema; por último, las muestras deben enviarse por
separado, bien empaquetadas y convenientemente identificadas.
a) Orina:
La orina es teóricamente un líquido estéril. Por tanto, debe evitarse cualquier tipo de
contaminación durante su recogida. Preferentemente se emplean frascos estériles de
poliestireno.
El tiempo transcurrido entre la recogida de la muestra y su procesamiento debe ser lo
mas breve posible. Si no se puede analizar antes de una hora, debe ser refrigerada (pero no
congelada).
Existen tres métodos básicos para recoger una muestra de orina: directo, por sondaje o
por punción suprapúbica (cistocentesis).
Si es posible se prefiere la recogida directa, pero esto depende de la capacidad de
controlar al animal y de que éste coopere. Se le hace beber mucha agua y luego se le saca
controlado por una correa. Se descarta la primera parte de la micción y se recoge la parte
central, descartando el resto.
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El sondaje se evita siempre que sea posible ya que conlleva riesgos, incluyendo la
posibilidad de generar una infección si la sonda no está estéril. También debe descartarse la
parte inicial de la micción. Es lo que se suele llamar "flora de arrastre".
Tanto en la recogida directa como en el sondaje pueden encontrarse algunas bacterias
en la orina como resultado de su contacto con el tercio externo del tracto urinario.
En la punción suprapúbica (cistocentesis) la orina se extrae directamente de la vejiga
con aguja y jeringa estéril. En este caso la orina es estéril si no hay infección, ya que no existe
flora de arrastre.
b) Heces:
La recogida debe hacerse en frascos limpios, pero no es imprescindible que sean
estériles, ya que las heces poseen una flora habitual, por lo que la búsqueda se centra
exclusivamente en microorganismos patógenos. Debe evitarse la contaminación con otros
materiales: serrín, tierra, etc., por lo que es preferible que se expulsen las heces sobre una
superficie embaldosada o asfaltada.
Si hay dificultad para obtener la muestra pueden emplearse hisopos rectales.
Si el análisis se demora puede refrigerarse la muestra, aunque esto debe evitarse siempre
que sea posible.
c) Sangre:
Para tomar muestras de sangre se corta el pelo y se desinfecta la piel de la zona donde
se va a realizar la punción. Hay que evitar también la contaminación posterior de dicha zona.
Se extrae la sangre con jeringa y aguja estériles, y se inyecta en un frasco que contenga
el medio de cultivo. Como la bacteriemia suele ser intermitente, se aconseja obtener varias
muestras a lo largo de 24 horas.
En perro y gatos suelen usarse las venas de las patas, por ejemplo la safena lateral
(pata) o la cefálica (cara frontal del antebrazo, en un punto medio entre el codo y el carpo)
d) Líquidos de cavidades corporales:
Se desinfecta la zona de la punción y se procede cuidadosamente para evitar la
introducción de gérmenes en el animal. Los líquidos deben obtenerse por punción aséptica, con
aguja y jeringa estériles.
e) Hisopos:
Consisten en un pequeño trozo de algodón enrollado fuertemente alrededor del extremo
de una varilla de madera. Vienen estériles y empaquetados en un tubo.
Existen hisopos que utilizan alginato cálcico en vez de algodón. Son muy útiles porque
no inhiben el crecimiento de las bacterias, no interfieren en la acción de los antibióticos y no
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irritan tejidos o heridas.
Al tomar las muestras debe tenerse cuidado de no tocar otras partes del cuerpo del
animal o la piel de los alrededores.
Los hisopos son muy útiles para recoger muestras de:
-piel, especialmente heridas, pústulas, abscesos, etc.
-secreciones (ej. vulva, prepucio, etc.)
-Recto, cuando es difícil obtener muestras fecales.
-oídos, ojos, cavidades nasales, boca, garganta, etc.
f) Pus:
En general, si no se puede tomar con hisopo, se aspira con una jeringa estéril. Si se
sospecha la presencia de anaerobios hay que tomar precauciones para que no penetre oxígeno
en la muestra.
3.- EXAMEN Y CULTIVO DE LAS MUESTRAS:
TINCIONES:
1) Tinción de Gram:
Divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas,
dependiendo de la estructura de su pared. En primer lugar hay que fijar la preparación. Se pone
una gota de la muestra en el centro del portaobjetos y se extiende con el asa de siembra
flameada. Se deja secar al aire, y una vez seca se FIJA pasándola por encima de la llama del
mechero Bunsen, sin dejar que se caliente demasiado. Una vez fijada, se lleva a cabo la tinción.
El procedimiento es el siguiente:
* Recubrir la preparación con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
* Decantar y lavar con agua.
* Recubrir la preparación con lugol. Dejar actuar un minuto.
* Decantar y lavar con agua.
* Decolorar bañando con alcohol-acetona. Dejar 30 segundos.
* Decantar y lavar con agua.
* Recubrir la preparación safranina. Dejar 15 segundos.
* Decantar y lavar con agua.
* Dejar secar. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión tras añadirle una
gota de aceite.
Las bacterias Gram positivas se observan de color violeta, mientras que las Gram
negativas quedan de color rojo-rosado. Cuando se observa la preparación al microscopio hay
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que indicar la morfología bacteriana (cocos, bacilos,..), la agrupación (parejas, racimos,
cadenas) y la tinción (Gram positivos o Gram negativos).
2) Tinción de Ziehl-Neelsen:
Esta tinción permite diferenciar las bacterias ácido-alcohol resistentes del resto. En
primer lugar hay que preparar una extensión y fijarla, como se hizo en la tinción de Gram. En el
caso de las bacterias ácido-alcohol resistentes, suele realizarse en una campana de seguridad.
Luego se procede como sigue:
*Recubrir la preparación con carbolfucsina, dejándola actuar durante 20 minutos.
Calentar con un flameador por debajo de la preparación hasta que empiece a desprender vapor.
Dejar enfriar y repetir la operación cada 8-10 minutos.
*Decantar el colorante. Lavar con agua.
*Añadir alcohol-Ac.Clorhídrico para decolorar. Dejar unos dos minutos.
*Lavar con agua.
*Recubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto.
*Decantar y lavar con agua. Dejar secar.
*Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Las bacterias ácido-alcohol resistentes quedarán teñidas con el color rojo de la carbolfucsina.
3) Tinción de azul de algodón-lactofenol:
Se utiliza para la observación de la morfología de hongos. Se coloca una gota de azul de
algodón en un portaobjetos, se toma una muestra con el asa de siembra se coloca en la gota, se
tapa con un cubre y se observa al microscopio con objetivo x100 o x400.
? MEDIOS DE CULTIVO
Para el aislamiento primario de los microorganismos a partir de las muestras clínicas, se
siembran en medios de cultivo. Las condiciones de incubación (tiempo, temperatura y
atmósfera) dependen de cada microorganismo. La mayoría de las bacterias crecen en 24-48
horas, a 35º-37 ºC y en atmósfera aerobia. Cada bacteria depositada sobre la superficie de un
medio de cultivo sólido se multiplica y da lugar a una enorme acumulación de bacterias que
forman una colonia visible microscópicamente.
El tema de cultivos de los microorganismos se ha explicado con bastante profundidad
en las clases teóricas. Sin embargo, conviene repasar los conceptos básicos.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO:
1) Por su consistencia:
a) líquidos: Nutrientes + sol. tampón. Ej. agua de peptona, tioglicolato
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b) sólido: líquido + agar. Ej. Agar McConkey
2) Por su origen:
a) sintéticos: Químicamente definido. Ej. Agar McConkey
b) Semisintético: sintético + extracto orgánico (ej. extracto de levadura)
c) Naturales: Composición no siempre constante (ej. agar patata-zanahoria)
3) Por su composición:
a) Comunes: Microorganismos poco exigentes
b) Enriquecidos: Medios comunes a los que se añaden sustancias que actúan como
factores de crecimiento o neutralizan inhibidores. Para bacterias exigentes.
4) Otros medios:
a) Medio de enriquecimiento: Medio LIQUIDO que favorece el desarrollo de una
bacteria e inhibe el de otras. ej. Caldo de Selenito
b) Medio Selectivo: Medio SÓLIDO que inhibe el desarrollo de unas bacterias y
favorece el de otras.
* alterando el pH: Básico para Vibrio
* alterando la temperatura: ej. Yersinia, Listeria...
* Aumentando la Presión Osmótica: Staphylococcus (MSA)
* Adición de antisépticos: Agar McConkey (cristal violeta que inhibe las Gram
+)
* Adición de Antibióticos: Thayer-Martin VCN
c) Medios diferenciales: Las bacterias actúan sobre uno o mas de sus componentes
poniendo de manifiesto sus características. Únicos (Agar McConkey) o Combinados
(Kligler)
d) Medios especiales
e) Medios de transporte
f) Medios de conservación
EJEMPLO: Agar McConkey: sólido, sintético, común, selectivo, diferencial.
? PROCESA MIENTO DE LAS MUESTRAS
a) Orina:
Generalmente se hace en principio un examen físico de la orina (aspecto, color, olor,...)
y químico (pH, glucosa, nitritos, etc.). Luego se estudia el SEDIMENTO URINARIO, que nos
dará una indicación de lo que podemos obtener en el cultivo, y además nos proporcionará otros
datos (levaduras, cristales, bacterias, células, etc.). Se ponen de 10 a 15 mL. de orina en un
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tubo de centrífuga de fondo cónico, se centrifuga a 1000 r.p.m. durante 5 ó 10 minutos. Se
elimina el sobrenadante, se colocan unas gotas entre porta y cubre y se observa al microscopio
óptico.
La presencia de bacterias en el cultivo se valorará en función del número y el tipo.
Teóricamente, si todo el proceso se ha desarrollado correctamente, en una punción suprapúbica
cualquier número de bacterias es indicativo de infección. En el resto de los casos (sondaje y
recogida directa), la valoración dependerá del número de bacterias y del tipo, ya que puede
haber bacterias provenientes de la flora de arrastre de uretra y piel. En la mayoría de los casos
en que existe infección de orina, ésta se debe a un solo tipo de bacterias, y en un 10% de los
casos, a dos tipos. Si hay mas de dos tipos, existe una elevada probabilidad de que sea una
contaminación y conviene repetir el análisis. En cuanto al número, se considera que hay
infección cuando hay mas de 105 u.f.c./ml. de orina, siendo u.f.c.= unidades formadoras de
colonias. Si encontramos entre 104 y 105 u.f.c./ml. conviene repetir el análisis. Si hay menos de
103 u.f.c./ml. se considera contaminación.
Existen algunas excepciones a estas reglas. En general, se considera que puede haber
infección por levaduras o algunos gram positivos con cantidades inferiores a 105 u.f.c./ml.
Asimismo hay que considerar el estado general del animal. Por ejemplo en animales diabéticos,
tratados con inmunosupresores, etc. se valorará cualquier cantidad de bacterias que aparezca,
incluso si hay mas de dos tipos diferentes.
b) Heces:
En heces existe una flora habitual, por lo que normalmente se buscan microorganismos
patógenos. En este caso tenemos en cuenta exclusivamente presencia/ ausencia, sin considerar
el número de bacterias. Así, un elevado número de colonias de "flora habitual" no es indicativo
de infección, mientras que una sola colonia de una bacteria patógena (ej. Salmonella) si es
indicativo de infección.
Existe un gran número de bacterias que pueden ser patógenas en heces, por lo que es
importante la orientación diagnóstica del clínico.
En algunos casos existe la posibilidad de que las alteraciones se deban a
DISBACTERIOSIS, es decir a desequilibrios de la flora habitual del intestino causados
generalmente por un excesivo consumo de antibióticos. Estos destruyen la mayor parte de la
flora normal, lo que permite la proliferación de otras bacterias muy resistentes o de levaduras
c) Sangre:
La sangre es un líquido estéril, por lo que teóricamente cualquier bacteria que aparezca
puede considerarse indicativa de infección si todo el procedimiento ha sido realizado en las
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condiciones apropiadas.
d) Exudados:
Los microorganismos que se pueden encontrar varían según la zona del cuerpo y
también difieren en los diversos animales.
? SIEMBRA DE LAS DISTINTAS MUESTRAS:
TÉCNICAS DE SIEMBRA:
Para procesar las muestras pueden cultivarse en medios sólidos o líquidos. En el primer
caso suelen emplearse Placas de Petri. Los medios líquidos están en tubos. En algunos casos
(ej. sangre) la siembra se hace inyectándola con una jeringa en un frasco que contiene el medio
de cultivo.
La siembra suele realizarse con el ASA, aunque en algunas técnicas especiales pueden
emplearse hisopos. El asa consta de un mango en cuyo extremo existe un filamento de platino
o nicrom. Estos metales tienen la propiedad de alcanzar rápidamente altas temperaturas
cuando se exponen a la llama de un mechero Bunsen, y de enfriarse rápidamente en pocos
segundos. Esto permite esterilizarlas rápidamente tanto antes como después de usarlas.
Existen dos tipos básicos de asa de siembra: recta (o asa de picadura) y con bucle
(generalmente calibrada).
Las PLACAS se pueden sembrar para recuento o para aislamiento, según deseemos
contar el número de bacterias en la muestra o separar los diferentes tipos para luego trabajar
con ellos (Ver esquemas)
1) Recuento: Se toma una gota de la muestra y se coloca en el centro de la placa con agar. Con
el asa, se extiende la gota en todas las direcciones como indica el esquema.
2) Aislamiento: Se toma una gota de la muestra con el asa de bucle y se golpea ligeramente en
el interior del frasco de la muestra, a fín de que quede solamente lo que haya en el alambre. A
continuación se trazan estrías en un lateral de la placa. Se flamea el asa, se deja enfriar y se
trazan estrías partiendo desde donde se había sembrado. Se vuelve a repetir la operación y por
último, sin flamear, se traza una rúbrica.
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En los TUBOS, el medio puede ser sólido o líquido. El medio sólido puede estar en
pico de flauta, plano inclinado o recto.
a) Orina:
Se siembra generalmente en dos tipos de medios. Un medio rico (ej. CLED, agar
sangre,..) en el cual puedan crecer tanto Gram positivos como Gram negativos, o incluso
levaduras; y un medio selectivo, como el Agar McConkey, donde crecen las Gram negativas
(básicamente Enterobacterias y Pseudomonas) pero no las Gram positivas ni las levaduras. Se
intenta aislar Enterobacterias o Pseudomonas porque son los agentes causales de la mayoría de
las infecciones urinarias.
En el CLED, la orina la sembramos para recuento, ya que en este medio crecen todos
los microorganismos. En el McConkey sembramos para aislamiento, ya que en este caso lo que
deseamos es separar los distintos tipos bacterianos para identificarlos y estudiar su sensibilidad.
Para hacer el recuento, se hace una regla de tres. Si conocemos el tamaño de la gota de
orina que pusimos y sabemos cuantas colonias han crecido, podremos deducir cuantas
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crecerían a partir de un mililitro de muestra. Los bucles de las asas suelen ser de 1/100 o 1/500
ml.
Ambos medios son diferenciales. Permiten diferenciar las bacterias que fermentan la
lactosa (Lac +) de las que no la fermentan (Lac -). En el CLED, las Lac+ son amarillas y las
negativas de su color. En McConkey las Lac+ son de color rojo o rosado y las negativas son
transparentes o de su color, si producen pigmentos.
b) Heces:
Las heces presentan una flora habitual, por lo que deben sembrarse en medios que
faciliten la detección de microorganismos patógenos. Existe un protocolo básico con el que se
intenta detectar los microorganismos patógenos mas frecuentes. Siempre se intenta tener en
cuenta la orientación diagnóstica a fin de añadir otros medios especiales para determinadas
bacterias.
Normalmente utilizamos 5 medios sólidos y 1 medio líquido.
El medio líquido es un medio de enriquecimiento, el CALDO DE SELENITO, que favorece
el crecimiento de Salmonella. Se incuba a 370C durante 24 horas y posteriormente se resiembra
en un medio sólido, generalmente Agar SS, para poder observar las colonias.
Los medios sólidos tienen distintos grados de selectividad y son:
* Agar McConkey. Es un medio poco selectivo. Permite el crecimiento de las bacterias
Gram negativas. Se emplea básicamente para estudiar el equilibrio de la flora intestinal. Nos
permite diferenciar las bacterias Lac+ (colonias rojas) de las Lac-.
* Agar Salmonella - Shigella (SS): Es un medio moderadamente selectivo para
Salmonella y Shigella. Shigella tiene escaso interés veterinario, aunque tiene importancia en
Microbiología de alimentos. En agar SS, las colonias lac + son de color rojo o rosado, mientras
que las lac- son de su color. Salmonella es una bacteria lactosa negativa; las colonias
SOSPECHOSAS de Salmonella serán transparentes y presentan en muchos casos un punto
negro. Esto se debe a la producción de SH2 que interacciona con las sales de hierro que hay en
el medio de cultivo y precipita.
* Agar Verde Brillante (BG): Es un medio altamente selectivo para Salmonella. En agar
verde brillante, las colonias Lac + son de diversos colores (amarillo, verdoso, etc.), mientras
que las Lac- son de color rojo. Por tanto, se consideran SOSPECHOSAS de ser Salmonella
aquellas colonias que tengan una coloración rojiza.
* Agar con sal y manitol (MSA). Es un medio con una elevada concentración salina, lo
que lo hace selectivo para Staphylococcus. La fermentación del manitol permite diferenciar las
colonias SOSPECHOSAS de Staphylococcus aureus, ya que son de color amarillo cremoso.
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* Agar Sabouraud: Es un medio diseñado para favorecer el desarrollo de levaduras,
aunque también pueden crecer otros microorganismos. Las levaduras crecen lentamente, por lo
que las colonias se observan mejor tras 48 horas de incubación. Las colonias sospechosas son
de color blanco y aspecto nacarado. El cultivo huele a pan.
El CALDO DE SELENITO se siembra con el asa de bucle. Como siempre, se flamea
el asa, se deja enfriar y se toma una gota de la muestra de heces. Se destapa el tubo y se inclina
ligeramente. Se apoya el bucle del asa en el interior del tubo y se deposita la gota. Se flamea la
boca del tubo antes y después de realizar este proceso. Se flamea el asa. Se tapa el tubo y se
mueve suavemente para mezclar el inóculo con el medio.
Todos los medios de cultivo sólidos usados para el cultivo de heces se siembran por
aislamiento, ya que nos interesa detectar los diferentes tipos de bacterias que aparecen, sin que
influya su número.
En todos los casos, el aspecto de las colonias nos da una identificación PRESUNTIVA,
sin que podamos afirmar que se trata de una bacteria concreta. En condiciones normales solo
identificaremos los "presuntos" patógenos.
En los casos en que la orientación diagnóstica lo aconseje, incorporaremos otros
medios selectivos y otros protocolos. Por ejemplo, agua de peptona tamponada para Vibrio, o
incubación a 40C durante una semana para Yersinia.
La incubación suele realizarse durante 24 horas a 370C, aunque las levaduras suelen
dejarse 48 horas. Algunas veces se incuba a 42ºC para seleccionar.
c) Heridas, pus:
Normalmente las sembramos en Cled y McConkey. Se siembran por aislamiento ya que
lo que importa es el tipo de bacterias que aparecen. A veces se añade Agar Chocolate si se
sospecha la existencia de bacterias exigentes. En caso de sospecharse la presencia de
anaerobios, debe evitarse el contacto del aire con la muestra, sembrándose a continuación en
Agar Sangre con amikacina y procesándose en anaerobiosis como explicaremos posteriormente.
d) Sangre:
Normalmente se toman tres muestras el mismo día, con un intervalo de varias horas.
Cada una de las muestras se siembra en un medio de cultivo para aerobios, otro para
anaerobios y un tercero con un medio de cultivo para Brucella (ej. medio de Castañeda). Los
dos primeros se incuban alrededor de 7 a 10 días a 370C, haciendo pases a agar sangre y agar
chocolate. El medio de Castañeda se incuba durante un mes aproximadamente, haciendo
resiembras cada semana.
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* ANAEROBIOS:
El estudio de las bacterias anaerobias se efectúa según la secuencia clásica: examen
directo (ej. Gram), cultivo e identificación y antibiograma. Pero todo el proceso debe
efectuarse en ausencia de oxígeno, desde la recogida de la muestra hasta los cultivos y
antibiogramas.
Las muestras no deben tomarse con hisopo sino con jeringa y evitando inmediatamente
la entrada de aire. Es importante evitar la contaminación de la muestra por la flora de las
superficies mucosas adyacentes, ya que éstas tienen su propia flora anaerobia normal.
El examen directo del material, teñido por el método de Gram, posee un gran valor para
orientar el diagnóstico de las infecciones por anaerobios. La morfología de las bacterias
anaerobias es en muchos casos bastante típica.
Los medios de cultivo deben sembrarse de inmediato, efectuando las manipulaciones
preferentemente en una campana con atmósfera anaerobia. Como medio selectivo puede usarse
agar sangre con amikacina. La amikacina, como otros aminoglicósidos, inhibe gran parte de la
flora aerobia, lo que favorece el crecimiento de los anaerobios.
La incubación en anaerobiosis se efectúa colocando las placas de Petri en jarras para el
cultivo de anaerobios. Se puede eliminar el oxígeno extrayendo el aire y reemplazándolo por
otro gas. También puede obtenerse la anaerobiosis por métodos químicos, mediante sobres
comercializados que contienen un reactivo que al añadirle agua genera hidrógeno, que en
presencia de un catalizador reacciona con el oxígeno produciendo agua y eliminando por tanto
el oxígeno libre.
La identificación de anaerobios se realiza en muchos casos de forma presuntiva, por su
morfología colonial, aspecto en la tinción de Gram, sensibilidad a antibióticos etc. Una
identificación mas precisa puede realizarse mediante cromatografía de gases de los productos
de su metabolismo.
? IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Al observar el aspecto de las colonias bacterianas crecidas en los medios de cultivo
sólido, podemos darnos cuenta de las diferencias en tamaño, forma, textura, bordes, etc.
Además podemos obtener información a partir de tinciones, de su crecimiento o no en
determinados medios, o de las propiedades que muestran en los medios diferenciales (ej.
Hemólisis en agar sangre). Para identificar el género y la especie a la que pertenece una
18
determinada bacteria, hay que realizar diversas pruebas metabólicas, pero siempre teniendo en
cuenta el tipo de bacteria con el que estamos trabajando (cocos Gram positivos o Gram
negativos, bacilos Gram positivos o Gram negativos, Corinebacterias, etc.). Cada prueba tendrá
sentido dentro de su esquema. Nos vamos a centrar en los dos grupos más frecuentes en
patología clínica veterinaria: Bacilos Gram negativos (concretamente Enterobacterias y Bacilos
No fermentadores) y Cocos Gram positivos.
* IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
(Enterobacterias y Bacilos no fermentadores).
Entre los bacilos Gram negativos de interés en clínica veterinaria, los mas frecuentes
pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Otros, como los géneros Pseudomonas y Acinetobacter, se
incluyen dentro de los llamados “Bacilos no fermentadores”, en la familia Pseudomonadaceae.
Una de las pruebas mas usadas para diferenciar entre estas dos familias es la prueba de
la oxidasa. Las Enterobacterias son oxidasa negativa, mientras que las Pseudomonas suelen ser
oxidasa positiva.
Para identificar los diferentes géneros y especies de estas familias se suelen realizar
pruebas bioquímicas. Teniendo siempre presente las características de las que partimos (Bacilos
gram negativos que crecen en determinados medios, ya sean oxidasa positiva o negativa)
podemos estudiar diferentes características: fermentación u oxidación de diversos
carbohidratos, desaminación de aminoácidos, utilización de determinados sustratos, etc.
? Pruebas más usadas en la identificación de enterobacterias:
Entre las pruebas más usadas para la identificación de enterobacterias están: utilización
oxidativa o fermentativa de glucosa y lactosa, producción de SH2 , producción de otros gases a
partir de los azúcares, producción de indol a partir del triptófano, capacidad para crecer
utilizando citrato como única fuente de carbono, fermentación butilén-glicólica de la glucosa y
desaminación de la fenilalanina. Con estas pruebas podemos llegar a incluir la bacteria que
queremos identificar en algún grupo, pero para identificar a nivel de especie hacen falta entre
20 y 25 pruebas bioquímicas, incluyendo fermentación de numerosos azúcares,
descarboxilación, desaminación o dihidrólisis de diversos aminoácidos, utilización de otros
sustratos etc . Vamos a describir con más detalle cada una de las pruebas que hemos citado
anteriormente.
aAgar Hierro de Kligler: En este medio, de color rojo, tenemos una cantidad limitante de
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glucosa y una cantidad 10 veces superior de lactosa. Además hay tiosulfato, peptonas y rojo
fenol (indicador de pH). Podemos observar diferentes pruebas bioquímicas: fermentación de
glucosa, fermentación de lactosa, producción de SH2 y producción de gas. El medio tiene una
parte recta y una zona en plano inclinado. Se siembra el fondo por picadura y luego se hacen
estrías en el plano inclinado. Se incuba a 37ºC durante 18-24 h (nunca se leen las reacciones
antes) y se leen los resultados de las pruebas. Pueden darse múltiples combinaciones de
resultados de las diferentes pruebas.
a) Fermentación de azúcares: Como hemos dicho hay una concentración de glucosa
limitante y diez veces inferior a la de lactosa. Las bacterias pueden utilizar los azúcares
por vía oxidativa (aceptor final de electrones es el oxígeno) y/o fermentativa (no
requiere oxígeno). Los productos finales de la oxidación son ácidos menos estables que
los de la fermentación. Pueden darse diversas situaciones en función de las capacidades
metabólicas del microorganismo en estudio.
1) Inicialmente la utilización de la glucosa se lleva a cabo de forma aerobia en la
zona de plano inclinado. Los productos finales serán ácidos que causan un
cambio del indicador de pH de color rojo a amarillo. Por lo tanto, a las 6 horas
aproximadamente, se ha acabado la glucosa y la zona del plano inclinado está de
color amarillo. ¿qué habrá pasado en el fondo del tubo, donde no hay
oxígeno?. Pues dependerá de si la bacteria es capaz o no de fermentar la
glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la glucosa, el fondo del tubo
quedará como estaba, o bien, si la bacteria ha utilizado las peptonas para crecer,
puede haberse producido una alcalinización (el rojo será un poco mas intenso).
Si la bacteria fermenta la glucosa, se originarán productos ácidos, mas estables
que los de la oxidación. A las 6 horas, estará el fondo del tubo de color amarillo.
2) La glucosa estaba en cantidad limitante. ¿qué pasa cuando se acaba la
glucosa? Podemos tener un microorganismo que fermenta la lactosa o un
microorganismo que no la fermenta. Si fermenta la lactosa se seguirán
produciendo compuestos ácidos, tanto en el fondo del tubo como en el plano
inclinado. Al cabo de 18-24 horas, tanto el fondo del tubo como el plano
inclinado estarán de color amarillo. Si no la fermenta, el microorganismo
empezará a utilizar las peptonas para poder seguir creciendo. La utilización de
las peptonas tiene lugar fundamentalmente por vía oxidativa (en el plano
inclinado) y además sus productos son alcalinos. Por tanto, se producirá un
20
cambio del pH en el plano inclinado, volviendo el rojo fenol a su color inicial.
En el fondo del tubo, si estaba de color amarillo por la fermentación de la
glucosa, seguirá de este color, dado que los productos ácidos eran mas estables
y en esta zona el metabolismo de las peptonas es mucho mas lento. Si la
bacteria no fermentaba la glucosa y el fondo estaba de color rojo a las 6 horas,
seguirá estando de color rojo a las 18-24 horas.
3) Resumiendo: Fondo amarillo y plano inclinado rojo, indica que la bacteria
fermenta la glucosa pero no la lactosa. Fondo amarillo y plano inclinado
amarillo, indica que la bacteria fermenta la glucosa y la lactosa. Fondo rojo (sin
cambios) y plano inclinado rojo (pero con crecimiento bacteriano), indica que la
bacteria no fermenta la glucosa ni la lactosa, pero crece en aerobiosis utilizando
las peptonas. Recordar que todas las Enterobacterias fermentan la glucosa.
¿Podría darse el caso de que la bacteria fermentara la lactosa pero no la glucosa? Piénsalo y razona la respuesta.
b) Producción de sulfídrico: Algunas bacterias son capaces de producir sulfídrico. El
sulfídrico es un gas, por lo que no lo podríamos observar. Pero reacciona con las sales
de hierro que hay en el medio y precipita en forma de puntos o zonas de color negro.
c) Producción de gas: La producción de gas se observa por la formación de burbujas,
muescas o incluso desplazamientos del medio.
aMovilidad-Indol: Es un medio semisólido, de color amarillo pálido, que sembramos por
picadura en profundidad. En este medio llevamos a cabo dos pruebas diferentes e
independientes entre si. Por un lado, intentamos determinar si el microorganismo es móvil,
observando al cabo de 24 h de incubación, si ha habido un desplazamiento a partir de la línea
de siembra. Por otro lado, analizamos la capacidad del microorganismo para desaminar el
triptófano produciendo indol. El indol es un producto incoloro. Para ponerlo de manifiesto,
añadimos el reactivo de Kovacs (que contiene p-amino-benzaldehido) . Si se forma un anillo de
color rojo, la reacción se considera positiva, es decir, la bacteria es capaz de producir indol a
partir del triptófano.
aCitrato: En este medio, de color verde, tenemos citrato sódico como única fuente de
carbono y sales de amonio como fuente de nitrógeno. El indicador de pH es el azul de
bromotimol, que a pH alcalino vira de verde (neutro) a azul. Sembramos por todo el plano
inclinado e incubamos 24 h a 37ºC. Los microorganismos capaces de crecer utilizando el citrato
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como única fuente de carbono, utilizarán las sales de amonio como fuente de nitrógeno,
provocando una alcalinización del medio. Por tanto, si el color del medio cambia de verde a
azul, la reacción será positiva, lo que significa que el microorganismo es capaz de crecer
utilizando el citrato como única fuente de carbono.
aFenilalanina desaminasa: En este medio, de color amarillo pálido, analizamos la
capacidad de la bacteria para desaminar la fenilalanina. Es decir, queremos saber si la bacteria
posee el enzima fenilalanina desaminasa. Sembramos el tubo por todo el plano inclinado e
incubamos 24 h a 37ºC. El producto de la desaminación de la fenilalanina es el ácido
fenilpirúvico, que es incoloro. Añadimos un reactivo, el cloruro férrico, que produce un cambio
de color, observándose color verde si la reacción es positiva, es decir, si la bacteria posee
fenilalanina desaminasa.
aVoges-Proskauer: El medio de Clark-Lubs es un caldo que contiene glucosa y permite
estudiar la vía metabólica por la que es atacado este azúcar. Algunas bacterias utilizan la
fermentación butilénglicólica ( también llamada butanodiólica) y producen butilénglicol, que
posteriormente se transforma en acetil-metil-carbinol (acetoína). Inoculamos los tubos y los
incubamos 24 horas a 37ºC. Para detectar la acetoína producida utilizamos la reacción de
Voges-Proskauer. Añadimos los reactivos, que en este caso son KOH y a-naftol. A los 20
minutos, si la reacción es positiva, se forma un anillo de color rojo intenso., lo que significa que
la bacteria lleva a cabo la fermentación butilén-glicólica. Si no se forma este anillo, la reacción
se considera negativa.
Una vez realizadas y leídas las pruebas, buscamos la identificación en la tabla 1. Con las
pruebas que realizaremos en las prácticas de laboratorio, no podemos llegar a identificar
géneros o especies; nos quedaremos a nivel de grupo. Recordar como ya hemos explicado, que
siempre hay que tener en cuenta las características iniciales de las que partimos (morfología,
tinción de gram, crecimiento en los diferentes medios de cultivo...). Si aplicamos estas pruebas
a microorganismos que no pertenezcan a los grupos descritos (Enterobacterias o Pseudomonas)
los resultados no serán coherentes.
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Tabla 1: Identificación bioquímica de Enterobacterias y Bacilos no fermentadores.
Escherichia Salmonella
Citrobacter
Arizona
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Proteus
Providencia
Morganella
Bacilos no
fermentadore
s (BNF)
SH2 - + - + / - -
Indol + - - + / - -
VP - - + - -
Citrato - + + d d
Fenilalanina
desaminasa
- - - + -
(+) = La mayoría de las cepas son positivas para esa prueba.
(-) = La mayoría de las cepas son negativas para esa prueba.
( + / - ) = muchas cepas positivas (alrededor del 80%) pero también hay bastantes negativas.
( d ) = Porcentaje similar de cepas positivas y negativas para esa prueba.
? IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS: Staphylococcus,
Streptococcus y Enterococcus.
Dentro de los cocos gram positivos, los géneros mas importantes en Microbiología
Clínica Veterinaria son Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus. Si tenemos cocos Gram
positivos en una muestra clínica, hacemos la prueba de la catalasa. Si es positiva, podemos
incluir a la bacteria en el género Staphylococcus. Si es negativa, probablemente se tratará de
Streptococcus o Enterococcus. Si se trataba de un Staphylococcus, llevamos a cabo a continuación la
prueba de la coagulasa. La coagulasa nos permite dividir el género Staphylococcus en dos grandes
grupos: coagulasa postivos y coagulasa negativos. En el primer grupo (coagulasa positivos) se
incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius y algunas cepas de Staphylococcus hyicus y
Staphylococcus delphinii. Entre los coagulasa negativos estarían Staphulococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus, etc.
aPrueba de la catalasa: La catalasa es un enzima que descompone el agua oxigenada en
agua mas oxígeno libre. Para la realización de esta prueba colocamos en un portaobjetos una
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gota de una suspensión de la colonia que queremos probar. Añadimos una gota de agua
oxigenada al 3%. Si la bacteria posee el enzima catalasa, desdoblará el agua oxigenada y se
liberará oxígeno, que se observa en forma de burbujas. Si no posee el enzima, no se formarán
burbujas. Cocos Gram positivos catalasa positivos en una muestra clínica, podemos considerar
que pertenecen al género Staphylococcus; si son catalasa negativos, pueden ser Streptococcus o
Enterococcus.
aPrueba de la coagulasa: Partimos de cocos Gram positivos catalasa positivos; En un tubo
en el que hay 1 mL de plasma de conejo añadimos una o dos colonias de la bacteria que
queremos probar. Si la bacteria posee coagulasa, se formará un coágulo firme que se adhiere a
las paredes del tubo. En caso contrario, el plasma permanece fluido. Conviene leer la reacción
a las 4 horas, porque a veces el coágulo puede autolisarse y no se observa a las 24 horas. En
general, se considera que los Staphylococcus coagulasa positivos son patógenos mientras que los
coagulasa negativos pueden comportarse como patógenos oportunistas.
* Sistemas miniaturizados de identificación:
Con estas pruebas no podemos llegar a la identificación a nivel de especie. Existen
diversos sistemas miniaturizados que combinan entre 10 y 50 pruebas bioquímicas y permiten
una identificación mas precisa. Estos paneles o galerías llevan diversos microtubos con una
pequeña cantidad de medio liofilizado. Se rehidrata al añadir una suspensión de la bacteria que
se quiere identificar en medio de cultivo o solución salina. Se incuban en las condiciones
adecuadas y se leen las reacciones.
Los sistemas miniaturizados reducen el consumo de medios y reactivos y el espacio de
almacenamiento e incubación que necesitan es menor. Además, al ser un sistema comercial
permite comparar resultados entre diferentes laboratorios. Cada sistema lleva pruebas
diferentes en función del tipo de microorganismo con el que estemos trabajando. Existen
bancos de datos computerizados que permiten la identificación automática.
? ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS: ANTIBIOGRAMA.
Además de identificar los microorganismos que pueden estar causando la infección,
debemos dar al clínico la información relativa a la sensibilidad de dichos microorganismos a los
antibióticos, para poder elegir los que van a usarse para el tratamiento. Mediante las diversas
técnicas de estudio de la sensibilidad a antibióticos, podemos determinar a que antibióticos es
sensible el microorganismo in vitro. Para elegir el tratamiento mas adecuado, habrá que tener en
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cuenta estos datos, pero también habrá que considerar criterios farmacológicos, clínicos, etc.
El método más usado para el estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos es
el antibiograma.
? Antibiograma:
El medio de cultivo de elección para llevar a cabo el antibiograma es el Agar Mueller-
Hinton. En algunos casos especiales pueden utilizarse otros medios, si la bacteria en estudio no
es capaz de crecer en Agar Mueller-Hinton.
El primer paso para realizar la técnica es preparar una suspensión de la bacteria en
solución salina estéril. Esta suspensión debe tener una turbidez concreta (igual a un patrón
determinado) para evitar resultados erróneos. A continuación, con un hisopo extendemos la
suspensión bacteriana por toda la superficie de la placa de Agar Mueller-Hinton, haciendo lo
que se llama una siembra en césped. El siguiente paso es añadir los antibióticos, que se
encuentran impregnados en discos de papel de filtro. Incubamos las placas en estufa 24 horas a
37ºC y a continuación leemos los resultados. El antibiótico habrá difundido desde los bordes
del disco, y la concentración de antibiótico irá siendo menos a medida que nos alejamos del
disco. Se formará un halo de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco.
El diámetro del halo depende de diversos factores, incluyendo la capacidad de difusión del
antibiótico y la sensibilidad del microorganismo.
Para saber si un microorganismo es sensible a un antibiótico debemos medir el diámetro
(en milímetros) del halo formado alrededor del disco de antibiótico y comparar el resultado con
una Tabla. Se consideran tres categorías: Sensible, moderadamente sensible y resistente. Si no
se forma halo de inhibición del crecimiento, la bacteria es resistente al antibiótico. Si se forma
halo, hay que medirlo y en función del diámetro del halo, del antibiótico y del microorganismo
que estemos estudiando veremos en la Tabla si la bacteria es sensible, moderadamente sensible
o resistente a dicho antibiótico.
? VALORACIÓN DE DESINFECTANTES:
El test en uso, cuyo prototipo es el de Kelsey-Maurer, intenta la comprobación de la
eficacia del desinfectante en las condiciones reales de uso (por ejemplo, la solución de
desinfectante en la que ponemos el instrumental en el quirófano). Comprueba si hay o no
crecimiento de colonias tras la siembra en placas de agar nutritivo (por ejemplo Agar Brain-
Heart) de una dilución 1/10 del producto en cuestión. Se toman dos placas de agar nutritivo y
se colocan 10 gotas de la dilución del desinfectante en cada placa. Se incuba una placa a
temperatura ambiente durante 7 días y la otra a 37ºC durante 72 horas. Si al final hay
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crecimiento bacteriano en 5 o mas de las gotas, se considera que el desinfectante no funciona
adecuadamente.
Incubar a temperatura ambiente 7 días
Incubar a 37ºC 72 horas
Si hay crecimiento en 5 gotas o menos, el desinfectante funciona adecuadamente.
Agar Brain-
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? DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRECTO. Pruebas serológicas.
Como ya habíamos dicho, podemos considerar dos tipos de diagnóstico microbiológico:
1) Directo, basado en la puesta de manifiesto de la presencia del microorganismo
(tinción y cultivo), que es lo que hemos explicado hasta ahora.
2) Indirecto, demostrar la "huella" que el microorganismo deja en el enfermo. Ej.
Técnicas inmunológicas o genéticas.
Existen numerosas pruebas que pueden utilizarse para demostrar la “huella” que el
microorganismo deja en el enfermo: aglutinación, ELISA, RIA, inmunofluorescencia, PCR,
etc.
* Técnicas inmunológicas:
Algunas pruebas serológicas permiten el diagnóstico de enfermedades infecciosas
mediante la detección de los anticuerpos frente a los antígenos de los microorganismos
infectantes. Para su realización es necesario tomar una muestra de sangre del paciente, para
obtener de ella el suero. Se extraen 5 o 10 mL de sangre y se pone en un tubo en el que se
separa el suero por centrifugación suave. Algunas técnicas no permiten diferenciar la clase de
inmunoglobulina que produce la reacción, mientras que otras permiten la diferenciación entre
IgM e IgG, con lo que podremos saber si la infección es reciente o se trata de una enfermedad
pasada.
En las prácticas de laboratorio vamos a realizar una prueba de aglutinación para la
detección de anticuerpos frente a bacterias del género Brucella.
? Técnica de Aglutinación para Brucella (Brucelloslide-Test®):
La brucelosis humana es una antropozoonosis ampliamente distribuida causada por
bacterias del género Brucella. El hombre es un huésped accidental; Brucella puede causar
infecciones en numerosas especies animales, tanto domésticos como salvajes.
El test que vamos a usar detecta anticuerpos específicos (aglutininas) frente a Brucella
melitensis, abortus ovis y suis en el suero. Para poder detectarlos, ponemos en un portaobjetos una
gota del reactivo consistente en una suspensión concentrada de Brucella inactivada por calor y
fenol y coloreada con Rosa de Bengala. Añadimos una gota del suero problema y mezclamos
suavemente. La aparición de grumos evidentes indica una reacción positiva. La lectura de
resultados debe realizarse antes de 4 minutos, ya que luego pueden aparecer falsos positivos.
También pueden aparecer falsos positivos por reacciones cruzadas en pacientes vacunados de
cólera o infectados con Yersinia o Francisella tularensis. Siempre hay que utilizar un suero control
positivo para garantizar los resultados.
Para cuantificar las aglutininas hacemos la aglutinación con distintas diluciones del
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suero. Cuanto mas grande es la dilución a la que sigue habiendo aglutinación, mayor cantidad
de anticuerpos debe haber en el suero.
Esta prueba permite detectar y cuantificar anticuerpos, pero no diferenciar la clase de
inmunoglobulina que produce la reacción, por lo que no podemos saber si se trata de una
infección activa (IgM) o ya pasada (IgG). Para poder diferenciarlo, usando esta técnica,
necesitamos dos muestras del suero del paciente para poder ver las variaciones en los títulos
de anticuerpos (seroconversión). Tomamos una muestra en una fecha dada y la comparamos
con otra que tomamos dos o tres semanas después. Se considerará que existe enfermedad
actual cuando el título (cantidad) de anticuerpos de la segunda muestra se incrementa como
mínimo en 4 veces con respecto a la primera. Si el título de anticuerpos es el mismo en las dos
muestras de suero, se considerará que se trata de una infección ya pasada. Las dos muestras de
suero deben procesarse conjuntamente para evitar diferencias metodológicas.
En la actualidad existen diversas técnicas que permiten conocer la cantidad de
anticuerpos y su clase (IgM, IgG). Esto permite un diagnóstico mas rápido.