MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Índice Introducción 1

Introducción 2

La producción de vino como modelo de un proceso de fermentación industrial

o Presentación

o Hongos y las levaduras

o Crecimiento de microorganismos

o Factores ambientales que afectan al crecimiento: temperatura

o T

o R

o Actividad de agua

o  pH

o  Potencial redox y concentración de oxígeno

o Radiación

o Presión hidrostática

o  Control de microorganismos

o Metabolismo microbiano: introducción

o Catabolismo de la glucosa

o Respiración y fermentación

o Expresión de la información genética

Tratamiento de Residuos sólidos urbanos

Tratamiento de aguas residuales

Introducción a la Microbiología Ambiental1.- Introducción.

A la hora de desarrollar un proceso industrial destinado a la producción de un metabolito secundario o de una enzima de origen microbiano, hay que considerar varios aspectos: (1º) el aislamiento del microorganismos de interés, la detección de los metabolitos secundarios deseados y la conservación del microorganismo aislado para la producción industrial estable, (2º) el diseño del proceso de fermentación, y (3º) la mejora de las cepas aisladas para incrementar el rendimiento.

Todos los organismos producen metabolitos primarios (aquellos que intervienen en las rutas centrales del metabolismo y que son esenciales para la supervivencia y, en general, idénticos en todo tipo de organismos) y secundarios. Estos últimos son específicos de cada tipo de organismo y están involucrados en el establecimiento de las relaciones ecológicas del organismo productor.

2.- Aislamiento y manipulación de cultivos de interés.

2.1.- Aislamiento de cultivos

El primer paso en el proceso industrial es el aislamiento de un microorganismo que produzca un metabolito secundario con interés industrial. La tarea de aislamiento de microorganismos hay que plantearla considerando las características del producto y del proceso que se va a realizar y las características ecológicas de la muestra que se toma. Lo primero nos indicará dónde tomar las muestras y lo segundo cómo diseñar los medios de aislamiento para los microorganismos presentes en dichas muestras.

El estudio ecológico de las características del microorganismo de interés permitirá hacer una búsqueda sistemática en los diferentes nichos de un ecosistema, lo que proporcionará un gran número de microorganismos de salida para el proceso de detección.

Un esquema de estudio ecológico previo a la toma de muestras comprendería los siguientes pasos: (1º) lista de grupos de microorganismos que van a ser aislados (los medios y técnicas de cultivo son diferentes para bacterias y hongos, por ejemplo); (2º) descripción del ecosistema o hábitat en el que se van a tomar las muestras, (3º) agrupación de las muestras según el material de origen (suelo y horizontes del suelo, agua, material vegetal, etc.); (4º) lista de los parámetros ambientales a considerar (pH, salinidad, potencial redox, temperatura, etc.); (5º) lista de los substratos naturales disponibles por los microorganismos autóctonos en su ambiente natural, (6º) diseño de las técnicas de aislamiento usando la información de los puntos anteriores, (7º) evaluación de las técnicas de aislamiento usando patrones internos como control, y (9º) utilización de procedimientos de enriquecimiento para los microorganismos que puedan ser de interés.

1.2.- Detección de metabolitos secundarios:

Una vez recogidas las muestras hay que desarrollar el procedimiento de búsqueda y detección (screening en inglés) del metabolito secundario de interés. Históricamente la búsqueda se ha dirigido hacia la producción de antibióticos; pero actualmente se ha ampliado el campo a otros productos terapéuticos y, en general, puede desarrollarse cualquier búsqueda para la que se disponga de un sistema de detección suficientemente correcto.

En cualquier caso, haz que considerar dos cualidades importantes a la hora de diseñar un proceso de detección: (1º) la selectividad: se ha de poder detectar un compuesto de interés mezclado con un número muy elevado de compuestos que no son interesantes; y, (2º), la sensibilidad: la concentración del metabolito secundario de interés puede ser extremadamente baja.

La búsqueda puede hacerse en cultivos sólidos o en cultivos líquidos. Sin embargo, puesto que la producción ha de realizarse en cultivos líquidos y puesto que los metabolitos secundarios de cultivos sólidos son diferentes de los de cultivos líquidos, es conveniente realizar la detección, siempre que sea posible, en medios de cultivo líquido.

Las pruebas de actividad se pueden realzar sobre diferentes tipos de organismos (animales vivos, plantas, bacterias, hongos), sobre cultivos celulares o sobre preparaciones subcelulares. Para cada tipo de búsqueda hay que diseñar un procedimiento de detección adecuado.

1.3.- Desarrollo del inóculo:

Tanto en la primera producción industrial como en las siguientes es necesario utilizar grandes volúmenes de cultivo por lo que la preparación de un inóculo adecuado es una tarea de importancia capital. En un proceso industrial puede ser necesario realizar incubaciones de gran volumen (>160.000 litros) para las que son necesarios también grandes inóculos (>1.000 litros).

Para repetir rutinariamente la operación de producción es necesario utilizar cultivos almacenados del microorganismo de interés (cultivos «stock») y a partir de ellos hay que desarrollar el inóculo intentando: (1º) minimizar la pérdida de viabilidad durante el proceso de recuperación del microorganismo, (2º) obtener una copia genéticamente idéntica a la que se había almacenado (esto es: evitar mutaciones y contaminaciones), (3º) incrementar la biomasa del cultivo y (4º) cultivar el microorganismo hasta un estado fisiológico adecuado para lograr la mayor eficiencia en la fase final de producción.

Al desarrollar un inóculo es necesario conseguir una alta velocidad de crecimiento y de concentración de biomasa al inicio del proceso de fermentación.

1.4.- Mejora de las técnicas de cultivo:

Desde las primeras etapas del desarrollo de un proceso industriales hace necesario mejorar el medio de cultivo del microorganismo para conseguir un mayor rendimiento en la producción del metabolito de interés, reducir la presencia de otros productos que puedan dificultar el aislamiento del compuesto deseado y reducir los costes de producción. Puesto que el número de variables químicas y físicas independientes que afectan el crecimiento del microorganismo es muy alto, su optimización mediante el análisis sistemático de cada una de ellas se hace rápidamente

imposible. Para realizar el estudio cuando hay más de cinco variables independientes se recomienda utilizar una aproximación de análisis multivariable (método de Packett-Burman) que consiste en agrupar varias variables para decidir sobre el incremento en rendimiento debido al cambio de un grupo de ellas.

1.5.- Conservación de los microorganismos importantes:

La conservación de microorganismo de interés industrial es una técnica básica en todo el proceso. La conservación ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente productivas durante largos periodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotípicos, especialmente en las características relacionadas con la producción de los metabolitos secundarios de interés.

Se han desarrollado varias técnicas de conservación; (1) el subcultivo de células activas, (2) la desecación de cultivos, (3) la liofilización, (4) la congelación mecánica (-20 ó -80ºC) y (5) la ultracongelación en vapor de nitrógeno líquido (-156ºC) o en nitrógeno líquido (-196ºC). Generalmente, las tasas de supervivencia son más elevadas después de la conservación en nitrógeno líquido que tras cualquiera de los otros métodos. En los casos de conservación por congelación, es necesario añadir a los cultivos agentes crioprotectores (glicerol, Di-Metil-SulfOxido, DMSO).

MICROBIOLOGÍA APLICADA

1.- Introducción

     La Microbiología Industrial trata de utilizar microorganismos para que produzcan compuestos o realicen funciones que sean útiles desde un punto de vista aplicado. Comprende el cultivo de microorganismos para su propia producción como alimento y para la producción y transformación de fármacos, alimentos, disolventes orgánicos, etc.

     Para poder utilizar microorganismos en procesos aplicados debemos conocer los principios básicos del funcionamiento celular y del cultivo controlado de microorganismos. Para cada producto o transformación concreta será necesario, además, determinar qué microorganismo es el más adecuado para llevarlo a cabo.

     En este capítulo revisaremos algunos aspectos básicos para el estudio de los procesos de producción que estudiaremos en capítulos siguientes.

2.- Tipos de organización celular

     Los seres vivos pueden agruparse en tres grandes grupos que se separaron en épocas evolutivas muy antiguas: bacterias, arqueas y eucarias. Bacterias y arqueas presentan un tipo de organización celular conocida como procariótica porque en ellas el material genético no está separado del resto del citoplasma por una membrana nuclear (son células sin núcleo), mientras que los organismos pertenecientes al grupo de eucaria presentan un núcleo diferenciado del resto de la célula y, por tanto, su organización celular se denomina eucariótica.

     La teoría evolutiva establece que todos los seres vivos (procarióticos y eucarióticos) derivan de un antepasado común cuyos descendientes fueron divergiendo a lo largo de la evolución. Mediante técnicas de biología molecular ha sido posible ir estableciendo las relaciones familiares entre los diferentes grupos de organismos de forma que pueden representarse en esquemas que relacionan los grupos entre sí. Estos esquemas se conocen generalmente con el nombre de árboles universales de la vida.

     Los organismos más relevantes desde el punto de vista industrial y aplicado pertenecen al grupo de bacterias y eucarias. Dentro de las bacterias se encuentran la mayoría de los organismos patógenos, un gran número de productores de substancias de interés aplicado (antibióticos, por ejemplo) y productores y agentes alterantes de alimentos.

Dentro de los eucarias nos encontramos los animales, plantas y hongos (las levaduras unicelulares y los hongos filamentosos).

Hay algunas arqueas que participan en procesos de interés aplicado (organismos metanógenos, por ejemplo). Aunque su número es reducido, probablemente se irá incrementando en el futuro conforme se profundice en el estudio de este tipo de microorganismos.

En esta presentación hemos dejado de un lado los virus por ser estructuras acelulares que sólo desarrollan actividad biológica cuando se encuentran en el interior de una célula a la que infectan y por su escasa relevancia en microbiología industrial (dejando a un lado su efecto negativo sobre ciertos cultivos industriales).

El estudio de la organización interna de las células procarióticas y eucarióticas cae fuera de las posibilidades de este documento y los conceptos básicos deben ser repasados por los alumnos.

3.- Estructura de la pared celular

La estructura de la pared celular de las bacterias permite distinguir dos grandes grupos: las bacterias Grampositivas (cuya pared celular contiene una sola membrana, una gruesa capa de peptidoglicano y ácidos teicoicos, Fig. 1A) y las bacterias Gram-negativas (cuya pared celular tiene dos membranas ligeramente diferentes que delimitan un espacio periplásmico en el que se encuentra una delgada capa de peptidoglicano, y que presentan lipopolisacáridos en el exterior, Fig. 1B)

   Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas son responsables de diferente sensibilidad a antibióticos y de diferencias en su capacidad de exportar proteínas al exterior de la célula.

   Las bacterias entéricas son ejemplos de Gram-negativas mientras que las bacterias lácticas son ejemplos de Gram-positivas

Las células eucarióticas pueden tener pared que recubra su membrana. Esto ocurre en los hongos y en las plantas. Sin embargo, la estructura de esta pared es diferente a la de las bacterias. Una diferencia esencial es que los eucariontes no tienen peptidoglicano en su pared celular. Las enzimas que sintetizan el peptidoglicano son dianas específicas para antibióticos activos frente a bacterias pero son inactivos frente a eucarias (por ejemplo, las penicilinas y cefalosporinas).

4.- Membranas biológicas

Las membranas biológicas son unas estructuras esenciales para el mantenimiento de la integridad celular y para el correcto funcionamiento de los procesos biológicos. Desempeñan dos funciones esenciales: (1) son barreras de permeabilidad que separan diferentes compartimentos celulares, y

(2) son un soporte que permite mantener ordenados los componentes celulares para que puedan funcionar correctamente.

Las membranas biológicas son impermeables al agua, compuestos polares y compuestos cargados. Para que este tipo de compuestos entre o salga de la célula o de los compartimentos intracelulares son necesarios canales de paso específicos. Las moléculas apolares, sin embargo, sí pueden atravesar las membranas biológicas.

Las barreras de permeabilidad permiten mantener concentraciones diferentes de iones o moléculas a ambos lados de una membrana biológica. Esta diferencia de concentraciones (que se suele denominar gradiente de concentración) da lugar a la existencia de una energía potencial que puede ser transformada en la energía química necesaria para el funcionamiento de los procesos biológicos.

Por tanto, los agentes químicos que destruyen las membranas biológicas son letales para las células ya que destruyen los gradientes que son la base de muchos procesos biológicos y desordenan los componentes celulares al destruir el soporte en el que se encuentran.

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL III

El Vino

1.- Introducción

En este capítulo vamos a utilizar la producción de vino como esquema para estudiar los principios básicos de la microbiología industrial y de la biología de microorganismos. Más adelante estudiaremos otros procesos de producción industrial con un mayor detalle.

La microbiología industrial está dedicada a la utilización comercial de microorganismos e incluye procesos que tienen gran importancia económica, ambiental y social.

Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentación en microbiología industrial para describir los procesos de cultivo de microorganismos con propósitos industriales. Sin embargo, no hay que confundir esta utilización del térmico con el proceso bioquímico de fermentación consistente en la regeneración del poder reductor (NADH) por un procedimiento no oxidativo (estos procesos se estudiarán más adelante en el curso). La fermentación que tiene lugar en la producción del vino, en este sentido, comprende ambos significados: por un lado, se trata bioquímicamente de un proceso de fermentación (producción de alcohol a partir de glucosa en condiciones anaerobias) y es una fermentación industrial en el sentido de que se trata de un proceso industrial llevado a cabo por microorganismos.

El desarrollo de una fermentación industrial incluye dos tipos de procesos denominados, por sus nombres en inglés, procesos upstream y procesos downstream. Los procesos upstream comprenden la selección y preparación del microorganismo, la preparación del medio de cultivo y de las condiciones de fermentación (cultivo). Los procesos downstream incluyen la purificación del producto y el tratamiento de los residuos de la fermentación.

En el proceso de fermentación del mosto de uva para producir vino, podemos distinguir los procesos upstream de la selección y preparación de cepas de levadura, tratamiento del mosto y acondicionamiento de loas condiciones de fermentación. Los procesos downstream comprenden, en este caso, el tratamiento del vino para su clarificación y el de los residuos del proceso.

Los productos fabricados por fermentaciones industriales pueden agruparse grosso modo en dos clases:

(1) los productos de gran volumen y bajo valor (en este grupo se incluyen los productos alimenticios, bebidas, aditivos alimentarios y algunos productos químicos producidos por fermentación) y

(2) los productos de bajo volumen y alto valor (los fármacos, por ejemplo).

Por otro lado, hay que señalar que tienen origen en fermentaciones industriales un gran número de productos de uso cotidiano que pertenecen a diferentes grupos:

(1) alimentos (derivados lácteos y de vegetales fermentados), bebidas (vino, cerveza, etc.), aditivos alimentarios (vinagre, ácido cítrico, carotenos, etc.).

(2) productos farmacéuticos: antibióticos ß-lactámicos (penicilinas y cefalosporinas), antibióticos aminoglicósidos y tetraciclinas; compuestos antitumorales y otros fármacos (lovastatina, por ejemplo, utilizada para controlar la producción de colesterol).

(3) Enzimas microbianas tales como proteasas, amilasas, etc. (4) Productos químicos tales como alcoholes, polisacáridos, disolventes (acetona),

lípidos, productos base para la producción de plásticos, etc. (5) Productos recombinantes diseñados por ingeniería genética.

Además de estas utilidades, los microorganismos se usan industrialmente en ciertos procesos de microbiología ambiental tales como el tratamiento de residuos sólidos y líquidos y en biorremediación. Estos aspectos serán tratados más adelante en este curso.

2.- Producción de vino     Se trata de una fermentación para la fabricación de un producto de gran volumen y bajo valor añadido. En el proceso, un hongo (Saccharomyces cerevisiae) crece utilizando el azúcar (glucosa) presente en el mosto de uva para producir alcohol. El proceso puede esquematizarse como sigue:     Vamos a utilizar el estudio de la fermentación del vino para revisar los factores que intervienen en un proceso industrial estudiando en los próximos apartados

El microorganismo (hongos) El crecimiento de microorganismos El medio de cultivo El proceso de fermentación

2.1.- El microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Los hongos

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los hongos son organismos eucarióticos (sus células tienen una organización interna en orgánulos membranosos) quimioheterótrofos. A continuación vamos a explicar el concepto de quimioheterótrofo y a describir los principales grupos de hongos.

Los organismos necesitan carbono y energía para poder crecer. En la naturaleza las fuentes de energía pueden ser químicas (energía presente en los enlaces de compuestos químicos) o lumínica (energía de la luz que se transforma en energía química).

Por otra parte, las reaccines de óxido-reducción que tienen lugar en los seres vivos requieren donadores de electrones que pueden ser orgánicos o inorgánicos. Por último, el carbono puede encontrarse de dos formas, como carbono orgánico y como carbono inorgánico (CO2).

La combinación de estas posibilidades da lugar a las diferentes categorías de microorganismos en función de su nutrición:

Tipo de nutrición Fuente de energíaFuente de electrones

Fuente de carbono

Ejemplo

Quimiotrofos química - - -

Fototrofo luz - - -

Organotrofo - comp.orgánico - -

Litotrofo -comp. inorgánico - -

Autotrofo - - inorgánico-

Heterotrofo - - orgánico-

Quimioorgano(hetero)trofo química comp.orgánico orgánico bacterias, hongos, animales

Quimiolito(auto)trofo química comp. inorgánico inorgánicoalgunas bacterias

Fotolito(auto)trofo luz comp. inorgánico inorgánicobacterias, plantas, algas

Fotoorgano(hetero)trofo luz comp.orgánico orgánicoalgunas bacterias, algas

Como puede verse, las bacterias presentan una gran versatilidad metabólica. Mucho mayor que la que presentan plantas, animales u hongos. En cualquier caso, los principales microorganismos de interés aplicado industrial pertenecen al grupo de los quimioheterótrofos.

El microorganismo responsable de la fermentación alcohólica de la producción del vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos unicelulares, a diferencia de otro tipo de hongos a los que conocemos como filamentosos. Sin embargo, biológicamente, ambos tipos de hongos (unicelulares o filamentosos) son similares. Las levaduras se multiplican en los medios de cultivo como células aisladas individuales que se dividen y, de esta forma, aumentan su número.

En el caso de los hongos filamentoso, sin embargo, las células se encuentran contenidas dentro de unos tubos formados por la pared celular. Estos tubos se denominan hifas y van creciendo por sus puntas (crecimiento apical) y ramificándose para formar la colonia que denominamos micelio. Por consiguiente, los hongos filamentosos tienen un crecimiento micelial, mientras que las levaduras no.

Es importante tener en cuenta que en el crecimiento micelial, sólo el borde de la colonia (las puntas de las hifas) crece. La parte central de una colonia micelial está formada por células viejas mientras que el borde de la colonia está formado por células jóvenes. Las células jóvenes se

encuentran en trofofase (fase de alimentación y crecimiento), mientras que las células viejas se encuentran en idiofase (fase de diferenciación). Cuando observamos una colonia micelial (por ejemplo una colonia de moho sobre una naranja), el crecimiento de la colonia se produce sólo por el borde de la parte mohosa y en la parte central de la colonia se produce la diferenciación que dará lugar a la formación de las esporas y a la aparición del color verdoso característico.

Las células jóvenes desarrollan la mayoría de la actividad metabólica del hongo, liberando enzimas al medio y abosorbiendo los nutrientes. La zona central, por otra parte, tiene células en las que se acumulan las substancias de reserva que pueden ser necesarias para que el micelio colonice nuevas zonas pobres en nutrientes (por ejemplo, cuando el moho de una fruta comienza a extenderse por la fuente de plástico en la que se encuentra) o cuando el hongo se diferencia (por ejemplo, cuando produce esporas o cuerpos fructíferos).

El crecimiento de un hongo como levadura o como hongo filamentoso está, en algunas ocasiones, regulado por condiciones ambientales, de forma que un mismo hongo puede crecer en ciertas situaciones como levadura y en otras como hongo filamentoso (por ejemplo, los hongos patógenos ustilago maydis y Candida albicans).

Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la pared celular de los hongos (levaduras y filamentosos) es diferente de la de las bacterias y de la de las plantas. La pared celular de bacterias está formada por peptidoglicano, mientras que la de hongos por quitina y polisacáridos (glcanos) y la de las plantas por celulosa.

Por último hay que recordar que como organismos eucarióticos que son, los hongos tienen su núcleo diferenciado en el interior de la célula, tienen varios cromosomas, la división celular se produce por mitosis (proceso que no ocurre en bacterias) y la producción de células sexuales por meiosis.

La clasificación de los hongos es muy compleja y aquí vamos a ver sólo lo más simple para poder seguir el curso. La clasificación se basa en dos criterios: (1) si las hifas están tabicadas (divididas en células) o no y (2) dentro de los hongos con hifas tabicadas, en la organización de las esporas sexuales.

Los hongos con hifas no tabicadas se denominan Ficomicetos (esta nomenclatura y clsificación, repito, puede encontrarse de forma diferente en distintos libros). Los ficomicetos son hongos inferiores (en algunos casos se discute si son hongos o no) y viven en ambientes acuosos. Destacan los géneros Mucor que participa en la producción de algunos tipos de alimentos y Phytophthora alguno de cuyos miembros son patógenos vegetales (P. infestans, por ejemplo).

Los hongos superiores se pueden agrupar en tres clases o Ascomicetos. En ellos las esporas sexuales (ascosporas) se encuentran en el

interior de una bolsa o asca. Son ejemplos de ascomicetos la levadura S. cerevissiae, los hongos filamentosos Neurospora, y hongos comestibles como las trufas. Son el grupo de hongos más abundante.

o Basidiomicetos. En ellos las esporas sexuales (basidiosporas) se encuentran en el exterior de unas estructuras com forma de maza denominadas basidios.

Pertenecen a este grupo levaduras como el patógeno humano Cryptococcus neoformans que produce meningitis en pacientes inmunodeprimidos, el patógeno vegetal Ustilago maydis que produce tumores en los granos del maíz, hongos superiores con cuerpos fructiferos complejos (setas) tales como el champiñón (Agaricus bisporus) y la seta de chopo (Pleurotus ostreatus), etc.

o Deuteromicetos. Tradicionalmente se conocían como hongos imperfectos porque en ellos no se había podido encontrar la forma sexual y, por consiguiente, no se sabe si producen ascosporas o basidiosporas. Actualmente y mediante el uso de técnicas de análisis del ADN se ha podido determinar que la mayoría de ellos pertenecen al grupo de los ascomicetos y, por alguna razón, han perdido la posibilidad de realizar la reproducción sexual. Alguno de los hongos más importantes en microbiología industrial son deuteromicetos: Penicillium productor de la penicilina, Aspergillus productor de ácido cítrico y de lovastatina; también se encuentran en este grupo hongos patógenos vegetales como Trichoderma y Verticillium, y hongos patógenos oportunistas animales tales como Candida albicans

2.2.- Crecimiento celular

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen aislados. Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias.

Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc.

Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generación y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al número de células inicial, y g al número de generaciones transcurridas, el número de células final (N) será:

Llamando T al tiempo de generación y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuación anterior puede transformarse en la siguiente:

Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es mejor transformarlas en algo más simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta:

Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generación T es muy grande, el crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si T es pequeño el crecimiento será rápido.

En un crecimiento equilibrado, todos los parámetros de crecimiento evolucionan en paralelo. Esto es: el incremento en el número de células, en la biomasa de cultivo y en la acumulación de metabolitos primarios, proteínas, ácidos nucleicos etc., es paralelo. Por tanto, en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:

Esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo así como la probabilidad de que una célula se divida en un tiempo determinado.

Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente función exponencial:

la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. Comparando esta ecuación con  la similar presentada más arriba, podemos concluir que µ = ln2/T y, por consiguiente, que T = ln2/µ. Es decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del  incremento en el número de células, biomasa, etc.

El gráfico  representa la variación de la biomasa (o número de células, etc.) de un cultivo (línea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentración (línea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Esta relación de proporcionalidad puede expresarse de la forma siguiente:

Donde dS indica la variación de la concentración del  substrato. Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilización del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido:

El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil antropomórfico: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo) y varía también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos serán revisados más adelante).

Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total 8gramos de células, por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 505 de la masa celular corresponde a carbono).

Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la fórmula que relaciona la variación de biomasa con la de substrato, llegamos a la definición de un nuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo.

  

La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la velocidad de crecimiento (µ). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor será la tasa de crecimiento.

 Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimientos más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta correlación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur.

Por último, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afecta al valor de µ; pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expresión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente:

   En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el microorganismo, de la concentración de substrato y de un valor Ks que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima.

La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato.

2.3.- Fases del crecimiento de un cultivo

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y podríamos traducirlo por cutivo discontinuo por contraposición con el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:

   Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la que el microorganismo se adpata a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cinética explicamos en la página anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sinio que la aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.

 En la fase de mmuerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero ¿qué es un microorganismo vivo en términos microbiológicos?. Consideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen porqué estar metabólicamente inactivos.

2.4.- Medida del crecimiento microbiano

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los cuales presentaré a continuación. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto.

En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos. Una información más completa puede encontrarse en la conexión Métodos de recuento.

Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partículas). Ls métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso. Entre los métodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar:

1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fase. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas.

2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de estos sistemas es sencilla (método de empleo) y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del cultivo.

3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.

4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro.

5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.

6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida indirecta detecta únicamente las células vivas.

Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una operación on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran

volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminación.

Antes de cerrar este apartado hay que señalar que en la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofia (inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

2.5.- Factores ambientales que afectan al crecimiento de microorganismos

Una vez visto cómo podemos seguir la evolución de un cultivo, vamos a recordar que en un proceso de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan manteniendo unas proporciones constantes. Por tanto, la medida (seguimiento) de cualquiera de los factores nos permite seguir la evolución de los otros. A continuación vamos a revisar los que son estrictamente ambientales y más adelante revisaremos los relacionados con los nutrientes del cultivo. Entre los factores ambientales destacan los siguientes:

2.5.1 Temperatura

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento (μ) en función de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que (μ) es máxima (para las condiciones de concentración de substrato en que se trabaja, (ver la discusión anterior al respecto). Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente (µ → 0) y se produce la muerte celular.

El incremento de µ con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar.

La ausencia de crecimiento (µ=0) a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitación del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas.

Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué comenzar a morir. Sin embargo, cuando la

temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente (como veremos más adelante) y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.

Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima.

Tipo de microorganismo Temp. mínima Temp. óptima Temp. máxima

Psicrófilo -5  + 5 12 - 15 15 - 20

Psicrótrofo -5  + 5 25 - 30 30 - 35

Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47

Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90

Además de los indicados existen organismos hipertermófilos que pueden crecer a temperaturas cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión. Son microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen aplicaciones actuales en agronomía o en microbiología industrial.

Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC).

Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas derivados de las altas temperaturas y controlar la de los fermentadores para evitar la esterilización de los cultivos. Estas altas temperaturas, por otro lado, tienen interés aplicado en el campo de la termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación en los que el incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos mesófilos patógenos presentes.

Importancia de los microorganismos de ambientes extremos

La mayor parte de los microorganismos de importancia aplicada tanto en microbiología industrial como alimentaria son mesófilos, psicrófilos o psicrótrofos. En los procesos de compostaje, el papel de los termófilos es importante, y también hay que considerar la presencia de esporas termoresistentes en el estudio de los tratamientos térmicos de termodestrucción de microorganismos en alimentos.

Sin embargo, es creciente el número de productos que se producen partiendo de microorganismos termófilos porque producen proteínas termorresistentes que tienen gran utilidad en procesos aplicados. Quizá el mejor ejemplo de esto es la ADN polimerasa Taq obtenida a partir de la eubacteria termófila Thermus aquaticus. Esta enzima permite sintetizar in vitro ADN a alata temperatura lo que ha sido esencial para el desarrollo de la tecnología de la

reacción en cadena de la polimerasa (conocida por sus iniciales en inglés: PCR) lo cual ha supuesto un avance en la biología molecular, el diagnóstico y la detección de microorganismos en los ambientes más variados.

Aplicación de la temperatura en la termodestrucción de microorganismos

Un aspecto aplicado muy importante de la temperatura es su utilización para la esterilización por calor. Es necesario esterilizar ciertos ambientes o instrumentos, o eliminar de ellos una parte muy importante de su carga microbiana. Esto se puede hacer con facilidad y de forma controlada mediante tratamientos términos. En esta sección veremos cómo se puede predecir cómno será la evolución de las poblaciones microbianas como consecuencia de su exposición a latas temperaturas. Habíamos visto en su momento que durante la fase de muerte, la desaparición de microorganismos seguía la cinética descrita en la ecuación siguiente:

La fase de muerte también sigue una cinética exponencial y puede ser sometida a un tratamiento matemático similar al usado para el tratamiento matemático del crecimiento. Si representamos la variación del logaritmo del número de células supervivientes a un tratamiento térmico realizado a una temperatura dada en función del tiempo de tratamiento, se obtiene una gráfica como la siguiente:

El descenso del logaritmo de supervivientes es lineal con el tiempo. La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción. Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N0 como el número de células al inicio del tratamiento y Nx el número de células supervivientes después de un tratamiento de x minutos a una temperatura t, el tiempo de termodestrucción se calcula de la siguiente manera:

Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas. Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica tal y como se indica en la siguiente gráfica:

De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial. La fórmulaincluida en la gráfica permite calcular el valor z cuando conocemos el incremeto de temperatura (t2-t1) y los respectivos valores D.

Los valores d y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetaticas de los mismos microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z.

Otro valor que tiene gran importancia aplicada en el estudio de la microbiología de la termodestrucción es el parámetro F que corresponde al tiempo equivalente (medido en minutos de tratamiento a 250ºF, o 121.1ºC) a todo el calor recibido considerando su capacidad de destruir microorganismos. Al valor de la integral del calor recibido se la denomina F0. Cuando consideramos que el calentamiento es un proceso instantáneo, se puede calcular usando la siguiente fórmula:

Es muy importante saber trabajar correctamente con los conceptos anteriores. Otros tratamientos tecnológicos para destruir microorganismos (radiación, por ejemplo) son susceptibles de tratamientos matemáticos similares a los descritos en esta sección.

Consideraciones sobre las bajas temperaturas

Los microorganismos se comportan a bajas temperaturas de forma diferente según se trate de condiciones de refrigeración (0ºC-8ºC) o de congelaci´0on (por debajo de -20ºC).

En condiciones de refrigeración los microorganismos mesófilos y termófilos detienen su crecimiento (µ=0) y se mantienen durante largo tiempo sin morir. Los psicrófilos y psicrótrofos pueden crecer en estas condiciones y llegar a producir poblaciones importantes (esta es una causa de deterioro de alimentos conservados en refrigeración).

En condiciones de congelación, la formación de cristales en el interior de las células produce unas altas mortalidades que reducen el tamaño de la población. En el momento de la congelación se produce la muerte rápida de muchos microorganismos y, a tiempos más largos, la tasa de muerte se reduce aunque el número de viables sigue disminuyendo. En esta segunda fase, la mortalidad es más rápida cuando la temperatura de congelación es más alta (más próxima a valores de -20ºC) que cuando es menor (valores de -80ºC).

La tolerancia a la congelación de diferentes microorganismos puede variar. No se puede considerar la congelación un procedimiento de esterilización sino sólo (en el caso de microbiología de alimentos) un procedimiento de conservación. Se pueden conservar largo tiempo cultivos de microorganismos o de células eucarióticas congelados en medios que contengan agentes crioprotectores como el glicerol.

2.5.2 Actividad de agua

Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P)  y la presión de vapor de agua del agua pura (P0):

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de agua mucho

menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR) de la siguiente forma:

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada.

La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad del agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes:

Bactérias aw >0.90,

Levaduras aw >0.85,

Hongos filamentosos aw >0.80.

Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua muchos menores (mucos más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.

Existen microorganismos extremadamente tolerantes a las actividades muy bajas (toleran valores de aw=0.60). Algunos de estos microorganismos pertenecen al grupo de las Arqueas y pueden observarse en las salinas de desecación formando manchas coloreadas en los depósitos de sal.

La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

2.5.3 Potencial del Ion Hidrogeno (pH)

Es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.

Cada tipo de microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango muere.

Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0

El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6.0 a 7.0.

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos industriales para evitar que un descenso excesivo pueda producir la autoesterilización del cultivo.

Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante.

La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos.En resumen, es necesario controlar el pH de los cultivos y de las fermentaciones industriales para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metabolismo correcto del microorganismo con el que se trabaja.

Por otro lado, el efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).

2.5.4. Potencial REDOX y Concentración de oxígeno

Este es otro factor determinante del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial Redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial Redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno [O2].

Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables como veremos más adelante. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento.

En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando no lo necesita (existen anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios).

Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran" nitratos (NO3

-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados.

Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxígeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas, por ejemplo).

Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento (Ys) de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos, por ejemplo las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando.

La levadura Saccharomyces cerevisiae desarrolla ambos tipos de metabolismo; pero sólo produce etanol en condiciones de crecimiento anaerobio (fermentativo). Por consiguiente, y en general, al preparar un cultivo industrial debemos saber:

(1) En qué condiciones metabólicas se produce lo que nos interesa fabricar y

(2) Controlar la fermentación industrial para que se produzca en esas condiciones deseadas.

En el curso de ciertas reacciones metabólicas Redox, se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas de súperóxido) que pueden dañar las proteínas, membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Estas formas reactivas son un subproducto del metabolismo respirativo (algo así como el precio que hay que pagar por ser más eficientes y tener un (Ys) mayor. Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes:

Los organismos aerobios tienen SOD y muchos de ellos catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno.

2.5.5 Radiación

Las radiaciones ultravioleta (UV), Rayos X y radiación Gamma (γ) producen efectos esterilizantes (destrucción de microorganismos) al alterar las proteínas, membranas, ácidos nucleicos y al generar radicales libres del tipo OH- y H+. El tratamiento matemático de la destrucción de microorganismos por estos procedimientos es similar al descrito para el uso de altas temperaturas. Hay que considerar, sin embargo, los poderes de penetración de los diferentes tipos de radiación.

Así, por ejemplo, la radiación UV tiene un poder de penetración muy bajo y, por consiguiente, se

utiliza para esterilizar superficies, mientras que la radiación X o la γ tiene poderes de penetración mucho mayores.

La resistencia de diferentes tipos de microorganismos a las radiaciones varía. Las esporas bacterianas, las bacterias, levaduras, hongos filamentosos y otras células eucarióticas son progresivamente más sensibles a las radiaciones. Hay algunos microorganismos especialmente resistentes a las radiaciones, entre ellos destaca Deinococcus radiodurans.

2.5.6 Presión hidrostática

Las altas presiones inhiben el crecimiento de los microorganismos. Esto limita la altura de los fermentadores que se pueden utilizar sin que las altas presiones hidrostáticas del fondo inhiban el crecimiento. La altura de los fermentadores, por tanto, se suele limitar a un máximo de 14.5 m (lo que genera una presión de 1.5 atm).

La razón por la que las altas presiones inhiben el crecimiento no está clara, aunque se ha visto que se detiene la síntesis de proteínas y los procesos catabólicos.

También en este caso hay una gran variabilidad en la tolerancia de los microorganismos a las altas presiones. En este sentido, hay que señalar a los microorganismos barófilos que han sido aislados de fosas oceánicas y que crecen sometidos a presiones extraordinariamente elevadas.

Desde el punto de vista aplicado y a parte de la consideración hecha sobre el tamaño de los fermentadores, el efecto de la presión sobre el crecimiento de los microorganismos tiene importancia en el desarrollo de sistemas de eliminación de microorganismos en alimentos mediante altas presiones y en la consideración de los microorganismos que participan en procesos en los que aumenta la presión tales como la fabricación de vinos espumosos.

METABOLISMO MICROBIANO:

1.- Introducción

Llamamos metabolismo al conjunto de reacciones de un organismo. Para los microorganismos con los que vamos a trabajar, normalmente quimiohetero-(organo)-trofos, podemos hacer el siguiente esquema general del metabolismo:

Los microorganismos son sistemas que necesitan una gran cantidad de energía para mantenerse ordenados. Esta energía se obtiene de la oxidación de compuestos orgánicos reducidos. Los nutrientes proporcionan esos compuestos reducidos y, en el curso de la oxidación, se libera energía (que se acumula en forma de moléculas almacenadoras de energía, especialmente el ATP) y se producen elementos estructurales que servirán para la construcción de nuevas células (crecimiento y diferenciación).

Al proceso por el que se obtiene energía y elementos estructurales básicos a partir de nutrientes se le denomina catabolismo y al que utiliza la energía obtenida en el catabolismo para sintetizar nuevos componentes celulares se le denomina anabolismo. Es importante tener en cuenta que aunque se estudie de forma separada el anabolismo y el catabolismo, ambos tipos de procesos ocurren simultáneamente de forma que conforme se van produciendo elementos estructurales y energía en el catabolismo, esos elementos se usan para formar nuevos componentes celulares en procesos anabólicos.

A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar durante el crecimiento (trofofase) se les denomina metabolitos primarios y su producción es paralela al crecimiento celular. Por el contrario, los productos metabólicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sino diferenciación celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general, puede decirse que los metabolitos secundarios se producen después de que se han producido los primarios; aunque en ciertas condiciones (como en cultivo continuo) se pueden producir simultáneamente.

Es conveniente considerar el metabolismo como un flujo de materia reducida que puede oxidarse para la producción de energía o utilizarse para la biosíntesis de nuevos elementos estructurales.

No todo el carbono presente en los nutrientes va a oxidarse completamente ya que parte se utilizará para sintetizar nueva biomasa. Por otra parte, no todo el carbono de los nutrientes se utiliza para la producción de biomasa y, por consiguiente, el rendimiento (medido tal y como se describió en otro apartado de estas notas) es siempre inferior a la unidad (en torno al 50% en muchos casos).

La oxidación de los nutrientes consiste en la captación de electrones de un compuesto reducido por parte de un agente oxidante que llamaremos aceptor final de electrones. Este aceptor final puede ser inorgánico: oxígeno (con ∆G0`= -237 kJ) o NO3

- (con ∆G0`= -163 kJ); o compuestos orgánicos tales como el fumarato (con ∆G0`= -86 kJ).

Cuanto más negativo sea el valor de ∆G0`, mayor cantidad de energía se podrá obtener de la oxidación  y más eficiente será el proceso. Por esto, puede verse que la oxidación en la que el aceptor final de electrones es el O2 es la que más rendimiento de producción de energía permite.

En las páginas siguientes vamos a seguir el proceso de oxidación biológica de una molécula reducida señalando los pasos en los que se produce la liberación de energía. El esquema general del metabolismo se construye en torno al proceso de oxidación de la glucosa. La ecuación general de oxidación de la glucosa es la siguiente:

C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O        ∆G0`= -1330 kJ/mol

En el proceso de oxidación biológica de la glucosa, los productos finales (CO2, H2O y la energía) se producen en sitios diferentes en la célula: el CO2 se produce en reacciones de descarboxilación, mientras que el H2O y la energía se producen principalmente en la membrana celular como resultado de la cadena transportadora de electrones y de la actividad de la ATPasa de membrana.

2.- Catabolismo de la glucosa (glucolisis)

El catabolismo de la glucosa (compuesto de seis carbonos al que nos referiremos como C6) puede ocurrir por cuatro vías diferentes:

(1) Ruta de Embden-Meyerhof (EM). Es la más común en todo tipo de organismos incluyendo hongos filamentosos, levaduras y muchos tipos de bacterias. Esta ruta puede funcionar tanto en condiciones aerobias como en anaerobias y se lleva a cabo por una serie de 10 enzimas citoplásmicas. La mayoría de los pasos de la ruta son reversibles, aunque hay tres (los catalizados por las enzimas hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) que son irreversibles. En los procesos anabólicos hay unos desvíos metabólicos para evitar estos pasos irreversibles. El resultado de la ruta EM es el siguiente:

Glucosa (C6) + 2ADP + 2NAD+ → piruvato (C3) + 2ATP + 2NADH + 2H+

Como resultado de esta ruta se obtiene una pequeña cantidad de energía (dos moles de ATP por mol de glucosa) por procesos de fosforilación a nivel de substrato, se obtienen dos moles de

NAD reducido (NADH+ H+) y se ha logrado una oxidación parcial del carbono de la glucosa para producir como metabolito final dos moles de piruvato por mol de glucosa catabolizada.

(2) Ruta de las Pentosas Fosfato (PF). Esta ruta está presente en muchas bacterias y en la mayoría de los eucariontes. En muchos casos se lleva a cabo simultáneamente a la ruta EM descrita antes. Por ejemplo: en levaduras, entre el 10 y el 20% de la glucosa se metaboliza por la ruta PF (el porcentaje puede ser aún mayor en condiciones de crecimiento rápido) y el resto por la EM. La ruta PF funciona en condiciones aerobias y anaerobias y tiene importancia en procesos catabólicos y en anabólicos tales como en la síntesis de nucleótidos y de aminoácidos aromáticos. La ecuación general de la ruta PF es la siguiente:

3 Glucosa-6-fosfato (C6) + 6NADP+ H2O→fructosa-6-fosfato (C6) + gliceraldehido-3-fosfato (C3) + 3CO2 + 6NADPH + 6H+

Como resultado, no se produce energía, aunque sí ocurren una descarboxilación. La fructosa-6-fosfato y el gliceraldehido-3-fosfato son intermediarios comunes de las rutas EM y PF. Por último, los seis moles de NADPH+ H+ producidos en la ecuación se usan como "poder reductor" en procesos anabólicos.

(3) Ruta de Etner-Doudoroff (ED). Es una ruta usada por un número reducido de microorganismos carentes de la ruta EM. La mayoría son bacterias Gramnegativas tales como Pseudomonas, Rhizobium, Xhantomonas, Azotobacter y Zymomonas.  La ruta ED es muy rara en hongos. El resultado general de la ruta ED es el siguiente:

Glucosa (C6) + ADP + NAD+ + NADP+ → piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+

Como puede verse, el rendimiento energético es menor que en la ruta EM.

(4) Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD).Es la ruta que siguen ciertas bacterias lácticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc). Se puede considerar una variante de la ruta de las PF puesto que se forma un azucar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilación. sin embargo, en la ruta WD, la enzima fosfocetolasa rompe el azúcar C5 y da lugar a dos ramas que condicen a la formación de lactato y etanol en un proceso de fermentación heteroláctica.

El metabolito final más relevante de esta primera fase del catabolismo de la glucosa es el ácido pirúvico (piruvato) que se forma en las rutas EM, ED y PF (en esta ruta, tal y como se ha descrito, se forman intermediarios que pueden conducir a la formación de piruvato). El metabolismo central continúa, pues, con el catabolismo del piruvato.

PROCESOS METABÓLICOS FERMENTATIVOS

 1.- Concepto de fermentación

La palabra «fermentación» es confusa en Microbiología porque con ella se hace referencia a cuatro tipos de procesos diferentes: el metabolismo microbiano en ausencia de oxígeno, la producción de metabolitos secundarios, la modificación de compuestos químicos por microorganismos en crecimiento y el crecimiento bacteriano en sí cuando el interés del cultivo es la producción de biomasa. El sentido en que vamos a utilizarla en estas notas es el primero: fermentación es el proceso por el que las células pueden obtener energía sin llevar a cabo un proceso de fosforilación oxidativa.

Esto es: En la fermentación, la energía se obtiene mediante un proceso químico de fosforilación a nivel de substrato sin que se produzca una variación neta del poder reductor de la célula.

Los primeros estudios científicos serios sobre procesos de fermentación se llevaron a cabo por Pasteur en el análisis de los procesos de producción y alteración del alcohol durante la fabricación del vino. Los procesos de fermentación son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas más antiguas de conservación de la energía.

1.1.- Diferencias entre fermentación y respiración:

En los procesos de fermentación la energía química también deriva de la oxidación de compuestos reducidos. En cualquier proceso de oxidación se produce una transferencia de electrones desde el compuesto reducido que se oxida hasta el compuesto oxidado que se reduce, y en esa transferencia de electrones se produce la liberación de energía. En los procesos oxidativos el aceptor final de los electrones de la oxidación es el oxígeno o, de una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. Sin embargo, en los procesos fermentativos, la transferencia de electrones se produce hasta llegar a un aceptor final que es un compuesto orgánico oxidado.

Por consiguiente, en un proceso de fermentación tanto el donador de electrones como el aceptor son compuestos orgánicos, mientras que en un proceso de respiración el donador de los electrones es orgánico y el aceptor inorgánico. Otra manera de plantear el mismo proceso es considerar que en un proceso de respiración el aceptor final de electrones es siempre externo mientras que en un proceso de fermentación el aceptor final es interno. La respiración es mucho más efectiva energéticamente que la fermentación porque en aquélla la oxidación del compuesto orgánico es más completa que en esta y, como resultado de ello, se liberan 688 kcal/mol (∆Go) en la respiración de glucosa y sólo 58 kcal/mol en la fermentación. (Estos valores hay que considerarlos a la luz de la necesidad de 7.3 kcal/mol para la síntesis de ATP).

Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxígeno como aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de oxígeno sólo se pueda producir fermentación: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgánico oxidado que los reciba al

final de la cadena respiratoria produciéndose un proceso de fosforilación oxidativa en ausencia de oxígeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras moléculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO3

--) y los sulfatos (SO4=).

2.- Rutas fermentativas para la utilización del piruvato

En la oxidación de un mol de glucosa a piruvato se producen en total 2 moles de ATP como rendimiento neto (se producen 4 moles de ATP y se consumen dos) y se genera también un mol de NADH+H+. Cuando se produce la entrada en el ciclo de Krebs del piruvato se va a generar una gran cantidad de NADH+H+ que se reoxida principalmente mediante la fosforilación oxidativa.

Cuando una célula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrógeno necesario para las primeras fases de la glicolisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metabólicos iniciales del catabolismo de la glucosa.

Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos finales.

2.1.- Fermentación Etanólica o alcohólica:

En esta, el piruvato se reduce para formar etanol y CO2:

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi → 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP

Este es el proceso de fermentación que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae y algunas (pocas) bacterias.

Su importancia industrial es evidente: la fermentación alcohólica produce el alcohol presente en las bebidas fermentadas (vino, cerveza, etc.) y el CO2 que se libera en esta fermentación es el causante del esponjamiento de la masa de pan durante su fermentación. En este último caso el proceso de cocción posterior durante la fabricación permite eliminar todo el alcohol de manera que no queda presente en el producto final.

2.2.- Fermentación homoláctica:

Se denomina así la fermentación cuyo único producto final es el ácido láctico. Su ecuación global es:

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi → 2 ácido láctico + 2 ATP

Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica). Es un proceso de fermentación presente en muchas bacterias del grupo láctico: Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus.

Su importancia industrial estriba en la bajada del pH de los productos donde se encuentran estas bacterias: esta bajada del pH como consecuencia de la liberación de ácido láctico es suficiente para producir unos cambios químicos en el producto (precipitación de proteínas durante el cuajado de la leche), cambios microbiológico (protección del deterioro microbiano de alimentos como consecuencia de la eliminación de la flora competidora) y organolépticos (los ácidos orgánicos de cadena corta, y entre ellos el ácido láctico tienen características de producción de sabor) que hacen de esta fermentación un proceso muy relevante en la producción de alimentos.

La fermentación homoláctica es la causante de las agujetas (Sensacion de pinchadas) producidas en los músculos después de un esfuerzo intenso en el que la cantidad de oxígeno aportada a las fibras musculares no es suficiente para asegurar toda la reoxidación del NADH+H+. Las agujetas se producen por los depósitos de ácido láctico entre las fibras musculares. Asimismo, la fermentación homoláctica es responsable de la alteración del esmalte dental en la boca causado por bacterias láctica (flora habitual).

2.3.- Fermentación heteroláctica:

Denominada así porque su producto final no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentación homoláctica como se desprende de la producción de sólo un mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La obtención del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas. La reacción global es:

Glucosa + ADP + Pi → Ac. láctico + etanol + CO2 + ATP

Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo láctico pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus. Industrialmente el proceso es relevante en la producción de alimentos fermentados (por ejemplo el sauerkraut). Otra bacteria productora de este tipo de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche.

2.4.- Fermentación del ácido propiónico:

Las bacterias que presentan este tipo de fermentación se pueden utilizar tanto azúcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y ácido propiónico como productos finales.

Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones lácticas primarias.

Industrialmente Propionibacterium es importante en la fermentación del queso para producir el tipo suizo: la fermentación propiónica utiliza en este caso el lactato producido en las fermentaciones lácticas primarias produciendo CO2 responsable de los «ojos» del queso suizo y acumulación de ácidos orgánicos de cadena corta responsables de características organolépticas.

2.5.- Fermentación ácido-mixta:

La fermentación ácido mixta produce ácido acético, etanol, H2 ,CO2 y proporciones diferentes de ácido láctico o propiónico (fórmico) según las especies. Es un tipo de fermentación que llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentación se produce ATP además de la reoxidación del NADH+H+.

La producción de formiato o CO2 + H2 depende de la presencia en la bacteria de una enzima denominada formiato-liasa responsable del paso. No todas las bacterias la tienen y su actividad es detectable por la producción de grandes cantidades de gas (el H2 es insoluble) como consecuencia de la fermentación del azúcar.

2.6.- Fermentación butanodiólica:

Es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol. Como paso intermedio de la ruta se produce acetoína que puede servir para la identificación de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reacción de Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter.

2.7.- Fermentación del butanol:

Es un tipo de fermentación llevado a cabo por bacterias anaerobias estrictas del género Clostridium. En el curso de esta fermentación se producen compuestos orgánicos disolventes de gran importancia industrial y que, históricamente, han sido los primeros productos industriales bacterianos de importancia económica relevante durante la 1ª Guerra Mundial (trabajo de Weizmann).

3.- Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos

En algunas bacterias del género Clostridium se producen procesos acoplados de oxidación de aminoácidos con el objeto de producción de energía. Como en estos procesos no se utiliza ningún aceptor externo de los electrones de la oxidación, (el aceptor es el segundo aminoácido de la pareja) técnicamente constituyen procesos de fermentación de aminoácidos, en los que se llega a la desaminación y descarboxilación de los aminoácidos que intervienen en la pareja. El ejemplo más representativo es la desaminación y descarboxilación oxidativa de la alanina a acetato, acoplada con la desaminación reductiva de la glicina en el proceso conocido como reacción de Stickland.

4.- Conclusión

Los procesos de fermentación, en sentido metabólico, son aquellos en los que se produce una oxidación de compuestos orgánicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto orgánico interno que se reduce. En estos procesos puede producirse algún rendimiento energético; pero su principal función es la reoxidación del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse por sus productos finales.

EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

1.- Ciclo del material genético

El material genético de cualquier organismo (procarionte o eucarionte) está sometido a una serie de procesos cíclicos que aseguran la realización de sus dos funciones esenciales:

(1) La transmisión entre generaciones de la información genética con fidelidad y (2) La expresión de ésa información genética con precisión para que pueda cumplir la misión

para la que ha sido seleccionada.

Por consiguiente, el ciclo del material genético comprende tres procesos:

(1) Replicación del material genético para su transmisión en copias idénticas a la descendencia,

(2) Transcripción del material genético que se transmite entre generaciones para sintetizar el material genético que asegura la expresión de la información en la célula y

(3) Traducción de la información genética de la forma de ácido nucleico a la forma de proteínas.

Estos tres procesos ocurren independientemente de cuál sea la molécula transmisora principal de la información genética entre generaciones (ADN en la mayoría de los casos y ARN en el caso de los virus de ARN) y son esencialmente iguales en procariontes y en eucariontes.

1.1.- Replicación:

La replicación del material genético es un proceso complejo en el que participa un gran número de proteínas que reconocen la molécula de material genético y llevan a cabo la polimerización de otras moléculas complementarias cada una de sus hebras de forma que, al final, se logra disponer de dos moléculas idénticas (salvo errores denominados mutaciones) a la inicial. El proceso presenta ciertas diferencias según el material genético que se transmite entre generaciones sea ADN o A RN y, en el primer caso, si el organismo es eucarionte o procarionte.

1.1. 1.- Replicación del ADN procariótico. En este proceso interviene un grupo de enzimas conocido genéricamente como ADN polimerasa. Este complejo multienzimático va incorporando nucleótidos a la cadena que se va sintetizando utilizando como molde una de las hebras de la cadena antigua. Esta polimerización se produce añadiendo nuevos nucleótidos al extremo 3' de una hebra de ADN en crecimiento. Por ello se dice que la síntesis del ADN se produce en dirección 5'<3' mientras la ADN polimerasa va leyendo la hebra molde en dirección 3'o5'.

Por consiguiente, para que se produzca la síntesis de ADN por la ADN polimerasa, además de la enzima que realiza la polimerización en sí, es necesario otro juego de proteínas que van desenrollando la doble hélice de ADN delante de la ADN polimerasa para permitir que ésta funcione. Estas enzimas se denominan genéticamente topoisomerasas y girasas. La acción de las

topoisomerasas y girasas permite abrir unas burbujas en la doble hélice de ADN en las que entra el complejo de la ADN polimerasa y realiza la polimerización.

Sin embargo, la ADN polimerasa no es capaz de iniciar la polimerización del ADN sino que solamente es capaz de continuarla. Para que la ADN polimerasa funcione es necesario que exista un extremo 3' libre al que añadir un nuevo nucleótido. ¿Quién pone ese extremo 3' libre?. En todos los casos (salvo algunas excepciones de ciertos virus) ése extremo 3' viene de una pequeña cadena de ARN que se ha sintetizado como paso inicial de la replicación del ADN. Por consiguiente, la replicación del ADN comienza con la síntesis de una pequeña molécula de ARN que luego continúa como molécula de ADN. Esta pequeña molécula de ARN se denomina cebador o primer„ y es sintetizada por otro complejo multienzimático denominado ARN polimerasa.

La síntesis de ADN (replicación) va procediendo detrás de la horquilla que se forma en el punto en que se van abriendo las dos hebras de ADN molde por acción del complejo de girasas y topoisomerasas. De esta forma, la hebra que se va sintetizando es continua. Sin embargo, la hebra que se sintetiza usando como molde la complementaria de la anterior no puede ser continua porque la acción de las topoisomerasas y girasas se produce detrás del punto de origen de la transcripción. Por esto, de las dos hebras hijas, una será continua y l a otra discontinua. Los fragmentos de ésta última se unirán entre sí mediante la acción de otra enzima denominada ADN ligasa que une los fragmentos anteriores.

En las bacterias, cuyo material genético es cerrado, no tiene extremos, sólo existe un origen de replicación del ADN en cada molécula de ADN. Esto es válido para los plásmidos y para los cromosomas bacterianos. Asimismo, esto se cumple también en el ADN de los orgánulos celulares procarióticos presentes en las células eucarióticas.

1 12.- Replicación del ADN eucariótico. La replicación del ADN eucariótico es esencialmente igual a la del procariótico aunque presenta ciertas diferencias los cromosomas eucarióticos son abiertos, en lugar de cerrados, y el número de orígenes de transcripción es múltiple en cada cromosoma en lugar de tener uno solo por cromosoma.

1.1.3.- Replicación del material genético de los virus de ARN. Los virus de ARN tienen esta molécula como transmisora de la in formación genética entre generaciones. Para la transmisión de las copias de información genética entre los descendientes es necesario que el ARN del virus que infecta una célula se transcriba, en primer lugar, en una molécula de ADN que servirá como molde para la copia de muchas moléculas de ARN que formarán la descendencia. Esta transcripción de ARN a ADN se produce en dirección opuesta a la transcripción clásica que hemos descrito antes (ADN < ARN) y se lleva a cabo por un complejo multienzimático en el que el constituyente principal es la enzima denominada transcriptasa reversa.

1.2.- Transcripción:

Es el proceso por el que se transmite la in formación contenida en el ADN al ARN. Este proceso se lleva a cabo por la ARN polimerasa que utiliza como molde una de las dos hebras del ADN, la denominada hebra codificante. Durante el proceso de transcripción se reconoce un sitio

específico de la molécula de ADN en el que se van a unir las enzimas del complejo de ARN polimerasa. Este sitio específico se denomina promotor del gen y permite que se produzca la transcripción. Genes sin promotores no pueden ser transcritos aunque un promotor puede servir para transcribir varios genes seguidos que forman lo que se denomina un operón.

En células procarióticas existe una serie de proteínas que pueden un irse a la ARN polimerasa controlando a qué promotores se puede unir ésta y regulando así la expresión génica. Estas proteínas se denominan factores sigma. En células eucarióticas la unión de la ARN polimerasa a un promotor o a otro viene regulada por la unión de otras muchas proteínas que, de alguna forma, dirigen la unión de la polimerasa al promotor conveniente.

No todas las moléculas de ARN que se sintetizan en una célula van a ser traducidas en proteínas. La gran mayoría de las moléculas de ARN tienen otras funciones estructurales o enzimáticas diferentes de la transmisión de la información genética. Son las moléculas de ARN transferente (que sirve para activar los aminoácidos de manera que puedan ser polimerizados en proteínas) y las de ARN ribosomal que sirven para que estos orgánulos celulares puedan desarrollar su función. Constantemente se van encontrando nuevas moléculas de ARN con función diferente a la de transmisión de la información genética. En cualquier caso, éstas moléculas especiales de ARN son sintetizadas por un procedimiento de transcripción similar al descrito aunque el complejo enzimático de la ARN polimerasa pueda ser algo diferente.

1.3.- Traducción:

Es el proceso por el que la información genética con tenida en el ADN y transcrita en una ARN mensajero va a ser útil izada para sintetizar una proteína. El proceso de lleva a cabo en los ribosomas.

Para que un ribosoma pueda reconocer una ARN mensajero y utilizarlo para sintetizar una proteína, el ARN tiene que contener, además de la serie de nucleótidos que llevan la secuencia de la proteína, otras secuencias que permitan al ribosoma unirse al ARN, saber dónde ha de iniciarse la traducción de la secuencia (el denominado codón de iniciación), saber dónde debe terminar la traducción (codón de terminación) y saber en qué punto de la molécula de ARN mensajero deben separarse éste y el ribosoma.

Los ribosomas de las células procarióticas son diferentes de los de l as células eucarióticas como puede comprobarse por su diferente susceptibilidad a antibióticos ribosomales. Por otra parte, la traducción en células procarióticas ocurre simultáneamente a la transcripción del gen, mientras que en las células eucarióticas, la traducción se produce sólo una vez que el ARN mensajero ha llegado al citoplasma y a la zona donde se encuentran los ribosomas, por lo que nunca es simultánea con la transcripción.

La traducción del mensaje genético desde el ARNm hasta una proteína no es suficiente, en algunos casos, para que se exprese correctamente. Es necesario que el polipéptido que se va sintetizan do por el ribosoma se pliegue de forma adecuada para que pueda desarrollar su función biológica correctamente; sin embargo, en muchos casos esto no ocurre de una manera completamente espontánea: es necesario el concurso de un grupo de proteínas esenciales

denominadas chaperoninas (anglicismo que viene a significar proteínas tutoras o, si se quiere, tutorinas) que ayudan al péptido naciente a adquirir la configuración tridimensional correcta. Estas proteínas son muy importantes, por otra parte, para corregir errores pequeños que se produzcan en proteínas maduras y que causan su inactivación o bajada de rendimiento.

1.3.1.- Modificaciones del ARN mensajero: Tiene que producirse una serie de modificaciones en el ARN mensajero para que pueda ser traducido correctamente. En las células eucarióticas las moléculas de ARN deben ser trasladadas del núcleo, donde ocurre la transcripción, al citoplasma, donde ocurre la traducción. Por otra parte, l os genes de organismos eucarióticos suelen tener fragmentos que no se traducen pero si se transcriben, son los denominados intrones por contraposición a los exones o secuencias del ARN que van a ser traducidas. Cuando se transcribe un ARN eucariótico éste es una secuencia de intrones y exones que debe ser procesada para eliminar los intrones y dejar sólo los exones colocados ordenadamente. Esta eliminación selectiva de intrones se denomina técnicamente procesamiento o splicing, y ocurre en el núcleo. En los genes procarióticos no existen (salvo alguna excepción muy rara en un grupo especial de arqueobacterias) intrones y, por lo tanto, no hay procesamiento.

1.4.- Aplicaciones de los procesos y sistemas enzimáticos que intervienen en el ciclo del material genético, en la ingeniería genética y la Biotecnología:

Los procesos y sistemas enzimáticos involucrados en la transmisión y expresión de la información genética entre generaciones pueden ser aislados y utilizados en la Biotecnología para lograr la expresión y manipulación de información genética por microorganismos e, incluso, por organismos superiores. Como ejemplo citaremos dos aplicaciones derivadas de las propiedades y enzimas involucradas en la replicación del ADN.

1.4.1.- Detección se secuencias de ADN o ARN mediante hibridación de ácidos nucleicos. Estas técnicas están basadas en la especificidad de la unión de hebras de ácidos nucleicos con secuencias complementarias. Dependiendo de la perfección del acoplamiento de las dos secuencias (del grado de complementariedad) la unión entre las dos cadenas será más o menos fuerte. Esto significa que podrá resistir temperaturas más elevadas cuando la complementariedad es más alta o se separarán las hebras (se producirá la fusión) cuando la complementariedad es demasiado baja. En cualquier caso, las hebras se mantendrán unidas o no dependiendo del binomio grado de complementariedad-temperatura.

La especificidad de la unión de hebras nos permite detectar la presencia de secuencias en una molécula, o en una mezcla de moléculas, de ácido nucleico (ADN o ARN) usando como sonda una molécula con secuencia complementaria y convenientemente marcada para facilitar su detección. Estos procedimientos se utilizan en hibridación in situ, experimentos de Southern (detección de secuencias de ADN) o en experimentos de Northern (detección de secuencias de ARN).

1 4.2.- Amplificación de secuencias de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa: en esta técnica se utiliza la capacidad de la ADN polimerasa de sintetizar ADN a partir de una secuencia cebadora determinada. En ella se usan dos cebadores que flanqueen una secuencia de ADN que se quiere detectar o de la que se desea disponer de un gran número de

copias; estos cebadores deben servir para iniciar la síntesis de ADN en cada una de las dos hebras del fragmento que se quiere amplificar y, por consiguiente, deben estar <(orientados„ hacia el interior de la secuencia que se quiere amplificar. Mediante la adición de ADN polimerasa y de los cofactores y substratos necesarios es posible realizar la síntesis de la molécula de ADN flanqueada por los dos cebadores in vitro. Si, además, se realizan varios procesos de síntesis de ADN usando los mismos cebadores en procesos consecutivos el número de copias de l a molécula, de ADN que se quiere amplificar aumentará exponencial mente permitiendo disponer de grandes cantidades de la misma.

En la práctica, esta reacción de polimerización se lleva a cabo con la ADN polimerasa de una bacteria termófila (Thermus aquaticus u otras similares) capaz de resistir múltiples ciclos a elevada temperatura (Taq-polimerasa). La técnica también se puede utilizar para detectar ARN siempre y cuando se realice un paso previo de transcripción reversa dei mismo.

2.- Control de la expresión génica

La transmisión de la información genética entre generaciones y la expresión en forma de proteínas de dicha información genética no son suficientes para permitir que el programa de desarrollo de un organismo se lleve a cabo correctamente. Es necesario, además, asegurar que los genes que constituyen la información genética transmitida se expresen en momentos adecuados bien desde el punto de vista cronológico o espacial (procesos de desarrollo) o bien como respuesta a cambios en las condiciones ambientales en las que se encuentra la célula o el individuo. Por otra parte, las respuestas al ambiente o los procesos de desarrollo no suelen producirse como con secuencia de la activación de un único gen en un momento, sitio o condición determinado, sino que suele ser necesaria la expresión coordinada de un conjunto de ellos para que tenga lugar el efecto. Estos dos hechos hacen que el control de la expresión génica sea central en el proceso de la biología molecular de los seres vivos.

El modelo más coherente de regulación de la expresión génica se conoce con el nombre de Modelo del Operón que explica, como veremos, l a expresión coordinada de genes. Por otra parte, veremos a continuación cuál es el proceso por el que llega al material genético la in formación ambiental o de desarrollo que permita la expresión coordinada; estudiaremos el proceso de transducción de la señal.

2.1.- Modelo del operón: La expresión de un grupo de secuencias codificantes de diferentes péptidos cuya presencia debe ser coordinada se logra colocando todas las secuencias bajo el control de un mismo promotor.

La transcripción de todas estas secuencias darán lugar a un ARN mensajero de gran tamaño que codifica todos los genes contenidos en el operón (ARN policistrónico) de forma que siempre se podrán traducir coordinadamente las diferentes proteínas del operón. La cantidad de cada una de las proteínas del operón que se produce como consecuencia de la traducción no siempre es equimolecular porque existen elementos de regulación de la traducción que provocan la separación del ribosoma y el ARNm en ciertos momentos controlando así más finamente la coordinación de la expresión.

¿Cómo se regula de la expresión génica?. Entre el promotor del operón y el inicio del primer gen estructural del fragmento policistrónico existe una secuencia de ADN denominada Operador. A esta secuencia se puede unir una proteína denominada Regulador de forma que cuando se encuentra unido el regulador a la secuencia del operador impide el paso de la ARN polimerasa en su trayecto de transcripción del ADN para sintetizar el ARN policistrónico. Por con siguiente, la regulación de la expresión se logra mediante un impedimento físico de la actividad de la ARN polimerasa causado por la unión de una proteína al ADN. Existen dos clases de operones según sea su respuesta a las condiciones ambientales: los operones inducibles y los operones represibles.

2.1.1.- Operón inducible: es aquél en el que como consecuencia de la presencia de una molécula inductora se produce la expresión de los genes del operón. El ejemplo más clásico es el del Operón de la lactosa que regula la síntesis de las proteínas que permiten el metabolismo de la lactosa por las bacterias.

Cuando una bacteria se encuentra en un ambiente donde puede disponer de lactosa los genes que hacen posible la utilización de este azúcar por la bacteria se inducen. Estos genes, agrupados en el Operón de la lactosa, están constitutivamente reprimidos porque a la región del operador del operón se ha unido una proteína inhibidora que impide el paso de la ARN polimerasa. Cuando hay lactosa en el medio de crecimiento alguna molécula de este azúcar puede llegar al interior de la célula usando alguno de los sistemas de transporte presentes en la membrana bacteriana para azúcares. Una vez en el interior de la célula, la lactosa puede unirse a la proteína inhibidora unida a la región reguladora del operón de la lactosa de suerte que, cuando la lactosa está unida, la proteína inhibidora se separa de la región operadora permitiendo el paso de la ARN polimerasa y la transcripción de los genes correspondientes.

Cuando desaparece la lactosa del medio la proteína inhibidora queda de nuevo libre de forma que puede volver a unirse al fragmento operador del operón impidiendo, de nuevo, la transcripción de los gen es que lo forman.

El resultado de este proceso es que, como respuesta a la presencia de lactosa en el medio, se induce la expresión de los genes que permiten su catabolismo. Este sistema es extremadamente sensible porque la acción de las enzimas que permiten el paso de la lactosa a través de la membrana (transportadoras de lactosa) permite que la concentración intracelular de lactosa sea suficientemente alta hasta el momento en el que la concentración extracelular es ya tan baja que no puede utilizarse el azúcar eficientemente.

2.1.2.- Operón represible: en otros casos es necesario que la expresión de ciertos genes se detenga tan pronto como sea metabólicamente posible, porque su actividad no sea necesaria, para lograr una mayor economía de la energía celular. Es el caso, por ejemplo, de los operones de la arginina y del triptófano. Estudiaremos con más detalle el primero de ellos.

Si la cantidad de arginina presente en la proteínas que se encuentran en el medio en que crece una bacteria es suficientemente alta como para satisfacer las necesidades bacterianas de este aminoácido, no es necesario que la bacteria lo sintetice sino que, simplemente, lo asimila de la dieta. Ahora bien, si la cantidad de arginina exógena no fuera suficiente, las bacterias pueden

sintetizarla a partir de otros precursores mediante el concurso de una serie de enzimas codificadas en el operón de la arginina.

De nuevo, nos encontramos con un operón y a su secuencia operadora se une una proteína represora específica. Sin embargo, en este caso l a proteína represora se mantiene unida siempre que a ella se encuentre unida, a su vez, una molécula de arginina o de un análogo de arginina. Cuando la concentración celular de arginina desciende por debajo de unos niveles críticos (que vienen determinados por la constante de afinidad de la molécula represora por la arginina o su análogo) el represor se separa de la arginina y queda inactivo separándose, también, de la secuencia operadora y permitiendo la transcripción de los genes que codifican las proteínas de síntesis endógena de arginina. El efecto final es la expresión de los genes del operón como respuesta a los niveles de arginina presentes en la célula.

2.2.- Mecanismos de transducción de señal. Se conocen con este nombre los mecanismos que permiten a las células sentir condiciones exteriores (ambientales o señales de desarrollo) y activar como consecuencia de ello la expresión de algunos genes u operones. Los dos ejemplos de operón descritos anteriormente responden a las condiciones ambientales de concentración de lactosa y arginina, respectivamente; sin embargo, no se consideran incluidos dentro de l os mecanismos de transducción de señal porque la detección del estado ambiental no se realiza a través de la membrana bacteriana sino que se produce directamente por interacción del inductor con el represor modulando su unión al operador.

En el caso de los sistemas de transducción de seña, un complejo de proteínas de membrana recibe la señal externa. Para ello, este complejo ha de tener una proteína, al menos, dirigida hacia el exterior de l a célula de manera que actúe como receptor de la señal. Como con secuencia de la detección de la señal (lo que, en términos bioquímicos suele significar "cuando se ha unido I receptor de membrana la molécula que actúa como inductor") se produce un cambio conformacional en la molécula del receptor; cambio que, a su vez, causa otros en las otras proteínas del complejo de membrana con las que interacciona. Como consecuencia de estos cambios estructurales el complejo de proteínas, por su cara interna, es capaz de modificar químicamente proteínas citoplásmicas activando o inactivando así su función como represores de operones o genes (esto suele ocurrir mediante procesos de fosforilación) o bien sintetiza moléculas que son inductores que regulan la actividad de represores presentes en la célula (estas moléculas inductoras son lo que se suele denominar colectivamente "segundos mensajeros").

Los sistemas de transducción de señal son muy importantes porque de ellos depende gran parte del control de la expresión génica y porque son manipulables genéticamente de forma que podemos utilizarlos para disparar procesos de expresión génica usando señales inductoras diferentes de las que normalmente las controlan en la naturaleza pero que son poco manejables eh procesos industriales biotecnológicos.

3.- Requerimientos estructurales para la exportación de proteínas

Si se desea utilizar el potencial de los microorganismos como productores de proteínas en la industria es necesario, además de proceder al clonaje de los genes codificantes de las proteínas de interés y de estudiar y manipular el control de la expresión de los gen es correspondientes,

conocer cómo se puede lograr que la proteína se localice en una fracción del cultivo donde sea más fácil proceder a su purificación. En la mayoría de los casos es interesante que la proteína se exporte al exterior de la célula y para ello hay que conocer el mecanismo por el que esto ocurre.

Las proteínas sintetizadas en las células están destinadas, como norma, a quedarse en el citoplasma celular. Para que una proteína se integre en la membrana celular o para que la atraviese y sea exportada al exterior, es necesario que la proteína contenga unas señales que dirijan este proceso. Estas señales son componentes de l a secuencia de aminoácidos de la propia proteína que se localizan en el extremo amino-terminal (el primero que se sintetiza por el ribosoma) del péptido naciente.

Existen varios tipos de señales: unas son las señales de exportación que sirven para que el péptido que va sintetizándose sea exportado al exterior de la membrana citoplásmica. Estas señales son secuencias que se insertan y atraviesan la membrana plasmática y, una vez que se ha conseguido el paso del péptido naciente al exterior celular, son eliminadas mediante una enzima denominada peptidasa señal (signal peptidase, en inglés). Si no funciona la peptidasa señal, la proteína queda unida por su extremo aminoterminal a la membrana citoplásmica.

Otro tipo de señales sirven para que la proteína se ancle en la membrana celular: son secuencias que están diseñadas para quedarse atrapadas en la bicapa lipídica de la membrana celular de manera que las proteínas que las contienen pasan a ser proteínas integrales de membrana y no pueden purificarse con métodos convencionales.

Por último, en los organismos eucarióticos (y por ello en hongos y levaduras de interés biotecnológico) se puede producir otro procesamiento adicional de las proteínas: la glicosilación, consisten te en la adición ordenada de cadenas polisacarídicas a los péptidos nacientes. La presencia de estas modificaciones polisacarídicas es esencial para la función de muchas proteínas eucarióticas. La adición de las cadenas de azúcar se produce en el Aparato de Golgi y tiene lugar en proteínas que contienen una secuencia dos tipos de señales: una que las dirige hacia dicho orgánulo celular (especializado en modificación de las proteínas y su posterior secreción al medio extracelular) y una segunda señal que indica en qué posiciones de la secuencia de la proteína va a producirse la unión del polisacárido.

4.- Conclusión

Desde el punto de vista biológico, la expresión de la información gen ética de un organismo y su transmisión entre generaciones es un proceso complejo en el que interviene un gran número de proteínas y de mecanismos. Estos mecanismos aseguran la fidelidad de la copia de la información desde el ADN al ARN para asegurar la expresión, y del ADN a una nueva molécula de ADN para asegurar la transmisión. Sin embargo, además de la traducción del ARN por los ribosomas, para que se produzca una correcta expresión del mensaje genético ha de estar controlado el momento del dicha expresión, ha de asegurarse que el mensaje (proteína) adquiera la conformación correcta para su funcionamiento y se coloque en el lugar celular correspondiente.

Desde el punto de vista biotecnológico, todos estos procesos son manipulables para poder conseguir la expresión artificial de proteínas de interés industrial en procesos llevados a cabo por microorganismos.

Microbiología Aplicada al Tratamiento de residuos sólidos urbanos

1.- Introducción.

Los residuos sólidos urbanos (RSU, o en inglés Municipal Solid Waste, MSW) es un tipo de contaminación muy heterogéneo en composición (madera, tela, plástico, metal, restos de alimentos, papel, etc.) muy concentrada en su producción (los grandes núcleos urbanos producen más RSU que los puebles pequeños) y a la que contribuimos todos de forma significativa. La composición de los RSU varía históricamente, estacionalmente y según el nivel económico del núcleo urbano que los produce.

2.- Tratamiento de los RSU.

Las soluciones para el tratamiento de los RSU son variadas:

(1º) La más clásica es el vertedero en el que no se selecciona el material. Este procedimiento ha venido siendo poco costoso económicamente aunque no ecológicamente. Actualmente plantea dos problemas:

(a) no existe seguridad de que no se produzcan filtraciones del material vertido a las aguas subterráneas; (b) es muy difícil encontrar nuevos emplazamientos para los vertederos cerca de los núcleos urbanos, lo que incrementa el coste del vertido. La tendencia actual es hacia la reducción del número y la capacidad total de los vertederos; aunque seguirán existiendo como vertederos selectivos para el material biológicamente inactivo que no sea recuperable mediante reciclaje o compostaje.

(2º) Incineración que presenta problemas económicos (las instalaciones son muy costosas) y ecológicos (problemas relacionados con la seguridad y toxicidad de los humos y cenizas). Sin embargo, la incineración permite una gran reducción del volumen (85%) y del peso (75%) del material destinado a los vertederos.

(3º) Reciclado y compostaje. El reciclado consiste en la de restos de papel, metal o cristal en materias primas para nuevos productos en los que no cambia el material (el papel se convierte en nuevo papel). Compostaje es el proceso en el que los residuos no reciclables pero biodegradables se convierten por un proceso microbiológico en residuos orgánicos estables con menos peso y volumen, inocuos desde el punto de vista sanitario, fácilmente transportables y almacenables y útiles como aditivos en el tratamiento de suelos.

En los países más avanzados el tratamiento de los RSU comprende dos etapas:

(1ª) La incentivación para la reducción del volumen e impacto ambiental de los productos iniciales (reducción de los envoltorios, substitución por materiales biodegradables, utilización de productos concentrados que requieren menos volumen para empaquetar, utilización de pilas de carbono-zinc menos contaminantes, etc.)

(2ª) El tratamiento por reciclaje y compostaje de aquél material susceptible, preferentemente a su incineración o vertido, siendo considerados estos dos últimos como métodos viables complementarios de los primeros dependiendo de cada caso particular.

Para un tratamiento correcto de los RSU es necesaria su clasificación por los consumidores (que son sus principales generadores) mediante la separación de los residuos siguiendo una de dos estrategias alternativas:

(1º) Históricamente se ha prestado más atención al reciclado por lo que la separación de los residuos en dos fracciones se hacía en reciclable/no reciclable más compostable.

(2º) Alternativamente se puede hacer la clasificación en base al compostaje en dos fracciones: compostable y no compostable más reciclable. Esta última alternativa permite un compostaje (obtener un compost) de más calidad que en el caso anterior puesto que la separación de los residuos no compostables se realiza por el consumidor y, por lo tanto, se realiza en el origen. La separación del material reciclable del no reciclable, en este caso, se hace en la factoría de tratamiento de los RSU.

La factoría (Planta) de tratamiento de los RSU ha de realizar en cualquiera de los dos casos, una clasificación final de los residuos, y un tratamiento inicial previo al compostaje que suele consistir en la disgregación y fractura del material en trozos pequeños y en humedecerlo para que tenga la cantidad de agua adecuada para el proceso microbiológico.

2.- Compostaje.

2.1.- Definición.

El compostaje es un proceso de fermentación sólida espontánea basado en el aumento de la temperatura producido por la actividad de los microorganismos. El material a comportar es el medio de cultivo, la fuente de nutrientes, el inóculo, la fuente de agua y el producto final. El propio material retiene el calor producido por los microorganismos y esto causa el aumento en la temperatura del proceso. Para esto es necesario que la cantidad de material a comportar supere un mínimo crítico.

2.2.- Generación de calor durante el compostaje.

El aumento de la temperatura durante el proceso de compostaje se debe al catabolismo aerobio del material compostable por los microorganismos que forman su flora natural. Como consecuencia de este metabolismo aerobio se utilizan los carbohidratos, lípidos y proteínas del substrato como fuente de carbono y de energía por los microorganismos quimioheterotrofos; estos mutrientes son metabolizados por rutas diferentes que convergen en ciclos productores de

gran cantidad de energía (ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos) tanto directamente utilizable (una molécula de ATP por ciclo completo) como obtenible mediante la cadena transportadora de electrones (cadena respiratoria, 2 moléculas de NADH+H+, una de NADPH+H+ y una de FADH2 por vuelta de ciclo). Parte de esta energía la disipan los microorganismos como calor, necesario para elevar la temperatura ambiental de forma que puedan funcionar metabólicamente de forma más eficiente. Cuando, debido al apilamiento de material compostable, parte del calor producido queda atrapado en el mismo material en proceso de compostaje, se produce un efecto de retroalimentación de la generación de calor.

Por consiguiente, para la generación de calor es necesario el metabolismo aerobio que permita convertir las moléculas de nucleótidos reducidos (NADH+H+, NADPH+H+ y FADH2) en moléculas utilizables metabólicamente como unidades de energía (ATP), y esto sólo es posible mediante la cadena transportadora de electrones con el O2 como aceptor final (cadena respiratoria). En caso de no existir suficiente oxígeno para permitir el metabolismo aerobio, los microorganismos cambian su tipo de producción de energía hacia procesos fermentativos mucho menos eficientes desde el punto de vista energético (menos producción de calor, procesos más lentos), que generan productos secundarios que, en ciertas ocasiones, pueden resultar indeseables (generación de metano, malos olores producidos por poliaminas, etc.), que no esterilizan el material (no sube la temperatura y no se produce la autoesterilización) por lo que sanitariamente el producto puede ser peligroso y que no logran la estabilización biológica total del producto (esto es: productos de fermentaciones anaerobias pueden ser utilizados como fuentes de carbono y energía por otros quimioheterotrofos posteriormente).

2.3.- Ejemplo de proceso de compostaje.

El proceso de compostaje puede ejemplificarse con el tratamiento de las hojas producidas en otoño: al caer las hojas están cubiertas por muchos microorganismos. Por separado no muestran variaciones de temperatura como resultado del metabolismo microbiano; pero si se apilan para que contengan la temperatura, ésta sube y se produce un proceso de selección de los microorganismos:

(1º) Las bacterias y hongos mesófilos, mediante un proceso de retroalimentación positiva incrementan su número y la temperatura hasta que ésta se hace limitante y mueren (hacia 45ºC-55ºC);

(2º) A esta temperatura los microorganismos más importantes son los termófilos que, mediante un segundo proceso de retroalimentación positiva-neutra-negativa, incrementan número y temperatura hasta alcanzar los 80ºC; (3º) A esta temperatura se produce un cierto proceso de autoesterilización del producto y la temperatura desciende progresiva e irreversiblemente. Si el material de partida está muy compactado o con mucha humedad, no se puede producir un intercambio efectivo de oxígeno y se desarrollan procesos fermentativos que retrasan o impiden el aumento de temperatura.

El proceso espontáneo de compostaje es relativamente lento debido al efecto inhibidor de la alta temperatura y a la disminución del oxígeno interno. Esto no es importante para procesos

pequeños; pero es muy problemático en los procesos industriales debido al incremento del coste que supone.

2.4.-Manipulación del proceso de compostaje.

Industrialmente es necesario agilizar el proceso de compostaje para que se produzca totalmente con la máxima rapidez. Para esto hay que manipular las variables del proceso de fermentación para conseguir las condiciones óptimas para el proceso. Los aspectos manipulables del proceso son el tamaño y la forma de la pila de compostaje, la agitación mecánica del material y la ventilación del proceso. Vamos a estudiar varios casos en los que se alteran estas variables para estudiar su efecto en la velocidad del proceso.

(1) Efecto del tamaño y forma de la pila.

Como ejemplo estudiaremos con más detalle el compostaje urbano de las hojas de árboles. Este material se produce sólo durante un periodo concreto del año (dos meses en otoño) lo que permite disponer de nueve meses para su procesado y, por consiguiente, un compostaje lento.

El diseño de la pila ha de hacerse en función de los requerimientos del proceso y de las condiciones ambientales:

(a) al inicio es necesario una buena aireación del material para que se inicie el proceso de incremento de la temperatura evitando la anoxia; al mismo tiempo, es necesario evitar un excesivo incremento de la temperatura en esta primera etapa que conduzca a una autoesterilización del material antes de que sea biológicamente estable. Por consiguiente, esta primera pila será de dimensiones reducidas.

(b) En invierno, el descenso acusado de la temperatura ambiental hace de este el factor limitante que hay que prevenir, y esto se logra combinando dos pilas de compostaje de otoño en una mayor de invierno. (c) En primavera es necesario, de nuevo, prevenir la anoxia por lo que el cultivo es agitado mecánicamente al principio de la estación permitiendo su evolución espontánea a continuación.

Este tipo de tratamiento no permite el co-compostaje de hojas con césped o con otro material putrescible o con otro ritmo de producción. El co-compostaje es factible en pequeñas instalaciones individuales; pero no en las industriales.

(2) Agitación mecánica.

Si se agita periódicamente el material conpostando para obtener un control de la temperatura y un aumento del nivel interno de oxígeno puede comprobarse que el proceso mecánico no supone una reducción de la temperatura significativa (45ºC-55ºC-79ºC a las 0, 10 y 35 horas tras la agitación) mientras que los niveles de oxígeno no se hacen limitantes durante un periodo en el que la temperatura lo es (20%, 2,5%, 10% durante el mismo periodo, indicando el último incremento el resultado de la autoesterilización del cultivo). Por consiguiente, la agitación

mecánica no es un procedimiento realista de control de la temperatura durante el proceso de compostaje, y no tiene un efecto significativo sobre la disponibilidad de oxígeno.

Tiempo Temperatura Oxígeno

0 h 45ºC 20%

10 h 55ºC 2.5%

35 h 79ºC 10%

La tabla indica la variación de la temperatura y del porcentaje de oxígeno en la masa en fermentación a diferentes tiempos (medidos en horas) después de un volteo mecánico. El aumento de la cantidad de oxígeno a las 35h se debe al proceso de autoesterilización por alta tempetratura que detiene su consumo por los microorganismos presentes en la mezcla.

(3) Ventilación.

La ventilación forzada de la pila de compostaje permite proporcionar oxígeno, eliminar CO 2 y descender la temperatura del proceso. La mayor parte del calor que se genera procede de la respiración aerobia de los microorganismos, y este calor se emplea, en su mayor parte (80%), en la vaporización del agua, de forma que es necesario mucho más aire para eliminar el calor generado que para proporcionar el O2 necesario (relación 9:1).

El calor eliminado por ventilación puede calcularse como

Qv=m * (h(salida) – h(entrada))

Donde m es el flujo de aire (masa por unidad de tiempo),

h(entrada) es la entalpía del aire de entrada (energía por unidad de masa de aire),

h(salida) entalpia del la del aire de salida

Qv la energía por unidad de tiempo eliminada.

Los valores de h dependen de la humedad relativa del aire que en salida es del orden del 100%. Los valores de Qv vienen limitados por las condiciones biológicas de los microorganismos.

3.1.- Procesos basados en el flujo libre de aire

3.1.1- Cuando la ventilación se diseña para proporcionar O2 se hace pasar aire a través de la pila controlando el flujo con un programador de tiempo que está activo durante poco tiempo y es

capaz de mover decenas de metros cúbicos de aire seco por tonelada y hora de material. En estas condiciones, para mantener una concentración de O2 del orden del 10-15% el flujo de aire necesario (m) es demasiado pequeño para evitar que se produzca el suicidio por elevación de la temperatura de la población microbiana. Esto enlentece excesivamente la duración del compostaje.

3.1.2.- La ventilación puede diseñarse para controlar simultáneamente la temperatura (la adecuada biológicamente es del orden de 60ºC) y la oxigenación del proceso. En este caso, el regulador de la ventilación está controlado inicialmente por tiempo hasta llegar a una temperatura determinada, momento en el que la ventilación pasa a ser controlada para mantener la temperatura del proceso. En este caso, es necesario hacer frente a los picos de temperatura mediante la inoculación de un alto flujo de aire (centenares de metros cúbicos por tonelada y hora). Cuando el proceso de compostaje está completo, la temperatura comienza a descender y el control vuelve a ser temporal. Durante todo el proceso el nivel de oxígeno es alto debido a la relación 9:1 por lo que el aporte de O2 es más que suficiente.

El mayor inconveniente de este sistema es que se produce un gradiente de temperatura muy acusado entre la parte inferior y la superior de la pila de compostaje, lo que genera diferencias en la velocidad del proceso y, finalmente, una desecación del material que puede comprometer la velocidad de crecimiento de los microorganismos.

De hecho, como la humedad generada deriva únicamente del calor producido por la actividad biológica, una manera de seguir el proceso de compostaje es el seguimiento de la humedad del aire de salida.

3.2.- Procesos basados en la recirculación de aire.

El proceso denominado de «túnel holandés» se utiliza para producir compost destinado a la producción de champiñón. consiste en la construcción de pilas de 3x3x33m cerradas en salas especiales. El suelo es falso y permite que se insufle el aire desde la parte inferior del compost, este aire sale por la parte superior y es recogido en la bóveda de la cámara. El aire se hace recircular pasando bien por un compresor que lo refrigera y descarga de humedad o bien directamente a la parte inferior de la cámara; la elección de uno u otro circuito depende de la necesidad de humedad de la mezcla. Se permite la entrada de aire nuevo del exterior dependiendo de la necesidad de oxígeno para el proceso, el volumen de aire del exterior que entra es compensado por liberación al exterior de aire del circuito.

Con este sistema se puede lograr, mediante un control computerizado del proceso, que no se genere un gran gradiente de temperatura en la cámara de fermentación, lo que hace que el proceso, y el producto final, sea más homogéneo. Así mismo, permite un control muy fino de la temperatura y de la humedad. El sistema requiere menos consumo de aire ambiental y un aislamiento de una zona más pequeña que en los casos anteriores, lo que facilita la ventilación de las instalaciones y el manejo de los gases de salida.

4.- Bibliografía:

Finstein, M.S. 1992. Composting in the control of municipal solid waste management. En «Environmental microbiology» Ed. por R. Mitchell. Wiley-Liss. New York. pp. 355-374.

 

Principios y microbiología del tratamiento de aguas residuales

Introducción. Composición de las aguas residuales domésticas. Demanda biológica de oxígeno. Demanda química de oxígeno. Carbono orgánico total. Pasos del tratamiento de aguas residuales. Procesos de lodos activados. Descripción del sistema básico. Microorganismos presentes en los flóculos. Aspectos nutricionales del proceso. Digestión anaerobia de aguas residuales

1.- Introducción.

El tratamiento de aguas residuales se inició en Inglaterra a finales del siglo XIX y principios del XX para controlar los brotes infecciosos en las ciudades. Históricamente, el primer objetivo del tratamiento de aguas era reducir el contenido en materia en suspensión del agua a menos de 30 mgl-1 y la demanda biológica de oxígeno (ver más adelante) a menos de 20 mgl-1. La aguas a tratar pueden ser domésticas (compuestas de aguas negras, restos de alimentos, patógenos y parásitos), y aguas industriales (contaminadas principalmente por compuestos xenobióticos y metales pesados). Los objetivos del tratamiento biológico son tres: (1º) reducir el contenido en materia orgánica de las aguas, (2º) reducir su contenido en nutrientes, y (3º) eliminar los patógenos y parásitos.

2.- Composición de las aguas residuales domésticas.

Están contaminadas con materia orgánica fácilmente biodegradable (40-60% de proteínas, 25-50% de carbohidratos y 10% de lípidos, con trazas de otros compuestos). La materia orgánica puede encontrarse como carbono disuelto (Carbono Orgánico Disuelto, COD) o en forma particulada (Carbono Orgánico Particulado, COP). Este último puede separarse del disuelto por decantación o por floculación.

Existen tres métodos principales para medir la cantidad de materia orgánica en el agua:

(1º) la medida de la demanda biológica de oxígeno (2º) la de la cantidad total de carbono (3º) la de la demanda química de oxígeno.

Todos los métodos se basan en la valoración de la cantidad de oxígeno necesaria para oxidar diferentes fracciones de la materia orgánica presente en el agua.

2.1.- Demanda biológica de oxígeno: (DBO),

Se define como la concentración de oxigeno disuelto consumido por los microorganismos, presentes en el agua o añadidos a ella para efectuar la medida de este parámetro, en la oxidación de toda la materia orgánica presente en la muestra de agua. Su valor debe ser inferior a 8 mgl -1. La DBO puede descomponerse en dos factores:

(1º) La demanda de oxígeno para la oxidación realizada por los microorganismos quimioheterotrofos o Demanda Hidrogenada o Hidrogenosa de Oxigeno (DOH) (2º) El oxígeno consumido en las oxidaciones de los quimioautotrofos nitrificantes (bacterias que oxidan el NH4 para obtener energía o Demanda Nitrogenada de Oxigeno, DON).

La DOH se mide añadiendo la muestra de agua a analizar a una solución tampón que contiene las sales inorgánicas necesarias para el crecimiento de los microorganismos y que está saturada de O2. La muestra se incuba en estas condiciones durante cinco días a 20ºC en la obscuridad. Las concentraciones de oxígeno se miden utilizando un electrodo de oxígeno. Es necesario añadir al experimento un inhibidor de la nitrificación (ver más adelante). El cálculo de la DOH se hace según la fórmula:

DOH (mgl-1) = (D1-D5)/P

Donde: D1 y D5 son las concentraciones de oxígeno en la muestra el primero y el quinto día P el coeficiente de dilución de la muestra.

Para realizar esta medida se necesita una población mixta de microorganismos; si esta no es muy abundante puede suplementarse con un inóculo destinado a la degradación del material orgánico en el tiempo requerido. El valor de la DOH comprende todas las transformaciones oxidativas de la materia orgánica biodegradable:

Comp. Orgánicos + O2 + bacterias → biomasa bacteriana + CO2 + NH4 + H2O

Biomasa bacteriana + O2 + protozoos → biomasa de protozoos + CO2

El rendimiento de la conversión de la biomasa bacteriana en la de protozoos es de 0,78 mg protozoos / mg bacterias.

La DON es la cantidad de oxígeno consumida por los microorganismos nitrificantes que oxidan el NH4 como fuente de energía. En general, el consumo viene a ser de unos 4.57 gr O 2 por gr de NH4 consumido; pero parte de este nitrógeno no se oxida a NO2

- o a NO3- sino que se incorpora a

las bacterias, por lo que el factor de corrección para los cálculos es de 4.33:

DON = (Ndisponible - Nasimilado) * 4.33

La DON es la causante de muchos altos valores de demanda de oxígeno en aguas con bajo contenido de materia orgánica: en aguas ricas en NH4 la actividad de las bacterias nitrificantes puede consumir entre el 25 y el 85% del total del oxígeno consumido. Para distinguir entre la DOH y la DON se emplean inhibidores de la nitrificación que no afectan al consumo heterótrofo de materia orgánica. Un inhibidor de este tipo de la 2-cloro-6(tricloro-metil)-piridina.

2.2.- Demanda química de oxígeno (DQO):

(DQO) es la cantidad de oxígeno requerida para oxidar completamente la materia orgánica utilizando oxidantes químicos como el dicromato potásico (K2Cr2O7) con ácido sulfúrico. Los valores de la DQO han de estar en relación con los de la DBO; si la DQO es mucho mayor que la DBO una parte importante de la materia orgánica presente en el agua no será fácilmente biodegradable. Para las aguas domésticas, la DQO es del orden de 250 a 1000 mg O 2 por litro, y la relación DBO/DQO oscila entre 0.4 y 0.8. Las aguas estabilizadas biológicamente tienen una relación DBO/DQO = 0.12. (Ver tratabilidad de las ARD)

2.3.- Carbono orgánico total: (COT)

Se mide mediante la oxidación de la materia orgánica aplicando calor y oxígeno o mediante oxidantes químicos y se detecta mediante análisis infrarrojo de la producción de CO2. Los valores deben ser comparables con los de la DQO.

3.- Pasos del tratamiento de aguas residuales

En el tratamiento de aguas residuales se pueden distinguir hasta cuatro etapas que comprenden procesos químicos, físicos y biológicos:

(1º) Tratamiento preliminar, destinado a la eliminación de residuos fácilmente separables. (2º) Tratamiento primario que comprende procesos de sedimentación. (3º) Tratamiento secundario que comprende procesos biológicos (lodos activados) y químicos (desinfección) (4º) Tratamiento terciario o avanzado que está dirigido a la reducción final de la DBO, la disminución de nutrientes y la eliminación de patógenos y parásitos.

4.- Procesos de lodos activados

4.1.- Descripción del sistema básico:

Tratamiento iniciado en Inglaterra a principios de este siglo y que se ha difundido mucho. Consiste en un tratamiento aerobio que oxida la materia orgánica a CO2 y agua y NH4

+ y nueva biomasa. El aire necesario para el tratamiento se proporciona mediante difusión o por tratamiento mecánico. Durante el tratamiento los microorganismos forman flóculos que, posteriormente, se dejan sedimentar en un tanque ad hoc denominado tanque de clarificación. El sistema básico

comprende, pues, un tanque de aireación y un tanque de clarificación por los que se hace pasar los lodos varias veces. Los dos objetivos principales del sistema de lodos activados son

(1º) La oxidación de la materia biodegradable en el tanque de aireación (2º) La floculación que permite la separación de la biomasa nueva del efluente tratado.

4.2.- Microorganismos presentes en los flóculos:

Los flóculos de lodo activado contienen partículas orgánicas, inorgánicas y bacterias. El tamaño de las partículas varía entre 1 μm y 1000 μm. Las células vivas del flóculo representan entre el 5 y el 20% del total de bacterias. Los microorganismos presentes en los flóculos son bacterias, hongos, protozoos y rotíferos.

(1º) Bacterias:

Constituyen el principal componente. Los géneros principales son Zooglea, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Achromobacter, Corynebacterium y Acinetobacter; también hay formas filamentosas como Beggiatoa. Estas bacterias oxidan la materia orgánica y producen polisacártidos y otros polímeros extracelulares que facilitan la floculación. Los microorganismos aerobios representan una fracción importante cuyo número varía inversamente al tamaño del flóculo puesto que la difusión de O2 al interior se va viendo más dificultada. En los flóculos de gran tamaño el interior es anaerobio y permite el crecimiento de anaerobios estrictos (tales como metanógenos) que han sobrevivido fases de mayor aerobiosis en pequeñas bolsas anaerobias internas en flóculos de menor tamaño. Su número en los lodos activados llega a 10 8

ufcml-1 y entre ellas el grupo más importante numéricamente es el de Pseudomonas. En los lodos activados también hay bacterias autotrofas tales como las nitrificantes (Nitrosomonas y Nitrobacter responsables de la DON) e incluso algunas bacterias fotosintéticas.

(2º) Hongos:

Normalmente no están presentes. Sólo en condiciones ambientales muy especiales (bajo pH, deficiencia de nitrógeno, presencia de productos tóxicos) pueden apaercer ciertos hongos de los géneros Penicillium y Cephalosporium, entre otros.

(3º) Protozoos:

Están presentes como depredadores de las bacterias. Pertenecen a los tres grupos (ciliados, flagelados y rizópodos). La actividad de los protozoos contribuye significativamente a la reducción de la DBO.

(4º) Rotíferos:

Son metazoos de tamaño entre 100 y 500 μm. Son organismos que se unen al flóculo y desarrollan dos importantes funciones en él:

(a) Eliminan las bacterias libres que no se han agregado al flóculo, y

(b) Contribuyen a la formación del flóculo mediante la producción de materia fecal rodeada de capas de mucus.

4.3.- Aspectos nutricionales del proceso:

Las aguas residuales domésticas tienen una relación C: N: P de 100:5:1 lo que satisface las necesidades nutritivas de muchos microorganismos que digieren la matera orgánica en pocas horas transformando la DBO en biomasa. La aireación en este tanque permite

(1º) Mantener las condiciones de aerobiosis que dirigen el proceso (2º) Mantener en suspensión los flóculos para que puedan acceder a todo el volumen de líquido en tratamiento.

Cuando los microorganismos han reducido la cantidad de nutrientes de forma significativa entran en una fase metabólica similar a la estacionaria y en ella producen gran cantidad de polímeros extracelulares (por ejemplo Zooglea) que permiten la agregación del material del flóculo. Los heteropolisacáridos que forman el núcleo del flóculo son refractarios a la biodegradación.

5.- Digestión anaerobia de aguas residuales

Consiste en una serie de procesos microbiológicos dirigidos a la digestión de la materia orgánica con producción de metano. Es un proceso en el que pueden intervenir diferentes tipos de microorganismos pero que está dirigido principalmente por bacterias.

Presenta una serie de ventajas frente a la digestión aerobia:

(1º) muchas bacterias anaerobias pueden usar CO2 como aceptor de electrones y, por tanto, no hay necesidad de suministrar oxígeno por lo que el proceso es más barato. (2º) Se produce menos cantidad de lodo porque la eficiencia energética de las bacterias anaerobias es menor: el 50% del carbono es convertido en biomasa en condiciones aerobias y sólo el 5% en condiciones anaerobias. (3º) Se produce un gas útil. (4º) El requerimiento energético es menor (5º) Se pueden degradar compuestos xenobióticos ambientales de gran poder deletereo.

Sin embargo, se pueden citar algunos inconvenientes:

(1º) Es un proceso lento, (2º) Muy sensible a agentes tóxicos.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS.ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES

Recuento de microorganismos viables totales. Métodos físicos para la detección de microorganismos. Métodos químicos para la detección de microorganismos. Métodos inmunológicos. Exámen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras.

1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras líquidas u homogeneizadas).

- Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento.

- Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales. Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso. Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:.

Contaje en Placa Estándar (Del ingles Standard Plate Count). Determinación del número más probable. Métodos basados en la reducción de colorantes por viables. Contaje microscópico directo.

1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo,

el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).

3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica de epifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables.

4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación.

6.- Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.

7.- Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exácto.

8.- Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).

9.- Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

10.- Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias.

Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de colonias observable (técnicas biológicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en técnicas químicas, físicas e inmunológicas.

 2. Métodos físicos para la detención de microorganismos.

A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como función del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 células por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones».

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el medio.

C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión por un sistema de detección; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersión de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Métodos químicos de detección de microorganismos.

A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.

B) Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacárido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no-viables. Es muy rápido.

C) Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern.

D) PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo en cuestión.

E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

F) Radiometria: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente.

G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.

4. Métodos inmunológicos.

Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas móviles de Salmonella y otras bacterias)

A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicación ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.

B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la detección de Salmonella, el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos.

C) Test 1 - 2 de Salmonella : Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las cámaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias móviles de este género atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella.

D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.

E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado.

El método se ha usado para detección de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.

F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos.

5. Examen de superficies.

- Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos presentes en superficies contaminadas. Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento). En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.

6. Recuento de mohos y levaduras.

Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es más rápido que el de los mohos.