PRACTICA Nº1 EQUIPOS DE LABORATORIO EN MICROBIOLOGÍA. PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA

MICROBIOLOGÍA

DOCENTE: QUISPE MANCO; MARIA DEL CARMEN

INTEGRANTES:

ARIAS GUZMAN; EVELYN

CHAVEZ QUIJANO; MELISSA

FERNÁNDEZ ROCCA, CARLOS

HURTADO QUISPE; MELINA

PALPA GOMEZ; JESICA

TRUJILLO MUCHA; MILAGROS

ESTERILIZACIÓN DE PLACAS Y TUBOS

POR CALOR SECO (180°C POR 1 HORA)

Los microorganismos se destruyen por oxidación para eso se necesita que la temperatura y el tiempo sea mayor para que actué sobre los microorganismos. El calor se inicia por conducción y se propaga por convección.

Ejemplo: materiales de vidrio.

ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

POR CALOR HÚMEDO: (121°C POR 15 MINUTOS)

El mecanismo de acción del funcionamiento del autoclave se funde en ebullición del agua a una presión superior a lo normal y al subir la presión atmosférica aumenta la temperatura. En consecuencia si la presión del vapor aumenta, la temperatura también sube y así el vapor penetra por osmosis a la célula coagulando su citoplasma.

ESTERILIZACIÓN DE MEDIO ORGÁNICO

TINDALIZACIÓN

Consiste en someter el producto 3 días sucesivos a un calentamiento entre 56-100°c, logrando destruir las formas vegetativas, sirve para esterilizar sustancias orgánicas. Su objetivo es destruir las esporas cuando estas germinan evitando contaminaciones por microorganismo resistentes.

FILTRACIÓN

El mecanismo de filtración se debe al hecho de que los microorganismos por tener carga negativa y los filtros positiva, quedan absorbidas al actuar la presión o vacío.

ESTERILIZACIÓN DE MEDIO ORGÁNICO

A. AGAR MAC CONKEY

B. AGAR MANITOL

C. AGAR SANGRE

Se puso en baño maria por 15-20 minutos hasta que el medio se ponga transparente. Luego se deja enfriar hasta 45°c y se vierte a las placas (100 mm) aprox. 30 ml. A agar base se le agrega 5% de sangre de carnero (pero en este caso se utilizo sangre humana).

BA C

PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO

PREPARACIÓN DEL MEDIOS DIFERENCIALES

A. CITRATO

B. LIA

C. UREA

Se puso en baño maría por 15-20 minutos hasta que el medio se ponga transparente. Luego se deja enfriar hasta 45°c y se vierte a los tubos. En el caso de lia es tubo debe tener fondo y pico (para que la bacteria se desarrolle en medio anaerobio y aerobio), en el caso de urea y citrato debe tener pico de flauta. Estos medios se utilizan para la identificación de bacterias GRAM (-)

A

B

C

CUESTIONARIO 11. ¿Qué es la bioseguridad, de cuántos niveles consta y qué características posee cada uno de estos niveles? ¿Qué tipo de laboratorio realizamos las practicas de la universidad?

La bioseguridad es un conjunto de medidas probadamente eficaces para evitar la adquisición accidental de infecciones con patógenos contenidos en las muestras, así como los riesgos relacionados con la exposición a agentes químicos, físicos o mecánicos a los que está expuesto el personal en los laboratorios.

Nivel de Biosegur

idad

Riesgo Biológico

Tipo de Laboratorio Estudio y Agentes

1 Mínimo Enseñanza básica investigación

Estudio de infecciones de bajo riesgo. Agentes: neumococos, salmonella

2 Moderado Servicios de atención primaria; diagnostico, investigación

Agentes infecciosos: hepatitis, la enfermedad de lyme, influenza.

3 Alto Diagnostico especial, investigación

Se requiere múltiples vacunas. Agentes infecciosos: ántrax, tifu , VIH

4 Extremo Unidades de patógenos peligros

Agentes infecciosos: ebola, hantavirus

CUESTIONARIO 12. ¿Realice un cuadro resumen con los métodos físicos y químicos

de esterilización?

Esterilización

Físico

Calor

Seco

Poupinel

Húmedo

Vapor a presión

Radiación

Ionizantes

Radiación gamma

Químico

Gases

Oxido de etileno

Peróxido de hidrogeno

Formol

CUESTIONARIO 1

3. ¿Cuál es la ventaja del uso del autoclave?

La ventaja que posee este método de esterilización es que el tiempo de exposición de los materiales a estilizar es mas corto que el calor seco, reduce el tiempo de exposición para la esterilización por que reduce el tiempo de ciclo completo, no deja residuos tóxicos en material, DESTRUCCÓN DE BACTERIAS Y ESPORAS EN CORTO TIEMPO y hay bajo deterioro del material expuesto.

CUESTIONARIO 1

4. ¿Cómo realiza el control de calidad en calor seco y húmedo?

CALOR SECO: Se realiza control de calidad con Cintas Testigo, Controles químicos internos, Color test,

CALOR HUMEDO: Se realiza control de calidad con Cintas Testigo, Bowie & Dick,

CUESTIONARIO 1

5. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo líquido bacteriano se derrama sobre una superficie.

Primero se le agrega un desinfectante para este tipos de caso seria un betagen (desinfectante cuaternario) o lejía estos inactivaran a la bacteria, luego se procede a cubrir con un paño y se avisa que tipo de bacteria se cayo en la zona, finalmente se avisa al personal de limpieza que están altamente capacitados ellos terminaran de limpiar la zona, llevándose el material contaminado para ponerlo en una bolsa roja y autoclavarlo.

6. ¿Cuáles son los riesgos y problemáticas en el grupo que se tendrán al no seguir las indicaciones recomendadas?

RIESGOS

• Que se puedan sufrir accidentes en la prácticas de laboratorio.

• Que exista el riesgo de contaminación por los medios de cultivos que se

usan y/o materiales potencialmente contaminantes.

• Que se sufra contaminación en el lugar del trabajo

PROBLEMÁTICA

Que no se sepa como actuar en caso de un accidente

Que se pueda ensuciar la mesa de trabajo por no seguir reglas o

cuidados de como manipular materiales potencialmente peligrosos.

CUESTIONARIO 1

PRÁCTICA Nº2 COLORACIONES

SIMPLES Y COMPUESTAS

COLORACIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

TINCIÓN SIMPLE

Se utiliza para determinar la morfología bacteriana y la agregación o tipo de distribución bacteriana. Se caracteriza porque:

• Necesita fijación previa

• Se utiliza un solo colorante

Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes celulares, ya que las células bacterianas en medias a pH neutros suelen presentar una débil carga negativa. Así pues la bacteria cargada negativamente se combinara con los iones positivos de los colorantes básicos (azul de metileno), de tal forma que la bacteria quedara coloreada.

En este caso se utilizo la cepa de yogurt

TINCIÓN DIFERENCIALTINCIÓN GRAM

Se utiliza para diferenciar bacterias GRAM (-) y GRAM (+), esta diferenciación se debe a la pared celular de la bacteria.

• Se necesitara fijación previa generalmente por calor.

Se basa en el empleo de un primer colorantes básico (cristal violeta) la cual teñirá a las bacterias de azul; posteriormente un mordiente (lugol) la cual aumentara la afinidad del primer colorante a las células. Finalmente un agente decolorante que decolorará solamente un tipo de bacterias que serán teñidas con el colorante de contraste.

Este distinto comportamiento frente a la decoloración es dependiente de la composición de la pared bacteriana, hecho que servirá para clasificarlas como GRAM + (aquellas que no han sido decoloradas y que por lo tanto quedan teñidas de azul) o como GRAM – (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teñidas de color rojo).

Para esta coloración se utilizaros las cepas 10 (BGP) y la 11 (VC)

TINCIÓN DIFERENCIAL

Cristal violeta x 1 min.

Lugol alcohólico por 1

min.

Alcohol acetona

para decolorar

por 30 seg.

Safranina por 30 seg.

Cepas 10 y 11 Recolección de las cepas

Combinar solución salina

con cepas

TINCIÓN DIFERENCIAL

TINCIÓN ZIEHL- NEELSEN

Se utiliza para bacterias alcohol acido resistentes (Mycobacterium) esto se debe al alto contenido lipídico de estas bacterias, fundamentalmente fosfolípidos ceras y ácidos micolicos.

La fucsina fenicada, resiste la decoloración porque esta muy ligado a los lípidos ya que es más soluble en ellos que en el agente decolorante.

De ahí que se necesiten, para este tipo de tinciones, colorantes altamente concentrados así como la presencia de calor que facilite su penetración al interior de dichas bacterias han quedado teñidas, su decoloración posterior no es posible, resistiendo incluso a decoloraciones acidas. Así pues, utilizando esta propiedad podemos diferenciar este tipo de bacterias, como es el caso del genero Mycobacterium, del resto que no presentan esta propiedad.

El azul de metileno se utiliza como colorante de contraste

TINCIÓN DIFERENCIAL

Yogurt Fucsina

Fenificada por 5 min.

Emisión de los 3 vapores

Decolorar con alcohol ácido

Azul de metileno por 2 min.

COLORACIÓN ESTRUCTURALTINTA CHINA

Se utiliza para observar las capsulas de las bacterias.

No son una verdadera tinción. se llaman así porque lo que realmente se tiñe es el fondo sobre el que están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teñir. se emplea para ver la cápsula de s. pneumoniae y Cryptococcus neoformans en LCR.

COLORACIÓN PARA ESPORAS

TÉCNICA DE WIRTZ CONKLIN

Se utiliza para la identificación de esporas las cuales se observaran de color verde (debido a su tinción con verde de malaquita) entre las bacterias que presentaran un color rojo (debido a su tinción con safranina).

• Verde de malaquita 2 por 3 min.

• Calentar con el mechero hasta la emisión de vapores.

• Aplicar la solución de safranina por 1 min.

CUESTIONARIO 21.Cuál es la diferencia entre bacterias gram positivas y gram

negativas, cuál es el fundamento de la coloración gram?

Es probable que la diferencia entre las bacterias gram positivas y gram negativos se deba a la naturaleza física de sus paredes celulares

Gram positivas: las bacterias gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano y carecen de membrana externa

Gram negativas: el peptidoglucano es solo una pequeña porción de la pared, en la que predominan las proteínas, fosfolípidos, y lipopolisacaridos que se unen formando tres capas. la capa externa formada lipopolisacaridos, fosfolípidos y proteínas. la capa intermedia es mas fina integrada por moléculas de lipoproteínas. la zona mas profunda de peptidoglucano.

FundamentoDurante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta en mezcla con el lugol forma en la célula el complejo carbohidrato -proteína- ribonucleato de magnesio que al ser tratado con alcohol acetona no cede a la decoloración, quedando teñida de violeta. En cambio las que se decoloran se tienen con el colorante de contraste safranina. Dicho comportamiento se debe a la diferencia a la pared celular de los dos tipos de células.

2. Qué es un mordiente para qué se utiliza?

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.

CUESTIONARIO 2

CUESTIONARIO 2

3. Cómo realizaría el control de calidad de las tinciones?

Para un control optimo por ejemplo en este caso de la tinción Gram, los organismos empleados podrían incluir un organismo Gram positivo que tienda a decolorarse rápidamente, tal como un Bacillus sp. y un organismo Gram negativo, tal como Neisseria catarrhalis. los porta control pueden emplearse para controlar los reactivos nuevos o auxiliares de laboratorio que teñirán los portas. los porta control deben teñirse por lo menos una vez a la semana y cada vez que se prepara un reactivo nuevo. Los resultados deben anotarse en el libro de control de calidad apropiado. para estar seguros de que los portas control se examinan y realmente con cuidado, los tipos o proporciones de bacterias Gram-positivo y Gram-negativo pueden cambiarse periódicamente.

CUESTIONARIO 2

4. Mencione ejemplos de tinciones estructurales

Para la capsula

• Colorante de his

• Colorante de anthony . welch

• Colorante de nigrosina

Para flagelos

• Colorante de leifsson

• Colorante de casares

Para gránulos o corpúsculos de inclusión

• Colorante de loeffler para corinebacterum

• Colorante de Albert

PRÁCTICA Nº3 PREPARACIÓN DE

MEDIOS DE CULTIVO

POR SUS CONSISTENCIA - MEDIOS LÍQUIDOS O CALDOS

Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres.

POR SU CONSISTENCIA - MEDIOS SÓLIDOS

Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa.

Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina UNIDAD FORMADORA DE COLONIA (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.

POR SUS CONSISTENCIA - MEDIOS SEMISÓLIDOS

Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno De sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.

POR SU COMPOSICIÓN - MEDIOS COMPLEJOS

Fueron los primeros utilizados, y los más empleados. Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.

POR SU COMPOSICIÓN – MEDIOS DEFINIDOS

Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

POR SU UTILIZACIÓN – MEDIOS SELECTIVOS

Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias

Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el aislamiento de patógenos entéricos.

POR SU UTILIZACIÓN – MEDIOS DIFERENCIALES

Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas diferenciar géneros o especies. No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero si contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos.

Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.

CUESTIONARIO N°3

1. ¿Cuáles son las recomendaciones para preparar agar sangre y agar chocolate?

PARA ELLO ANTES DE COMENZAR EL TRABAJO SE ESTERILIZARÁ, JUNTO CON LOS MEDIOS DE CULTIVO, EL MATERIAL QUE POSTERIORMENTE VA A SER UTILIZADO.

AGAR SANGRE:

• CALENTAR CON AGITACIÓN FRECUENTE

• ESTERILIZAR 20 MINUTOS A 121°C.

• ENFRIAR A 45-50°C AGREGAR 5-10 % DE SANGRE OVINA DESFIBRINADA ESTÉRIL A TEMPERATURA AMBIENTE AL MEDIO ESTERILIZADO, FUNDIDO Y ENFRIADO A 45-50 ºC. HOMOGENIZAR DE FORMA MUY SUAVE Y DISTRIBUIR EN PLACAS DE PETRI ESTÉRILES SIN GENERAR BURBUJAS CERCA AL MECHERO. EL MEDIO LISTO PARA USAR SE GUARDA A TEMPERATURA DE 2 – 8°C.

AGAR CHOCOLATE:

• DESPUÉS DE AÑADIR LA SANGRE Y AGITANDO FRECUENTEMENTE SE MANTIENE EL MEDIO DE CULTIVO A 80°C POR 10 MINUTOS HASTA QUE ADQUIERA UN COLOR PARDO CHOCOLATADO.

• TENER EN CUENTA LAS CONDICIONES DE ESTERILIDAD, BIOSEGURIDAD Y TEMPERATURA.

CUESTIONARIO N°3

2. Realizar un cuadro de 10 medios de cultivo: tipo de medio, PH e indicador

CUESTIONARIO N°3

3. ¿Cómo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo?

• Control de calidad del agua destilada.

Conductividad.

Ph

Contaminación microbiana

Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes

Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.

• Evaluación de la eficiencia de los medios de cultivo

Cada lote se prueba antes de su uso, mediante la inoculación de controles positivos y negativos.

• Protocolo de control de calidad.

1. Aspecto fisico: nivel, volumen, color, empaque.

2. Control de esterilidad: 5% de la producción total se incuba durante 72 horas. Se descarta o se acepta.

3. Control de ph.

4. Calidad microbiona: método ecométrico, cepas atcc.

CUESTIONARIO N°3

• MÉTODO ECOMÉTRICO: técnica simple que permite recuperara, comparar y cuantificar el crecimiento de microorganismos de referencia (ATCC) con cargas de UFC definidas en los diferentes medios de cultivo.

• Productividad: determina el rendimiento, recuperación y crecimiento de microorganismos que habitualmente se desarrollan en un medio de cultivo.

• Selectividad: evalúa la supresión del crecimiento del microorganismo, que se espera que sea inhibido en medio.

PRÁCTICA Nº4 MÉTODOS DE

SIEMBRA

METODO ESTRÍA SIMPLE

• Es para aislar una sola bacteria que estamos sospechando. Se hace en muestras como: ORINA, LCR, LIQUIDO PLEURAL. Lo mas importante de este método es para obtener colonias aisladas.

MÉTODO SIEMBRA POR AGOTAMIENTO

• Se hace en muestras como: ESPUTO, SECRECIÓN VAGINAL, SECRECIÓN FARÍNGEA, y para obtener colonias muy aisladas y separadas de las saprofitas con las patógenas. Se hace tres agotamientos y una estria

MÉTODO SIEMBRA POR INOCULACIÓN

• Mayormente se realiza en caldos nutritivos y para hacer un antibiograma. Y también se hace para potenciar el crecimiento bacteriano

MÉTODO SIEMBRA POR DISPERSIÓN

• Es un método usado mayormente para realizar antibiogramas a partir de un inoculo de una cepa obtenido a partir de una muestra del paciente. Se hace en 3 direcciones y por agotamiento con un hisopo estéril.

MÉTODO SIEMBRA POR PUNTURA + ESTRÍA

• Se hace en medios diferenciales que tienen fondo y pico como TSI y LIA y se hace con asa de siembra

CUESTIONARIO N°4

1. CITE UN EJEMPLO DEL USO DE CADA TÉCNICA DE SIEMBRE.

MÉTODO POR ESTRÍA O SIMPLE. EJEMPLO: MUESTRAS DE ORINA EN AGAR MACCONKEY

MÉTODO POR AGOTAMIENTO. EJEMPLO: MUESTRA DE ESPUTO, SECRECIÓN FARÍNGEA EN AGAR SANGRE

MÉTODO POR INOCULACIÓN. EJEMPLO: MUESTRA PUNTAS DE CATÉTER EN CALDO TIOLGLICOLATO, PARA

REALIZAR ATB EN UNA SOLUCIÓN SALINA ESTÉRIL.

MÉTODO DE DISPERSIÓN. EJEMPLO: MAYORMENTE ESTE MÉTODO SE USA PARA REALIZAR UNA

ANTIBIOGRAMA EN AGAR MUELLET HINTON, DESDE UN INOCULO DE UNA CEPA PURA DE MUESTRA PREVIO CRECIMIENTO EN LA SIEMBRA PRIMARIA.

MÉTODO POR PUNTURA Y ESTRÍA. EJEMPLO: ESTO SE REALIZA PARA DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA EN AGAR TSI Y LIA,

DESDE UNA CEPA PURA PREVIO CRECIMIENTO DE MUESTRA QUE FUE SEMBRADA.