procedimientos de microbiologia

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Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinador: M. Angeles Domínguez

Autores: Pere Coll

M. Teresa Coque

M. Angeles Domínguez

Julio Vázquez

Jordi Vila

ISBN: 84-609-7030-2

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INDICE:INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO1. Introducción2. Métodos moleculares de tipificación en el laboratorio de microbiología3. Características de los marcadores moleculares. Criterios para la elección de un buen marcador molecular.

3.1. Evaluación de los marcadores moleculares

3.1.1. Criterios que evalúan su eficacia3.1.2. Criterios que evalúan su eficiencia3.1.3. ¿Con qué colección de cepas deben evaluarse los marcadores epidemiológicos?3.1.4. Análisis de los datos

3.2. Bibliografía específica4. Análisis del ADN extracromosómico y de los elementos genéticos de transmisión horizontal

4.1. Plásmidos4.1.1. Fundamentos y variantes técnicas

4.1.1.1. Crecimiento del cultivo bacteriano.4.1.1.2. Centrifugación, lisis bacteriana y extracción del ADN plasmídico.4.1.1.3. Purificación del ADN.4.1.1.4. Digestión del ADN plasmídico.4.1.1.5. Determinación del peso molecular de plásmidos.

4.1.2. Criterios para la interpretación de los resultados4.1.2.1. Análisis de plásmidos sin restricción.4.1.2.2. Análisis de perfiles de plásmidos tras restricción.

4.1.3. Indicaciones para la aplicación del análisis de plásmidos4.1.4. Inconvenientes de la técnica

4.2. Análisis de otros elementos de transmisión horizontal (ETH)4.2.1. Indicaciones para el análisis epidemiológico de ETH4.2.2. Criterios para la interpretación de resultados

4.3. Bibliografía específica5. Análisis del ADN mediante procedimientos de restricción e hibridación

5.1. Fundamentos y variantes técnicas5.1.1. Hibridación con sondas específicas5.1.2. Ribotipado

5.2. Procedimiento técnico5.2.1. Subcultivo de la cepa5.2.2. Lisis bacteriana5.2.3. Extracción del ADN total5.2.4. Restricción del ADN5.2.5. Electroforesis5.2.6. Transferencia5.2.7. Hibridación5.2.8. Revelado

5.3. Criterios para la interpretación de los resultados5.4. Indicaciones5.5. Inconvenientes de la técnica5.6. Bibliografía específica

6. Análisis del ADN cromosómico mediante macrorrestricción: Electroforesis en campo pulsante (PFGE)6.1. Tratamiento previo de los microorganismos

6.1.1. Crecimiento bacteriano6.1.2. Lisis6.1.3. Lavados6.1.4. Restricción

6.2. Fundamentos y variantes técnicas6.2.1. Componentes de un sistema de PFGE6.2.2. Variables que afectan a la resolución del PFGE

6.3. Criterios para la interpretación de resultados6.4. Indicaciones6.5. Inconvenientes de la técnica6.6. Bibliografía específica

7. Análisis del ADN mediante amplificación con PCR7.1. Tratamiento previo de los microorganismos7.2. Fundamentos y variantes técnicas7.3. Criterios para la interpretación de resultados


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7.4. Indicaciones7.5. Inconvenientes de la técnica7.6. Bibliografía específica

8. Análisis del ADN por secuenciación: Multilocus sequence typing (MLST)8.1. Tratamiento previo de los microorganismos8.2. Fundamentos y variantes técnicas

8.2.1. Aplicación directa sobre muestras clínicas en ausencia de cultivo8.2.2. Multilocus Restriction Type (MLRT) 8.2.3. Aplicación de MLST mediante tecnología de micromatrices

8.3. Criterios para la interpretación de resultados8.4. Indicaciones8.5. Inconvenientes de la técnica8.6. Bibliografía específica

9. Otras técnicas de tipificación molecular9.1. Amplification fragment length polymorphism (AFLP)9.2. Bibliografía específica9.3. Micromatrices de ADN9.4. Bibliografía específica

DOCUMENTOS TÉCNICOS 1. Análisis de ADN extracromosómico y de los elementos genéticos de transmisión horizontal: Análisis de ADNplasmídico (métodos de kado-liu y birnboim-doly).

2. Análisis del ADN mediante procedimientos de restricción e hibridación: análisis del polimorfismo de restricciónasociado a IS6110.

3. Análisis del ADN cromosómico mediante macrorrestricción: Tipificación molecular del ADN cromosómicomediante electroforesis en campo pulsante (PFGE).

4. Análisis del ADN mediante amplificación con pcr: Tipificación molecular utilizando técnicas de amplificación deADN relacionado con secuencias rep (repetitive extragenic palindrom).

5. Análisis del ADN por secuenciación: Multilocus sequence typing (MLST) en Neisseria meningitidis


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Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

18. MÉTODOS MOLECULARES DE TIPIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA EN

BACTERIOLOGÍA. 2005

Coordinador: M. Angeles Domínguez

Autores: Pere Coll

M. Teresa Coque

M. Angeles Domínguez

Julio Vázquez

Jordi Vila


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DOCUMENTO CIENTÍFICO

1. INTRODUCCIÓNEn esta nueva edición de los Procedimientos enMicrobiología Clínica, la Sociedad Española deEnfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica haconsiderado de interés incluir un documento querecoja las aplicaciones de los métodos moleculares

en la tipificación bacteriana y su utilidad en losestudios epidemiológicos.Los sistemas de tipificación molecular constituyenuna de las aportaciones microbiológicas que másdifusión han tenido en los últimos años. Estossistemas comprenden una gran variedad de técnicasque tienen como objeto comparar la composición delos ácidos nucleicos de dos o más microorganismos.De este modo, se puede reconocer la relación entreaislamientos vinculados epidemiológicamente y, portanto, derivados recientes de un microorganismoprecursor común. A la vez, deben ser técnicascapaces de diferenciar aislamientos no relacionados,

con independencia de su pertenencia a la mismaespecie microbiológica o taxón. Con anterioridadestos estudios se basaban en las característicasfenotípicas de los microorganismos (propiedadesantigénicas, metabólicas o de resistencia antibiótica).Sin embargo, muchos de estos sistemas fenotípicosson limitados para establecer diferencias osimilitudes concluyentes entre microorganismos.En este documento se utilizará una nomenclaturaque mantiene las siglas originales en inglés de lasdiferentes técnicas y que son como se las conoceinternacionalmente.

2. MÉTODOS MOLECULARES DE TIPIFICACIÓNEN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIALas técnicas moleculares que analizan propiedadeso polimorfismos genéticos en los microorganismos,han ampliado notablemente el campo de latipificación en microbiología. Los fundamentos deestas técnicas son variables: estudios de restriccióndel ADN cromosómico o extracromosómico, análisisdel número de copias de determinadas secuenciasde inserción o repetitivas a lo largo del cromosoma ode las regiones entre secuencias de inserción orepetitivas adyacentes (REP-PCR; polimorfismoIS6110 en Mycobacterium tuberculosis) o

amplificación arbitraria de fragmentos genéticos (AP-PCR). La mayor ventaja de estos métodos radica enla estabilidad de los marcadores genéticos utilizadosy en la posibilidad de aplicarlos universalmente adistintos géneros y especies de microorganismos.Los marcadores moleculares se han aplicado adiferentes campos y su disponibilidad ha mejoradonuestro conocimiento sobre:- patogénesis e historia natural de ciertas

infecciones,- detección de brotes y epidemias, identificación

de reservorios y de mecanismos de transmisiónde patógenos,

- diseño de medidas de control de propagación dela infección, y

- evolución genética de poblaciones microbianas.

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En todas estas aplicaciones el objetivo de losmarcadores moleculares es el de definir la relación

existente, clonal o no, entre los aislamientosestudiados. El término clon o grupo clonal enepidemiología hace referencia al grupo deaislamientos relacionados por el hecho de descenderde un ancestro común, esto es, por formar parte deuna cadena de replicación y transmisión. Las cepas

relacionadas provienen, pues, de la expansión clonalde un precursor único y poseen un nivel de similitudentre sus genotipos y fenotipos significativamentesuperior al que se encontraría entre aislamientos norelacionados de la misma especie seleccionadosarbitrariamente.Merece también especial mención, la diseminaciónhorizontal entre bacterias (del mismo o distintotaxón) de plásmidos o elementos genéticospotencialmente móviles (transposones, integrones,fagos...) que contengan secuencias relevantesepidemiológicamente, como por ejemplo, genes deresistencia antibiótica o de virulencia. A estos

aspectos se ha dedicado también uno de losapartados.La aplicación de técnicas y marcadores deepidemiología molecular es indispensable en elestudio de la infección nosocomial, sobre todo enhospitales en los que se dispone de unidades devigilancia intensiva, neonatología, quemados,hematología u oncología, en donde ingresanpacientes susceptibles de adquirir infecciones gravesintrahospitalarias. Asimismo, existen numerosasreferencias relacionadas con la aplicación demarcadores moleculares al estudio de lasinfecciones extrahospitalarias, son algunos ejemplos

los estudios de patrones de transmisión detuberculosis, la identificación de reservorios delegionelosis y los estudios epidemiológicos deinfección por neumococo o meningococo.Los métodos moleculares aplicados al estudioepidemiológico pueden estructurarse en lossiguientes apartados: 1) análisis de ADNextracromosómico; 2) restricción de ADNcromosómico y detección de secuencias porhibridación con sondas; 3) macrorrestricción de ADNcromosómico, 4) amplificación de secuenciasgenéticas con o sin restricción posterior del productoobtenido, 5) análisis de ADN por secuenciación y 6)

perfil de hibridación de múltiples secuencias. Laelección de la técnica a aplicar dependerá de lacapacidad técnica y tecnológica de cada laboratorio,de la situación epidemiológica específica a estudiar yde la rapidez necesaria en la respuesta dellaboratorio. La macrorrestricción de ADNcromosómico, incluye la técnica de PFGE, siendouna de las mas utilizadas ya que presenta granversatilidad y permite conocer la clonalidad dediferentes aislados en situaciones epidémicas contiempo y espacio definido. Como alternativa seencuentran las técnicas de amplificación (técnicas dePCR), de mayor rapidez que el PFGE, que ofrecen

las mismas ventajas que el PFGE en situaciones deepidemia, y el análisis por secuenciación que ofreceventajas en estudios de grandes grupos clonalespero de escasa utilidad en la caracterización deepidemias por lo que se utilizan para el análisis y


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comparación de aislados de diferentes áreasgeográficas y su evolución en el tiempo. El perfil dehibridación de múltiples secuencias incluye lasmicromatrices o microarrays, técnica de escasaaplicación actual pero con gran proyección de futuro.A continuación se exponen los métodos moleculares

que más se han utilizado para estudiosepidemiológicos en bacteriología, clasificados en los6 apartados mencionados. En cada uno de ellos secomentan los fundamentos básicos y técnicos deestos métodos, incluyendo criterios para lainterpretación de los resultados e indicaciones sobrecada uno de los procedimientos. Al final, se haincluido un capítulo de documentos técnicos, en elque se detallan 5 procedimientos, representativos delos métodos moleculares expuestos, en forma deprotocolo de trabajo normalizado (PNT) redactadosegún la normativa ISO, que puede ser adaptado alas particularidades de cada laboratorio. Previamente

se indican las características que deben reunir losmarcadores moleculares para poder utilizarse en elestudio epidemiológico.

3. CARACTERÍSTICAS DE LOS MARCADORESMOLECULARES. CRITERIOS PARA LAELECCIÓN DE UN BUEN MARCADORMOLECULAR

La definición de clon es probabilística y el nivel desimilitud necesario para su definición debe tener encuenta el taxón estudiado, el marcador utilizado y eltiempo que dure la investigación epidemiológica. Porello, antes de escoger un marcador molecular debe

formularse de forma clara y precisa aquella preguntaen términos epidemiológicos cuya respuesta espreciso conocer, definir el nivel de relación genéticaque es necesario determinar para responder a lapregunta anterior, escoger los marcadores que soncapaces de discriminar a este nivel de relación yverificar la eficacia de los métodos seleccionados.Cuando se analizan brotes epidémicos por taxonesmuy homogéneos es necesario utilizar marcadoresmuy discriminativos para reconocer a losaislamientos no relacionados como distintos de lacepa epidémica. Por el contrario, en la vigilancia delas enfermedades infecciosas, puede interesar

monitorizar la diseminación de un clon a nivelmundial de forma prospectiva (esto es, durantemucho tiempo). En este caso, es posible que esteclon sufra cambios microevolutivos que generenpatrones relacionados pero no idénticos. Siutilizamos marcadores muy discriminativos podemosidentificar aislamientos relacionados comodiferentes. Es por ello que se ha recomendadoestablecer categorías de relación entre las cepas. Enel caso de la electroforesis de campo pulsante(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE), se habla decepas “idénticas”, “probablemente relacionadas”,“posiblemente relacionadas” o “distintas” en función

del número de cambios genéticos que traduce ladiferencia existente entre los patrones obtenidos. Encualquier caso, conviene recordar que estos criteriosse han establecido para el estudio de epidemias conel objeto de diferenciar las cepas incluidas en una

cadena de transmisión (relacionadas) de las que nolo están (no relacionadas). Por otra parte, cuando seutilizan marcadores cuya capacidad discriminativa sebasa en secuencias que se ven influidas por elambiente o el estado fisiológico del microorganismolas diferencias que se observan no serán

proporcionales al grado de relación de las cepas.Así, por ejemplo, los plásmidos se ven muy influidospor las condiciones de crecimiento delmicroorganismo y las diferencias en el perfilplasmídico no traducen necesariamente el grado derelación existente entre las cepas estudiadas.La capacidad de discriminación de un marcadordepende de la variabilidad genética existente en laregión del cromosoma que explora. Así, por ejemplo,el PFGE explora todo el cromosoma detectando lavariabilidad existente en los lugares de restricción delenzima utilizado para la digestión del ADN o lainserción o deleción de grandes fragmentos entre

dos lugares de restricción. En función de estosfactores se obtendrá un polimorfismo en los tamañosde los fragmentos obtenidos en la digestión. Engeneral el PFGE es muy discriminativo ya que esmuy sensible a la microvariación existente en unacolección de cepas. Por el contrario, el ribotipadobasa su capacidad de discriminación en lavariabilidad existente en las regiones cromosómicasadyacentes a las distintas copias del operón rrn. Estemarcador suele ser menos discriminativo y lavariabilidad que detecta suele tener su origen en unmomento relativamente lejano en el tiempo (Tabla 1).Idealmente un marcador debería permitir calcular la

distancia genética existente entre las cepasestudiadas. Su conocimiento permite establecer larelación entre las cepas y, por lo tanto, conocer conprecisión su historia evolutiva. Las diferenciasdetectadas por este marcador ideal deberíancorresponder a cambios evolutivos “neutros” cuyaacumulación fuera proporcional al tiempotranscurrido. Ello requiere que la estructurapoblacional del microorganismo estudiado seafundamentalmente clonal. En aquellas poblacionespanmíticas en las que los fenómenos derecombinación dan lugar a un intercambio aleatoriofrecuente de genes es más difícil interpretar los

resultados de los marcadores moleculares.En cualquier caso, deben escogerse marcadores queanalicen secuencias con baja recombinación. Debemencionarse, no obstante, que en determinadasespecies muy homogéneas la única manera dediscriminar los aislamientos es analizar precisamenteregiones recombinativas (este es el caso, porejemplo de M. tuberculosis donde se utiliza elpolimorfismo genético asociado a la IS6110 o eltipado por la unidad repetitiva intercalada demicobacteria: MIRU).


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Tabla 1. Características de los marcadores moleculares más utilizados (modificada de van Belkum et al. Clin Microbiol Rev 2

Marcador Tipabilidad Reproducibilidad Poder dediscriminación

Facilidad técnica Interpretación

Perfil plasmídico Variable Regular Variable Regular Buena REA de ADN total Excelente Variable Variable Buena Regular Ribotipado Excelente Excelente Buena Buena Buena PFGE Excelente Excelente Excelente Buena Buena PCR Excelente Regular Excelente Buena Regular AFLP Excelente Buena Excelente Buena Regular MLST Óptima Excelente Excelente Difícil Excelente

REA: análisis del ADN total con enzimas de restricción de alta frecuencia de corte; PFGE: digestión del ADN total con eresolución de los fragmentos generados por electroforesis de campo pulsante; PCR: polimorfismo de amplificación; Afragmentos de amplificación: MLST: tipado por secuenciación


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3.1. EVALUACIÓN DE LOS MARCADORESMOLECULARES:3.1.1. Criterios que evalúan su eficacia:Tipabilidad: Proporción de cepas que un marcadorpuede clasificar como pertenecientes a un tipodeterminado. Al conjunto de cepas que no son

susceptibles de ser clasificadas se les conoce comocepas no tipables. Un marcador será tanto más útilcuando más se acerque su tipabilidad al valor 1.Reproducibilidad: Capacidad de un marcador paraclasificar a una cepa en el mismo tipo cuando serealizan varios ensayos independientes. En aquellosmarcadores complejos no debe tenerse en cuenta lavariabilidad que se acepta entre patrones dentro deun mismo tipo. Los experimentos destinados avalorar la reproducibilidad deben tener en cuentatodas las variables posibles. Dado que el valor dereproducibilidad de un marcador afecta de maneramuy significativa su capacidad de discriminación, el

valor de reproducibilidad debe ser superior a 0,95.Las situaciones en las que se pretende comparar unnúmero limitado de cepas (frecuentemente en elmismo experimento) toleran una menorreproducibilidad; las bases de datos a gran escala(centros de referencia) exigen una reproducibilidadmayor.Estabilidad: Mide la capacidad de un marcador parareconocer la relación clonal que existe entre cepasque proceden de un precursor común, a pesar de lavariación fenotípica o genotípica ocurrida durante ladiseminación clonal en la naturaleza o en elalmacenamiento y replicación en el laboratorio

(epidemias a gran escala, cepas de archivo). Elestudio de la estabilidad in vivo se realizacomparando cepas antes y después de un númerode pases en un modelo animal, aislamientosconsecutivos en el mismo enfermo (colonización oinfección persistente) o en sitios anatómicos distintoso en el curso de epidemias muy bien definidas. Elestudio de la estabilidad in vitro se realizacomparando las cepas antes y después de sualmacenamiento durante un periodo determinado detiempo, en el que se hacen una serie de resiembrasen un medio de cultivo concreto (se recomiendaincluir un mínimo de 10 cepas que se estudian cada

cinco pases en un experimento de 50 resiembras, loque da un total de 100).Poder discriminativo: Probabilidad promedio de queel marcador utilizado clasifique en 2 tipos distintos a2 cepas no relacionadas escogidas al azar de lapoblación de un determinado taxón. El poderdiscriminativo se cuantifica con el Indice deDiversidad de Simpson, según la fórmula:

ID= 1-1/N (N-1)Σs j=1 n j (n j-1)N= nº de cepas; S=nº tipos distintos; n j= nº cepas

pertenecientes al tipo J.El valor de ID depende del número de tipos distintosdefinidos por el marcador y de la homogeneidad con

la que la población estudiada se distribuye en los “n”tipos. Idealmente el valor de ID debe ser superior a0,95. Puede utilizarse una combinación demarcadores.

3.1.2. Criterios que evalúan su eficiencia:Antes de escoger un marcador debemos considerarlas características de la investigación que nosproponemos llevar a término. Entre estascaracterísticas cabe destacar el tamaño de lamuestra a analizar y la premura con la que se

necesitan los resultados. Así, no es lo mismo unestudio de 5 casos que pueden corresponder a unatransmisión nosocomial cuya confirmación puedecondicionar una serie de medidas de control queestán en marcha, que un estudio retrospectivo sobrela difusión de una cepa en una determinadacomunidad que puede representar el análisis decentenares de cepas. Dada por supuesta lacapacidad de discriminación, en el primer caso sevalorará la rapidez del marcador y la disponibilidadde los distintos marcadores en el entorno inmediato.En el segundo serán la reproducibilidad y el coste.También hay que valorar la versatilidad de un

marcador y su facilidad técnica. El PFGE es unmarcador flexible, ya que se puede utilizar para elestudio de la mayor parte de bacterias, pero elprocedimiento técnico es relativamente complejo yexige de una instrumentación específica que no seencuentra presente en todos los laboratorios demicrobiología clínica. Con la excepción delribotipado, las técnicas que analizan polimorfismos ovariantes de restricción (restriction fragment lengthpolymorphism o RFLP) asociados a una secuencia yrevelados con una sonda específica, además detécnicamente complejos, sólo sirven para el estudiode la especie en la que se encuentra esta secuencia

(por ejemplo, RFLP asociado a IS6110 y M.tuberculosis). En los taxones en los que se handemostrado útiles, los polimorfismos de amplificaciónson rápidos, técnicamente sencillos y la mayor partede laboratorios de microbiología tienen acceso a untermociclador.Por último, es importante considerar la facilidad conla que se pueden exportar los datos generados abases de datos del propio laboratorio o intercambiarestos con otros laboratorios o centros de referencia.3.1.3. ¿Con qué colección de cepas deben evaluarselos marcadores epidemiológicos?Deben evaluarse con una colección suficientemente

numerosa de cepas, correctamente identificadas alnivel taxonómico indicado, que reflejen al máximo ladiversidad que se espera en este taxón, o comomínimo en la subpoblación que se pretende estudiarcon el marcador. Es conveniente que se incluyan losdiferentes grados de relación posible, esto es, cepasidénticas, cepas no idénticas pero muy similares,cepas moderadamente relacionadas y cepasclaramente distintas. La relación epidemiológica delas cepas debe conocerse en función de datosclínicos y epidemiológicos pormenorizados.Para conocer la tipabilidad y el poder dediscriminación se recomienda estudiar una colección

numerosa de cepas no relacionadasepidemiológicamente (>100). Cuando se quiereconocer la estructura genética de una población seutilizan colecciones incluso mayores que debenreflejar el conjunto de la población. Por ejemplo, en


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el caso del meningococo se han de incluir cepasaisladas de enfermos, pero también de portadores.Para conocer la eficacia de un marcador en elestudio y control de brotes epidémicos se han decomparar las cepas supuestamente relacionadas conuna colección de cepas control no relacionadas (de

10 a 30 cepas) aisladas de pacientes similares y enun periodo de tiempo similar.3.1.4. Análisis de los datosLa mayoría de los marcadores moleculares se basanen separaciones electroforéticas que dan lugar a unpatrón de bandas. El análisis de los resultados sebasará en el cálculo de los coeficientes de similitudde estos patrones para cada par de cepas. Estosresultados se expresan en una matriz de similitudque puede representarse gráficamente como undendrograma de homologías.Es extremadamente importante estandarizar lascondiciones experimentales a fin de que los patrones

electroforéticos sean reproducibles y puedancompararse los resultados obtenidos en distintosgeles tanto en el mismo laboratorio como en distintoslaboratorios. Este hecho es especialmenteimportante cuando los datos de tipificación de undeterminado microorganismo se centralizan en unlaboratorio dando lugar a grandes bases de datos. Sibien este esfuerzo de estandarización se harealizado para algunos microorganismos (M.tuberculosis y RFLP asociado a IS6110,Staphylococcus aureus y PFGE) queda mucho porhacer en este sentido.El primer paso en el análisis de los resultados es la

normalización de los geles. Existen numerososfactores que influyen en el proceso electroforético(protocolo de trabajo, carga del gel, condiciones deelectroforesis, instrumentación... etc) que pueden darlugar a que dos bandas del mismo tamaño tenganuna posición en el gel ligeramente diferente. Lanormalización consiste en asignar a estas bandas elmismo peso (posición) a pesar de las diferenciasgeneradas por el proceso analítico. La normalizaciónde los geles se ha visto facilitada por el desarrollo deprogramas informáticos (algunos comercializados),pero en cualquier caso exige una cuidadosasupervisión visual.

Una vez normalizados los geles, para el cálculo de lasimilitud entre un par de cepas pueden utilizarsediversos coeficientes. El más utilizado es elcoeficiente de Dice que se basa en la posición de lasbandas. Cuando se ha definido la totalidad debandas presentes, se determina su presencia oausencia en cada una de las dos cepas y elcoeficiente de similitud se calcula con la siguientefórmula:

2nABSD = --------------------

2nAB + a + bnAB = número de bandas presentes en las dos

cepasa = número de bandas presentes en la cepa Apero no en la cepa Bb = número de bandas presentes en la cepa Bpero no en la cepa A

Otros marcadores basados en la posición de lasbandas son el de Jaccard o el coeficiente dePearson. Existen otros coeficientes de similitud quetambién tienen en cuenta la intensidad de lasbandas. Su utilización exige que la intensidad de lasbandas sea reproducible en los diferentes ensayos.

El algoritmo matemático que se utiliza máscomúnmente para construir dendrogramas a partir dela matriz de similitud es el método de agrupación porpares no ponderado, utilizando promedios(unwweighted pair group method using arithmeticaverages: UPGMA). Este método asume que el “relojmolecular” es idéntico para todas las cepas y dalugar a un árbol “con raíz” (o punto de partida) apartir del cual tienen lugar las divisiones. Losdendrogramas generados con los marcadoresmoleculares no hay que considerarlos como unarepresentación filogenética de las relaciones entrecepas, sino como una forma práctica de visualizar el

grado de relación entre cepas e identificar grupos oclades. En un dendrograma, el punto de corte paraconsiderar las cepas como relacionadas es arbitrario.En algunos casos se exige una identidad depatrones pero frecuentemente, tal como se hacomentado para el PFGE, se acepta un ciertonúmero de diferencias. La experiencia, y, tal como seha comentado, la concordancia de sistemas detipado ayudan a seleccionar un punto de corteadecuado.

3.2. BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA1. Struelens MJ and the Members of the European Study

Group on Epidemiological Markers (ESGEM) of theEuropean Society for Clinical Microbiology and InfectiousDiseases (ESCMID). Consensus guidelines forappropriate use and evaluation of microbial typingsystems. Clin Microbiol Infect 1996; 2: 2-11.

2. Van Belkum, A, Struelens M, de Visser, A, Verbrugh, H,Tibayrenc, M. Role of genomic typing in taxonomy,evolutionary genetics and microbial epidemiology. ClinMicrobiol Rev 2001; 14: 547-560.

3. Soll DR, Lockhart SR, Pujol C. Laboratory proceduresfor the epidemiological analysis of microorganisms. En:Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, YolkenRH (ED). Manual of Clinical Microbiology. 8ª Edición.American Society for Microbiology. Washington DC.2003; pp 139-161.

4. Pfaller, MA. Molecular epidemiology in the care ofpatients. Arch Pathol Lab Med. 1999; 123: 1007-1010.

4. ANÁLISIS DEL ADN EXTRACROMOSÓMICO YDE LOS ELEMENTOS GENÉTICOS DETRANSMISIÓN HORIZONTAL

La resistencia a agentes antimicrobianos se producepor mutación o por la adquisición de geneslocalizados en diferentes elementos de transmisiónhorizontal (ETH) como plásmidos, transposones ointegrones, capaces de transmitirse entremicroorganismos de la misma o de distinta especie.El aumento de la resistencia a un determinado

antibiótico puede ser debido a la diseminación de unclon o de un ETH entre distintas cepas. Ladiferenciación entre “epidemias” debidas a clones o aETH puede ser relevante ya que las políticas de


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control pueden varían según las diferentessituaciones epidemiológicas. El análisis ycaracterización de los ETH permite la monitorizaciónde elementos genéticos específicos de losmicroorganismos o de áreas geográficas que puedenser importantes en la evolución y diseminación de las

bacterias que los albergan.En este apartado analizaremos los fundamentos eimportancia del análisis de diferente ETH implicadosen la diseminación de la resistencia a losantimicrobianos con especial énfasis en losplásmidos.4.1. PLÁSMIDOSLos plásmidos son elementos de ADNextracromosómico que constituyen entre el 1% y>10% del genoma de muchas especies bacterianas.Se replican intracelularmente de manera autónomay, aunque en la mayoría de las ocasiones no sonesenciales para la viabilidad de la célula, contienen

genes que confieren distintas propiedades como laresistencia a antibióticos, virulencia o actividadesmetabólicas. Los plásmidos se clasifican según suscaracterísticas, algunas de ellas con importanciaepidemiológica: tamaño, rango de hospedador(presencia en una o diferentes especies y géneros),número de copias por célula, capacidad detransferirse por conjugación y grupo deincompatibilidad. Tradicionalmente, el número deplásmidos por célula se ha utilizado como marcadorfenotípico. Hoy en día tiene escasa utilidad y elanálisis plasmídico está enfocado a dirimir latransmisibilidad de los genes que albergan y por

tanto su valor epidemiológico.Los plásmidos están constituidos por una regiónconstante que incluye determinantes genéticos parasus funciones esenciales (replicación, mantenimientoy transferencia) y una region variable de ADNheterólogo (ej., genes de resistencia). La relaciónepidemiológica entre distintos plásmidos se realizaen función de su región constante. La caracterizacióndel ADN heterólogo es útil para determinar laecología y la epidemiología de los mismos enrespuesta a distintas presiones selectivas, en el casode los determinantes de resistencia a la utilización deantimicrobianos.

Los plásmidos suelen existir como moléculascirculares de ADN de doble hebra (dsADN) cerradascovalentemente (conocidas como formas CCC,Covalently Closed Circular). Las alteraciones porrotura de la dsADN dan lugar a las configuraciones

plasmídicas abierta circulares (formas OC, OpenCircular) o lineal (formas L) según se afecte una olas dos hebras. Estas tres configuraciones migran adistinta velocidad en los geles de agarosa: la formaCCC más rápidamente que la OC y ésta másrápidamente que la L. Todas ellas se encuentran

frecuentemente en una misma célula por lo quenormalmente se observan 3 bandascorrespondientes al mismo plásmido. Con frecuenciatambién se detectan dímeros o multímeros de lasformas CCC y OC (figura 1.).

Figura 1. Interpretación del ADN plasmídico obtenido.Problemas más frecuentes en la extracción de plásmidos.Línea E. ADN plasmídico puro de excelente calidad. Laslíneas 1-5 ilustran los resultados atípicos más frecuentesque nos podemos encontrar. Línea 1, Formas CCC (bandainferior) y OC (banda superior) del plásmido multicopiapUC18 con una banda inferior de ADN plasmídicodegradado (inmediatamente debajo de la forma CCC).

Estas formas aparecen tras una lisis prolongada y sonresistentes a la digestión enzimática. Línea 2, multímerosde las formas CCC junto con las formas CCC y OC delplásmido pTZ19. Los multímeros se diferencian de lacontaminación de ADN cromosómico con una simpledigestión enzimática, éstos junto las formas CCC y OCdarán una única banda correspondiente a la forma L delplásmido como se ilustra en el siguiente carril. Línea 3,formas L del plásmido tras digestión enzimática. Línea 4,contaminación de ADN cromosómico (banda superior) junto a las formas CCC y OC plasmídicas. Se observacuando las preparaciones han sido tratadas agresivamente(agitación con vórtex durante los primeros pasos de laextracción). Se identifica fácilmente tras digestión

enzimática ya que da lugar a una mancha difusa a lo largodel carril como se ilustra en la línea 5. Línea 5, ADNplasmídico contaminado con ADN cromosómico trasdigestión enzimática. Línea 6, marcador de peso molecularlambda ADN digerido con HindIII. (Imagen tomada deQiagen Plasmid Purification Handbook 09/2000)

Los plásmidos se han encontrado en la mayoría delas bacterias conocidas. En algunos géneros comoBorrelia y Streptomyces existen los llamados“plásmidos lineales” de extremos covalentementecerrados y estructura similar a la de algunos virus.4.1.1. Fundamentos y variantes técnicasEl análisis de plásmidos tiene como objetivosdetectar su presencia y/o establecer la relación entreellos. Para ello es necesario partir de un cultivobacteriano adecuado, centrifugar el cultivo, aplicar unmétodo de extracción y purificar el ADN plasmídicoobtenido. Posteriormente podremos medir el tamañode los plásmidos y establecer las relacionesepidemiológicas.4.1.1.1 Crecimiento del cultivo bacteriano. Lacantidad y calidad de ADN plasmídico final obtenidovienen determinadas por diferentes factores como elnúmero de copias, el tamaño del ADN heterólogo yla cepa hospedadora. Los plásmidos de alto pesomolecular o con grandes secuencias en su regiónvariable suelen estar en bajo número de copias y elrendimiento de su extracción puede optimizarsemodificando el volumen, el medio de cultivo y la

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técnica de lisis. Debe tenerse en cuenta diferentesfactores:

Inoculación. Se debe partir de una única colonia decultivo en medio selectivo sólido crecidas el díaanterior. La incubación debe ser de 12-16 hcoincidiendo con la transición de la fase logarítmica

a la estacionaria. En este intervalo, el cocienteADN/ARN es mayor que en la fase logarítmica y elADN todavía no se degrada, como sucede al finalde la fase estacionaria.Medios de cultivo. Suelen ser líquidos y consuplemento antibiótico para lograr amplificar lascélulas que portan el plásmido. El más utilizado esel medio Luria Bertani (LB), siendo la formulaciónque contiene 10 g de NaCl/L la que mejoresrendimientos de ADN plasmídico ofrece. En el casode plásmidos de muy bajo número de copiaspueden utilizarse medios enriquecidos como elmedio TB (Terrific Broth) que aumentan de 4-6

veces el rendimiento. Para microorganismosgrampositivos se utiliza infusión cerebro-corazón(BHI), tripticasa de soja (TSA) o medio definido M9.Si se utilizan medios de cultivo ricos, el volumen hade reducirse para evitar un aumento de la biomasaque aumentaría la viscosidad del lisado, afectaría ala lisis bacteriana y haría necesaria una mayoragitación con aumento del riesgo de fragmentacióndel ADN cromosómico y por tanto contaminacióndel ADN plasmídico.La adición de cloranfenicol (170 μg/mL) al medio decultivo amplifica el número de copias de losplásmidos y por tanto el rendimiento final. Esto se

debe a la acción inhibitoria del cloranfenicol sobrela síntesis de proteínas y por ello sobre lareplicación del cromosoma bacteriano pero nosobre la de los plásmidos. Asimismo, favorece ladisminución de la biomasa cuando se empleangrandes volúmenes. El cloranfenicol no debeañadirse cuando se inocula el microorganismo sinodespués de 2,5 h de incubación.Volumen de cultivo. Casi todos los métodos,muchos de ellos comerciales (sistemas miniprep),pueden adaptarse para diferentes volúmenes. Engeneral se debe aumentar el volumen en funcióndel tamaño y número de copias (tabla 2) .

Cepas hospedadoras. La extracción de plásmidosse puede realizar a partir de las cepas salvajes quelos albergan (cuando se quiere determinar elcontenido plasmídico o las cepas contienen unúnico plásmido) o de los transconjugantes a losque previamente se ha transferido el plásmido(cuando se quiere caracterizar un único plásmidoen cepas que contienen más de uno). En esteúltimo caso, se deben utilizar cepas receptorasconocidas para asegurarnos una extracción óptima.Existe un gran número de cepas receptoras deEscherichia coli. La mayoría funcionan

adecuadamente pero HB101 y sus derivados comoTG1 y la serie JM100 liberan una gran cantidad decarbohidratos durante la lisis lo cual puede inhibir ladigestión con enzimas de restricción y tienen una

elevada actividad endonucleasa lo que determinaun ADN de inferior calidad. Las cepas DH1, DH5α,C600 y XL1Blue son las que mejores rendimientosofrecen. En ocasiones se recomiendan algunasespecíficas de especie como OG1RF y JH2-2 paraEnterococcus faecalis o la cepa GE1 para

Enterococcus faecium.4.1.1.2. Centrifugación, lisis bacteriana y extraccióndel ADN plasmídico. El contenido celular de loscultivos bacterianos se concentra por centrifugacióny se lisa por diferentes métodos que incluyentratamiento con álcalis o calor, detergentes iónicos ono iónicos y disolventes orgánicos. La elección delmétodo de extracción depende de la especiebacteriana que contiene el plásmido, su tamañomolecular y el tipo de análisis que se planee realizar:

Los plásmidos de alto peso molecular han deextraerse con una lisis suave que evite sufragmentación. Normalmente se resuspenden en

soluciones de sacarosa y se tratan con lisozima yEDTA para romper la membrana, procediendo a lalisis de los esferoplastos resultantes del tratamientoprevio con detergentes como dodecil sulfato desodio (SDS). Los plásmidos de bajo o medio pesomolecular (los más frecuentemente analizados) seextraen con métodos más agresivos que incluyentratamiento con EDTA y lisozima y exposiciónposterior al calor o a álcalis.El tratamiento debe modificarse según la cepahospedadora (especie bacteriana o estirpe, debidoa la diferente composición de la pared celular dedistintos microorganismos).

Se han descrito numerosos protocolos para laseparación de ADN plasmídico del cromosómico.Los protocolos actuales permiten el análisis de ungran número de muestras (métodos “a pequeñaescala"). Se basan mayoritariamente en el métodode lisis alcalina de Birnboim y Doly y sonaplicables a un gran número de bacteriasgrampositivas y gramnegativas. Este método sebasa en la diferente resistencia a valores de pHelevados del ADN plasmídico y cromosómico. Laaplicación de una solución de SDS y NaOH provocala lisis celular y la desnaturalización del ADNplasmídico y cromosómico. La neutralización con

acetato potásico permite que el ADN plasmídicovuelva a su configuración CCC y por tantopermanezca soluble mientras el ADN cromosómico ylas proteínas precipitan en un complejo formado porpotasio y SDS que se elimina por centrifugación. ElADN plasmídico en el sobrenadante se concentrapor precipitación con etanol. Los métodos semodifican en el caso de microorganismosgrampositivos con el fin de digerir la pared celular(por adición de lisozima o de lisozima y lisostafina) opara posterior restricción añadiendo RNAsa.


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Este método está limitado a la obtención deplásmidos en alto o medio número de copias y depeso molecular 20 kb) siempre deben purificarse. Elmétodo de elección es la centrifugación en gradientede cloruro de cesio-bromuro de etidio (ClCs-BrEt).Debido a su excesivo coste y duración y laimposibilidad de aplicación a un elevado número demuestras se han desarrollado otros métodos queincluyen el uso de resinas de intercambio iónico,HPLC o precipitación diferencial con polietilenglicol(PEG). Las resinas están disponiblescomercialmente (equipos QIAGEN Plasmid Midi,Maxi, Mega y Giga, distribuidos por IZASA) y

permiten la extracción y purificación de plásmidos dehasta 150 kb.4.1.1.4. Digestión del ADN plasmídico. El estudio delas relaciones epidemiológicas entre diferentesplásmidos se lleva a cabo por comparación de sus

patrones de huella dactilar (“plasmid fingerprinting”)generados tras la digestión del dsADN plasmídico(formas CCC) con enzimas de restricción (ER). Paraque los resultados puedan ser interpretables, lospatrones deben tener entre 5 y 10 bandas. Dado queen la mayoría de los casos la secuencia de los

plásmidos se desconoce, la elección del/los ER hade realizarse inicialmente de forma empírica.4.1.1.5. Determinación del peso molecular deplásmidos. La estimación del tamaño molecular deun plásmido se realiza por comparación de lamovilidad electroforética en geles de agarosa de susformas CCC con la de plásmidos de tamañomolecular conocido o por la suma del tamaño de losfragmentos de ADN obtenidos tras digestiónenzimática. La determinación del tamaño deplásmidos lineales ha de realizarse por electroforesisde campo pulsante. En general, es necesario:

- Calcular la movilidad electroforética: se define

midiendo las distancias de migración de losfragmentos de ADN (en mm) sobre la fotografíade los geles o de las imágenes.- Construir una curva de calibración en la que serepresenta la distancia recorrida (en mm) de loscontroles utilizados frente a sus pesosmoleculares (en kbp). La curva ha de ser unalínea recta para permitir una correctadeterminación de los valores objeto de estudiopor interpolación. Existen distintos métodosmatemáticos lineales que incluyen el log10 deltamaño molecular versus la movilidad, el log10 deltamaño molecular versus el log10 de la movilidad,

y el tamaño molecular versus el valor recíprocode la movilidad. Este último es uno de los másprecisos, especialmente cuando se aplica con elmétodo de mínimos cuadrados adaptado a losordenadores personales. Finalmente, el tamañomolecular de los fragmentos correspondientes sedetermina por interpolación de las distanciasrecorridas sobre la curva de calibración obtenidacon los valores de los controles.- Los nuevos sistemas de captación y análisis deimágenes digitalizadas ampliamente utilizados enla actualidad como el PhoretixTM gel análisissoftware package (NonLinear Dynamics USA,

Newcastle, UK) o el Applied Mathemathics (BioRad, Birmingham, UK) permiten el cálculocomputerizado de los pesos moleculares, elanálisis de gran número de muestras y lacomparación de muestras en distintos geles deforma directa.

4.1.2. Criterios para la interpretación de losresultados

4.1.2.1. Análisis de plásmidos sin restricción. Laobtención de perfiles plasmídicos idénticos o muysimilares en diferentes aislados debe serinterpretada con precaución ya que no siemprerefleja una relación epidemiológica entre los mismos.

Hay que tener presente que especies bacterianaspróximas evolutivamente adquieren con frecuenciaplásmidos similares y que determinados patronesplasmídicos pueden ser muy estables en


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determinadas especies como Salmonella spp. yShigella spp.4.1.2.2. Análisis de perfiles de plásmidos trasrestricción. Se realiza por comparación de lospolimorfismos genéticos obtenidos tras la digestiónenzimática del ADN plasmídico. A diferencia de lo

que sucede con el ADN genómico, no existencriterios que establezcan el número de bandas quedeben compartir dos plásmidos para serconsiderados idénticos o posiblemente relacionados.En general, consideramos que dos plásmidos estángenéticamente relacionados cuando comparten ≥3sitios de restricción para un ER determinado ygeneran el mismo número de bandas de igual pesomolecular. Esto suele confirmarse al menos para 2ER diferentes (figura 2).

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Figura 2. Análisis de polimorfismos plásmídicos.(Métodode Birnboim Doly y purificación posterior con resinas deintercambio iónico). Electroforesis en gel de agarosa de lospatrones de bandas correspondientes a plásmidos dediferentes clones de Klebsiella pneumoniae productores deTEM-4 tras digestión enzimática con EcoRI y PstI. Esteensayo permitió demostrar una epidemia plasmídica ennuestra institución. El ADN plasmídico fue obtenido a partirde transconjugantes utilizando como cepa receptora E. coli BM21; línea A1-A4, ADN plasmídico obtenido de cuatroclones de K. pneumoniae tras digestión enzimática conPstI; línea A5-8 , ADN plasmídico obtenido de cuatroclones de K. pneumoniae tras digestión enzimática conEcoRI; línea M1, marcador de peso molecular II (RocheDiagnostics) y línea M2, ADN marcador de peso molecularIII (Roche Diagnostics). Tres de los plásmidos teníanperfiles idénticos y el otro difería en 2 bandas con respectoa este perfil utilizando diferentes enzimas de restricción, locual permitió establecer la relación epidemiológica de éstecon el perfil de los plásmidos anteriores. (Imagen tomadade Coque et al, Antimicrob Agents Chemother 2002;46:500). Es importante tener en cuenta que:

- La obtención de patrones de bandas similaresno siempre indica una relación epidemiológicaentre plásmidos; y que diferentes plásmidosportadores de los mismos transposones y/ointegrones pueden tener fragmentos comunes.Por ello, es importante considerar siempre la

posible presencia de otros elementos detransmisión horizontal “epidémicos”.- La hibridación cruzada de un plásmido con otroes el método de elección para determinar lahomología entre los mismos. No obstante, ha deinterpretarse con precaución ya que una

hibridación positiva en fragmentos de alto pesomolecular puede deberse a una homología enregiones mucho más pequeñas contenidas en losmismos. Para evitar interpretaciones erróneas, esconveniente realizar la hibridación cruzada sobreADN plasmídico digerido con enzimas quegeneren un gran número de fragmentos.

4.1.3. Indicaciones para la aplicación delanálisis de plásmidos

El análisis del contenido total plasmídico fue una delas técnicas epidemiológicas moleculares másutilizadas en los años 70 y 80 para la investigaciónde brotes epidémicos. En la actualidad apenas se

utiliza con este fin, debido a la introducción de otrastécnicas y a las limitaciones que presenta. En laactualidad las indicaciones de mayor utilidad serían:establecer la relación epidemiológica entreplásmidos diferentes aislados de la misma odiferente especie bacteriana y ayudar a lalocalización de otros elementos extracromosómicos(transposones, integrones).4.1.4. Inconvenientes de la técnicaEl análisis plasmídico puede presentar una serie deinconvenientes prácticos y de interpretación de losresultados obtenidos.

1. Su utilidad está restringida a aislados que

contengan plásmidos.2. Los plásmidos son inestables en determinadasespecies o clones.3. El análisis de plásmidos de elevado pesomolecular precisa técnicas que requieren tiempo(sólo permiten el análisis de un limitado númerode muestras por jornada de trabajo) y personalespecializado.4. La presencia de diferentes formas plasmídicasen una preparación puede dificultar laidentificación de sus correspondientes bandas.Las formas OC suelen ser muy frecuentes enpreparaciones almacenadas durante largo tiempo

y en plásmidos de alto peso molecular. Ennumerosas ocasiones es difícil establecer si unabanda corresponde a una forma CCC o OC, locual puede complicarse al compararpreparaciones de plásmidos diferentes (figura 1-vista anteriormente).

4.2. ANÁLISIS DE OTROS ELEMENTOS DETRANSMISIÓN HORIZONTAL

La diseminación de genes de resistencia puederealizarse a través de elementos de transmisiónhorizontal diferentes de los plásmidos. También sedenominan elementos transponibles (ETH) y se

caracterizan por su capacidad de movilización entredistintas regiones del genoma de una célulabacteriana y/o entre diferentes regiones del genomade diferentes clones bacterianos de igual o diferenteespecie. Estos elementos frecuentemente dan lugar


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a polimorfismos en los perfiles de ADN plasmídico ode ADN genómico que pueden interpretarse como laintroducción de nuevas cepas o de nuevosplásmidos en lugar de un intercambio genético de“ETH epidémicos” entre cepas o plásmidosendémicos de cada institución.

De forma general, los ETH o elementostransponibles se pueden clasificar según sumecanismo de transposición y estructura en lossiguientes tipos:

Clase I. Incluyen las secuencias de inserción (IS)y los transposones compuestos que consisten enuna secuencia de ADN flanqueada por 2 IS quepueden ser iguales o distintas (ej., Tn5, Tn10 queconfieren resistencia a bleomicina-estreptomicinay tetraciclina, respectivamente).Clase II. Incluyen transposones que carecen deIS reconocibles en sus extremos (ej., Tn1546 yTn5382 que confieren resistencia a

glicopéptidos).Clase III. Bacteriófagos transponibles (fago Mu)Transposones conjugativos. Difieren de losanteriores por su estructura y mecanismo detranslocación. Son más similares a plásmidos yfagos que a los otros elementos transponibles(ej., Tn916).Otros elementos. Comparten características conalguno de los grupos anteriores e incluyenintegrones, intrones y plásmidos integrativos.

El análisis con fines epidemiológicos se lleva a cabocuando sospechamos la presencia de un ETHepidémico específico tratándose normalmente de

transposones de clase II e integrones (ej., Tn1546 yTn5382 en enterococos con fenotipos de resistenciaVanA y VanB, respectivamente, integrones de clase1 en enterobacterias productoras de ß-lactamasasde espectro extendido de tipo CTX-M). La presenciade integrones (clase 1 y 2), de transposones declase I y de secuencias indicativas de elementosmóviles como integrasas (int), secuencias deinserción (IS) o transposición (tnp) es frecuente en elcromosoma y en plásmidos de aislados hospitalariosy en muchas ocasiones no está relacionadadirectamente con el ETH que contiene el gen deresistencia objeto de nuestro interés. En la tabla 3 se

resumen algunos de los ETH implicados en ladiseminación epidémica de genes de resistenciaantibiótica.El análisis de ETH suele estar limitado a centros dereferencia y laboratorios interesados en determinar elmodo de transmisión y la evolución de estoselementos. Requiere personal entrenado en técnicasde biología molecular. Su aplicación va en aumentoen los laboratorios de microbiología interesados en laepidemiología molecular de la resistencia a losagentes antimicrobianos.4.2.1. Indicaciones para el análisisepidemiológico de ETH

El análisis de ETH con fines epidemiológicos serealiza con 2 objetivos principales:4.2.1.1. Identificación de ETH epidémicos (enaislados bacterianos de igual o diferente especie).Se han descrito múltiples estrategias que combinan

diferentes técnicas moleculares. Las más utilizadasson:

Comparación de los polimorfismos de ETHobtenidos por amplificación de la secuenciacompleta del elemento y posterior digestiónenzimática. Las condiciones específicas

dependen del tamaño molecular y la secuenciadel ETH y de la especie bacteriana en que seencuentra. Para ETH de 3,5-5 kb aplicaremosPCR con polimerasas “hot-start“; para ETH de 5-30 kb utilizaremos L-PCR (Expand LongTemplate PCR System, Roche Diagnostics). Loscebadores y las enzimas de restricción a utilizardependen del elemento. Pueden diseñarse en elpropio laboratorio o, en el caso de elementosconocidos, utilizar condiciones previamentepublicadas.Comparación de los patrones de amplificación desecuencias parciales del ETH que cubren toda la

estructura del elemento (PCR overlapping). Losamplicones deben compartir sus secuenciasterminales para poder concluir su pertenencia almismo ETH. La secuenciación de fragmentosespecíficos resulta necesaria para: i) confirmar laasociación de un gen de resistencia al ETH, ii)identificar alteraciones en regiones específicas(mutaciones, inserciones o delecciones).Las condiciones experimentales dependen delETH a analizar.Comparación de los polimorfismos obtenidos poramplificación de la secuencia completa delelemento, posterior digestión enzimática e

hibridación con sondas específicas. Presenta unamayor dificultad técnica que las anteriores. Se hautilizado para la caracterización de los distintosETH diseminados mundialmente (figura 3).

4.2.1.2. Localización de ETH en el genomabacteriano. En ocasiones, es necesario caracterizarun brote epidémico por ETH lo cual incluye lalocalización de los mismos en el genoma de distintosaislados. La estrategia más común es latransferencia por Southern blot de geles con ADNgenómico digerido enzimáticamente y de geles conADN plasmídico y una posterior hibridación con

sondas específicas para el gen de resistencia y, enalgunos casos, para genes específicos delcromosoma.4.2.2. Criterios para la interpretación deresultados- Alteraciones en los patrones de amplificación y/orestricción de un ETH indican mutaciones,inserciones o delecciones respecto a la secuenciainicial del elemento. Se han de confirmar porhibridación y/o secuenciación de fragmentosespecíficos.- La localización de un ETH en el genoma presentadificultades debido a la frecuente contaminación de

las preparaciones de ADN plasmídico con ADNcromosómico y a la presencia de ADN plasmídico en


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Figura 3. Polimorfismos genéticos en el Tn1546 tras digestión con enzimas de restricción y posterior hibridación con sondasespecíficas de regiones parciales de este elemento. En la parte superior está representado el Tn1546. Las líneas gruesasnegras representan las sondas utilizadas y su correlación con las secuencias del elemento. Los números del 1-9 representanlos fragmentos tras hibridación con las sondas anteriores. Las letras sobre los pocillos de la membrana reflejan lospolimorfismos de Tn1546 encontrados (imagen reproducida con permiso del autor, Willems et al. 1999. Antimicrob. AgentsChemother 1999; 43:483-91).

las preparaciones de ADN genómico. La hibridacióncon sondas correspondientes a genes específicos de

cromosoma o de plásmidos evita este problema.4.3. BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA1. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª

ed. Cold Spring Harbor press. 1989.2. Threlfall EJ, Woodford N. Plasmid profile typing and

plasmid fingerprinting. En: Howard J, Whitcombe DM(editores). Methods in Molecular Biology. Diagnosticbacteriology protocols. Totowa, NJ.: Humana Press Inc.Vol 46: p. 225-236.

3. Murray BE, Hodel-Christian SL. Bacterial Resistance:Theoretical and practical considerations, characterizationof R plasmids, and detection of plasmid-specified genes.En: Lorian V (editor). Antibiotics in Molecular Medicine.

4. Platt DJ, Chesham JS, Brown DJ, Kraft CA, Taggart J.Restriction enzyme fingerprinting of enterobacterialplasmids: a simple strategy with wide application. J Hyg(Lond). 1986; 97:205-210.

5. Rochelle PA, Fry JC, Day MJ, Bale MJ. An accuratemethod for estimating sizes of small and large plasmidsand DNA fragments by gel electrophoresis. J GenMicrobiol 1985; 132:53-59.

6. Craig N, Craigie R, Gellert M , Lambowitz AM. MobileDNA II. ASM Press, Washington, D.C. 2002.

5. ANÁLISIS DEL ADN MEDIANTEPROCEDIMIENTOS DE RESTRICCIÓN EHIBRIDACIÓN

Con el fin de evitar la contaminación de su genoma porADN exógeno, las bacterias han desarrollado unsistema de protección basado en los enzimas derestricción, que reconocen una secuencia específicade nucleótidos de unos 4 a 8 pares de bases (pb)

dando lugar a un corte en la molécula de ADN a estenivel. A la secuencia específica reconocida por cada

enzima se le conoce como lugar de restricción. Estesistema de protección se complementa con unametilación del ADN propio de la bacteria a nivel dellugar de restricción para evitar que sea digerido por supropio enzima de restricción.Cuando se digiere una molécula de ADN con unenzima de restricción se obtienen un número defragmentos equivalentes a las veces que se encuentrarepetido el lugar de restricción a lo largo de lamolécula. Esta frecuencia depende del número de pbdel lugar de restricción así como de la proporciónrelativa de los nucleótidos ATGC del lugar derestricción en relación con la del ADN digerido. Así, la

probabilidad de encontrar un lugar de restricción de 6pb en una molécula de ADN es de una vez por cada4096 pb, mientras que un lugar de restricción de 4 pbse da cada 256 pb. Por otra parte, el lugar derestricción del enzima SmaI, CCCGGG, se encuentramenos representado de lo previsible en el cromosomade los estafilococos dada la pobreza en GC de sugenoma (%GC 38).El tamaño de los distintos fragmentos de restriccióntraduce la separación entre dos lugares de restriccióncontiguos. Un cambio por mutación o recombinación,en uno de estos lugares de restricción lo haceirreconocible para el enzima y se traduce en una

variación del perfil de fragmentos de restricción que esel responsable del polimorfismo existente entre lasdistintas cepas.

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Este perfil también variará si existen delecciones oinserciones de ADN entre dos lugares de restricción.La comparación de cepas para detectar elpolimorfismo del tamaño de los fragmentos derestricción (RFLP) se consigue separando losfragmentos obtenidos mediante una electroforesis en

un gel de agarosa que se tiñe con bromuro de etidio.Cada banda corresponde a la suma de todos losfragmentos generados del tamaño correspondiente aaquella movilidad electroforética.Podemos dividir a los enzimas de restricción para unaespecie concreta, en aquellos que darán lugar a ungran número de fragmentos (cientos) de pequeñotamaño y aquellos cuyo lugar de restricción estarápoco representado en el genoma y darán pocosfragmentos (10 a 30) de gran tamaño. Los fragmentosde pequeño tamaño obtenidos con los enzimas de altafrecuencia de corte pueden separarse porelectroforesis convencional mientras que los

fragmentos de gran tamaño (>40 kb) co-emigran enuna única banda en la electroforesis convencional y sedeben separar con técnicas electroforéticas especialescomo la electroforesis con alternancia de camposeléctricos o electroforesis de campo pulsante.Cuando se separan por electroforesis en un gel losfragmentos de restricción del ADN total obtenidos conun enzima con alta frecuencia de corte, se obtiene unnúmero tan elevado de fragmentos que es muy difícil,si no imposible, resolver las bandas existentes. Ellodificulta enormemente la comparación de los perfilesde las distintas cepas invalidando, en cierta forma, lautilidad de esta técnica. Una alternativa para simplificar

la interpretación de los RFLP del ADN total, consisteen centrarse en una zona concreta del genoma enlugar de estudiar todo el cromosoma. Para ello, serealiza una transferencia de los fragmentos derestricción del ADN total obtenidos a una membrana(Southern-blot) que se analiza mediante hibridacióncon una sonda marcada complementaria delfragmento cuyo polimorfismo se quiere estudiar. Elrevelado de la hibridación tan solo pondrá en evidenciaaquellos fragmentos que contengan la totalidad o partede la secuencia escogida, obteniéndose perfiles conpocas bandas. El número de bandas estará enrelación con el número de copias de la secuencia

existentes en el genoma mientras que su polimorfismoestará en relación con su distribución a lo largo delgenoma, así como con las variaciones en los lugaresde restricción dentro de esta secuencia y en lasregiones más próximas. Tanto la transferencia deSouthern como la hibridación complican notablementelos aspectos técnicos del análisis.

5.1. FUNDAMENTOS Y VARIANTES TÉCNICASCuando se quieren utilizar las técnicas de restricción-hibridación para la tipificación molecular de undeterminado microorganismo, el paso másimportante es la elección de la sonda a utilizar. Hay

que conocer con precisión el poder de discriminaciónde la sonda, esto es, el nivel de relación genéticaque puede resolver. Además, este conocimientodebe adquirirse para cada nuevo taxón que se quieraestudiar. Se han utilizado varias aproximaciones a la

hora de diseñar sondas que exploren los fragmentosde restricción del ADN total. El fragmento analizado (ypor consiguiente su sonda complementaria), puede serespecífico de una especie determinada o, en el casodel ribotipado, utilizar una sonda única para todas lasbacterias, complementaria de los operones de 16 y

23S RNA de E. coli (regiones del cromosoma quecodifican el ARN ribosómico). Se aprovecha el hechode que en estos operones existen zonas muyconservadas para utilizar la misma sonda para elanálisis de la gran mayoría de especies bacterianas.5.1.1. Hibridación con sondas específicasEn el diseño de sondas específicas para undeterminado microorganismo se han utilizado, entreotras, sondas clonadas al azar, sondascomplementarias de un gen, o sondascomplementarias de elementos transponibles comolas secuencias de inserción. La clonación al azar defragmentos de genoma y su uso como sonda exige

un trabajo inicial de cribado importante antes deencontrar un fragmento que explore una zonasuficientemente estable y discriminativa del genoma.Las sondas que exploran supuestos genes depatogenicidad o las regiones que los flanqueansuelen ser poco discriminativas. Las secuencias deinserción son elementos repetitivos de ADN que seencuentran en muchas células procariotas yeucariotas. La presencia de elementos repetitivosfacilita las reorganizaciones cromosómicas y da lugara diversidad. En algunas bacterias con granhomología cromosómica, como Mycobacteriumtuberculosis, el uso de patrones de restricción-

hibridación asociados a secuencias de inserción esde las pocas técnicas capaces de diferenciar entrecepas. En este sentido, existe un protocoloestandarizado para el estudio de los RFLP asociadosa IS6110 con el que se han creado bases de datoslocales y en el ámbito internacional que hanpermitido conocer mejor la difusión de estemicroorganismo así como determinados aspectos desu patogenicidad. A fin de aumentar lareproducibilidad de la técnica, el peso molecular delas bandas de cada patrón se obtiene porextrapolación a partir de un estándar interno que seincluye en cada canal y que exige una segunda

hibridación con una sonda complementaria delmismo (ver documento técnico).5.1.2. RibotipadoLos genes que codifican para las tres clases derARN (23S, 16S y 5S) se encuentran en una unidadde transcripción policistrónica: el operón rrn. Elorden de los genes, después del promotor, es 5’-16S-23S-5S-3’. Un operón típico de E. coli mide6.000-7.000 pb de ADN. En el cromosomabacteriano se encuentran un número variable decopias del operón rrn (entre 2 y 11) según la especie,aunque existen especies como Mycobacterium spp,Mycoplasma o Borrelia burgdorferi en las que solo se

encuentra una copia. Como veremos más adelante,cuanto mayor es el número de copias, mayor es lacapacidad discriminativa del ribotipado.Las secuencias de nucleótidos que codifican para elARN 16S y 23S han cambiado muy poco a lo largo


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de la evolución. Esto es, estas secuencias están muyconservadas en las distintas especies bacterianas apesar de la diversidad que pueda existir en el restodel genoma. No obstante, entre los genes quecodifican para el rARN 16S y 23S existe una regiónespaciadora heterogénea que codifica para tARN y

secuencias repetidas. También existen genes quecodifican para tARN en la región 3’ del operón. Asípues, la estructura del operón rrn permite, por unaparte, que sea reconocido por una sonda universal(derivada de E. coli) y, por la otra, que se generenpolimorfismos de restricción en función de laheterogeneidad que se ha comentado para lassecuencias espaciadores y el entorno 3’. Algunos delos polimorfismos observados son específicos deespecie mientras que otros permiten discriminar anivel infraespecífico. En este sentido, el ribotipadopuede tener aplicaciones tanto taxonómicas comoepidemiológicas. Es de destacar que existe un

sistema automatizado (Riboprinter . Qualicon Inc.Wilmington. EEUU) que facilita el proceso yestandariza el sistema lo que favorece la creación debases de datos.

5.2. PROCEDIMIENTO TÉCNICOEn los métodos de restricción-hibridación puedendiferenciarse los siguientes pasos: 1) Subcultivo dela cepa. 2) Lisis celular. 3) Preparación del ADNgenómico. 4) Digestión con enzimas de restricción.5) Electroforesis. 6) Transferencia de los fragmentosde restricción a una membrana. 7) Hibridación conuna sonda marcada. 8) Revelado. 9) Análisis de

resultados. El protocolo de trabajo de algunos deellos dependerá del microorganismo que se estéanalizando por lo que sólo se comentarán losaspectos generales.5.2.1. Subcultivo de la cepa: Cada vez existenmayores evidencias de que en una muestra clínicapueden coexistir varias cepas de la misma especie.Por ello es importante la observación atenta de lasplacas de aislamiento para la identificación ysubcultivo de los distintos morfotipos e incluso,cuando la apariencia es homogénea, endeterminados estudios es prudente el análisis devarias colonias del mismo morfotipo. El subcultivo se

realiza en un medio líquido adecuado para elmicroorganismo estudiado y una vez en la faseestacionaria (generalmente a las 18 horas) sesedimentan las células bacterianas porcentrifugación procediéndose a su lavado.5.2.2. Lisis bacteriana: Para obtener el ADN espreciso romper la pared bacteriana. Para ello, elpellet (sedimento) obtenido se resuspende en untampón de lisis adecuado que suele contenerlisozima y un detergente (SDS al 1%). También seincluye proteinasa K que inactiva las nucleasas quepodrían dañar el ADN.5.2.3. Extracción del ADN total: Puede utilizarse el

método clásico con fenol. En este caso se añadendos volúmenes de fenol tamponado al tampón delisis agitándose por inversión del tubo a fin demezclar las fases acuosas y fenólica. Posteriormentese separan las dos fases por centrifugación y se

transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo,repitiéndose el procedimiento. Finalmente se añadendos volúmenes de cloroformo-alcohol isoamílico(24:1) mezclándose cuidadosamente y, después decentrifugar, se transfiere la fase acuosa a un nuevotubo. El ADN obtenido, después de añadir NaCl a

una concentración final de 300 mM, se precipita con2 volúmenes de etanol al 95% enfriado a –20ºC. Elpellet de ADN obtenido por centrifugación se lavacon etanol al 70%, se seca y se resuspende con eltampón adecuado (generalmente Tris-HCL 10 mM apH 7,5 con EDTA 1 mM). Alternativamente, el ADNpuede obtenerse utilizando columnas de extraccióncomerciales en las que el ADN de la muestra quedaretenido en la matriz y es eluido después de unlavado.La cuantificación del ADN obtenido se realiza porespectofotometría o sometiéndolo a electroforesis junto con otras alícuotas de concentración conocida

y evaluando la intensidad de la banda obtenida. Laconcentración mínima para poder digerirlo es de 0,12μg/μl.5.2.4. Restricción del ADN: Unos 3 μg de ADN sedigerirán en 25 μl de un tampón de reacción quecontenga el enzima de restricción elegido. El tampónde reacción se elaborará siguiendo las instruccionesdel fabricante. Es prudente aumentar la cantidad deenzima recomendada a fin de conseguir unadigestión completa, que es imprescindible paraobtener resultados reproducibles. La elección delenzima de restricción se hace en función de losdatos existentes en la literatura. Cuando se analiza

un taxón del que no existe experiencia previa sedeberán estudiar varios enzimas hasta encontrar elque se adecue a nuestras necesidades.5.2.5. Electroforesis: La electroforesis se realizará enun gel de agarosa cuyo porcentaje dependerá deltamaño de los fragmentos que se han de resolver, loque a su vez depende del tamaño del genoma delmicroorganismo estudiado y del enzima derestricción utilizado. Antes de cargar el gel seañadirá a cada ADN digerido 3μl de tampón decarga. El tampón de carga contiene un colorante debajo peso como el azul de bromofenol que migracerca del frente de la muestra y permite monitorizar

la separación electroforética. Uno de los tamponesde electroforesis más utilizados es el TBE (Tris-HCL89 mM a pH 8,1 con H3BO3 89 mM y EDTA 2 mM).En cada gel deben incluirse marcadores de pesomolecular con un rango de tamaños que permitaextrapolar el peso de las bandas de hibridaciónobtenidos. Estos marcadores pueden ser externos,esto es correr en un canal propio, o internos. En elcaso de marcadores externos se utilizan cepascontrol con patrones conocidos ya que hibridaráncon la sonda utilizada. Los marcadores internoscorren con la muestra en cada carril y debenevidenciarse con una segunda hibridación que utilizauna sonda complementaria de los mismos (verdocumento técnico). Para visualizar la separaciónelectroforética de los fragmentos de restricción, el gelse sumerge durante una hora en una solución de 0,2


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μg/ml de bromuro de etidio. La visualización de losfragmentos obtenidos se consigue con luz UV. Estavisualización permite, por una parte, controlar que ladigestión ha sido completa y, por otra, que laseparación electroforética ha sido correcta. Esimportante conseguir una imagen digitalizada del gel.

5.2.6. Transferencia: Los fragmentos de restricciónvisualizados se encuentran en el interior de la matrizdel gel y no son accesibles para la sonda que seutilizará en la hibridación. Por ello es necesarioprimero transferirlos del gel a la superficie de unamembrana en un proceso conocido comotransferencia o Southern blot. Se procede en primerlugar a la depurinación y fragmentación de los ácidosnucléicos con HCl 0,25 M, a continuación el gel selava con agua y se sumerge en una solución deNaOH 0,5 M y ClNa 1,5 M para desnaturalizar elADN. A continuación se pueden transferir losfragmentos de restricción a una membrana mediante

diversos procedimientos como la transferencia porcapilaridad o mediante el vacío (figura 4). Puedecomprobarse la transferencia visualizando el gel conluz UV y comprobando que no queda ADN en elmismo.5.2.7. Hibridación: La sonda que se utilizará en lahibridación es complementaria de la región cuyopolimorfismo analizamos. Generalmente se obtieneen el propio laboratorio por técnicas de amplificación(ver documento técnico). Clásicamente las sondasse marcaban con isótopos radioactivos y los híbridosresultantes se detectaban mediante autoradiografia.En la actualidad se utiliza, en general, el marcado

con peroxidasa. Se procede en primer lugar a ladesnaturalización de la sonda obteniéndosemonocadenas cargadas negativamente. Laperoxidasa formando un complejo con un polímerocon carga positiva se une inicialmente al ADN porcarga electrostática y posteriormente de formacovalente por la acción del glutaraldehído. Los

híbridos resultantes se detectan por la oxidación deluminol por la peroxidasa que, en presencia de uncompuesto intensificador da lugar a la emisión de luzque se detecta por autoradiografía. Sea cual sea laforma de marcado de la sonda, antes de lahibridación la membrana debe ser tratada con un

tampón de hibridación que contenga esperma desalmón, timo de ternero u otra fuente de ADN quebloquee los sitios libres de la membrana e impida lafijación inespecífica de la sonda.La hibridación se realiza a continuación añadiendo almismo tampón la sonda marcada. Un tampón dehibridación estándar contiene NaH2PO4 50 mM(pH7,5), EDTA 50 mM, NaCl 0,9 M, sulfato dedextrano al 5% y SDS al 3%. La hibridación tendrálugar en tubos de hibridación en el interior de unhorno de hibridación a unos 65ºC durante 16-24 h.Una vez finalizada, se lavará la membrana con untampón de lavado que contiene NaCl 0,3 M, citrato

sódico 0,03 M (pH 7,0) y SDS al 2% a 45ºC.5.2.8. Revelado: El patrón de hibridación se visualizaexponiendo la membrana a una película fotográficaen el interior de un cassette con pantallasintensificadoras (autoradiografía). Una vez expuesta,la película se revela y fija con reactivos fotográficos.En función del tiempo de exposición y de revelado sepodrá modular la intensidad de las imágenesobtenidas.

5.3. CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DERESULTADOS

El estudio de los RFLP por técnicas de hibridación

generalmente da lugar a perfiles con un númerolimitado de bandas. El análisis de estos patronespuede hacerse teniendo en cuenta el númeroabsoluto de las diferencias observadas en lasbandas o bien mediante el porcentaje de similitud delos patrones que suele calcularse mediante el índicede Dice (apartado 3.1.4).

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Figura 4.- Southern blot o transferencia de ADN utilizando un sistema de vacío: los fragmentos de ADN contenidos en un gel

de agarosa, previamente tratado, son transferidos a una membrana, de nylon o nitrocelulosa, con ayuda de la presión creadapor una cámara conectada a una bomba de vacío. Las flechas muestran la dirección en la que avanzan los fragmentos de ADN(1), desde el gel a la membrana, siguiendo la dirección de la presión generada por el sistema (2).

Membrana

Bombade vacío

Gel de agarosa ADN

(1)

(2)

Cámara de presión negativa


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Pueden existir situaciones en las que, por el bajonúmero de bandas obtenido, la técnica no seadiscriminativa. Así, por ejemplo, en Mycobacteriumtuberculosis, el estudio de los RFLP asociados aIS6110 no es discriminativo en las cepas con menosde seis bandas y, en estos casos, deberán utilizarse

marcadores alternativos.Por otra parte, es muy importante la cuidadosaestandarización de la reacción ya que en distintosexperimentos pueden darse diferencias en lacantidad de ADN estudiada, en la digestión,electroforesis, eficacia de la hibridación o delmarcado de la sonda. Esta falta de estandarizaciónafectará la reproducibilidad del marcador dando lugara variaciones en los patrones siendo especialmentedifícil la valoración de las bandas débiles.Una vez sabemos que el marcador es discriminativoy hemos asegurado la reproducibilidad de la técnica,suelen considerarse cepas clonales las que

comparten el mismo patrón de hibridación (figura 5).No obstante, hay que tener en cuenta que muchasde las sondas utilizadas son complementarias deelementos móviles. Por ello, en las cepas cuyospatrones se diferencian en una única banda seaconseja estudiarlas con un segundo marcador.

5.4. INDICACIONESEn general, en las bacterias, no se recomienda lautilización de las técnicas de restricción-hibridacióncuando existen alternativas menos complejastécnicamente y con capacidad de discriminaciónsimilar. Una notable excepción a esta regla es la

epidemiología molecular de la tuberculosis. Existe unprotocolo estandarizado para el estudio de los RFLPasociados a IS6110 en M. tuberculosis (véasedocumento técnico) y se han creado bases de datoslocales e internacionales con miles de cepas. Estemarcador ha permitido conocer mejor la

epidemiología de la enfermedad y seguir la pista dedeterminadas cepas caracterizadas por suresistencia o patogenicidad. A pesar de ello, inclusoen este caso y teniendo en cuenta la dificultad deconvertir las bases de datos existentes, existenpropuestas para cambiar el marcador.

5.5. INCONVENIENTES DE LA TÉCNICAEl inconveniente fundamental de la restricción-hibridación es la complejidad técnica. Como se havisto, conlleva la realización de numerosos pasosque retrasan varios días la obtención de resultados.Por otra parte, con la salvedad del ribotipado, cadasonda suele ser específica de una especie y amenudo no se dispone de sondas que exploreneficientemente el polimorfismo existente en undeterminado taxón. El ribotipado, que sería unatécnica “universal” suele tener una capacidad dediscriminación inferior a otras técnicas como la

electroforesis en campo pulsante.

5.6. BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA1. Van Belkum A, Struelens M, deVisser A, Verbrugh H,

Tibayrenc M. Role of genomic typing in taxonomy,evolutionary genetics, and microbial epidemiology. ClinMicrobiol Rev 2001; 14: 547-560.

2. Bingen EH, Denamur E, Elion J. Use of ribotyping inepidemiological surveillance of nosocomial outbreaks.Clin Microbiol Rev 1994; 7: 311-327.

3. Hollis RJ, Bruce L, Fritschel SJ, Pfaller MA.Comparative evaluation of an automated ribotypinginstrument versus pulsed-field gel electrophoresis forepidemiological investigation of clinical isolates of

bacteria. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 34: 263-268.4. Kanduma E, McHugh TD, Gillespie SH. Molecularmethods for Mycobacterium tuberculosis strain typing: ausers guide. J Appl Microbiol 2003; 94: 781-791.

Figura 5. Patrones de restricción-hibridación asociados a IS6110: Línea 1, cepa control MT1423. Obsérvese como las cepasde las líneas 5, 6, 7 y 8 comparten el mismo patrón constituyendo un cluster . Ello también ocurre con las cepas en las lineas 10y 11.

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6.ANÁLISIS DEL ADN CROMOSÓMICOMEDIANTE MACRORRESTRICCIÓN:ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE(PFGE)Como se ha expuesto en el apartado 5(procedimientos de restricción e hibridación de ADN)

para una especie bacteriana concreta, podemosencontrar enzimas de restricción de baja frecuenciade corte, es decir, enzimas cuyo lugar de restricción,por su longitud y secuencia, se encuentranraramente a lo largo del ADN cromosómico de laespecie bacteriana en cuestión. El uso de este tipode enzimas permite la macrorrestricción del ADN dela bacteria y la división del ADN en pocos fragmentos(entre 10 y 30). Muchos de estos fragmentos son degran tamaño, más de 40 kb, y no pueden separarsepor técnicas de electroforesis convencional, en lasque se aplica un campo eléctrico constante óestático, sino que requieren técnicas en las que la

orientación del campo eléctrico es variableperiódicamente, son las denominadas técnicas deelectroforesis en campo pulsante o pulsed-field gelelectrophoresis (PFGE).La combinación de estas dos técnicas,macrorrestricción del ADN y separación de losfragmentos por PFGE, se ha aplicado con muchafrecuencia en estudios epidemiológicos enbacteriología. Se obtienen así, patrones derestricción sencillos que representan el ADNcromosómico bacteriano distribuido en unas pocasbandas con movilidades electroforéticas distintas.Sin embargo, las características de estas técnicas

determinan una serie de cambios a tener en cuentaen las distintas fases en las que se divide el procesode macrorrestricción y PFGE: 1) el procedimiento deextracción de ADN, obliga a inmovilizar las célulasbacterianas en bloques de agarosa, en los que sellevará a cabo la lisis, de manera que el ADNcromosómico también quede embebido en agarosa,el objetivo es que el ADN permanezca íntegro y nose fracture accidentalmente (al pipetear, agitar ...) locual desvirtuaría los patrones de restricción yafectaría a la reproducibilidad de la técnica, 2) larestricción del ADN debe hacerse tal y como ésteestá preparado, es decir, inmovilizado en los bloques

de agarosa, utilizando enzimas de baja frecuencia decorte, y 3) la técnica de electroforesis utilizada parala separación de fragmentos debe ser una PFGE,con las características diferenciales propias de ésta.

6.1. TRATAMIENTO PREVIO DE LOSMICROORGANISMOS

Como se ha apuntado previamente, para poderobtener patrones de restricción reproducibles porPFGE que permitan la comparación de los genotiposde una serie de microorganismos, el objetivo esaislar el ADN cromosómico íntegro, sin fracturas y, ala vez, en las mejores condiciones de pureza para

que los enzimas de restricción puedan cortarcorrectamente, evitando restricciones incompletas.Para ello deben observarse una serie deprecauciones con relación al procesamiento ytratamiento previo de los microorganismos:

6.1.1. Crecimiento bacteriano. Los microorganismosse pueden obtener a partir de un cultivo en mediolíquido o bien realizar una suspensión procedente deun medio sólido. En cualquier caso se debe tratar decultivos puros, en medios no selectivos, de no másde 18-24 horas de incubación. Es conveniente

estandarizar el inóculo mediante espectrofotometría(ver documento técnico correspondiente), ésta seráuna medida indirecta de la concentración de ADNque se obtendrá durante el procedimiento.Seguidamente, se mezcla parte del inóculo con elmismo volumen de agarosa de bajo punto de fusiónfundida, y se deja solidificar en un moldeespecialmente diseñado para ello. De esta maneraconseguimos inmovilizar un número de célulasbacterianas equivalente para cada cepa queincluimos en el estudio. A partir de este momento, elresto del procesamiento se realizará utilizando elbloque completo. La agarosa en la que se

encuentran embebidas las células permite fluir a sutravés las soluciones de lisis o restricción en las quevamos a sumergir el bloque, y a la vez va a protegerlas moléculas de ADN de la rotura mecánica y de ladegradación nucleolítica.6.1.2. Lisis. Para conseguir la lisis de losmicroorganismos, los bloques se sumergen en unasolución de lisis que contenga los enzimas precisospara romper las células. La composición de lasolución de lisis es variable en función de la especiebacteriana con la que estemos trabajando (verdocumento técnico correspondiente). Como losenzimas deben actuar en el interior de la malla de

agarosa en que están embebidas las células, seprecisan enzimas más concentrados e incubacionesprolongadas.6.1.3. Lavados. Una vez que las células estánlisadas es preciso someter a los bloques a sucesivoslavados con una solución TE (10 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA ). Los lavados consisten en introducir losbloques en TE y agitarlos durante, al menos, 30minutos, esta operación se repite cuatro o cincoveces. El objetivo de los lavados es arrastrar fueradel bloque de agarosa restos celulares procedentesde la lisis, así como eliminar componentes quepuedan inhibir la restricción posterior (proteinasa K,

detergente o EDTA). Algunos protocolos publicadospara el procesamiento rápido de ciertas bacterias porPFGE, prescinden de los lavados y para ello seeliminan ciertos compuestos del procesamientoprevio, como el tratamiento con proteinasa K.6.1.4. Restricción. La actividad de los enzimas derestricción viene definida sobre ADN en ausencia deagarosa. En general, la presencia de agarosaconlleva cierto grado de inhibición de la reacción dedigestión, por tanto es preciso aumentar el númerode unidades de enzima por reacción. El tiempo deincubación de la reacción de restricción tambiéndebe incrementarse, teniendo en cuenta, no

obstante, que algunos enzimas pierden su actividadtras las primeras horas de incubación. En este caso,se debería añadir a la reacción una segunda alícuotadel enzima. En relación a la selección del enzima derestricción más adecuado, en estos momentos se


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pueden encontrar en la bibliografía científicaespecializada publicaciones sobre prácticamentecualquier especie bacteriana estudiada por PFGE(en el anexo 3 del documento técnicocorrespondiente, se incluye una tabla con losmicroorganismos y enzimas más frecuentes para su

estudio). A la hora de seleccionar un enzima derestricción para PFGE que genere pocos fragmentosde ADN y estos sean de gran tamaño, debe tenerseen cuenta que ello depende de la longitud y de lasecuencia del lugar de restricción del enzima. Engeneral, los enzimas con un lugar de restricción ricoen G+C, son adecuados para tratar el ADNbacteriano de especies con genoma rico en A+T y, ala inversa, enzimas que reconocen secuencias A+T,son adecuados para digerir ADN rico en G+C. Sinembargo, en la práctica, es difícil predecir la utilidadde un enzima para estudiar por PFGE unadeterminada especie bacteriana. Por último, destacar

que el estudio por PFGE de un grupo de cepas conun enzima de restricción primero, y con un segundoenzima distinto después, puede mejorar la capacidadde discriminación de la técnica.

6.2. FUNDAMENTOS Y VARIANTES TÉCNICASDurante los años 70, se observó que bajo la acciónde un campo eléctrico, las moléculas de ADN sereorientaban y se desplegaban avanzando endirección al polo positivo. Cuando el campo eléctricocesaba, las moléculas de ADN se relajabanrecuperando su estado inicial. La aplicación de unsegundo campo eléctrico, con una orientación

distinta del primero, obligaba al ADN a cambiar suconformación y reorientarse de nuevo para poderavanzar en la dirección del segundo campo eléctrico.El tiempo requerido para esta reorientación eradependiente de la longitud de la molécula, esto es desu peso molecular. Tras el cambio de orientación delcampo eléctrico, las moléculas grandes tardan mástiempo en alinearse y poder comenzar el avance através del gel de lo que tardan las moléculas de ADN

más pequeñas. Mientras los campos eléctricos quese alternen tengan la misma intensidad y voltaje, lamigración final del ADN se recogerá en forma delínea recta, aunque el patrón final de separación delos fragmentos revelará la suma de todos losavances cortos en “zig-zag” que el ADN ha realizado.

Este principio fue el que llevó a Schwartz y Cantor en1984 a la descripción de las técnicas de PFGE y suutilidad en la separación de moléculas grandes deADN, del orden de varios cientos de kb.Desde la descripción original del sistema, sediseñaron distintos aparatos con diferencias en lageometría de los electrodos o en la trayectoriamigratoria del ADN. Todos los sistemas erancapaces de separar un amplio rango de moléculasde ADN de diferentes tamaños (entre 1 y 7000 kb),aunque diferían en la velocidad de separación y en laresolución obtenida en un rango de peso moleculardado. De todos los sistemas desarrollados, el más

extendido ha sido el CHEF (clamped homogeneouselectric field electrophoresis). Sus mayores ventajasson la facilidad de manejo y la capacidad de separarmúltiples muestras generando patrones de bandasrectos, que hacen mucho más fácil la comparaciónentre ellos. Este sistema dispone de veinticuatroelectrodos dispuestos periféricamente y fijos a uncontorno hexagonal (figura 6).El voltaje generado por la fuente de electroforesis ogenerador de corriente se divide entre los electrodos,de manera que se crea un gradiente constante a lolargo de todo el gel. El ángu

procedimientos de microbiologia

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