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MANUAL DE PRCTICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA BASICA

Y

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PROGRAMA DE NUTRICION

ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA

Y PARASITOLOGIA

DPTO. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS ICB, UACJ.

DRA. EVANGELINA OLIVAS E. Y

M. EN C. LUIS ROBERTO ALARCON

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AGRADECIMIENTOS:

A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y

PARASITOLOGIA, POR SUS VALIOSAS SUGERENCIAS EN LA ELABORACION DE ESTE

MANUAL.

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CONTENIDO: Pag.

Portada.1

Agradecimientos..2

Contenido..3

Reglamento de laboratorios4

Introduccin a la Microbiologa.6

Bacteriologa7

Prctica # 1 Microscopa.9

Prctica # 2 Inoculacin y Aislamiento de Bacterias .12

Prctica # 3 Tcnicas Microscpicas de Bacterias .........16

Prctica #4 Medios de Cultivo ....20

Prctica # 5 Nutricin Microbiana .24

Prctica # 6 Factores Fsicos sobre microorganismos...26

Prctica # 7 Crecimiento Bacteriano..28

Prctica # 8 Metabolismo Bacteriano....33

Prctica # 9 Variaciones Genticas.. ..40

Prctica # 10 Control de los Microorganismos, efecto de agentes qumicos....42

Prctica # 11Microbiota Normal Humana ....44

Prctica # 12 Relacin Husped Parsito....46

Prctica # 13 Bacterias en el Ambiente..49

Prctica # 14 Eumycetos...51

Prctica # 15 Protozoarios.54

2 PARTE Microbiologa Alimentos..56

Bibliografia ..102

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REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES

INTRODUCCION

Este reglamento regir la actitud, el comportamiento y el desempeo del estudiante

dentro de los laboratorios de Microbiologa y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y

estudiantes que laboran en l, ya que el laboratorio es un rea donde se manejan

microorganismos patgenos, parsitos y algunos compuestos qumicos peligrosos. Asimismo, se

debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la

cristalera.

REGLAS

1. Todos los alumnos debern asistir con bata blanca larga y el cabello recogido. 2. La entrada al laboratorio quedar restringida exclusivamente a los alumnos inscritos 3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O

BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos.

4. Est estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio. 5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debindose colocar estas

en los lockers de la entrada de

6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deber comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminacin con los

microorganismos patgenos o parsitos manejados en las prcticas.

7. Se nombrar un jefe de mesa quien ser el responsable del cuidado del material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. Tambin vigilar que todos los integrantes

de la mesa se laven las manos con antisptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibir

del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo

de las prcticas, y posteriormente los devolver en las mismas condiciones que los

recibi, a excepcin de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo

cultivos). En caso de algn dao al material o aparatos, los alumnos integrantes del

equipo estarn obligados a reparar dicho dao en forma que indique el profesor.

8. Para tener derecho a la evaluacin final en la teora, el alumno deber tener el 80 % de asistencia.

9. Para poder tener derecho a la asistencia se dar 10 minutos como retardo 10. La calificacin final de la materia de Microbiologa quedar constituida por la puntacin

obtenida en la prctica y en la teora, cuya suma se efectuar en la forma siguiente:

a) La calificacin final obtenida en el laboratorio tendr un valor del 30 % de la calificacin final total.

b) La calificacin total de la teora corresponder al 70 % de la calificacin final. c) La suma de ambas calificaciones (teora y prctica) ser igual al 100 %. d) El alumno no podr acreditar la materia si obtiene calificacin reprobatoria en el

laboratorio o en la teora. Debe aprobar ambas para promediarse.

11.- El alumno deber capacitarse con la NOM-087 sobre la Separacin, Tratamiento y

Destino de los Residuos Biolgico- Infecciosos

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Introduccin.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestacin de servicios para

promocin, prevencin, diagnstico, tratamiento y rehabilitacin de la salud, regulando los

servicios mdicos para que respondan a las demandas y necesidades de la poblacin.

Los servicios mdicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,

independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea pblico, social o privado.

Las soluciones tecnolgicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta norma,

deben ser el resultado de las demandas de actividades de promocin y prevencin de la salud, as

como aqullas dirigidas al diagnstico y tratamiento de las diversas patologas. Se debe indicar

qu tecnologas diagnsticas, teraputicas y de rehabilitacin se utilizarn en los

establecimientos mdicos para atender correctamente tales demandas, lo cual integra el programa

mdico.

La indicacin o el uso de las tecnologas para la salud dependen de la motivacin, de los

conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una correcta

organizacin funcional de los establecimientos de atencin que asegure realizar las actividades

mdicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integracin de la infraestructura y el

equipamiento.

En esta norma se presentan los requisitos mnimos de infraestructura y equipamiento para

hospitales y consultorios de atencin mdica especializada, incluyendo la infraestructura y el

equipamiento para ejercer actividades directivas y de formacin de personal de salud, establecido

como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de prestacin de

Servicios de Atencin Mdica.

1. Objetivo

Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mnimos de

infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atencin mdica

especializada.

2. Campo de Aplicacin Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los hospitales

de los sectores pblico, social y privado, cualquiera que sea su denominacin, que realicen

internamiento de enfermos para la ejecucin de los procesos de diagnstico, tratamiento mdico.

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MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCION.

La microbiologa es la rama de la biologa encargada del estudio de los microorganismos, seres

vivos pequeos (del griego mikros "pequeo", bios, "vida" y - -loga, tratado, estudio, ciencia), tambin conocidos como microbios. Es la ciencia de la biologa

dedicada a estudiar los organismos que son slo visibles a travs del microscopio: organismos

procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos

microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como

pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular);

estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas

(clulas sin ncleo definido) como las bacterias. Sin embargo la microbiologa tradicional se ha

ocupado especialmente de los microorganismos patgenos entre bacterias, virus y hongos,

dejando a otros microorganismos en manos de la parasitologa y otras categoras de la biologa.

Aunque los conocimientos microbiolgicos de que se dispone en la actualidad son muy amplios,

todava es mucho lo que queda por conocer y constantemente se efectan nuevos

descubrimientos en este campo. Tanto es as que, segn las estimaciones ms habituales, slo un

1% de los microbios existentes en la biosfera han sido estudiados hasta el momento. Por lo tanto,

a pesar de que han pasado ms de 300 aos desde el descubrimiento de los microorganismos, la

ciencia de la microbiologa se halla todava en su infancia en comparacin con otras disciplinas

biolgicas tales como la zoologa, la botnica o incluso la entomologa.

Al tratar la microbiologa sobre todo los microorganismos patgenos para el hombre, se

relaciona con categoras de la medicina como patologa, inmunologa y epidemiologa.

La Microbiologa se puede definir, sobre la base de su etimologa, como la ciencia que trata de

los seres vivos muy pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo

del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga

determinado por la metodologa apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los

microorganismos. Con la invencin del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue

de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 aos

su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos morfolgicos microbianos, y a los

primeros intentos taxonmicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas

naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.

Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la

Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,

estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Qumica, que le

aportara varios avances metodolgicos fundamentales.

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BACTERIOLOGIA

La Bacteriologa es una disciplina de la Microbiologa, que ha estado presente a lo largo de la

historia de la humanidad.

Las bacterias son responsables de millones de muertes de personas a nivel mundial.

Entre algunas enfermedades infecciosas bacterianas, causantes de grandes epidemias que han

mermado la poblacin, se encuentran: la difteria, clera, tuberculosis, sfilis, ttanos, tos ferina, y

fiebre tifoidea. Sin embargo, tambin existen infecciones bacterianas que aunque estn asociadas

en menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de salud pblica en pases en vas

de desarrollo como el nuestro, entre las que podemos mencionar: diarreas (causadas por Shigella

o Escherichia coli), infecciones de vas urinarias, faringoamigdalitis, gonorrea, tracoma y

brucelosis.

CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS

De acuerdo al rbol de la Vida de Woese, microbilogo creador de la nueva taxonoma

molecular basada en la comparacin entre especies de la fraccin 16s del ARN ribosomal, se

proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye a todos los seres

vivos, aunque existen controversias.

Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las clulas procariotas, una de cuyas

caractersticas es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fsiles y

modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de aos. Su importancia radica en

el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les confiri, desde el

principio, de autonoma y proteccin con respecto a su medio ambiente. Desde entonces

constituyeron la forma de vida ms abundante en el planeta en trminos de biomasa y nmero de

especies. A pesar de su menor complejidad en relacin a Eucarya, los integrantes de los

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dominios Archeae y Bacteria pueden vivir en hbitats extremos: se les encuentra en las

profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al lento catabolismo del carbono orgnico

depositado en los sedimentos, y en las profundas fuentes hidrotermales submarinas.Se acepta la

aparicin del dominio Eukarya, con membrana nuclear y orgnulos ms desarrollados, desde

hace unos dos billones de aos; de este dominio derivan todos los organismos eucariontes uni y

multicelulares. Otra clasificacin de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por Whitaker y Margulis. Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae,

Fungi, Protista y Monera, en ste ltimo reino se incluyen todas las bacterias.

MORFOLOGA BACTERIANA

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PRACTICA #1

MICROSCOPIOS Y MICROSCOPIA

OBJETIVO DE LA PRACTICA.

Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio de luz, con su manejo y sus

cuidados y que conozca el fundamento de las diferentes clases de microscopios.

INTRODUCCION.

El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en el

laboratorio de microbiologa, debido a que proporciona la amplificacin o agrandamiento

aparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista, con una

amplificacin desde cien a cientos de miles de veces. Las dos categoras de microscopios

disponibles son los microscopios pticos (de luz) y los microscopios electrnicos.

I. EL MICROSCOPIO OPTICO (de luz):

Utiliza un sistema de lentes pticos que va amplificando la imagen sucesivamente y comprende: -

microscopio de campo claro -microscopio de campo obscuro -microscopio de fluorescencia -

microscopio de contraste de fases.

1. El Microscopio de Campo Claro: Es el instrumento ms ampliamente utilizado para microscopa de rutina. Aqu el rea observada est brillantemente iluminada y los objetos en estudio

aparecen ms obscuros. Generalmente producen un aumento til de unos l000 dimetros. La

amplificacin se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseadas y acomodadas para

proporcionar la amplificacin en forma ptima. Presenta lentes en el condensador, en los objetivos y

en los oculares. La lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la

muestra. Algunos de los rayos de luz de este cono pasan directamente a la lente del objetivo para

formar el fondo de luz o campo claro. Los rayos de luz que chocan con los objetos

(microorganismos) que hay en la muestra y se "curvan", son conducidos a la lente del objetivo para

formar una imagen del objeto. La imagen es amplificada por la lente ocular. Comnmente los

microscopios estn equipados con tres objetivos montados en una plataforma llamada revlver, que

al hacerse girar pone a uno de ellos en la lnea del condensador. y cada uno proporciona distinto

grado de aumento El poder de resolucin de un microscopio est determinado por la longitud de onda

de la luz y por una propiedad del objetivo y de la lente del condensador.

Sistema mecnico: Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del microscopio, platina, revlver, objetivos de de 10, 40 y 100 X, tornillo macromtrico, tornillo micromtrico,

condensador y diafragma.

2 Microscopio de Campo Oscuro: Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con un condensador de campo oscuro y una abertura numrica baja. Esta clase de condensador dirige los

rayos de luz dentro del campo de la muestra, formando un angulo tal, que solo los rayos que chocan

contra el objeto que hay en el campo de la muestra son refractados (curvados) y penetran en el

objetivo. As, el objeto queda brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro (campo

oscuro)

3 Microscopio de Fluorescencia: Est equipado con una fuente de luz ultravioleta, varios filtros y un condensador de campo obscuro. Se usa para examinar muestras teidas con colorantes de

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fluorocromo, denominados fluorescentes, los cuales absorben energa de longitudes de ondas cortas

invisibles, pero emiten ondas de longitudes de onda mayores visibles y el fenmeno es denominado

fluorescencia. Esta tcnica permite la identificacin rpida de algunos microorgnismos.

4 Microscopio de contraste de fases: Es un tipo de microscopio ptico que permite un mayor contraste entre substancias de diferente grosor o diferente ndice de refraccin, mediante el uso de un

condensador y un objetivo especiales que controlan la iluminacin del objeto, de manera que acenta

las ligeras diferencias en el espesor o en los ndices de refraccin de las estructuras celulares. Las

diferencias se revelan en forma de distintos grados de brillo o de oscuridad (un mejor contraste),

pudiendo localizarse estructuras dentro de la clula sin teir, que no son visibles en la microscopa de

campo claro.

EL MICROSCOPIO ELECTRONICO

Emplea haces de electrones en lugar de ondas de luz, para producir una imagen amplificada. Un

campo magntico substituye a las lentes. Es posible lograr amplificaciones de un milln de veces, las

que posteriormente se logran ampliar ms en la imagen fotografiada. Esto hace posible la

observacin de microorganismos tan pequeos, que no se ven con el microscopio ptico, como los

virus. -Microscopio electrnico de transmisin: Un haz de electrones finamente enfocados,

pasa a travs de un corte ultradelgado del especimen. Los electrones son enfocados a una

pequea rea de la muestra y la iluminan, apareciendo con reas claras y obscuras. La resolucin

de es de 2.5 nm y la amplificacin es de 10,000 X a 100,000

X.

- Microscopio electrnico de Barrido: Resuelve el problema de seccionar los especmenes,

permitiendo observar clulas completas. Unos electrones son dirigidos a la superficie de la

muestra y otros colectados para formar la imagen tridimensional.

MATERIALES Y METODOS:

EJERCICIO PARA EL TRANSPORTE Y MANEJO DEL MICROSCOPIO:

1. El transporte del microscopio de un lugar a otro debe ser muy cuidadoso. Con una mano se debe sujetar del brazo, mientras se coloca la otra mano bajo la base para

sostenerlo, mantenindolo en posicin vertical. Esto evita el desprendimiento de algunas de las partes que no son fijas.

2 Nunca deposite el microscopio en la orilla de la mesa, sino a unos cm de distancia del borde. 3 No toque las lentes con los dedos. 4 No juegue con los componentes del instrumento. Si no funciona en forma adecuada, notifquelo al profesor y no intente arreglarlo usted mismo.

5 No permita que ningn reactivo qumico entre en contacto con alguna parte del microscopio, a excepcin del aceite de inmersin usado con la lente de l00 X.

6 Limpie las lentes slamente con papel especial para lentes (papel seda) sobre todo al terminar de usarlo, para que no queden restos de aceite de inmersin.

EJERCICIO DE ENFOQUE 1 En base a las indicaciones del profesor vaya identificando las diferentes partes que constituyen el microscopio.

2 El profesor le proporcionar una preparacin fija de bacterias en un portaobjetos para el ejercicio.

3 Encienda el microscopio. 4 Mueva cuidadosamente el revlver y coloque el objetivo de 10 X sobre la platina.

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5 Coloque en la platina un portaobjetos con un especimen y ajstelo en el carro. Haga coincidir el haz de luz del condensador con el especimen.

6 Mueva el tornillo macromtrico para acercar el objetivo de 10 X a la platina, totalmente hasta el tope.

7 Posteriormente, sin dejar de observar a travs del ocular, mueva lentamente el tornillo macromtrico para ir alejando el objetivo de 10 X, hasta detectar una imagen o un color en la

preparacin; enseguida mueva lentamente el carro en la platina. Si la imagen se mueve, indicar que

est enfocando la preparacin. Mueva el tornillo micromtrico y afine el enfoque. Una vez logrado el

enfoque, ya no suba ni baje el tornillo macromtrico, solo use el micromtrico. Si se desenfoca,

vuelva a repetir el proceso.

8 A continuacin mueva el diafragma y determine la cantidad de luz ms efectiva para la observacin.

9 Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 10X y cambie al objetivo de 40 X. Ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico. Con el diafragma determine la cantidad de luz

adecuada .

10 Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 40X y coloque una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. A continuacin mueva de nuevo el revlver con cuidado, dejando

que la lente del objetivo de 100 X quede en contacto con el aceite. Ajuste el enfoque con el

micromtrico. Si no lo logra, regrese directamente al objetivo de 10 X, sin pasar por el de 40 X para

no ensuciarlo con el aceite y vuelva a enfocar. El aceite aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente

del objetivo.

11 Al terminar, mueva el revlver antes de sacar la preparacin y enseguida limpie el aceite de la lente, con papel seda. Puede usar un pauelo desechable por el lado que no suelta pelusa. No

utilice algodn ni otros materiales.

12 Nunca olvide retirar la preparacin de la platina al terminar, ni limpiar el aceite del lente 100X .

13 Apague el microscopio y enrolle el cable.

RESULTADOS, DISCUSION y CONCLUSIONES.

Haga dibujos de las observaciones a diferentes amplificaciones. Explique con un

esquema la formacin de la imagen que se observa

Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones y las dificultades

encontradas, as como las ventajas y desventajas que not en la tcnica.

CUESTIONARIO.

1 Cmo se forma la imagen del microscopio? 2 Por qu se usa el aceite de inmersin con el objetivo de 100 X slamente. 3 Consulte la literatura y describa otras clases de microscopio no mencionadas.

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PRACTICA #2

INOCULACION

Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

OBJETIVO DE LA PRCTICA.

Desarrollar las tcnicas comunes de inoculacin en medios de cultivo y las tcnicas de

aislamiento. Comprensin del fundamento en cada caso.

INTRODUCCION.

Las bacterias se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos denominados medios de

cultivo, cuyos componentes son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del

estudio.

El material que se inocula en el medio se denomina inculo. Cuando se inocula un medio

como el agar nutritivo u otros medios con agar en cajas de Petri, por el mtodo de "siembra por estra

cruzada en placa", las clulas quedan separadas individualmente. Durante la incubacin, las clulas

microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en 18 a 24 hs producen masas visibles a

simple vista, denominadas colonias. Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un

cultivo puro de una sola clase de bacterias. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo

original quedan muy cerca una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan pueden

quedar mezcladas o muy juntas. La siembra por estra permite aislar las bacterias que dan lugar a

colonias separadas y posteriormente, transfiriendo una sola colonia a un medio nuevo, se permite el

desarrollo de un cultivo puro bacteriano.

MATERIALES Y METODOS.

I. TECNICA DE LA ESTRIA CRUZADA EN PLACA (inoculacin y aislamiento de bacterias) 1 En todas las siembras siguientes deber quemar el asa al rojo vivo en la flama del mechero, antes y despus de usarla.

2 Con el asa bacteriolgica previamente quemada y enfriada en el rea de esterilidad, siembre una mezcla de dos o ms bacterias en una placa de agar nutritivo. Desarrolle el mtodo de siembra de

la estra cruzada en placa, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentgono, siguiendo las

indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inculo. Al final de la siembra las bacterias

quedarn bien separadas unas de otras. Al terminar, no olvide quemar el asa de nuevo. Con un

marcador indeleble marque cada caja con una clave para identificarla. Determine las caractersticas

coloniales de las diferentes especies sembradas.

3 Siembre por separado en placas del mismo medio, cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Serratia

marcescens y Streptococcus faecalis. Desarrolle el mtodo de siembra de la estra cruzada en placa.

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Marque las cajas. Incube igual que las anteriores. Describa las caractersticas coloniales de cada

especie.

4 Invierta todas las cajas (la tapa hacia abajo) para evitar la evaporacin. Incube a 35 C por 24 hs.

II. INOCULACION EN TUBO CON MEDIO LIQUIDO. 1 Inocule una asada de cada bacteria por separado, en tubos con caldo nutritivo. Deje un tubo testigo sin inocular.

2 Inocule por estra las bacterias en tubos con agar nutritivo inclinado. 3 Incube todos los medios sembrados a 37 C por 24 hs. 4 Note el desarrollo de colonias bacterianas separadas en los medios slidos en placa. En el caso de los medios lquidos, note slo una turbidez, un sedimento o una pelcula Haga deducciones y

explique.

III. SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO SOLIDO (agar inclinado y agar sin inclinar).

1 Siembre separadamente bacterias en tubos con medio slido inclinado, por estra. 2 Siembre por picadura en el centro, con una asa recta (sin anillo) las mismas bacterias por separado en tubos con medio slido sin inclinar.

3 Incube todos los tubos igual que en los puntos anteriores.

Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos. Compare sus resultados

personales con los de los otros equipos. Note las diferencias en el tipo de crecimiento de

cada bacteria en los medios slidos y en los lquidos.

Haga un cuadro de resultados con los datos de la morfologa colonial, en base a la forma,

tamao, color, etc. en la siembra de las diferentes bacterias en medio slido. Explique los

resultados y los errores cometidos al estriar. Note la diferencia en el tipo de crecimiento de

las bacterias en el medio lquido y deduzca si esta tcnica sera til para aislar bacterias.

Explique a qu se debe la formacin de colonias en el medio slido.

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Resultados, Discusion y Conclusiones

Fig. 5 esterilizacin de asa

Fig. 6 siembra en tubo con agar

inclinado

Fig. 7 siembra en medio lquido Fig. 8 Tcnica de estra cruzada

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PRACTICA #3

TECNICAS MICROSCOPICAS

DE BACTERIAS.

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Conocer y desarrollar las tcnicas microscpicas comunes para observar, teir y medir a

las bacterias y sus estructuras.

INTRODUCCION

El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su

tamao promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrmetros (m) de dimetro. En cuanto a su

forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos y

helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y

pueden ser mviles o inmviles. Las esfricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares,

en tetradas, en cadenas o en racimos.

Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden apreciar mediante tcnicas

microscpicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al

microscopio de clulas vivas en su forma, disposicin y tamaos naturales, han sido

antagonizadas por el hecho de que, el ndice de refraccin del protoplasma de los

microbios se acerca al del agua y por ello, las clulas y sus estructuras no pueden

diferenciarse en forma neta entre s, ni del lquido en que estn includas. El estudio

microscpico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes,

aprecindose su forma y tamao.

Preparacin en fresco:

Permite observar en los microorganismos su movilidad, color, tamao, forma y

agrupacin en condiciones naturales, cuando estn vivos, sin alteraciones. Sin embargo,

la observacin es difcil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el ndice

de refraccin del medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando

el microscopio de campo oscuro y el de contraste de fases.

La preparacin en fresco es utilizando un portaobjetos normal, con cubreobjetos encima. -Otra forma

es la preparacin en en gota suspendida, utilizando un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.

Tcnicas de tincin: Tcnicas de tincin simples o directas:

Tien homogneamente la clula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de metileno,

safranina, cristal violeta, etc.

Tcnicas de tincin compuesta o diferencial:

Requieren combinaciones de dos o ms colorantes, como en la tcnica de Gram, la de Ziehl Neelsen,

tincin de esporas, etc.

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Algunas de estas tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como cpsula, flagelos,

esporas, etc. Otras tien selectivamente bacterias de un grupo especfico.

Tinciones negativas:

En realidad no colorean los microorganismos, ya que el colorante se limita a depositarse en el campo

del rededor, delimitando las clulas. Esto se explica debido a que las bacterias presentan muchas

cargas negativas asociadas con la pared, membrana y citoplasma, siendo repelidos los colorantes con

carga cida.

MATERIALES Y METODOS

I. Preparacin en fresco.

En este tipo de preparacin se perdern varios detalles de las bacterias.

A partir de cultivos en medio lquido: cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en

medio lquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que no

queden burbujas de aire).

- A partir de cultivos en medio slido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con

ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y

resuspenderlas en la gota de agua. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma,

agrupacin, color, movilidad (cilios,flagelos, deslizamiento,browniano), etc. Nota: tenga en cuenta que el calor desprendido por el foco luminoso ir secando la

preparacin y como consecuencia habr perdida de movimiento.Adems podran aparecer

corrientes de lquido que pueden dificultar la observacin de la muestra.Cuando se observen

estos efectos se levanta el cubreobjetos y aadir ms lquido o bien, aplicar parafina o esmalte

en los bordes del cubreobjetos

. Diga si pudo observar la forma de las clulas y su agrupacin.

II. Tcnica de elaboracin de frotis bacterianos (antes de la tincin)

1 Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y djela enfriar en el rea de esterilidad 2 Destape un cultivo bacteriano lquido junto a la flama del mechero y tome con el asa una gotita del cultivo, depositndola en el centro de un portaobjetos limpio; extienda con el asa para

hacer un frote.

3 Si el cultivo no es lquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro de un portaobjetos. Queme el asa y djela enfriar, tomando a continuacin una poca de la masa bacteriana

de la superficie del medio, para hacer una suspensin de bacterias en la gotita del porta. Enseguida

extienda con el asa para hacer un frote.

4 Deje secar el frote al aire libre. 5 Fije la preparacin con calor, pasndola tres veces sobre la flama del mechero en forma rpida.

III.Tinciones Diferenciales Tincin

de Gram. 1 Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus subtilis

2 Despues de fijar los frotes, cbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague con agua.

3 Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua. 4 Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.

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5 Cubra con safranina medio minuto y lave con agua. 6 Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 100 X con aceite de inmersin. 7 Las bacterias teidas de rojo se consideran gramnegativas; las de morado, grampositivas. 8 Note las diferencias en la observacin de bacterias teidas con las no-teidas. 9 Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.

Tcnica de Ziehl-Neelsen 1 Haga un frote con Mycobacterium sp., djelo secar al aire libre y fjelo con calor. 2 Coloque encima un pequeo rectngulo de papel filtro (2 x 3 cm). Aplique unas gotas de carbol-fucsina sobre el papel, para humedecerlo bien y deje actuar 5 min., calentando la preparacin por el reverso cuidadosamente hasta emisin de vapores, sin permitir

la ebullicin. No deje secar el colorante, aplicando ms, si lo requiere.

3 Retire el papel con una pinza y enjuague con agua y escurra. 4 Decolore con alcohol cido, uno a dos min. y lave con agua. 5 Cubra con azul de metileno por 1-2 min y lave con agua corriente. 6 Deje secar y observe al microscopio. 7 Las bacterias teidas de rojo se consideran cido-resistentes (BAAR) 8 Las azules son no-cido resistentes.

Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.

Tincin negativa de cpsula.

1 En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensin bacteriana de Klebsiella pneumoniae o Leuconostoc en agua. Adicinele una gota de tinta china y mezcle con el asa.

2 Con otro porta extienda la preparacin, como para realizar un frote. Deje secar al aire libre. No se requiere fijar con calor.

3 Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua rpidamente y con cuidado, para no despegar la preparacin.

4 Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 y a 100 X.

Tincin de endosporas bacterianas.

1 Prepare un frote con Bacillus sp. Deje secar al aire libre y fje con calor. 2 Coloque sobre el portaobjetos una tira de papel filtro de menor tamao. Cubra con verde de malaquita en solucin acuosa de fenol. Caliente a emisin de vapores durante 5 min. No permita que

ebulla.

3 Deje enfriar y lave. 4 Agregue safranina 30 seg. Y lave con agua. Deje secar. Observe a 10 y a 100 X.

Tincin de flagelos

1 Hacer un crculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual 2 Se recomienda lavado con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo

de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.

3 Colocar dentro del crculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensin bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.

4 Fijar la preparacin al aire ya que si esta operacin se hace usando la flama del mechero se pueden destruir los flagelos.

5 Humedecer la preparacin con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo fro.

19

6 Lavar con agua corriente. 7 Secar y observar con objetivo de inmersin.

INTERPRETACION:

Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos

extremadamente delicados.

Fig. 1 Preparacin de frotis

Fig. 2 Tincin simple

Fig. 3 Tincin endosporas

20

RESULTADOS, N Y

Tincin de Gram

Fig. 3 Tincin de cpsula

Fig. 4 Tincin gram

21

PRACTICA # 4

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Comprender las diferencias qumicas de los diferentes medios de cultivo y las tcnicas para su

preparacin, con el fin de obtener el criterio necesario para su eleccin, en base a las necesidades de

cada bacteria y a los propsitos del laboratorio.

INTRODUCCION.

Los medios de cultivo contienen los nutrientes necesarios para cultivar microorganismos, tales como

bacterias, hongos y otros. Los microorganismos no pueden estudiarse individualmente debido a su

tamao tan pequeo, por lo que solo pueden ser estudiados en poblaciones. Para ello es necesario

cultivarlos en medios artificiales. Los medios de cultivo para los microorganismos pueden ser

slidos, lquidos o semislidos. Los medios lquidos se pueden transformar en slidos al adicionarles

agar, gelatina o gel de slice. Al disminuir la cantidad del agente solidificante, se obtiene el medio

semislido. Antes de preparar un medio de cultivo para el cultivo de cualquier microorganismo, es

necesario entender sus necesidades bsicas. Cualquier medio de cultivo debe contener los siguientes

factores: agua, carbono, energa, nitrgeno, minerales, pH y factores de crecimiento. Los

componentes de los medios son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del

estudio. Los medios sintticos se preparan utilizando una composicin exacta conocida,

generalmente a base de compuestos altamente purificados. Los medios no-sintticos contienen

ingredientes de composicin imprecisa y pueden ser a base de extracto de carne, adicionados de

sangre, suero u otras sustancias complejas.

Los medios selectivos impiden el desarrollo de ciertos grupos microbianos y favorecen el desarrollo

de otros. Por ejemplo puede omitirse una fuente nitrogenada orgnica, adicionando slo una

inorgnica. Pueden adicionarse ciertas sustancias como telurito de potasio, sulfito de bismuto, y

otros. Algunos antibiticos tambin pueden ser aadidos para inhibir. Los medios diferenciales

contienen sustancias nutritivas o indicadoras que permiten desarrollar a las bacterias con una

apariencia colonial distintiva. Los medios para pruebas de caracterizacin e identificacin de los

microorganismos estn adicionados de sustratos especficos y permiten diferenciar unas especies de

otras, en base a su capacidad enzimtica especfica. Medios de enriquecimiento favorecen la

multiplicacin y aumento de un cierto grupo de microorganismos. Aqu se combina un medio

selectivo y la variacin de otros factores como pH, temperatura, iluminacin, aereacin, una fuente

nica de carbono, etc. Medios enriquecidos: algunas bacterias requieren medios especiales,

complejos y sofisticados, ya que son incapaces de crecer en medios comunes.

Medios de mantenimiento: preservan satisfactoriamente la viabilidad de los organismos,

conteniendo concentraciones limitadas de nutrientes.

En la actualidad el trabajo requerido en la preparacin de medios se ha simplificado,

mediante la utilizacin de medios deshidratados que se obtienen comercialmente, en las

variedades deseadas. Algo similar a las mezclas deshidratadas para la elaboracin de

pasteles. Slo se requiere disolver una cantidad conocida en un volumen medido de agua,

repartir en los recipientes necesarios (tubos de ensayo, matraces, frascos, etc.) esterilizar.

22

Un pequeo grupo de microorganismos no se ha logrado cultivar in vitro, hasta la fecha,

como Mycobacterium leprae, Treponema pallidum y las rickettsias.

La esterilizacin de los medios es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos los

microorganismos presentes en ellos, cuidando que en los recipientes no vuelva entrar

ningn organismo. En esta forma, slo se cultivarn los organismos deseados. La

esterilizacin es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida .

Esterilizar es un trmino absoluto. Algo est estril o no lo est, pero nunca est parcialmente

estril.

Esterilizacin con calor: La temperatura elevada puede inactivar muchas enzimas,

desnaturalizar protenas y como consecuencia la muerte de los microorganismos. El

efecto depende de la temperatura y del tiempo de exposicin.

-El calor hmedo en forma de vapor saturado a presin es uno de los agentes ms utilizados

para la esterilizacin de medios de cultivo. Con el ambiente hmedo se favorece la penetracin ms

rpidamente del calor a la clula, provocando una coagulacin de las protenas. Comnmente se usa

el autoclave, a 121 C, 15 libras de presin, por 15 min.

-El calor seco (aire caliente) utilizado en los hornos, da lugar a la oxidacin de componentes

celulares vitales. Es utilizado en materiales generalmente de vidrio, limpios y secos, como cajas de

Petri, pipetas, algunos instrumentos quirrgicos, etc. Puede esterilizarse a 180 C una hora.

Filtracin: El uso de filtros bacteriolgicos es til cuando se requiere esterilizar sustancias

termolbiles, como vitaminas, aminocidos u otras similares. Estas deben ser adicionadas a los

medios previamente esterilizados, en condiciones aspticas. La incineracin: su uso es limitado,

como en la esterilizacin del asa microbiolgica, cadveres de animales de laboratorio, algunos

desechos de hospitales y otros similares. Reparticin de los medios estriles: Si los medios

esterilizados se van a repartir en cajas de Petri u otros recipientes, stos deben estar estriles y se

debe trabajar dentro del rea de esterilidad.

MATERIALES Y METODOS

Cada equipo de alumnos puede preparar un medio de cultivo diferente, pesando en cada caso la

cantidad indicada en las instrucciones de la etiqueta del medio, para un litro de agua, o la cantidad

que se necesite preparar.

23

I. Medios esterilizados por calor hmedo.

Prepare medio en dos matraces de 500 ml con 200 ml c/u (por ejemplo un medio de mantenimiento como Tripticasa-agar-soya). Para pesar, siga las instrucciones de la etiqueta. Tape con

algodn y un gorro de papel. Esterilice con calor hmedo en autoclave, a 121 C y 15 libras de

presin, durante 15 minutos. Reparta posteriormente en condiciones de esterilidad, en cajas de Petri

cuando el medio estril an est caliente aprox. a 60 C

Prepare tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapn de rosca o de algodn, con 5 ml aprox. de un medio con agar (pueden ser los medios sintticos y no-sintticos de la siguiente prctica); no

apriete los tapones de rosca y esterilice en la misma forma. Deje solidificar la mitad de los tubos (an

calientes) en posicin inclinada. Deje solidificar el resto en forma vertical. Despus de solidificar

apriete los tapones.

Prepare un matraz de 250 ml con 50 ml de medio lquido. Reparta en tubos de 16 x 150 mm, con tapn de rosca o de algodn. Deje flojos los tapones de rosca y esterilice, apretndolos al sacar.

Esterilizacin de material de vidrio vaco con calor seco, en el horno.

1 Para esterilizar algunas pipetas, primero colqueles algodn en la boca, a manera de filtro y ensegida envuelva cada una en una tira de papel, siguiendo las instrucciones del profesor. Esterilice

en el horno a 180 C por una hora.

2 Esterilice cajas de Petri vacas en el horno.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

24

PRACTICA #5

NUTRICION MICROBIANA

OBJETIVO:

Observar el crecimiento de los organismos en diferentes sustratos, relacionando el

mayor crecimiento con requerimientos nutricionales adecuados.

INTRODUCCION

Los requerimientos nutricionales de un microorganismo estn determinados por la composicin

qumica de la clula, por su constitucin gentica y por factores del medio ambiente. Cualquier

sustrato puede constituir una fuente de nutrientes para ciertos microorganismos. Sin embargo, cada

grupo de organismos vara ampliamente en sus caractersticas genticas y por consiguiente tambin

en sus propiedades fisiolgicas y en su capacidad para utilizar y transformar los diferentes

compuestos qumicos. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo con: a) la fuente de

carbono, N, S, P y O que utilicen, y b) segn la fuente de energa. En base a la fuente de C , se

denominan auttrofos a los microorganismos que utilizan CO2 o carbonatos, a diferencia de los

hetertrofos quienes slo son capaces de utilizar como fuente de C diferentes compuestos orgnicos

con varios grados de complejidad. Por lo que respecta a la fuente de energa, los fottrofos

transforman la energa luminosa en energa qumica; los quimitrofos obtienen su energa a partir de

la oxidacin de compuestos qumicos. Existen tambin grupos intermedios que se comportan como

facultativos en las clasificaciones anteriores. Por otro lado, existen algunos microorganismos

llamados prottrofos que requieren factores de crecimiento, es decir , compuestos orgnicos que son

utilizados como precursores o como constituyentes del material celular y que no pueden ser

sintetizados a partir de compuestos de carbono ms sencillos. Los que no requieren factores de

crecimiento son llamados auxtrofos. El ambiente natural donde vive cada microorganismo refleja el

tipo de nutrientes necesarios para su desarrollo. Utilizando medios de cultivo de composicin

qumica definida, se pueden determinar las necesidades nutritivas de un organismo. Al sembrar un

microorganismo en diferentes sustratos, se relaciona el crecimiento en los diferentes nutrientes, con

las caractersticas nutricionales del microorganismo en ese sustrato. Fuentes de nitrgeno y azufre:

Los nitratos y sulfatos pueden ser utilizados por unos microorganismos. Otros slo pueden usar

amonios o sulfuros, o compuestos orgnicos. Algunas bacterias son capaces de reducir el N2

atmosfrico, mediante el proceso denominado fijacin de N2. El fsforo generalmente es usado a

partir de fosfatos. El oxgeno es un nutriente obtenido por todos los organismos en cantidades

abundantes a partir del agua. Sin embargo, la mayora de los organismos son aerobios y requieren

oxgeno en forma molecular (O2) durante la produccin de energa como ltimo aceptor de

electrones. Pocos organismos utilizan otros aceptores finales de electrones.

MATERIALES Y METODOS.

1. Siembre separadamente los organismos Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus sp,. y un

hongo o un alga, en cada uno de los siguientes medios en tubo con agar inclinado

a) 15 gr de agar

b) 15 gr de agar + 0.5 gr de K2HPO4 + 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O

c) 15 gr de agar + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl + 0.5 gr de K2HPO4

+ 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O

25

d) 15 gr de agar + 0.2 gr de extracto de levadura + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl +

0.5 gr de K2HPO4 + o.5 g de MgSO. 7H2O

e) Agar nutritivo.

f) Sabouraud.

Todas las cantidades son para 1000 ml de agua destilada.

1 Deje un tubo de cada medio como control sin sembrar.

2 Incube todos los cultivos a 30C, por 48 hs, excepto las algas, que durarn varios das.

3 La mitad de los tubos con algas se incuban a temperatura ambiente en la obscuridad y el resto bajo la luz.

4 Determine las diferencias en la abundancia del crecimiento y obtenga conclusiones, en base a los nutrientes de cada medio, para cada organismo.

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

26

PRACTICA #6

FACTORES FISICOS

SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

OBJETIVO DE LA PRACTICA.

Comparar la susceptibilidad de diferentes organismos ante diferentes factores fsicos del ambiente,

observando sus modificaciones en el crecimiento.

INTRODUCCION

Para obtener el crecimiento ptimo de los microorganismos, no solo son indispensables los

requerimientos nutricionales, sino otros factores ambientales tanto fsicos como qumicos. Un agente

fsico es una condicin fsica o propiedad fsica que causa un cambio. La humedad, la temperatura, la

presin osmtica, el pH, las radiaciones y los filtros son ejemplos de agentes fsicos. El crecimiento

de los microorganismos se modifica al cambiar los factores ambientales. El conocimiento de los

factores ambientales nos permite explicar la distribucin de los organismos en la naturaleza; por otro

lado, el conocimiento de los factores limitantes del crecimiento microbiano se puede utilizar para su

control, sobre todo en el caso de organismos que son patgenos, que causan deterioro en los

alimentos o que dan lugar a prdidas econmicas en diferentes formas.

MATERIALES Y METODOS.

I. Determinacin de la temperatura ptima de crecimiento de algunas bacterias.

La temperatura ambiental es uno de los factores fsicos ms importantes que afectan directamente el

funcionamiento de las enzimas bacterianas, mismas que se inactivan por debajo de la mnima y por

encima de la mxima. La temperatura ptima de crecimiento de un microorganismo es la temperatura

a la cual se multiplica a su mxima velocidad.

1 Siembre tres lotes de tubos de agar nutritivo inclinado con las bacterias E. coli, Pseudomonas aeruginosa,, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Salmonella sp., S. aureus y otras.

2 Incube el primer lote a temperatura de refrigeracin, durante 24 hs y anote el resultado del crecimiento en cruces. Diga cul bacteria es psicroflica.

3 Incube el segundo lote de las mismas bacterias a temperatura ambiente . 4 Incube el tercer lote de bacterias en una incubadora a 37 C. 5 Determine la temperatura ptima para cada bacteria, que ser donde se observe el mejor crecimento. Con una cruz indique el crecimiento mnimo, con dos regular y con tres cruces el

mximo.

6 Tambin determine si alguna bacteria produjo pigmento a cierta temperatura.

II. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias.

Los organismos varan ampliamente en cuanto a su susceptibilidad a temperaturas elevadas. En este

experimento se determinar: a) el punto trmico mortal (temperatura a la cual un organismo muere en

diez minutos) y b) el tiempo trmico mortal (temperatura requerida para matar una bacteria

esporulada en diez minutos).

1 Divida el reverso de una placa de agar nutritivo en cinco partes, con un marcador.

27

2 A partir de un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo, siembre por estra cerrada una divisin de la placa de agar nutritivo. Marque el reverso con una clave.

3 Coloque el tubo en un bao mara a 60 C y caliente. Tome una asada a intervalos de diez minutos y siembre cada vez en uno de los sectores de la placa de agar. El tiempo total de

calentamiento ser de cuarenta minutos.

4 Determine el punto trmico mortal en E. coli. 5 Otro grupo de estudiantes puede trabajar igualmente con una bacteria esporulada como Bacillus subtilis (un cultivo de 48 hs o ms), para determinar el tiempo trmico mortal.

III. El calor hmedo combinado con elevacin de la presin atmosfrica.

Aqu queda includa la tcnica de esterilizacin en autoclave, utilizada en la preparacin de

medios de cultivo.

IV. Influencia de la presin osmtica. El crecimiento bacteriano puede ser afectado grandemente

por las cantidades de agua que entran o que salen a la clula. Cuando el medio que rodea a un

organismo es hipotnico (contiene pocos solutos) resulta una presin osmtica mayor dentro de la

clula, excepto para algunas especies marinas que no son afectadas. La pared celular de la mayora

de las bacterias es tan fuerte y rgida, que un hinchamiento celular ligero, generalmente es inaparente.

Sin embargo, cuando las bacterias son colocadas en una solucin hipertnica (contiene ms cantidad

de solutos) su crecimiento puede ser inhibido considerablemente. El grado de inhibicin depender

del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo; el citoplasma se deshidrata y el agua sale de la

clula, causando una plasmolisis. En estos casos la clula es inhibida en ausencia de agua celular

suficiente. En casos extremos hay una inactivacin enzimtica permanente y las clulas no se

recuperan en soluciones isotnicas.

1 Prepare 2 series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de NaCl en diferentes concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7 %, 10% y 15% y un control sin NaCl y mrquelos.

2 Prepare dos series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de Sacarosa al 3.0%, 7.5%, 15%, 30% y un control sin sacarosa y mrquelos.

3 Inocule una serie de tubos de cada compuesto con 0.1 ml (por tubo) de Escherichia coli y otra serie con Staphylococcus aureus. Homogenice cada tubo.

4 Incube a 37 C por 28 hs. 5 Registre la turbidez de los tubos y comprelos entre s. Concluya.

V. Influencia del pH 1 Prepare dos series de tubos con caldo nutritivo y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0) 2 Inocule una serie con 0.1 ml de Escherichia coli y otra serie con la levadura Saccharomyces cerevisiae

3 Incube la bacteria a 37 C y la levadura a 28 C. 4 Registre la turbidez presentada y compare.

VII. Efecto de la luz ultravioleta.

Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli por estra y exponga la caja abierta por 5 min a la luz

ultravioleta. Incube igual que en el punto anterior. Determine si hay crecimiento bacteriano.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

28

PRACTICA #7

CRECIMIENTO BACTERIANO

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Desarrollar algunas tcnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en poblaciones, tanto

en clulas viables como en clulas vivas y muertas, comprendiendo su fundamento y aplicacin.

INTRODUCCION El trmino crecimiento en las bacterias se refiere a cambios cuantitativos en la poblacin total de

las bacterias, es decir un aumento en la masa total de clulas, ms bien que a cambios en un

organismo en forma individual. Con frecuencia el inculo contiene miles de organismos y el

crecimiento slo denota el incremento del nmero o de la masa, por encima del inculo original.

El mtodo caracterstico de reproduccin bacteriana es la fisin binaria transversal; una clula se

divide en dos. En este caso, si se parte de una sola bacteria, el incremento de la poblacin se hace

en progresin geomtrica: una bacteria produce dos, dos dan cuatro, cuatro dan ocho; ocho dan

dieciseis, y as hasta 2n (smbolo del ltimo nmero, es decir el nmero mximo de clulas que

eventualmente alcanzara la poblacin). El tiempo de generacin se refiere al intervalo de tiempo

requerido para que la clula se divida, o lo que es lo mismo, para que la poblacin se duplique).

Muchos estudios bacteriolgicos requieren la determinacin del nmero de bacterias presentes

en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes mtodos, ya sea

contando solo clulas vivas o tambin vivas y muertas. La cantidad y tipo de microorganismos

en una muestra dependen de la composicin qumica de la misma y de los tratamientos a que

haya sido sometida. El mtodo de conteo elegido depende del objetivo del conteo. En esta forma,

se puede determinar la presencia o ausencia de microorganismos, as como su nmero presente

en el material de estudio. Un conteo total establece el grado de contaminacin microbiana.

Conociendo el nmero se puede estandarizar la concentracin de inculos y seguir la dinmica

poblacional de un cultivo puro y muchos otros estudios.

Mtodos de conteo directos al microscopio: Permiten efectuar el conteo de las clulas totales vivas y muertas. Su ventaja es que son rpidos.

-Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed: Un volumen conocido de la

muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un portaobjetos normal, en una superficie

conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del campo

microscpico. Se cuentan las clulas en diversos campos. Se obtiene el valor medio de clulas

por campo y se multiplica por el nmero de campos microscpicos comprendidos en la

preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en el volumen extendido (0.01 ml).

Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de organismos por ml o por gramo de

muestra.

-Conteo microscpico directo en cmara de Petroff-Hauser: Es una placa de vidrio

con una cuadrcula en depresin donde se deposita la muestra medida. Es posible relacionar el

nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro, con el volumen de esa rea.

Considerando los volmenes en la cuadrcula se puede calcular la concentracin de

microorganismos por ml.

Conteo Turbidimtrico: En una suspensin microbiana, la cantidad de clulas est directamente

relacionada con la turbiedad o densidad ptica de la misma e inversamente relacionada con la

29

cantidad de luz que pasa a travs de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la

cantidad de microorganismos en la suspensin mediante la determinacin de la turbiedad

mediante un nefelmetro o un espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva

estndar construda con una suspensin testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que

resulta en la suspensin microbiana se aproxima a la producida por un cierto nmero de clulas

en suspensin. Esta tcnica es til slamente para organismos unicelulares de pocos m, como

las bacterias, lo que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente distribudos.

Contadores electrnicos: Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con

microorganismos a travs de un orificio de 5 a 10 m de dimetro, mediante manipulacin con

una micropipeta de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se

altera cada vez que un microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se

amplifica y se registra electrnicamente.

Mtodos de Conteo en medio de cultivo: Mediante cultivo de la muestra, se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se

parte de un volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se

puede esperar la obtencin de cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se

esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperan

cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando

solucin salina, agua peptonada u otros.

- Mtodo de las diluciones y vaciado en placa,

- Tcnica de conteo en placa por extensin superficial,

- Recuento por filtro de membrana,

- Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable

- Mtodo de la gota o de Miles y Misra.

Otros mtodos: Determinacin del peso seco, determinacin del Nitrgeno en las cluas

cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.

MATERIALES Y METODOS.

I. Conteo directo al microscopio Mtodo de Breed:

1 En un portaobjetos limpio y desengrasado, marque un rea de 2 cm cuadrados. Invierta la laminilla.

2 Deposite 0.01 ml de un cultivo y extindalos en el rea marcada del portaobjetos y deje secar a temperatura ambiente.

3 Fije con calor y tia con azul de metileno de Leffler

4 Lave con agua de la llave. Deje secar a temperatura ambiente. 5 Coloque el objetivo micromtrico en la platina del microscopio y observe a 100 X. 6 Mida el dimetro del campo microscpico. 7 Cada divisin del objetivo micromtrico mide 10m (= 0.01 mm = 0.001 cm)

8 Determine la superificie del campo microscpico con la siguiente frmula: r2

en cm x 3.

1416 = Superficie de campo microscpico en cm

9 Determine el nmero de campos microscpicos que existen en la preparacin con la frmula: Superficie de la preparacin = nmero de campos microscpicos Superficie del campo microscpico

30

10 Coloque en la platina del microscopio la preparacin teida de las bacterias y cuente las bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscpico.

11 Calcule el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01 ml) y en 1 ml del

cultivo, con la frmula: # de bacterias x #de campos = # de bacterias x 100 = # bacterias/ml por

campo microscpicos en la preparacin de cultivo

II. Conteo por el mtodo de las diluciones y vaciado en placa.

Es un recuento de clulas bacterianas vivas slamente.

1 Prepare 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con 9 ml de diluyente estril cada uno (agua

peptonada al 0.1 % o una solucin salina isotnica). Mrquelos con las diluciones desde 1 x 10 -2

hasta 1 x 10 -8

.

2 Marque 7 cajas de Petri vacas estriles con los mismos nmeros de las diluciones. Haga duplicados con otras 7 cajas.

3 En condiciones estriles tome 10 ml de una suspensin bacteriana (puede ser E. coli), con una pipeta estril y depostelos en el frasco con diluyente. Descarte la pipeta y colquela en un frasco

con desinfectante.

4. Tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aprox. 25 veces. Esta ser la dilucin

1:10. 4 Con una nueva pipeta estril tome 1 ml y transfiera al tubo de la dilucin 1:100, mezclando en igual forma. y descartando la pipeta.

5 Con una nueva pipeta distribuya alcuotas de 1 ml a al tubo de la dilucin 1:1000 y a las dos cajas de Petri correspondientes marcadas. Descarte la pipeta.

6 Repita el procedimiento mezclando bien la dilucin 1:1000 y con una nueva pipeta distribuya alcuotas al tubo de la siguiente dilucin y sus dos cajas correspondientes y as

sucesivamente con las siguientes diluciones.

7. Enseguida adicione a cada caja aprox. 20 ml de medio de cultivo previamente fundido y mantenido a

50C. Al tapar cada caja, vaya mezclando el contenido muy cuidadosamente, para que no se derrame

el lquido.

Deje solidificar e incube 24 hs a 37 C.

9 Cuente las colonias desarrolladas, bajo la cmara cuentacolonias. Calcule la cantidad de colonias

por ml o por gr de muestra, mediante la siguiente frmula:

10 Promedio de colonias contadas x recproco de la dilucin = UFC / ml UFC=unidades formadoras de colonias

.

31

III.

Curva de crecimiento. 1 Obtenga un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo. 2 Siembre 0.l ml del cultivo en tubos con 5 ml de caldo nutritivo. Incube a 37 C. Guarde un tubo control sin inocular.

3 A las cero hs mida la turbidez en un espectrofotmetro. Ajuste el aparato con el control 4 Cada hora saque un tubo de la incubadora y haga la lectura, hasta completar 12 hs. 5 Dibuje una curva de crecimiento.

32

IV. Determinacin turbidimtrica. Esta medicin en un fotocolormetro se basa en el hecho de que

un cultivo de bacterias acta como una suspensin coloidal que intercepta la luz que pasa a travs de

ella. Dentro de ciertos lmites, la cantidad de luz que es absorbida es directamente proporcional a la

concentracin de clulas . Un fotocolormetro es un instrumento con una fotocelda que puede medir

la cantidad de luz que pasa a travs del cultivo. La luz que pasa a travs del cultivo activa un fototubo

que registra el porcentaje de transmitancia en un galvanmetro. Mientra ms alto sea el porcentaje de

transmitancia, ms bajo es el nmero de clulas en suspensin. El aparato debe ser calibrado antes de

cada lectura, con un tubo del medio estril sin cultivo, para establecer el 100 % de transmitancia.

Este mismo experimento permitir medir el crecimiento de una bacteria y obtener su curva de

crecimiento.

1 Siembre 0.1 ml de E. coli en 13 tubos con 10 ml de caldo nutritivo a partir de un cultivo lquido.

2 Incube todos los tubos a 37 C. 3 Deje un tubo con el mismo medio estril, sin inocular, como testigo y gurdelo en el refrigerador.. Este tubo servir para ajustar el fotocolormetro a 100 % de transmitancia, antes de las

lecturas.

4 A intervalos de una hora saque un tubo y determine la transmitancia en el fotocolormetro.

5 Dibuje una curva con los valores obtenidos, conforme se efectu el crecimiento de la bacteria. Con los mismos cultivos de E. coli puede desarrollar simultneamente la curva de

crecimiento, por la tcnica de las diluciones y vaciado en placa inoculando 1 ml (haciendo

diluciones seriadas.) Se puede planear el experimento para empezar a las 7.a.m. y terminar a las

7.00 p.m. Dibuje la curva de crecimiento en papel logartmico. Investigue la frmula para

determinar el tiempo de generacin y compare los resultados con los datos de la literaratura, en

el caso especfico de la bacteria estudiada.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES

33

PRACTICA #8

METABOLISMO BACTERIANO

OBJETIVO DE LA PRACTICA.

Desarrollar tcnicas comunes para observar la accin enzimtica bacteriana en diferentes sustratos,

relacionando los resultados con cada especie. Estos datos son esenciales en su identificacin.

INTRODUCCION. Las clulas de los microorganismos, al igual que las de todos los seres vivos,

por medio de su metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos del

medio ambiente, en compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproduccin.

En estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las reacciones de oxidacin,

reduccin, hidrlisis, transferencia de grupos, isomerizacin y sntesis, dando lugar a la degradacin

de los compuestos incorporados ( catabolismo) y a la sntesis de nuevos compuestos ( anabolismo).

Las exoenzimas son secretadas por la clula y actan fuera de ella sobre el sustrato, disminuyendo el

tamao de las molculas complejas en el medio ambiente, hasta lograr un tamao que pueda difundir

al interior de la clula, donde servirn de sustrato a las endoenzimas. Asmismo, cada grupo de

microorganismos muestra una capacidad enzimtica diferente para transformar los compuestos,

regida por su constitucin gentica y por factores ambientales. Pueden poseer una batera reducida de

enzimas actuando sobre pocos sustratos o pueden presentar un amplia variedad de sistemas

enzimticos (actuando sobre gran diversidad de sustratos.

MATERIALES Y METODOS

FERMENTACION. Fermentacin de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa y

manitol: En la fermentacin las molculas orgnicas sirven a la vez como donadores de electrones y

como aceptores. Por ejemplo, cuando la glucosa es fermentada por las bacterias del cido lctico,

primero es oxidado a piruvato, produciendo energa. El piruvato entonces, sirve como aceptor de

electrones y es reducido para formar cido lctico, con una produccin total de 2 molculas de ATP

por cada molcula de glucosa oxidada. Los productos finales de la fermentacin dependen del

microorganismo asociado y son muy variados, como cidos, alcoholes, diferentes molculas

orgnicas gases, los cuales pueden ser utilizados en la identificacin del organismo. Los cidos

liberados en el medio bajan el pH y la acidez se detecta mediante la adicin de un indicador de pH al

medio, como el rojo de fenol. Los gases producidos se detectan por medio de un tubo pequeo

(campana de Durham) introducido en forma invertida en el tubo con el medio lquido, donde quedan

atrapados, como una burbuja, en la parte superior de la campana.

1. Siembre tres bacterias como Escherichia coli, Enterobacter, Proteus vulgaris, en tubos de caldo-carbohidratos y campana de Durham. Deje un control sin bacterias. Cada medio se

prepara a partir de caldo rojo de fenol para fermentacin, adicionando por separado el carbohidrato al

0.7 %

2 Incube 24 hs a 37 C. 3 Observe los cambios ocurridos. El vire del indicador de pH a amarillo indica la degradacin del azcar con produccin de cido. La burbuja indica la produccin de gas. El vire a un color rojo

indica la produccin de amonaco y alcalinizacin cuando no se utiliza el carbohidrato.

Fermentacin cido-mixta ( prueba del Rojo de Metilo):

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Algunas bacterias como las entricas (del tracto gastrointestinal), fermentan la glucosa y producen

grandes cantidades de productos cidos que bajan el pH del medio a 5.0

1 siembre un tubo de medio MR-VP (rojo de metilo-Voges Proskauer) con E. coli y otro con Enterobacter aerogenes.. Deje un tubo testigo sin sembrar.

2 Incube a 37 C por 24-48 hs. 3 De cada tubo transfiera 2 ml a tubos limpios y aada a cada unos 5 gotas de reactivo rojo de metilo. Este indicador de pH es detectado para detectar la acidez, virando a rojo a pH 4.4 y

tornndose amarillo a pH 6.2. Si la fermentacin cido-mixta tom lugar, el rojo de metilo

permanece rojo. Si no ocurri, se desarrolla el color amarillo.

Fermentacin 2,3-butanediol (prueba de Voges Proskauer):

Algunas bacterias fermentadoras de azcares producen 2,3-butanediol como producto principal que

se acumula en el medio. La adicin de KOH al 40% y solucin de alfa naftol al 5 % en etanol

absoluto, revelar la presencia de acetona (acetil-metil-carbinol), un precursor en la sntesis de

2,4butanediol. La acetona en presencia de KOH desarrolla un color rosa. Esta reaccin es acelerada

por la adicin de alfa-naftol. El desarrollo del color es ms favorable en la porcin del cultivo

expuesto al aire, debido a que algo del 2,3-butanediol es oxidado en forma regresiva a acetona,

incrementando as, la intensidad del color en la reaccin. As, con el fin de obtener resultados ms

claros, los cultivos en caldo MR-VP y el reactivo aadido se tapan y se agitan muy suavemente para

aumentar la aereacin y la velocidad de la oxidacin de 2,3-butanediol a acetona.

1. Siembre un tubo de caldo MR-VP con E. coli y otro con Enterobacter aerogenes e

incube 24-48 hs a 37 C. Deje un tubo testigo sin sembrar.

3. Transfiera 5 ml de cada cultivo a otro tubo limpio y aada 10 gotas de KOH al 40 % y 15 gotas

de alfa-naftol a cada tubo y mezcle bien para facilitar la aereacin, lo cual incrementa la

oxidacin. Los resultados positivos son evidentes despus de 30 min, con la aparicin del color

rojo.

RESPIRACION AEROBIA Y ANAEROBIA

Los azcares son comnmente usados como fuente de energa mediante su oxidacin durante la

gliclisis, hasta piruvato, en la que se obtienen 2 ATP por cada molcula de glucosa oxidada. En

presencia de un aceptor de electrones externo (como el O2), el piruvato es oxidado a acetato (Acetil-

CoA), la cual entra al ciclo de Krebs donde es oxidada. En este ciclo la principal funcin es oxidar

varias molculas (remover los electrones y protones). Estos electrones y protones obtenidos entran a

los sistemas de transporte de electrones, donde se genera ms energa en forma de ATP, durante la

fosforilacin oxidativa. Finalmente, los electrones y protones son donados a un aceptor tal como el

O2 o el ( NO3-) que se encuentran en el medioambiente de la clula. Si el O2 es el aceptor de

electrones, este proceso es llamado respiracin aerobia. Si el aceptor es el (NO3-) u otra molcula

inorgnica que no sea O2, es llamado respiracin anaerobia.

Prueba de la oxidasa. Esta prueba detecta la presencia de citocromo oxidasa, enzima que transfiere

electrones del citocromo c al oxgeno. Cuando las colonias de las bacterias son tratadas con el

reactivo oxidasa (oxalato de dimetil-p-fenilendiamino) se tornan de color negro en 30 minutos,

debido a la enzima oxida el reactivo (color negro), mismo que es incoloro en su forma reducida.

1 Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli, otra con Pseudomonas aeruginosa (control positivo) y deje una tercera como testigo sin bacterias.

2 Elija en cada placa una colonia aislada de las bacterias y deposite en cada colonia dos gotas de del reactivo oxidasa

3 Las colonias oxidasa positivo se tornan negras.

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Prueba de la catalasa. La catalasa y la peroxidasa son las enzimas que catalizan el rompimiento del

perxido de hidrgeno H2O2. La oxidasa rompe el H2O2 en agua y O2, siendo importante porque

destoxifica a los organismos aerobios del H2O2, el cual inactiva las enzimas celulares esenciales. Este

se forma durante el metabolismo aerbico, cuando los componentes de la cadena respiratoria donan

electrones al oxgeno molecular.

1 Cultivos en placa de 24 hs de S. aureus como control positivo y otros dos organismos ,a 37 C y un control sin sembrar.

2 Elija una colonia aislada de bacterias en cada placa y agregue, unas gotas del reactivo catalasa (perxido de hidrgeno) sobre las colonias.

3 La actividad de la catalasa se detecta por la formacin de burbujas de oxgeno (una rpida efervescencia) al liberarse oxgeno gaseoso.

Reduccin de nitratos.

En la Respiracin anaerobia, algunos microorganismos utilizan molculas diferentes al

oxgeno como ltimo aceptor de electrones, por ejemplo el nitrato (NO3-

), quedando

reducido a nitrito (NO2-

).

1 Siembre Bacillus subtilis como testigo nitrato-reductasa positivo en tubos con caldo nitrato y campana de Durham. Siembre otros dos tubos con bacterias diferentes y un control sin sembrar.

2 Incube 24-48 hs a 37 C.

1 Observe la presencia de gas en la campana. 2 Agregue 4 gotas de solucin A (cido sulfanlico) y 4 gotas de la solucin B (alfanaftil-amina). Los iones nitrito reaccionan con los reactivos, dando un color rojo. Esto indica que hubo

reduccin de nitratos a nitritos.

HIDROLISIS DE GRANDES MOLECULAS.

En la naturaleza existen grandes molculas y muy complejas, como los polisacridos, las

protenas, los lpidos y los cidos nucleicos. Estas macromolculas son hidrolizadas por

los organismos quimiorganotrficos, mediante la accin de sus exoenzimas hidrolticas,

antes de que la clula pueda utilizarlas como nutrientes. La hidrlisis es el rompimiento

de una molcula por adicin de agua.

Hidrlisis del almidn:

Cuando el almidn (amilosa) es hidrolizado por la accin de exoenzimas amilasas, se

degrada a maltosa (disacrido de dos glucosas) y glucosa. Estos azcares son

transportados al citoplasma de la clula y usados como fuente de carbono y fuente de

energa.

1 Con un marcador divida externamente en cuatro, una caja de Petri con agar-almidn. 2 Siembre por estra en el primer sector a Bacillus subtilis, organismo testigo hidroltico del

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almidn. En el segundo y tercero siembre otras dos bacterias de actividad desconocida. El cuarto

sector ser un control del sustrato sin microorganismos.

3 Incube48hsaa37C 4 Cubra la superficie de las cajas con lugol y observe la reaccin. Compare con los resultados de las bacterias. Busque halos sin color azul alrededor de las colonias. En el sector control sin

bacterias observe el color azul del lugol con el almidn. El almidn reacciona qumicamente con

Iodo para producir un color azul oscuro, cuando las molculas de Iodo se insertan en los huecos de la

molcula espiralada del almidn (amilosa). Este resultado es debido a que la molcula absorbe ms

luz visible excepto el azul. Si el almidn se rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningn

color debido a que desaparece la espiral y no quedan los huecos para que entre el Iodo. Esta ausencia

de color es asociada con la hidrlisis del almidn,

Hidrlisis de la casena.

La casena es una protena encontrada en la leche, Como todas las protenas, est compuesta de

aminocidos que son utilizados por los microorganismos como fuente de energa y fuente de

carbono. Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se

vuelve turbio, debido a que la casena reacciona con los iones calcio y forma complejos coloidales

insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrlisis de la casena, los

aminocidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se torna de nuevo transparente

alrededor de la colonia del microorganismo. Este fenmeno permite detectar la degradacin de la

protena.

1 Divida en cuatro partes con el marcador, una caja con agar-leche descremada. 2 Siembre en un sector Bacillus subtilis, organismo testigo que hidroliza la casena.

1 El segundo y tercer sectores simbrelos con dos bacterias desconocidas. El cuarto sector djelo como testigo sin bacterias.

2 Incube todos los cultivos 48 hs a 37 C. Observe un halo de transparencia alrededor de las colonias que hidrolizaron la casena. Determine cules organismos hidrolizaron la casena.

Hidrlisis de la gelatina. La gelatina es una protena fibrosa que se obtiene al hervir huesos,

cartlgo y otros tejidos conectivos, que al enfriarse forma un gel. Ciertos microorganismos tienen

habilidad para romper la molcula, mediante la exoenzima gelatinasa, liberando aminocidos que se

usan como nutrientes. La gelatina hidrolisada se vuelve lquida.

1 Siembre tubos con gelatina, en el centro por picadura, los organismos Pseudomonas aeruginosa como testigo hidroltico de la gelatina y otras dos bacterias, as como un tubo control sin

sembrar.

2 Incube todos los cultivos 24-48 hs a 37 C. Observe y si es necesario vuelva a incubar. Observe diario.

2. Coloque los tubos en el hielo unos minutos y determine si hay licuefaccin de la gelatina en el

sitio de la picadura.

Hidrlisis de Grasas: Las grasas son steres de glicerina y cidos grasos que requieren la accin de

enzimas lipasas que hidrolicen los enlaces ster entre ambos compuestos, como en los triglicridos,

resultando cidos grasos de cadena larga y glicerol.. Las fosfolipasas hidrolizan los fosfolpidos. En

un medio de cultivo slido con mantequilla se observa un halo transparente alrededor de la colonia

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del microorganismo que hidroliza la grasa. Estas molculas resultantes son usadas como fuente de

energa y de carbono. La hidrlisis de grasas en los alimentos origina la rancidez, misma que se

refleja en el sabor y olor desagradables. En el medio de cultivo con agar, los cidos grasos liberados

acidifican el medio, lo que puede detectarse mediante un indicador de pH en el medio.

1 Siembre solo el centro de una placa de medio agar-spirit-blue-aceite de olivo, con Proteus mirabilis o con Staphylococcus epidermidis. Deje un control sin bacterias.

2 Incube 48hs a 37C 3 La hidrlisis de grasas es indicada por una zona azul alrededor del crecimiento bacteriano. Donde no hay hidrlisis se conserva el color original del medio (lavanda claro).

Hidrlisis de la urea. La urea o carbamida es una diamida que se degrada por medio de una

amidasa llamada ureasa. Se rompe el enlace del nitrgeno con el carbono, con liberacin de

amonaco y CO2 . El medio con urea es adicionado de un indicador de pH (rojo de fenol). El

amonaco libre alcaliniza el pH y el indicador vira a color violeta.

1. Siembre Proteus vulgaris en tubos con medio urea-agar inclinados e incube 48 hs a 37

C. 2. El cambio de color del medio de naranja a violeta indica la hidrlisis de la urea.

UTILIZACION DE AMINOACIDOS.

Los aminocidos son molculas que contienen un grupo cido (COOH), un grupo amino (NH2) y un

grupo radical (R), y son utilizados por las clulas para la sntesis de protenas. Los aminocidos son

los compuestos orgnicos nitrogenados ms utilizados por los microorganismos, originando la

separacin del grupo carboxilo, del grupo amino o del sulfhidrilo. La descarboxilacin permite la

formacin de aminas, con frecuencia malolientes. La desaminacin puede ser oxidativa, produciendo

un cetocido y amonaco. La desaminacin reductiva es frecuente por los clostridia (anaerobios),

produciendo un cido graso saturado y amonaco.

Utilizacin del Triptofano y produccin de indol

El triptofano es un aminocido que resulta del rompimiento de la mayora de las protenas. Algunas

bacterias producen la enzima triptofanasa que cataliza la separacin de residuos de indol, a partir del

triptofano. La degradacin es intracelular mediante un sistema enzimtico llamado triptofanasa,

dando lugar a amonaco, cido pirvico y tres metabolitos: indol, cido indol-actico y escatol.. El

indol se acumula en el medio de cultivo como un metabolito de desecho, mientras que el resto de la

molcula del triptofano (piruvato y NH4+

) es usada para satisfacer necesidades nutricionales. El indol

puede detectarse en el medio de cultivo, por adicin del reactivo de Kovac, el cual reacciona con el

indol en unos segundos, dando un compuesto rojo insoluble en agua,.

1 Siembre en tubos con caldo triptona la bacteria E. coli como testigo positivo productor de triptofanasa y del metabolito indol. Siembre otras dos bacterias en tubos del mismo medio y deje un

control sin bacterias.

2 Incube 24 hs a 35 C 3 Aada 5 gotas del reactivo de Kovac a cada tubo. El desarrollo de un color rojo indica la presencia de Indol.

Produccin de sulfuros, a partir de aminocidos con azufre.

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Muchas protenas son ricas en aminocidos con azufre, como la cistena y la metionina, los cuales

son liberados con la hidrlisis de las protenas. La produccin de H2S a partir de aminocidos con

azufre, mediante la enzima desulfurasa, indica la capacidad de los microorganismos para utilizarlos.

El olor del H2S es asociado tpicamente con el de los huevos podridos. Si adems de los aminocidos

con azufre, el medio de cultivo tambin contiene iones ferrosos, stos reaccionan con el H2S,

produciendo sulfuro ferroso (FeS), compuesto insoluble de color negro. El ennegrecimiento del

medio se observa primero donde hay mxima acidez.

1 Siembre tubos con medio de SIM con un Proteus vulgaris como testigo positivo productor de H2S , as como dos bacterias ms y un control sin sembrar.

2 Este medio SIM contiene polipptidos ricos en aminocidos azufrados, principalmente triptofano y adems iones ferrosos. Por lo tanto, en este medio se puede hacer simultneamente la

prueba de produccin H2S y la de Indol

2. Incube 48 hs 35 C. El color negro indica la presencia del sulfuros de un metal pesado..

Prueba de la lisin-descarboxilasa

La descarboxilacin es la separacin de un grupo carboxilo de molculas orgnicas como los

aminocidos, con liberacin de CO2. La descarboxilacin permite neutralizar los ambientes cidos.

Las enzimas descarboxilasas separan los grupos cidos de los aminocidos, produciendo aminas, que

hacen el medio ms alcalino. La descarboxilacin de la lisina puede detectarse en un medio

conteniendo lisina, junto con glucosa y un indicador de pH (prpura de bromocresol), para observar

visulamente los cambios. Los cidos de la fermentacin de la glucosa bajan el pH del medio

induciendo el cambio de color a amarillo . En este punto ocurre la descarboxilacin de la lisina

(activada por la acidez) resultando en la produccin de aminas y neutralizacin del medio y sto hace

que el indicador regrese a su color prpura al neutralizarse el medio.

1. Inocule Salmonella tiphymorium o Proteus mirabilis y otro con Escherichia coli por picadura

en un tubo de medio solido con Agar Lisina Hierro (LIA).

Incube todos los tubos 24 hs a 37 C.

En el medio de cultivo La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato

utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro

y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El

purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a

5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto

produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en

medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la

glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de

incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo

amarillo.

UTILIZACION DE CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO Y DE ENERGIA.

El medio citrato de Simmons es un medio de composicin definida, adicionado del indicador de pH

Azul de Bromotimol. Cuando la bacteria utiliza el citrato, elimina el cido del medio y el indicador

cambia de verde a azul en las condiciones alcalinas.

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1 Siembre Escherichia coli como testigo en tubos con citrato, as como otras dos bacterias y un control. Incube igual.

2 El crecimiento indica utilizacin del Carbono. Un color azul indica la formacin de productos alcalinos

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Como complemento de los resultados agregue las reacciones bioqumicas ocurridas en

cada ejercicio.

APENDICE:

Medio agar Leche descremada:

Triptona..5 gr

Extracto de levadura ....2.5 gr

Dextrosa..1.0

Agar 15 gr Agua destilada ..1000 ml.

Se autoclavea. Por separado se esteriliza la leche descremada. Al vaciar el medio en las placas se le

adicionan 2 ml de leche a cada placa, se mezcla y se deja solidificar.

Medio Agar-almidn: Extracto de

carne..3.0 g Almidn

soluble10 g

Agar..12 g Agua

destilada1000 ml Autoclavear.

Medio Agar Lisina Hierro (LIA) Peptona de gelatina5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Glucosa 1.0 g Lisina10.0 g Citrato de hierro y amonio 0.5g Tiosulfato de sodio0.04 g Purpura de Bromocresol0.02 g Agar 15.02 g

Agua destilada 1000 ml

Suspender 35 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Dejar hidratar por 15 min.

Calentar agitando y hervir por 1 min hasta disolucin. Distribuir y autoclavear. Dejar enfriar con

inclinacin .

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PRACTICA #9

VARIACIONES GENETICAS BACTERIANAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA. Desarrollar algunas tcnicas para inducir mutantes,

comprendiendo su importancia y su aplicabilidad

INTRODUCCION Variaciones temporales: se refieren a variaciones en las bacterias debidas a

factores ambientales y que no incluyen reestructuracin del DNA. Tales variaciones pueden ser

morfolgicas o fisiolgicas y desaparecen tan pronto como los cambios ambientales que las

indujeron desaparecen tambin. Por ejemplo, un cultivo de E. coli al hacerse viejo, cuando los

nutrientes en el medio de cultivo se agotan, las clulas nuevas son ms cortas, cocoides, pero al

inocular la bacteria en un medio fresco, recupera su forma y tamao originales. Variaciones

permanentes: son cambios resultantes de alteraciones en la molcula del DNA, dando lugar a que

permanezcan durante un gran nmero de resiembras de la bacteria. Estas modificaciones son debidas

a mutaciones y ocurren espontneamente. Pueden ser inducidas por factores fsicos y qumicos.

Transferencia de DNA (recombinacion bacteriana): Algunas variaciones permanentes tambin

pueden ser causadas por la transferencia de DNA de un organismo a otro, por diferentes mecanismos

directos, tales como la conjugacin o indirectamente por medio de un fago.

MATERIALES Y METODOS.

I. Aislamiento de mutantes que ilustren la variacin del genotipo (por efecto de la luz

ultravioleta). 1 Siembre 0.1 ml de cultivo de Serratia marcescens en cada una de siete placas de agar nutritivo, y extienda por estra.

2 Destape las cajas bajo una lmpara de luz ultravioleta (use lentes para luz U.V. con el fin de proteger los ojos). Retire las cajas de una en una a intervalos de 6, 30, 60, 90, 120 y 150 segundos.

Deje una caja como testigo sin tratamiento de lu