Universidad ComplutenseFACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II

GUIA DE PRCTICAS DEGUIA DE PRCTICAS DEMICRMICROBIOLOBIOLOGAOGA

COMPLEMENTCOMPLEMENTOSOS DEDE FORMAFORMACINCIN

Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

INDICE

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO..............................................................................1

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA.............................................................................................3

1. ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO..........................................................5

2. PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL......................................................................7

3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.....................................................................................11

4. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS.....................................................................................15

5. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS. .............................................................21

6. SIEMBRAS: CULTIVO DE AEROBIOS.............................................................................................27

7. SIEMBRAS: CULTIVO DE ANAEROBIOS........................................................................................29

8. CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL...................................................................................31

9. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO.. 35

10. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA ........................................43

ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS.......................................................47

BIBLIOGRAFA.....................................................................................................................................52

CALENDARIO.......................................................................................................................................53

- El acceso al laboratorio de prcticas slo se per-mite a los alumnos que estn realizando las prc-ticas. No se admiten visitas por razones de seguri-dad.

- Los laboratorios de investigacin son de accesorestringido al personal del Departamento.

- Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempreque se est trabajando en el laboratorio. Duranteel periodo de prcticas, la bata no debe utilizarsefuera del laboratorio.

- Debe respetarse la prohibicin de beber, comer,masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debeevitar llevarse a la boca ningn objeto (bolgra-fos...) o tocarse los ojos y nariz.

- En la superficie de trabajo no deben depositarseen ningn momento ropa u objetos personales.

- Cada alumno es responsable de la limpieza desu lugar de trabajo y del material asignado, ascomo de los microscopios que haya usado.

- Se deben usar los mecheros Bunsen con pre-caucin, no dejando material inflamable cerca yevitando el posible contacto con pelo y ropas. Secomprobar que se ha apagado el gas al finalizarel experimento y al abandonar el laboratorio.

- Est prohibido pipetear con la boca.

- Ante un vertido accidental de material micro-biolgico debe informarse inmediatamente al pro-fesor encargado del grupo.

- No se debe forzar un tubo de vidrio o la aperturade un frasco sin tener protegidas las manos.

- No se manejarn los autoclaves o el materialrecin esterilizado si no se dispone de guantesapropiados.

- La eliminacin de residuos, material desechabley material reciclable se realizar siguiendo laspautas de la prctica 1, utilizando los contenedo-res dispuestos a tal efecto.

- Se deben lavar las manos con jabn antispticoante cualquier sospecha de contaminacin y siem-pre antes de marcharse del laboratorio.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

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Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa serequieren unas tcnicas especficas y diferentesde las que se utilizan en otras disciplinas. Esimprescindible trabajar en condiciones aspticas:El material e instrumental que se va a utilizar, ascomo los medios de cultivo, deben ser sometidosa algn procedimiento de esterilizacin, eliminn-dose de ellos cualquier posible microorganismo.Para mantener las condiciones de esterilidad,debemos trabajar en campana de flujo laminar oen la proximidad de la llama de un mecheroBunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismossuele realizarse utilizando cultivos axnicos opuros, es decir, que contienen organismos de unasola especie microbiana. La posibilidad de conta-minacin est siempre presente porque los micro-organismos se encuentran en todos los ambien-tes: En el aire, en el agua, en nuestra piel y, engeneral, en todo lo que tocamos. Para evitar lascontaminaciones hemos de observar las siguien-tes normas:

- El medio de cultivo y el recipiente que lo contie-ne deben estar estriles.

- Los tubos o matraces deben ser tapados conalgodn hidrfobo estril o cubiertos con uncapuchn metlico, para impedir la entrada demicroorganismos. Si se usan placas de Petrideben mantenerse tapadas mientras no se estnmanipulando.

- Los instrumentos que van a entrar en contactocon el medio de cultivo, con los distintos recipien-tes o con los microorganismos en estudio (asa desiembra, pipetas, etc) deben ser previamente esteri-lizados.

Materiales empleados y forma de uso

- Asa e hilo de siembra: Antes de su utilizacin,se esterilizan sometindolos a la accin de lallama de un mechero hasta que el filamento quedeincandescente. Luego se flamear la parte inferiordel filamento. Una vez utilizados, deben flamearsede nuevo con el objeto de eliminar los microorga-nismos que quedan en ellos.

- Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio yse utilizan para la transferencia de cultivos lqui-dos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chu-pete de goma u otro sistema de aspiracin mec-nica. Pueden utilizarse, con el extremo inferiorcerrado, en sustitucin del hilo de siembra, cuan-do se realizan siembras en el interior del agar (enprofundidad). Para ello se sella previamente elextremo de la misma con la llama del mechero.

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Figura I. I n s t r u m e n t o spara siembra demicroorganismos

A: Asa de siembra

B: Hilo de siembra

C: Pipeta Pasteur

D: Cayado

Figura II. Pipetas

A: Pipeta automtica de 0,2-1 ml

B: Pipeta automtica de 0,02-0,2 ml

C: Pipeta de vidrio de 10 ml

D: Pipeta de vidrio de 1 ml

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

- Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados):Sirven para distribuir los microorganismos de lamuestra sobre la superficie del medio de cultivocontenido en una placa de Petri. Se utilizarn pre-viamente esterilizadas, impregnndolas en alcoholy pasndolas posteriormente por la llama delmechero. Tambin, pueden hacerse usando unapipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma yacodndola con la llama del mechero.

- Pipetas graduadas de vidrio o plstico: Se sumi-nistran ya estriles a los alumnos, dentro de estu-ches metlicos o bien empaquetadas de formaindividual (envueltas en papel satinado o plsticopara mantener su esterilidad), en cualquier casodeben abrirse cerca de la llama del mechero. Lapipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada,debe flamearse ligeramente antes de ser usada.Las pipetas llevan un algodn en la boquilla, queacta como filtro, para evitar la contaminacin ypara impedir la llegada de lquido al sistema desuccin. Dicho algodn debe permanecer en laboquilla durante el uso. Bajo ningn concepto sedebe pipetear con la boca una muestra micro-biolgica. Para pipetear suspensiones de microor-ganismos se utilizan chupetes o pipeteadores mso menos sofisticados, como son las peras degoma provistas de vlvulas que permiten controlarla succin y el dispensado de los lquidos o los dis-positivos semejantes a jeringas en los que se colo-

ca la pipeta y que operan por medio de un mbo-lo o con ayuda de bombas elctricas.

- Tubos de ensayo con cultivos problema y pla-cas Petri: Se destapan cerca de la llama delmechero utilizando para ello slo los dedos quequedan libres en la mano que sostiene el asa desiembra. Se flamea la boca del tubo, se toma unapequea muestra del cultivo con asa de siembraestril, previamente atemperada, y tras flamear denuevo la boca del tubo colocamos el tapn. Todoel proceso se realiza cerca de la llama. Si el medioes lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar lamuestra, porque los microorganismos tienden asedimentar. En el caso de que el medio sea slido(tubos de agar inclinado y placas Petri), la mues-tra se obtendr rozando ligeramente con el asa lazona en la que se aprecia masa microbiana. Lostubos y las placas deben permanecer abiertos elmenor tiempo posible con el fin de evitar contami-naciones.

- Medios de cultivo: Pueden ser lquidos, slidosy semislidos. Se distribuyen en matraces, tubosde ensayo y placas de Petri. Estas ltimas slo lle-van medio slido. Su preparacin y esterilizacinse describe mas adelante. La composicin de los medios, colorantes y reac-tivos utilizados en prcticas se describe en elanexo del final de la gua.

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El asa de siembra semaneja cogindola delmango como si fuera unlpiz

El tapn se manejacon el dedo meiquede la mano derecha.

Toda la operacin serealiza cerca delmechero Bunsen

La boca del tubo seflamea despus de abriry antes de cerrar

Figura III. Manejo del asa de siembra durante una inoculacin.

5

En Microbiologa es importante recordar la necesi-dad de una pulcra y esmerada limpieza del mate-rial. Asimismo, es muy importante la recuperacindel material reciclable y la eliminacin del materialdesechable.

Todos los objetos sucios o contaminados debenrecogerse en recipientes adecuados, provistos detapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipe-tas, se separa del resto del material recogindoseen un contenedor vertical u horizontal lleno de unasolucin desinfectante, como por ejemplo unasolucin diluida de leja, en la que permanecerantes de su lavado durante 24 horas.

Como los objetos contaminados contienen, confrecuencia, cantidades importantes de materiaorgnica (procedente de los medios de cultivo)que protegen a los microorganismos de los agen-tes fsicos o qumicos utilizados en la descontami-nacin de los mismos, no puede asegurarse latotal destruccin de las formas vegetativas ymucho menos de las esporas. Por ello, se reco-mienda utilizar mayores concentraciones dedesinfectante y tiempos ms largos de tratamientoque para la desinfeccin o la esterilizacin dematerial limpio.

Generalmente se utiliza el autoclave para la des-contaminacin de instrumentos, equipos y mate-rial que sean estables al calor, as como de mate-rial desechable. A tal objeto se coloca este mate-rial en recipientes adecuados y se introducen en elautoclave sometindolos a la accin del vapor deagua a una atmsfera de sobrepresin (121 C) enciclos ms prolongados de lo habitual (1 hora enlugar de 30 minutos).

Una vez efectuado este tratamiento, se procede asu lavado para eliminar toda materia extraa,sumergiendo el material en agua caliente jabono-sa o utilizando detergentes, mezcla crmica ocualquier otro procedimiento enrgico, tantomecnico como qumico. Se aclara bien con abun-dante agua y se deja escurrir y secar a tempera-tura ambiente. En el caso de las pipetas, y antesde ser lavadas, debe extraerse con ayuda de unalambre o pinzas especiales, el trozo de algodnque tienen en la boquilla.Algunos de los objetos sucios y contaminados(portaobjetos, pipetas, etc), despus de lavados,

se sumergen en una mezcla sulfocrmica dondese dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavancon agua y se dejan escurrir. Los portas se secancon un pao de hilo limpio, procurando que noqueden hilazas sobre la superficie.

El material que contiene colorantes se trata, segnlas condiciones del material, durante un tiempovariable con una solucin que puede ser de cidoclorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica.

El resto del material (tubos de plstico, jeringas,etc) se trata con distintas soluciones desinfectan-tes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero deberecordarse que se utilizan a concentracionessuperiores a las utilizadas con otros fines.

PRCTICA 1

ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

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Introduccin

En Microbiologa se define esterilizacin como ladestruccin o eliminacin total de todos los micro-organismos vivos en un objeto o material, inclui-das las endosporas bacterianas. La esterilidad esun estado absoluto, no hay grados de esterilidad.El material que se va a esterilizar debe prepararsede tal manera que se conserve sin contaminar unavez esterilizado:

- El material de vidrio, como tubos, matraces,frascos, etc, se cierran con algodn graso o tapo-nes metlicos para evitar la entrada o salida de losmicroorganismos. Adems, cuando se usaalgodn, ha de cubrirse ste con un papel imper-meabilizado. En el caso de las pipetas, se lescoloca en la boquilla un trocito de algodn queactuar como filtro, evitando la contaminacin deloperario con los microorganismos de la muestra yque ste a su vez contamine la muestra. Una vezpreparadas, se introducen en estuches o cajasmetlicas, o bien se envuelven individualmente enpapel satinado para ser posteriormente esteriliza-das. Todo el material de vidrio se esteriliza concalor seco, generalmente en un horno Pasteur.

- El material de plstico desechable ya se sumi-nistra estril y listo para su uso. Por ejemplo, lasplacas de Petri se introducen en bolsas de plsti-co selladas y se esterilizan con xido de etileno oradiaciones.

- Las soluciones y medios de cultivo lquidos seenvasan en matraces o tubos y se esterilizan, ge-neralmente, en autoclave.

Existen varios mtodos para llevar a cabo el pro-ceso de esterilizacin y la eleccin de uno deter-minado viene condicionado por el tipo de materialque se quiere esterilizar.

Objetivos

Conocer la importancia de la esterilizacin y fami-liarizarse con el manejo de los procedimientosms frecuentemente utilizados para llevarla acabo.

Material

Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de airecaliente, autoclaves, equipos de filtracin y mate-riales a tratar.

Tcnicas

El mtodo ms comnmente empleado para des-truir los microorganismos es el calor, entre otrasrazones porque es el ms econmico y el msfcil de controlar. El calor utilizado con este finpuede aplicarse en forma de calor seco o de calorhmedo. El calor seco destruye los microorganis-mos por efectos de oxidacin y se requieren tem-peraturas muy elevadas. El calor hmedo eliminalos microorganismos a temperaturas menores, yaque la presencia de agua acelera la rotura de lospuentes de hidrgeno responsables de la estruc-tura terciaria de las protenas, haciendo que stasse desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

La esterilizacin por calor seco puede hacersepor flameado o mediante estufas de aire caliente.

I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas ehilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consisteen someter directamente a la accin de la llamade un mechero Bunsen los utensilios que sevayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su efi-cacia es altsima, sin embargo no se puede aplicara objetos termolbiles.

II) Esterilizacin por aire caliente: Se lleva acabo en estufas de aire caliente y consiste encolocar los objetos que se van a esterilizar, debi-damente protegidos para que no se contaminenuna vez esterilizados, en el interior de una estufa.Este procedimiento se utiliza para esterilizar mate-rial de vidrio: Pipetas, matraces, tubos, etc. u otrosmateriales termorresistentes. Las temperaturas alas que se someten estos materiales son muy ele-vadas (160-180C durante cerca de 2 horas).Estas temperaturas no pueden utilizarse paraesterilizar lquidos (como medios de cultivo), yaque al llegar a los 100C comenzaran a hervir ycontinuaran hirviendo sin elevar su temperaturapor encima del punto de ebullicin del agua a pre-sin atmosfrica y a esta temperatura las endos-poras bacterianas pueden sobrevivir durante

PRCTICA 2

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL

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horas. Pero incluso en muestras en las que supi-semos que no existen endosporas, esta metodo-loga puede implicar cambios en la concentracinde los componentes del medio, a causa de la fuer-te evaporacin sufrida.

El calor hmedo tambin se utiliza para la des-truccin de los microorganismos siendo, como yase ha comentado, a igual temperatura, muchoms eficaz que el calor seco; con este tratamientolas enzimas se desnaturalizan rpidamente, aligual que las membranas celulares. Adems, elvapor de agua, especialmente si se genera asobrepresin, es un eficaz transmisor de calor alinterior de la clula microbiana. Se puede aplicarutilizando varios mtodos: Ebullicin, vapor fluen-te y vapor saturado a presin:

I) Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tieneaccin limitada, ya que aplicada durante 10 minu-tos va a destruir las formas vegetativas de losmicroorganismos, pero las endosporas bacteria-nas pueden sobrevivir incluso a tratamientos pro-longados. Se podra utilizar el bao Mara o baode agua hirviente (slo con fines de desinfeccinen el laboratorio), cuando no se necesita alcanzarla esterilidad o cuando no se dispone de otrosmtodos mejores, tanto para material (pinzas, tije-ras, escalpelos, etc) como para medios de cultivoque no puedan esterilizarse en autoclave.

II) Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con fre-cuencia para esterilizar medios de cultivo que nose puedan someter a una temperatura superior a100C sin que pierdan alguna de sus propiedades,como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza unautoclave a presin atmosfrica, con la espitaabierta, donde nunca se superan los 100C, y serealiza el proceso durante tres das consecutivos,dejndose a temperatura ambiente en los interva-los entre dos tratamientos. La muestra se sometea calentamiento (100C) durante 30-45 minutosdestruyndose en este proceso las formas vege-tativas pero no las endosporas termorresistentes.Si stas se encuentran presentes en la muestragerminan despus del calentamiento y estas for-mas vegetativas sern destruidas en los siguien-tes ciclos.Este mtodo de esterilizacin se denomina tam-bin esterilizacin fraccionada o tindalizacin.

III) Vapor saturado a presin: La esterilizacinpor esta tcnica utiliza vapor de agua saturadoque se somete a una atmsfera extra de presinsobre la presin atmosfrica normal, elevndosecon ello el punto de ebullicin del agua de 100Ca 121C y consiguindose la destruccin de todoslos microorganismos (salvo los termfilos extre-

mos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta tem-peratura es tambin necesaria para la destruccinde las endosporas bacterianas, que presentanuna alta resistencia trmica y que pueden sobrevi-vir, como ya se ha indicado, a 100C durantehoras. El vapor de agua difunde por smosis atravs de las membranas de las esporas, coagu-lando su protoplasma, fenmeno que se acentasi el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta tc-nica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.

El autoclave permite elevar la presin una o dosatmsferas sobre la presin atmosfrica, elevn-dose con ello la temperatura de ebullicin delagua que se encuentra en su interior.Consta de un recipiente metlico, generalmentede acero inoxidable, similar a una gran olla, encuyo interior se introduce el material a esterilizarque se coloca sobre una rejilla o placa agujerea-da. Despus de cerrar cuidadosamente la tapa, seconecta la fuente de calor y comienza a elevarsela temperatura en su interior. La salida continuadel chorro de vapor a travs de la vlvula nos indi-ca que el aire contenido en el interior del autocla-ve ha sido eliminado. La eliminacin de este airees importante ya que la difusin del calor entre elvapor de agua y el aire es pobre, por lo que no sealcanzar la temperatura esperada a la presinelegida y no se conseguir la esterilizacin. Lavlvula se cierra cuando slo sale vapor de aguay, a partir de ese momento, comienza a elevarsela presin hasta una atmsfera sobre la presinnormal, elevndose como consecuencia la tempe-ratura hasta 121C. Transcurridos 15-20 minutos,en estas condiciones, el material se ha esteriliza-do. Es el incremento de temperatura por encimade los 100C y no la presin la que destruye losmicroorganismos.Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos,es necesario mantener el material en el autoclavedurante perodos de tiempo ms prolongados,pues se tarda ms en alcanzar los 121C en el

Figura 2.1: Autoclave de cuba horizontal

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centro de un gran volumen.Una vez transcurrido el tiempo necesario, seapaga el autoclave y se deja descender la tempe-ratura hasta que el indicador marque menos de80C, que ser cuando la presin haya descendi-do hasta presin atmosfrica. Se abre ligeramen-te la espita para comprobar que no queda vapor apresin en el interior y ya se puede proceder a reti-rar todo el material esterilizado, dejndolo enfriara temperatura ambiente.El autoclave se utiliza para esterilizar medios decultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas,etc que puedan soportar altas temperaturas y unaatmsfera de sobrepresin.Para la esterilizacin de materiales lquidos sensi-bles al calor, como algunos medios de cultivo,soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc.o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En laesterilizacin por calor se destruyen losmicroorganismos del medio, mientras que la filtra-cin los retira de una forma mecnica, en lugar dedestruirlos.La filtracin es el paso de un lquido o gas a travsde un material filtrante, con poros lo suficiente-mente pequeos como para retener clulas micro-bianas. Los filtros que se utilizan en la actualidadson, generalmente, los denominados filtros demembrana y estn integrados por pequeas pie-zas de material sinttico, generalmente acetato decelulosa o policarbonato, que pueden tener poroscon tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados pararetener bacterias. La accin combinada de losporos, la trama del filtro y la naturaleza qumicadel material utilizado retiene los microorganismos,pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrarpasan a travs de la membrana con la ayuda delvaco generado, por ejemplo, con una bomba devaco.Tanto los filtros de membrana como los equiposde filtracin con los que stos se usan deben seresterilizados por otros mtodos, generalmentevapor saturado a presin en el autoclave.Los virus y algunas bacterias de tamao muypequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, noson retenidos por los filtros habituales.

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Introduccin

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,factores de crecimiento y otros componentes, pre-parados en el laboratorio, que suministran loscompuestos necesarios para el desarrollo de losmicroorganismos.Algunas bacterias pueden crecer satisfactoria-mente en casi cualquier medio de cultivo, otrasbacterias necesitan medios especiales y existenalgunas que no pueden crecer en ninguno de losmedios desarrollados hasta ahora. Los distintostipos de medios de cultivo varan segn las nece-sidades de los microorganismos objeto de estudio,pero todos han de cumplir los siguientes requisi-tos:- Han de contener las sustancias necesarias parael crecimiento del microorganismo que se siem-bra.- Han de mantenerse estriles hasta el momentode la siembra.Los requerimientos para el crecimiento microbianose pueden agrupar en dos categoras: Fsicos yqumicos. Entre los primeros se incluyen la tempe-ratura, el pH y la presin osmtica; entre losrequerimientos qumicos se encuentran el agua,las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustanciasminerales, el oxgeno y determinados factoresorgnicos de crecimiento.Finalmente, una vez sembrados, deben ser incu-bados a la temperatura y condiciones adecuadas.

Objetivos

Aprender a preparar, esterilizar y almacenar dis-tintos tipos de medios de cultivo.

Tipos de medios de cultivo

Existe una gran variedad de medios para el culti-vo de los microorganismos en el laboratorio, lamayora de ellos pueden adquirirse ya elaborados,necesitando algunos slo la adicin de agua o laesterilizacin.Los medios de cultivo pueden clasificarse:

A) Por el estado fsico en que se encuentran

1.-Medios lquidos o caldos: Son aquellos quecontienen, disueltos en agua, los nutrientes nece-sarios para el crecimiento de los microorganis-mos.2.-Medios slidos: Contienen nutrientes disuel-tos en agua pero se les aade un agente solidifi-cante.El agar es un polisacrido complejo que se obtie-ne de algas rodofceas de origen marino cuyaspropiedades son de gran utilidad en la preparacinde medios de cultivo slidos: No es degradadoenzimticamente por los microorganismos (aexcepcin de algunos microorganismos deambientes marinos), funde aproximadamente a100C y permanece en estado lquido mientras latemperatura no descienda por debajo de 45-50C.Adems, una vez solidificado se puede incubar atemperaturas elevadas sin que se lice.Generalmente el agar se aade, para solidificar unmedio lquido, en una concentracin del 1,5%. Losmedios con agar se envasan en tubo o en placade Petri.3.-Medios semislidos: Son similares a losmedios slidos, pero la concentracin del agentesolidificante es menor, generalmente del 0,4% conlo que, una vez solidificados mantienen una con-sistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, paradeterminar la movilidad de los microorganismos.

B) Por su composicin

1.-Medios complejos: Contienen todos losnutrientes necesarios para el crecimiento demuchos tipos de microorganismos, pero no seconocen todos los componentes que forman partede ellos, ni las concentraciones exactas de cadauno de ellos. Muchos de sus componentes proce-den de la degradacin parcial de tejidos o produc-tos animales, de plantas o de microorganismosque son fuente de aminocidos, azcares, lpidos,vitaminas y minerales.Ejemplos de dichos componentes son las pepto-nas o triptonas (protenas animales digeridasenzimticamente), el extracto de carne y el extrac-to de levadura. Como ya se ha mencionado, enestos medios suelen encontrarse azcares peroen muchos casos los medios complejos son suple-mentados con glucosa.Un ejemplo de medio nutritivo complejo es elcaldo nutritivo, que contiene peptona y extracto decarne.

PRCTICA 3

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

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2.-Medios definidos: Son aquellos que contienenlos distintos nutrientes en forma de productos qu-micos puros (pero no extrapuros) y en concentra-ciones conocidas. As, un medio definido que per-mita el desarrollo de un microorganismo hetertro-fo y "poco exigente", como E. coli, debera conte-ner sales inorgnicas y fuentes de carbono y nitr-geno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa yNH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro,manganeso y cobre, se encuentran generalmentepresentes como contaminantes de los productosqumicos antes citados, en cantidades suficientespara el crecimiento.

C) Por su utilizacin:

Muchos medios de cultivo utilizados en el labora-torio son medios generales en los que se puedendesarrollar una gran variedad de microorganismoscon distintos requerimientos nutricionales. Sinembargo, en algunas ocasiones, es necesario ais-lar a partir de una muestra un microorganismo quese encuentre en un bajo nmero y que pueda serenmascarado por otros microorganismos presen-tes en un nmero ms elevado. En esos casos esrecomendable utilizar medios de cultivo que ayu-den a separar y diferenciar dichos microorganis-mos o que, de forma selectiva, favorezcan el cre-cimiento de alguno de ellos.

Estos medios pueden ser:

1.-Medios selectivos: Son aquellos que permitenel crecimiento de un tipo determinado demicroorganismos, inhibiendo el desarrollo de losdems.Algunos de estos medios contienen un agenteselectivo como antibiticos, productos qumicos,colorantes, etc. Entre los agentes selectivos pode-mos citar el cloruro sdico, que en concentracinelevada inhibe la mayora de los microorganismosexcepto los microorganismos halotolerantes,como son los estafilococos, o la azida de sodio,que inhibe el crecimiento de bacterias Gram nega-tivas al fijarse al hierro de la porfirina del sistemacitocromo, permitiendo seleccionar los estreptoco-cos, que carecen de este sistema, as como otrosGram positivos. De la misma manera, la bilis ysales biliares convierten los medios de cultivo alos que se aaden en selectivos para Salmonellaya que, adems de inhibir a los microorganismosGram positivos, en concentraciones elevadas inhi-ben tambin a bacterias Gram negativas fermen-tadoras de lactosa.Los colorantes, como el verde brillante, inhibenselectivamente las bacterias Gram positivas, sien-do tambin inhibidor para la mayora de las bacte-

rias intestinales excepto para Salmonella. Estecolorante es la base del medio Agar VerdeBrillante, utilizado para el aislamiento deSalmonella a partir de muestras fecales.Los medios selectivos pueden serlo tambin porsu pH, as el agar glucosado de Sabouraud ajus-tado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hon-gos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.

2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseadospara distinguir unos microorganismos de otros, apartir de una poblacin mixta, por la aparienciadistinta que toman sus colonias. Estos medios decultivo ponen de manifiesto propiedades que undeterminado tipo de microorganismo posee.Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivoenriquecido y es a la vez un medio diferencial, yaque permite reconocer aquellos microorganismoscapaces de producir hemlisis. Otros medios dife-renciales llevan incluido un indicador de pH, quepone de manifiesto la degradacin de un nutrienteespecfico (generalmente un azcar) por el cam-bio de color que se origina cuando ste es meta-bolizado, como en el caso del medio CLED.Los medios diferenciales pueden ser ademsselectivos, si se aaden agentes que inhiben elcre-cimiento de determinados microorganismos.En este caso va a ser posible distinguir diferentestipos microbianos dentro del limitado grupo demicroorganismos que pueden crecer. As, el medioLevine es selectivo para las bacterias Gram nega-tivas por contener dos colorantes, eosina y azul demetileno, que inhiben el crecimiento de bacteriasGram positivas. Es tambin un medio diferencial,porque distingue las bacterias que fermentan lalactosa (con produccin de cido) de las no fer-mentadoras. La formacin de cidos a partir delactosa hace que ambos colorantes precipiten enla superficie de las colonias, que aparecen decolor morado. En ciertas ocasiones, como ocurreen el caso de E. coli, las colonias presentanadems un brillo metlico. El agar MacConkey esotro ejemplo de medio selectivo y diferencial. Lapresencia de sales biliares y cristal violeta inhibenel crecimiento de bacterias no entricas; la fer-mentacin de lactosa con liberacin de productoscidos hace virar un indicador de pH incorporadoen el medio.

Preparacin de los medios de cultivo

La preparacin de medios de cultivo se ha simpli-ficado en gran medida por la comercializacin demedios deshidratados, en los que los diferentesnutrientes se encuentran ya mezclados en lasdebidas proporciones, siendo slo necesario la

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AGAR INCLINADO

MEDIOS LQUIDOS (CALDOS)

Bao a 55C

Figura 3.1: Preparacin de medios de cultivo

Figura original del "Manual Prctico de Microbiologa" (Daz y cols.)

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adicin de la cantidad correcta de agua destiladapara disolver sus componentes.Cuando se prepara un medio lquido se debe di-solver totalmente todos sus componentes en aguadestilada. A continuacin el caldo se envasa en losrecipientes adecuados (matraces o tubos), tapan-do los mismos y esterilizndolos.La preparacin de un medio slido puede hacersede dos maneras: Preparar el caldo y aadir agar al1,5% o bien utilizar un medio slido comercial.Independientemente de la forma elegida parahacerlo, la preparacin de los medios de cultivoslidos requiere procedimientos especiales, yaque el agar es insoluble en agua. Por ello, una vezaadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta100C, para permitir que el agar se funda y quedeincorporado al resto de los nutrientes disueltos.El medio fundido se dispensa en tubos o matra-ces, que se tapan y se esterilizan. Los medios sli-dos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar enposicin vertical, si van a ser inoculados en pro-fundidad, o bien pueden inclinarse para que alsolidificarse en esa posicin adopte la forma incli-nada que proporciona una mayor superficie desiembra.Si se desean preparar placas de Petri, se utilizarel medio de cultivo que ha sido esterilizado en unmatraz y, una vez atemperado, se verter en pla-cas vacas en un ambiente asptico, como el queproporciona la proximidad de la llama de unmechero o una campana de flujo laminar. En algu-nas ocasiones, el medio de cultivo destinado aplacas puede conservarse estril en tubos, que sefundirn al bao Mara cuando se vayan a prepa-rar las placas.Si se han de incorporar al medio compuestos ter-molbiles, como vitaminas o antibiticos, se este-rilizarn stos por filtracin y se aadirn al mediode cultivo previamente esterilizado en autoclave yuna vez que este se haya atemperado. En todoslos casos se han de seguir las instrucciones delfabricante.La conservacin de los medios ya preparadospuede hacerse a temperatura ambiente, pero espreferible conservarlos a 4C para retrasar su des-hidratacin.

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Introduccin

La morfologa de los microorganismos puede exa-minarse de dos formas: Observando microorga-nismos vivos sin colorear (en fresco) y observan-do clulas muertas teidas con colorantes.El examen en fresco de los microorganismos per-mite conocer algunas de sus caractersticas (mor-fologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo,las microorganismos vivos son casi incoloros y nose pueden visualizar fcilmente al microscopioptico normal cuando se encuentran suspendidosen agua, de ah que se utilicen colorantes paraincrementar su contraste con el entorno que losrodea y de esta forma hacerlos visibles.Los colorantes son compuestos aromticos solu-bles en agua (generalmente en forma de sales),que contienen un in orgnico coloreado y otro ininorgnico.Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos.El colorante es cido si la porcin coloreada tienecarga negativa, es decir, si tiene un anin colore-ado, siendo en este caso repelido por estructurasde la clula que presenten la misma carga, comoes el caso de la superficie bacteriana. El coloran-te se denomina bsico si la porcin coloreada esel catin, cargado positivamente y con afinidad porestructuras de la clula con carga negativa, comoes la superficie celular.Las bacterias toman mejor los colorantes bsicos,como son el cristal violeta, el azul de metil eno y lasafranina. La eosina es un colorante de tipo cido,as como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO

Objetivo

Observar microorganismos vivos en el microsco-pio de campo claro. Estudiar su morfologa y agru-pacin, apreciar las diferencias de tamao entreorganismos procariticos y eucariticos y apren-der a diferenciar el movimiento browniano de lamovilidad de los microorganismos.

Material

Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (oportaobjetos excavados), cultivos de microorga-nismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.)y microscopio.

Tcnica

Para la observacin de microorganismos sin teirse pueden utilizar dos tipos de preparaciones:Montaje hmedo y montaje en gota pendiente.- En el primer caso, depositar una gota de lamuestra tomada con asa de siembra previamenteflameada, en un portaobjetos y colocar sobre lamisma un cubreobjetos presionando suavemente.- En el segundo caso, depositar una gota de lamuestra en el centro de un cubreobjetos limpio ycolocarlo invertido sobre el pocillo de un portaob-jetos excavado, de manera que la gota no se

PRCTICA 4

OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

Figura 4. 1. Montaje hmedo entre portaobjetos y cubreobjetos

Figura 4. 2. Montaje en gota pendiente.

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mueva ni tome contacto con los lados o el fondode la depresin.

Utilizar el microscopio con el objetivo de 40aumentos, disminuyendo la cantidad de luz inci-dente sobre la muestra con ayuda del diafragma obajando el condensador. Un exceso de luz dificul-tar la observacin de los microorganismos, yaque poseen el mismo ndice de refraccin que elmedio circundante (el vidrio del portaobjetos y ellquido en el que se encuentran suspendidos).Si se utiliza el objetivo de inmersin se debe colo-car una gota de aceite de inmersin sobre elcubreobjetos.

Para reducir la evaporacin de la muestra con elcalor desprendido por el foco luminoso y que losmicroorganismos pierdan su movilidad, debe reali-zarse la operacin rpidamente o bien sellar losbordes del cubreobjetos con parafina.Observar la forma y el tamao de los microorga-nismos, comparando las levaduras (clulas euca-riticas) con las bacterias (clulas procariticas).Describir su movilidad, diferenciando el movimien-to browniano, debido a la colisin de los microor-ganismos con las molculas del lquido que losrodea, de la verdadera movilidad. La movilidad semanifiesta por el desplazamiento de los microor-ganismos a grandes distancias y en una direccindeterminada, aunque a veces pueden apreciarserotaciones o giros. Los desplazamientos cortos ysin sentido se deben al movimiento browniano.

TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tincin:

1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utili-za un colorante, que generalmente tie a losmicroorganismos. Este tipo de tincin se denomi-na directa.Si el colorante proporciona una coloracin alfondo, sin alterar el aspecto de las clulas, quepermanecen sin teir, la tincin se denominanegativa.La tincin simple permite observar morfologacelular, tamao y agrupacin de los microorganis-mos.

2.-Tincin diferencial: Es aquella que empleasecuencialmente dos colorantes que permiten dis-tinguir tipos de microorganismos en funcin dediferencias en su estructura y composicin qumi-ca. La tincin de Gram y la cido-alcohol-resisten-te, basadas en las propiedades de la pared celularbacteriana, son las ms utilizadas.

3.-Tincin estructural: Se utiliza para identificar yestudiar determinadas estructuras que puedenestar presentes en los microorganismos. En lastinciones estructurales se colorea nicamente unaparte de la clula.Se utilizan este tipo de tinciones para poner enevidencia la presencia de cpsulas, endosporas,flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.).

Tcnica general

En la mayora de los casos, los pasos a seguir sonlos que se indican a continuacin:

1- Realizar una extensin con el asa de siembraesterilizada, para ello se toma una pequea gotade cada uno de los cultivos y se extiende en unportaobjetos limpio. Si el cultivo procede de unmedio slido, se coloca una gota de agua en elportaobjetos y se mezcla con una pequea por-cin de la muestra hasta formar una suspensinhomognea, extendindola con el fin de obteneruna fina pelcula. Posteriormente, se deja secar alaire o en la parte alta de la llama del mechero,pero no se debe eliminar el lquido calentando elportaobjetos a la llama porque pueden distorsio-narse las clulas.2- Fijar la muestra. La fijacin tiene como finalidadcoagular el protoplasma de las clulas y hacer quese adhieran al portaobjetos, siendo el calor elmtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pue-den utilizarse otros agentes, como el alcohol(metanol) u otros compuestos qumicos. La fija-cin con calor se recomienda cuando se trabajacon muestras de un cultivo slido; en muestrasobtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer lafijacin con metanol ya que se retienen en el por-taobjetos un mayor nmero de clulas. Es nece-sario que la extensin se haya secado antes deproceder a la fijacin, por ello se debe esperarhasta que el lquido de la misma se evapore. Lafijacin por calor se lleva a cabo pasando variasveces la preparacin seca a travs de la llama deun mechero, con la extensin hacia arriba. El calordesnaturaliza las protenas y suele matar al micro-organismo. Es importante no excederse en esteproceso, para evitar que las bacterias se deformeno se rompan, siendo suficiente que el portaobjetosse note caliente sobre el dorso de la mano, perono demasiado.3- Realizar la tincin. Para ello es necesario cubrirla preparacin con abundante colorante y dejarloactuar durante algn tiempo. 4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las prepa-raciones teidas para eliminar el exceso de colo-rante, dejando caer con suavidad el agua sobre unextremo del portaobjetos, que se mantendr incli-nado durante este proceso. No se debe dirigir el

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agua con demasiada fuerza sobre la preparacinpara no arrastrar la muestra.5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos gol-pendolo ligeramente con cuidado por el canto.Permitir que se seque la preparacin, bien utili-zando un papel secante, sin frotar o bien dejndo-la secar al aire, aunque lleva ms tiempo.6- Examinar la preparacin al microscopio, con elobjetivo de inmersin (100x), colocando, previa-mente, una gota de aceite de inmersin sobre lapreparacin.

TINCIN SIMPLE

Objetivo

Estudiar las caractersticas de los microorganis-mos en cultivo, es decir, tamao, forma y agrupa-cin de las clulas.

Material

Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Escherichia coli yStaphylococcus aureus), colorantes, microscopioy aceite de inmersin.

Tcnica

1- Preparar extensiones de los distintosmicroorganismos, dejar secar al aire y proceder asu fijacin.2- Realizar la tincin cubriendo la preparacin conabundante colorante y dejarlo actuar durantealgn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de15 a 30 segundos, para el cristal violeta es sufi-ciente de 30 a 45 segundos, para la safranina de1 a 2 minutos y para el azul de metileno de 3 a 5minutos.3- Lavar con agua las preparaciones teidas ycontinuar con la tcnica tal y como se indica pre-viamente.4- Examinar la preparacin al microscopio con el

Figura 4.4. Procedimiento general para realizar una tincin.

Figura 4.3. Tcnica de extensin de una muestra sobre portaobjetos.

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objetivo de inmersin. Observar la forma y dispo-sicin de los microorganismos teidos con el co-lorante.

TINCIN DIFERENCIAL

La tincin diferencial colorea selectivamente cier-tos tipos de clulas, ya que los colorantes que seutilizan reaccionan de modo diferente con los dis-tintos microorganismos, generalmente debido adiferencias en la estructura y/o composicin qu-mica de la pared celular de stos.Estas tcnicas son de gran inters en la identifica-cin y la clasificacin de las bacterias, y la ms uti-lizada es la tincin de Gram.

Tincin de Gram

Es uno de los procedimientos de tincin ms tilesen la identificacin de microorganismos, ya quedivide a stos en dos grandes grupos: Gram posi-tivos y Gram negativos. En esta tcnica es nece-sario utilizar varias soluciones:

1.- Un primer colorante bsico, generalmente cris-tal violeta, que se aplica sobre la muestra y quereacciona con las clulas (cargadas negativamen-te), colorendolas.2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entreel primer colorante y las clulas. Parece ser que elmordiente (solucin diluida de yodo) se combinacon el colorante, para formar un compuesto inso-luble coloreado en el interior de la clula.3.- Un agente decolorante, como el etanol de 90%o la mezcla alcohol-acetona (1:1), que son disol-ventes orgnicos capaces de eliminar el primercolorante de algunas bacterias, decolorndolas.4.- Un colorante de contraste, igualmente decarcter bsico pero de distinto color que el primercolorante. Generalmente se suele utilizar la safra-nina, de color rosa, que contrasta con el color vio-leta del primer colorante, y que teir slo a lasbacterias decoloradas en el paso anterior.

Los organismos que resisten la decoloracin yretienen el complejo cristal violeta-yodo apare-cern de color violeta oscuro al microscopio y sedenominan Gram positivos. Aquellos que pierdenel color inicial del cristal violeta tras la decolora-cin, se clasifican como Gram negativos y tomanel color rosa debido al segundo colorante, la safranina.Las diferencias qumicas en sus paredes celula-

res, son las que permiten o no la salida del com-plejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram posi-tivas tienen una pared celular gruesa, compuestaprincipalmente por peptidoglucano, mientras queen Gram negativas, aunque la pared est tambinconstituida por pptidoglucano, es ms delgada ypresenta adems una membrana externa con lipo-polisacridos. Las paredes de las bacterias Grampositivas tratadas con alcohol sufren una deshi-dratacin y sus poros se contraen, dificultando lasalida del complejo cristal violeta-yodo. En lasGram negativas, el alcohol desorganiza la capalipdica ms externa y lava el colorante de la del-gada capa de peptidoglucano.

La tincin de Gram es ms reproducible cuandose aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya quelas bacterias Gram positivas, en la fase estaciona-ria de crecimiento, pueden aparecer como Gramnegativas.

Objetivo

Aprender una tcnica de coloracin diferencial einterpretar los resultados obtenidos en la misma,distinguiendo bacterias Gram positivas y Gramnegativas.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Escherichia coli, Staphy-lococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.),colorantes, solucin de lugol, etanol de 95%,microscopio y aceite de inmersin.

Tcnica

Preparar extensiones de los distintos microorga-nismos, que debern encontrase en fase expo-nencial de crecimiento. Dejar secar al aire y pro-ceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tc-nica ya descrita.Para la coloracin se seguir el siguiente protoco-lo (modificacin de Hucker):

1- Teir durante un minuto con la solucin cristalvioleta.2- Lavar el exceso de colorante con agua.3- Cubrir la extensin con una solucin diluida deyodo (lugol), que actuar como mordiente, duran-te un minuto.4- Lavar con agua el exceso de lugol.5- Decolorar con etanol de 90%, cubriendo la pre-paracin y dejando actuar durante 30 segundos.6- Lavar con agua abundante para eliminar el

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resto del disolvente.7- Colorear con safranina durante un minuto (colo-racin de contraste).8- Lavar con agua y dejar que la preparacin seseque.9- Examinar las preparaciones al microscopio, conaceite y usando el objetivo de inmersin. Las bac-terias Gram positivas aparecern coloreadas devioleta, mientras que las Gram negativas seobservan de color rosa.

TINCIN ESTRUCTURAL

Las tinciones estructurales se utilizan para ponerde manifiesto partes especficas de los microorga-nismos que carecen del contraste necesario parapoderse observar con el microscopio ptico. Losprocedimientos y colorantes utilizados permitenteir selectivamente una porcin de la clula,como pueden ser endosporas, flagelos, cpsulas,etc.

Tincin de esporas (endosporas)

Las endosporas son estructuras que se forman enel interior de ciertos tipos de bacterias, entre losque destacan las pertenecientes a los gnerosClostridium y Bacillus. A diferencia de la clulavegetativa de la que procede, la endospora esresistente a factores ambientales adversos: Altastemperaturas, compuestos qumicos txicos ytambin a los colorantes. Sin embargo, existencolorantes como el verde malaquita que, conayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vezteidas, no perdern el colorante en el lavado conagua y s lo harn las formas vegetativas, quequedarn teidas con el colorante de contraste.La posicin y morfologa de las esporas en el inte-rior de la bacteria tiene inters taxonmico, ya quees de utilidad para diferenciar especies dentro deun mismo gnero.

Objetivo

Aprender una tcnica de tincin estructural e inter-pretar los resultados obtenidos, reconocer lasesporas teidas y observar su forma y su localiza-cin en las bacterias.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Bacillus subtilis, Bacilluscereus y Bacillus sphaericus), colorantes, micros-copio y aceite de inmersin.

Tcnica (mtodo de Wirtz)

Los cultivos bacterianos debern encontrarse enfase estacionaria, para que se favorezca la espo-rulacin. Con ellos se preparan extensiones enportaobjetos y tras secar al aire se fija con calorsegn ya ha sido indicado. 1- Se cubre la preparacin con solucin de verdemalaquita, calentando con el mechero hasta laemisin de vapores. Se realiza invirtiendo elmechero y pasando la llama bajo la preparacinperidicamente. Esta operacin se repite durante5 minutos, evitando que la muestra hierva y quese evapore completamente el colorante, aadien-do ms colorante en caso necesario. 2- Lavar con agua el exceso de colorante.3- Aplicar la solucin de safranina, como coloran-te de contraste, durante 30 segundos. 4- Lavar con agua y secar la preparacin 5- Examinar con objetivo de inmersin, anotandola morfologa y disposicin de las endosporas enlas dos especies de Bacillus. Las esporas de B.subtilis son ovaladas y aparecen en posicin sub-terminal no deformante, coloreadas de verde, enel interior de las formas vegetativas, con formabacilar y que estn teidas de rosa. Las esporasde B. sphaericus son esfricas, aparecen en posi-cin terminal, estando la clula deformada por eltamao de la espora.

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Figura 4.3. Ejemplos de morfologa bacteriana al microscopio ptico.Staphylococcus en tincin Gram (arriba, izquierda) (objetivo 100x)Escherichia en tincin simple (arriba, derecha) (objetivo 100x)Bacillus en tincin Gram (abajo, izquierda) (objetivo 100x)Observacin en fresco de clulas de Candida (abajo, derecha) (objetivo 40x).

AISLAMIENTO

Introduccin

En la naturaleza, la mayora de los microorganis-mos no se encuentran aislados, sino integradosen poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estu-dio de estos microorganismos y de sus propieda-des, es necesario separar unos de otros y trabajarcon especies aisladas, obteniendo cultivos axni-cos o puros.Un cultivo axnico o puro es aquel que contieneun slo tipo de microorganismo y que procedegeneralmente de una sola clula; el crecimientode sta origina, en medio slido, una masa declulas fcilmente visible que recibe el nombre decolonia.Para obtener cultivos axnicos o puros a partir deuna poblacin microbiana mixta, se utilizan lasdenominadas tcnicas de aislamiento, que fuerondesarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquidocon esta finalidad, pero la presencia de contami-nacin, es decir, de microorganismos no desea-dos, dificult el aislamiento. La escuela de RobertKoch introdujo los medios slidos, complementa-dos con agar, y las placas de Petri enBacteriologa, permitiendo as la separacin fsicade las colonias sobre la superficie del medio decultivo o en el interior del mismo.El aspecto de las colonias sirve para diferenciardistintas especies microbianas.

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganis-mos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri.- Obtener colonias separadas, utilizando uno oms mtodos.- Estudiar la morfologa de cada colonia.

Material

Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placasde Petri con medio de cultivo slido y cultivo demicroorganismos.

Tcnicas

Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse:

a) Extensin en superficie con cayadoDepositar sobre la superficie de una placa conagar nutritivo una gota 0,1 ml de una determina-

Cayado

Serie de diluciones

conocidas de la muestra

Figura 5.1. Siembra por extensin ensuperficie para recuento.

Carga (1 Primera diseminacin (2 estra) Segunda diseminacin

(3 estra) ltima diseminacin

(4 estra)

Figura 5.2. Tcnica de aislamiento por estra en superficie.

estra)

PRCTICA 5

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

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da dilucin del cultivo de microorganismos proble-ma y extenderlo con ayuda del cayado, previa-mente esterilizado, en todas las direcciones hastaque est completamente seco. Incubar la placa,en posicin invertida, a la temperatura deseada(durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de micro-organismo. La posicin invertida evitar que elagua de condensacin se deposite sobre la super-ficie del medio, dificultando la obtencin de colo-nias aisladas.Es una tcnica usada para el aislamiento de colo-nias, que permite igualmente el recuento de bac-terias viables en la muestra, si conocemos exac-tamente el volumen de muestra sembrado.

b) Estra mltiple en superficieCon un asa de siembra, previamente esterilizada,se toma una muestra del cultivo de microorganis-mos y se extiende sobre un rea pequea de lasuperficie de la placa con agar nutritivo, en formade estras muy juntas, pero sin hacer presin parano daar el agar.Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar lasiembra realizada previamente, se extiende denuevo por otra zona de la placa haciendo nuevasestras. Este proceso se repite sucesivamente, fla-meando y enfriando el asa al comienzo de lassucesivas siembras en estra. Se lleva la placa aincubar, a la temperatura adecuada, siempre enposicin invertida.Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisla-das a partir de una muestra que contenga un ele-vado nmero de bacterias.

c) Dilucin en masaEn una placa de Petri vaca se deposita unpequeo volumen conocido de muestra y a conti-nuacin se aade el medio de cultivo (agar nutriti-vo) fundido y atemperado aproximadamente a45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de laplaca. De esta forma los microorganismos se dis-tribuirn de forma homognea en el medio de cul-

tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separa-das por todo el agar.Otra variacin de esta tcnica consiste en inocularel medio de cultivo, fundido y atemperado, conte-nido en un tubo, con un determinado volumen dela muestra. La homogeneizacin de la muestra yel medio de cultivo se realiza por rotacin del tuboentre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejanenfriar las placas hasta que se solidifique el medioy posteriormente se incuban a la temperatura ade-cuada (siempre en posicin invertida).Aunque con esta tcnica se obtienen colonias ais-ladas, generalmente slo se utiliza para determi-nar el nmero de microorganismos viables en unamuestra, cuando stos son anaerobios facultati-vos o microaerfilos.

Resultados

a) Extensin en superficie: Tras el perodo deincubacin se examinarn las placas. Las coloniasaparecen sobre la superficie, distribuidas unifor-memente si la siembra se ha realizado de formacorrecta. Podrn diferenciarse las colonias deacuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.Esta tcnica de siembra, adems de permitir quese distingan las colonias por su morfologa, permi-te el recuento de microorganismos viables. Laexpresin de este recuento se hace en "unidadesformadoras de colonias" (UFC) ya que cada unaprocede de un slo microorganismo (o de ungrupo de microorganismos, pues en algunoscasos stos tienden a formar agregados). A partirde las colonias aisladas, los microorganismospueden transferirse a otros medios de cultivo parasu estudio.

b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incuba-cin, se obser-varn las coloniasaisladas en algu-na regin de laplaca inoculada.Con esta tcnicase logra la separa-cin de los micro-organismos quese encuentran enun cultivo mixto, obien que procedende muestrashomogneas, peroen las que existe unelevado nmero.En las zonas donde existen colonias aisladas sepuede estudiar la morfologa colonial.

Inculo calibrado

Medio fundido atempera

HomogeneizHomogeneizar

Medio fundidoatemperado

Inculocalibrado

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masao inclusin en agar.

Figura 5.4. Aislamientopor estra en superficie.

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c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distri-buidas por toda la masa del agar. Aquellas queestn en la superficie tendrn distintas caracters-ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientrasque las colonias que se desarrollan en el interior,bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,aunque los microorganismos que formen las dis-tintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, lascolonias que aparecen en la profundidad del agarson siempre biconvexas y no se diferencian unasde otras por su morfologa.

RECUENTO

Tcnicas

Pueden utilizarse distintas tcnicas:

a) Extensin en superficie con cayadoDepositar sobre la superficie de una placa conagar nutritivo 0,1 ml de la muestra problema y deuna serie de diluciones decimales obtenidas a par-tir de sta. Despus se procede como se haexpuesto en el apartado de Aislamiento (pg. 21).Para realizar el recuento, se cuentan las coloniasy se expresa el resultado en UFC/ml de muestra.

b) Dilucin en masaMediante esta tcnica se pueden realizar recuen-tos tanto en placa de Petri como en tubo. Paraello, se inoculan los medios atemperados con 1 mlde la muestra problema y de una serie de dilu-ciones decimales de sta, como se ha expuesto

anteriormente (pg. 22). Para realizar el recuento,se cuentan las colonias y se expresa el resultadoen UFC/ml de muestra.

c) Filtracin

MTODO DE FILTRACIN

Se utiliza para la determinacin del nmero demicroorganismos a partir de una muestra lquida(ej., agua de consumo humano, bebidas) o ali-mentos slidos solubles en agua (ej., azcar,sal...) mediante filtracin de volmenes determina-dos de la muestra a analizar a travs de filtros demembrana e incubacin de los mismos sobremedios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Utilizaremos la tcnica de filtracin para la determi-nacin de coliformes totales y Escherichia colien un agua de consumo humano.

Material- Muestra de agua para analizar.- Membranas filtrantes estriles de steres decelulosa, de 0'45 m de poro.- Pinzas de extremos planos.- Equipo de filtracin por vaco.- Placas de Petri con agar lactosa-trifeniltetrazolio-tergitol 7 (Agar de lactosa TTC con heptadecilsul-fato de sodio o tergitol 7). - Estufas a 37C y 44C.

Tcnica- Colocar un filtro de membrana estril sobre elsistema de filtracin, utilizando pinzas estriles.Adaptar el embudo y filtrar 100 ml de la muestrade agua previamente homogeneizada.- Retirar el embudo y, con unas pinzas esteriliza-das, transferir la membrana sobre el medio de cul-tivo agar de lactosa TTC de modo que la superfi-cie de filtracin quede hacia arriba. Es importanteque la membrana quede homogneamente apo-yada sobre el medio de cultivo.- Esta prueba se realizar por duplicado, incuban-do las placas en posicin invertida, una a 37C yotra a 44C durante 24-48 horas

Resultados y recuentoSe examinan las membranas y se cuentan comobacterias lactosa-positivas todas las colonias, sintomar en consideracin el tamao, que originen unviraje de color a amarillo del medio por debajo dela membrana, consecuencia de la acidificacin delmedio tras la fermentacin de la lactosa.Las caractersticas de los distintos coliformes eneste medio son:

- Klebsiella y Enterobacter: Colonias rojo ladri-llo o naranja.

Figura 5.5. Recuento por dilucin en masa.

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- Escherichia y Citrobacter: Colonias amarillascon centro naranja.

Los microorganismos no fermentadores de lacto-sa dan colonias azul-violetas sobre fondo azul-verdoso.

Para realizar el recuento se cuentan las coloniaslactosa-positivas que hayan aparecido sobre lasuperficie del filtro, despus de la incubacin a37C (coliformes totales) y 44C (Escherichia coli),y se expresan como nmero de UFC presentes en

100 ml de agua.

d) Mtodo de los tubos mltiples

MTODO DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)Mediante el mtodo de los tubos mltiples onmero ms probable (NMP) se puede determinarel nmero de microorganismos a partir de dife-rentes tipos de muestras (aguas, suelo, etc.) apartir de una muestra sembrando distintosvolmenes de la muestra a analizar o dilucionesdecimales obtenidas a partir de sta, en series detres o cinco tubos que contienen medio de cultivolquido. Aplicaremos esta tcnica al recuento de co-liformes totales en una muestra de agua de bebi-da envasada.

Material- Muestra de agua.- Matraz con 50 ml de caldo lactosado, a concen-tracin doble, provisto de un tubo para valorar la

fermentacin (campana de Durham).- 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado, a concen-tracin doble, con campana de Durham.- 5 tubos con 9 ml de caldo lactosado, a concen-tracin sencilla, con campana de Durham.- Pipetas de 10 ml y 1 ml estriles.- Estufa regulada a 37C.

Tcnica- Agitar la muestra de agua problema.- Sembrar, mediante pipeta estril, 50 ml del aguaen el matraz con 50 ml de caldo lactosado, a con-centracin doble, 10 ml del agua en cada uno delos 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado, a con-centracin doble, y 1 ml en cada uno de los 5tubos con 9 ml de caldo lactosado, a concen-tracin sencilla.- Incubar a 37C durante 24-48 horas.

Resultado e interpretacinSe consideran tubos positivos aquellos en los quese observa enturbiamiento y aparicin de gas enal menos una dcima parte del volumen de lacampana de fermentacin. La ausencia de gas a las 48 horas se consideracomo prueba negativa.

Para calcular el NMP de coliformes totales, sedetermina a partir de tabla adjunta (pg. 26) enfuncin del nmero de tubos positivos en cadaserie. Los resultados se expresan como nmeroms probable (NMP) por 100 ml de muestra.

Figura 5.6. Equipo de filtracin a vaco

A. Filtro de celulosa de 045 m de dimetro deporo.B. Depsito para la muestra o medio.C. Depsito para la muestra o medio filtrados.D. Sistema de vaco.

A B

C

D

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Puntiforme

Forma

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Borde

Ondulado Lobulado

Filamentoso

Elevacin

Superficie

Plana

Elevad

Convex

Crateriform

Acumina

Lisa o

Mate o

Seca o

Invasiva o

Figura 5.6. Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medioslido.

Puntiforme

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Ondulado

Lobulado

Filamentoso

Plana

Elevada

Convexa

Crateriforme

Acuminada

Lisa o rugosa

Mate o brillante

Seca o cremosa

Invasiva o superficial

TABLA PARA NMP(COLIMETRA)

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