Agar LIA (Agar Lisina Hierro) (Color del medio : Azul prpura)

Prctica 1BioseguridadLa bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores, visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicacin adecuada de normas de bioseguridad as como la importancia de estas normas antes, durante y despus de cada prctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se est desenvolviendo. Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de anlisis, investigacin y dems, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeo seguro y garantizar resultados exitosos. Las normas generales son:1. El acceso al laboratorio estar limitado solo al personal autorizado. 1. El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de bioseguridad.1. Toda rea debe estar marcada con la respectiva seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin.1. Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga, abotonada y limpia, as mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y dems objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los bancos o mesas. 1. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio para evitar la contaminacin por corrientes de aire.1. Al inicio y trmino de una prctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una solucin desinfectante.1. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el trmino del mismo.1. Se deben lavar las manos al inicio y al trmino de cada sesin de trabajo, secndolas posteriormente con toallas de papel.1. Se debern usar todos los implementos necesarios para la proteccin segn el nivel de riesgo biolgico.1. Durante la prctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.1. Se debe colocar un calzado adecuado para las practicas en el laboratorio, as como mantener las uas cortas, limpias y sin esmalte.1. Utilizar los equipos segn las instrucciones o los procedimientos operativos estandarizados.1. Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de cadas no se produzca salpicadura.1. Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales potencialmente infecciosos sin la debida proteccin.1. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de laboratorio.1. Utilizar mscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.1. Apagar los instrumentos elctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1.Algunos smbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

1. Principios bsicos de bioseguridadEl trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros para manejar materiales infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienes trabajan en laboratorios, de otras personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contencinEl elemento ms importante de la contencin es el cumplimiento estricto de las prcticas y tcnicas microbiolgicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando las prcticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseados para la proteccin del personal y las prcticas de manejo (barrera primaria), as como el diseo de instalacin y caractersticas de ingeniera adecuados (barrera secundaria).1.2 Barreras primariasConstituyen la primera lnea de defensa cuando se manipulan materiales biolgicos, qumicos o fsicos. Se considera que las barreras de proteccin primaria son: equipos de proteccin personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biolgica (con barreras de aire, que permiten que ste fluya en una sola direccin y a una velocidad constante originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que atrapan las partculas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal; inmunizacin (vacunacin); desinfeccin (alcohol, compuestos fenlicos, hipocloritos) y esterilizacin (calor hmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca la proteccin del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos qumicos de riesgo. Seguridad.1.3 Barreras secundariasEl diseo y construccin de un laboratorio se conoce como contencin o barrera secundaria, contribuye a la proteccin del personal del laboratorio as como el que se localiza fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localizacin del laboratorio fuera del rea de trnsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al calor moderado, cidos y lcalis, reas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin, tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y elctrico de fcil acceso.

2. Clasificacin de los agentes biolgicos por grupo de riesgo2.1 Agentes biolgicos del grupo 1Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo: Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la elaboracin de quesos, embutidos, entre otros.2.2 Agentes biolgicos del grupo 2Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patologa infecciosa de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre otros.2.3 Agentes biolgicos del grupo 3Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patologa grave, de difcil y largo tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y ms frecuente peligro es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros.2.4 Agentes biolgicos del grupo 4Son aqullos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad y sin que exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus, etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratoriosSe consideran cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica descritos: tcnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseo arquitectnico de las instalaciones del laboratorio. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de actividades que se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad el laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contencin necesaria para proteger al personal y al ambiente.

3.1 Nivel de bioseguridad 1Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biolgicos del grupo de riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros de enseanza donde se emplean microorganismos no patgenos.3.2 Nivel de bioseguridad 2Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal especializado para el manejo de stos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de microbiologa clnica y de control de calidad sanitaria (tcnicos de laboratorio, especialistas en microbiologa).3.3 Nivel de bioseguridad 3Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo de riesgo 3. El material biolgico slo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con infraestructura apropiada para el nivel de contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, entre otras caractersticas; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiologa clnica, de produccin de biolgicos y de control de calidad sanitaria.3.4 Nivel de bioseguridad 4Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biolgico de riesgo 4, especialmente patgeno infecto contagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados por microorganismos del grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliogrficas Granados, E. y Villaverde C. (1977). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios. Serie de Normas Tcnicas N 18 (2 ed.). Per: Autor Per, Ministerio de Salud. (2001, junio). Buenas Prcticas de Laboratorio. Seminario Taller, Lambayeque, Per.

Prctica IIMaterial y equipo de laboratorio

1. IntroduccinLas tres fuentes del conocimiento son la observacin, la experimentacin y el razonamiento. La experimentacin exige menos esfuerzo mental pero ms tiempo, es decir ms presencia; por consiguiente se necesita equilibrar la enseanza con ms horas de laboratorio para un buen aprendizaje. Una buena enseanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre observar un fenmeno o una reaccin, y el poder interpretarlo. La correcta observacin le dar el domino real sobre la materia. La capacidad de interpretacin le proporcionar adems la preparacin tcnico-cientfica necesaria para ser un buen investigador.Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio, slo as se lograr obtener buenas lecturas lo que permitir una buena interpretacin de los resultados.

2. Objetivos2.1 Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa.2.2 Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiologa.2.3 Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiologa.

3. Procedimiento3.1 Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa3.1.1 Tubos de ensayoExiste una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioqumicos se usan tubos de 13 X 100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm.3.1.2 Placas de PetriEstn compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el ms grande hace de tapa. Se emplean para el aislamiento y cultivo de microorganismos.3.1.3 Tubos de SmithSon utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentacin.3.1.4 Campanas de DurhamSon tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la produccin de gas en los procesos de fermentacin.

3.1.5 Pipetas serolgicas o de medidaPresentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20C. Las marcas ms conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos de precisin, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en Norteamrica y tienen las siglas NBS y el ao de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX serolgica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%).Las pipetas serolgicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL y las de mayor uso son:Pipetas de 10 mL 0,1 mLPipetas de 5 mL. 0,1 mLPipetas de 1 ml. 0,1 y 0,01 mLPipetas de 0.1 mL. 0,1 y 0,001 mLPipetas de Dhan de 0,125 0,0125 mLPipetas de Dhan de 0,250 0,0250 mLPipetas de Bang de 0,2 0,08 y 0,005 mlLas pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la ltima lnea de graduacin. 3.1.6 Pipetas PasteurSon confeccionadas de varillas de vidrio de dimetro de 4 X 20 mm. y de 30 40 cm. de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma de pequeos inculos de siembra.Modo de emplear la pipeta Pasteur El tallo de la pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio Se coloca la punta de la pipeta en el lquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire. Con aspiracin suave, se llena el lquido por encima de la marca de calibracin. Se cierra la pieza de la boca con el dedo ndice. Se seca el exceso del lquido en el exterior de la pipeta con un pao o un papel limpio. Colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del lquido baje hasta la marca de calibracin moviendo con suavidad el ndice sobre la pieza de boca. El dedo no debe retirarse. Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepcin, colocando su punta contra la pared. Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vace durante el tiempo necesario. No se debe soplar para hacer salir la ltima gota al emplear una pipeta volumtrica o cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el vaciamiento sea correcto.3.1.7 Buretas Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las ms comunes son de 50 mL y estn graduadas al dcimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de lquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumtricas.Modo de usar la bureta La bureta limpia y vaca se mantiene en posicin vertical mediante un soporte adecuado. Se enjuaga la bureta con el mismo lquido que se va a descargar. Se llena la bureta con el lquido hasta un poco ms arriba de la graduacin y se descarga el lquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduacin y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solucin. Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar errores. Despus de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o tambin pueden colocarse en el soporte con las puntas hacia arriba. Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con cera y resina. La lubricacin adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca.3.1.8 Matraces Son recipientes volumtricos muy tiles en la preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamao son muy variables. Matraces cnicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que reducir a un mnimo la evaporacin; son tiles para las titulaciones. En Microbiologa sirven para la preparacin de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de alambre cuando se realiza el calentamiento evitando as el contacto directo entre el matraz y la llama. Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el mechero. Para calentar solventes orgnicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores correspondientes y permiten un cierre mucho ms hermtico que los tapones de caucho o de corcho. Matraces aforados o fiolas: Idnticos a los matraces erlenmeyer. Estn calibrados a medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica la medida. Se emplean para la preparacin de reactivos y de soluciones buffer. Matraces kitasato: Son matraces que adems de la boca tienen una tabulacin corta lateral para hacer vaco. Se utilizan como complemento del equipo de filtracin (esterilizacin en fro). 3.1.9 Esptulas de Drigalsky Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fraccin recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias por diseminacin.3.1.10 Probetas Recipientes cilndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad de 10 mL hasta 2 000 mL. Las ms utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL.3.1.11 Beacker o vasos de precipitacin Recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. El vidrio debe ser necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad.3.1.12 Varillas de vidrio macizoFragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confeccin de agitadores o baguetas. Las varillas cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra. 3.1.13 Frascos reactivosFrascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color mbar. Son cilndricos, tienen cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su vaciado y su tamao vara de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeos se pueden almacenar HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u otros reactivos. 3.1.14 Frascos goterosTienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o mbar, y sus tapones son ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para colorantes o para indicadores. 3.1.15 PicetasSon botellas plsticas de color blanco con una especie de cao que al presionar el frasco permite que el lquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar lminas portaobjetos con tinciones.3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos Los portaobjetos son lminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mnimo grosor. Los cubreobjetos son finsimas laminillas de mucho menor tamao que los portaobjetos y pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la observacin microscpica de las bacterias u otros organismos.3.1.17 Jarra de BrewerDenominada tambin campana de anaerobiosis, est constituida por una tapa de baquelita en cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada hermticamente mediante una abrazadera de metal.3.1.18 Asas de siembraCon mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrn resistente a elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos.3.1.19 Mangos de KolleVstagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para insertar el alambre de platino o micrn en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio.3.1.20 Alambres de platino en aro y en puntaPueden ser acoplados a los mangos de Kolle.3.1.21 Canastillas o cestos de metalLas mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas, sin riesgo de roturas. 3.1.22 GradillasPermiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes.3.1.23 Soportes universalesCon tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de metal de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento.3.1.24 Trpodes Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento. De variada altura y dimetro.3.1.25 Rejilla o malla metlicaMalla de alambre galvanizado, resistente a la corrosin a elevadas temperaturas. Se coloca sobre el trpode.3.1.26 Mecheros Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de metal por donde se introduce la mecha. Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos ms tiles en el laboratorio. Fue inventado por el alemn Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de mecheros, algunos tienen regulacin de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son simples, no regulan el gas, y queman gas propano.3.1.27 Autoclave Consta de una caldera de acero o de cobre batido estaado interiormente, protegida por una camisa metlica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base est instalada la fuente calrica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, est la placa cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno est adaptado un arandel de caucho para el cierre hermtico del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el cierre, evitndose el escape del vapor. Presenta adems, un manmetro (que marca las libras de presin), una vlvula de seguridad, un termmetro y una llave o espita (para la salida del aire y vapor al empezar a hervir el agua).El vapor de agua se aplica en una cmara cerrada en la que existe un generador de vapor; cuando ste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presin deseada, teniendo en cuenta que el vapor a 1 atm. de presin corresponde a 121C de temperatura. Esta temperatura, aplicada durante 15 o 20 minutos, una temperatura de 134 C durante 7 minutos destruye todas las formas vegetativas y esporuladas.El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilizacin ms usados son productos qumicos (que cambian de color segn los niveles alcanzados) y esporas de ciertas bacterias.3.1.28 Horno PasteurEs un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco. Es cilndrico, de metal, de triple pared; la intermedia ms corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas (concntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo. Las paredes son metlicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero mltiple o juego de resistencia (fuente calorfica). 3.1.29 Espectrofotmetro Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en anlisis bioqumicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas del azul y el verde. 3.1.30 Potencimetro Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biolgicos, medios de cultivo, etc. 3.1.31 Contador de colonias Lo ms difcil en la determinacin de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El contador de colonias soluciona este problema convirtindose en un auxiliar indispensable para todo laboratorio microbiolgico y adems no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo. 3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras Son incubadoras de temperaturas fras. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento ms prolongado de sueros, enzimas, etc.Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberas de agua caliente.3.1.33 Estufas de cultivoSirven para realizar el proceso de incubacin, que brinda una temperatura adecuada para que los microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos mtodos de incubacin: Incubacin por calor seco: Se realiza en incubadoras e incluso en hornos. Las incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre stos radica en la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato que es capaz de soportar temperaturas de 100 C ms. El ms conocido es el horno Pasteur. Incubacin por calor hmedo (bao Mara): El llamado bao Mara presenta un dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio de una corriente de conveccin, lo que permite que el agua se caliente en forma ms uniforme.3.1.34 Microscopio pticoLa Microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio. Podemos encontrar un microscopio simple que no es ms que una lente biconvexa, o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayor aumento.Los microscopios se clasifican bsicamente en dos grupos en funcin del tipo de luz utilizada y amplificacin: microscopio de luz ptica y microscopio electrnico. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se obtiene por un sistema de lentes pticas, corresponde a los microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se hace a travs de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio electrnico.Los diversos componentes del microscopio ptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

a) Sistema de soporte: Pie, bastidor, revlver portaobjetivos, platina.b) Sistema de aumento : Objetivos, ocularesc) Sistema de iluminacin: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.d) Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, condensador, elevador del diafragma iris, reguladores de la platina mecnica, tornillos para centrar el condensador.

Sistema de aumentoLa amplificacin de la imagen en un microscopio ptico se obtiene mediante dos sistemas de lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan objetivos y forman la imagen real del objeto que se est observando. El poder de aumento de cada uno de ellos es indicado por un nmero grabado ejemplo: 40 indica un aumento del objetivo de 40 veces.El segundo sistema de lentes que se sita en el extremo superior del tubo del microscopio, est ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. La amplificacin del ocular suele venir indicada en la parte superior del lente ocular o en la lateral.Poder de aumento del microscopioSe calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del microscopio ser de 450.Poder de resolucin del microscopioEs la distancia entre dos estructuras de un espcimen en la cual todava se pueden observar como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolucin se define como el espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar con claridad como dos entidades independientes y si se les acerca un poco ms, ya no se distinguen, y se les ve como un solo punto.El poder de resolucin est sujeto a la longitud de onda () del espectro de luz visible y a la propiedad de las lentes conocidas como la abertura numrica (AN). El lmite del poder de resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 /AN que para un microscopio ptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes, ser mejor el poder de resolucin del microscopio

Abertura numrica de un objetivoDepende del ndice de refraccin (N) del medio que llena el espacio entre el espcimen y la parte frontal del objetivo, y del ngulo () de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al objetivo. Usando una lente con mayor abertura numrica, se obtiene mayor poder de resolucin.AN = N x Sen /2El aire tiene un ndice de refraccin de 1, que limita la resolucin que se puede obtener, pero se puede incrementar la abertura numrica colocando aceite de inmersin entre el especmen y el objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio Aceite de inmersin Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto objeto es el aceite. Este tiene un ndice de refracccin de 1,5, lo que aumenta considerablemente la abertura numrica. La observacin de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espcimen y el objetivo, pero para observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersin de aceite.IluminacinLa iluminacin es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolucin de un microscopio. La luz proceder de la fuente de iluminacin que se situar en la parte ms baja del microscopio. Dicha luz penetrar en el condensador y ste llegar al objetivo que lo amplificar, as pues deber llegar un cono de luz muy grande para que su amplificacin sea mayor. Este tamao de cono de luz que llega al objetivo se podr controlar con el diafragma situado inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera completamente abierto, se perdera contraste y nitidez.Si se utiliza el objetivo de inmersin, la distancia de trabajo es muy pequea y, en estos casos, hay que abrir ms el diafragma para facilitar una mayor amplificacin que aumente el mximo poder de resolucin.

3.2 Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiologa.3.2.1 Microscopio Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril. Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica estril (1 gota) sobre una lmina porta objetos. Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo. Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X.3.2.2 Horno Pasteur Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado. Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura del horno a 180 C y mantener el material por espacio de 2 horas.Precauciones en el manejo No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio. Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de sta manera se evitar la carbonizacin del papel y tapones de algodn. No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes de goma, etc.3.2.3 Autoclave Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla. Colocar el material a esterilizar en la canastilla. Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en dos tornillos diagonalmente opuestos. Dejar abierta la espita. Encender la fuente de calor. Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo. Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la temperatura (121 C) durante 15 a 20 minutos. Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presin deseada. Apagar el sistema de calefaccin, despus del tiempo de esterilizacin. Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua. Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los vapores lleguen a la cara del operador.Precauciones en el manejo: Para evitar la prdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes. No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la circulacin del vapor. No bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar prdida de material y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin.3.2.4 Estufa Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el medio de cultivo inoculado. Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubacin durante 24, 48 horas o ms tiempo si es requerido.3.2.5 Bao Mara Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo. Encender la fuente calorfica. Graduar la temperatura deseada. Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado.

3.3 Esterilizacin del material de uso en el laboratorio de Microbiologa3..3.1 Placas de Petri Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o de descarte y esterilizar en autoclave a 121 C durante 20 minutos. Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y dejar secar. Envolver con papel y asegurar con pabilo. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.3.3.2 Tubos de ensayo En una canastilla o un depsito que los sostenga depositar los tubos que contengan material contaminado o de descarte. Esterilizar en el autoclave a l21 C durante 20 minutos. Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y dejar secar. Taponar los tubos con algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y facilite su uso posterior. Envolver con papel. De preferencia formar grupos de seis tubos, envolver y asegurar con pabilo. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.3.3.3 Matraces Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recin preparados o cultivos de descarte. Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar. Colocar tapones de algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y facilite su uso posterior. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.3.3.4 Pipetas Colocar un tapn de algodn ligeramente ajustado en el orificio superior de las pipetas. Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas. Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

4 Anexo

dcba Figura 2.1 Equipos de uso en Microbiologa, a. Autoclave, b. Incubadora c. Horno, d. Espectrofotmetro

ba

c

d

ef

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiologa, a. Potencimetro, b. Refrigeradora, c. Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Bao Mara.

5. Referencias bibliogrficas Granados, E. y Villaverde C. (1997). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Mendo, M. (1999).Instrumentacin de Laboratorio. Lima, Per: Editorial Cientfica Mundi E.I.R.L.

Prctica IIIObservacin de bacterias

1. IntroduccinLeewenhoek realiz observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta entonces slo se poda especular de la existencia de agentes infecciosos ms pequeos que lo que el ojo humano poda distinguir. Desde ese momento el microscopio ptico se ha transformado en una herramienta muy importante en la determinacin y clasificacin microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con slo unas pocas coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual ms eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivosa. Reconocer la morfologa de las bacterias.b. Adquirir destreza en la obtencin de un frotis.c. Describir las tcnicas de coloracin simple y compuesta.d. Adquirir destreza en la tincin de Gram

3. Procedimientoa. Obtencin de un frotis El frotis constituye la extensin y fijacin de la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia y desengrasada. Extensin: Se coloca en el centro de una lmina portaobjetos una gota del cultivo lquido. Si el cultivo fuera slido, se coloca previamente una gota de solucin salina o agua destilada sobre la lmina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequea porcin de una colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lmina. Fijacin: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

DbcA

Figura 3.1 Tecnica para la obtencin de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar una gota de solucion salina esteril en una lmina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa de Petri. c), d) realizar una emulsin , luego extender la muestra sobre la lamina y fijar la muestra al calor .

b. Coloracin simpleEs aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc.Procedimiento: En una lmina portaobjetos realizar el frotis de la muestra. Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5 minutos. Lavar el frotis a chorro de agua. Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio y esquematizar.

c. Coloracin compuesta: Tcnica de GramColoracin compuesta es aquella que utiliza ms de un colorante. La ms comn es la tincin de Gram, donde las bacterias se tien con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.Procedimiento: En una lmina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el frotis. Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos. Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto. Lavar a chorro de agua y decolorar rpidamente con alcohol acetona. Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos. Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin. Comparar y esquematizar.

4. Anexo

Reactivos para la tincin de GRAM

A) Violeta de Genciana de Hucker

Soluc. A Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g

Soluc. B Alcohol etlico ............................................................................... 20,0 mL Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B) Solucin de safraninaSafranina ...................................................................................... 0,25 gAlcohol etlico .............................................................................. 10,0 mLAgua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C) Solucin de lugolYodo .............................................................................................. 1,0 gYoduro de potasio ......................................................................... 2,0 gAgua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D) Alcohol acetonaAlcohol de 95 ............................................................................... 70,0 mL.Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

5. Referencias bibliogrficas Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Prctica IVMedios de cultivo

1. IntroduccinMedio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicacin de los microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrgeno, debe presentar un equilibrio cido base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121 C, 15 libras de presin, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo segn su naturaleza1.1.1 Naturalesa. Origen animal: Leche, huevos.b. Origen vegetal: Papas.1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composicin qumica conocida y constante ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo segn su utilidad1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Entre ellos estn el caldo comn, agar comn, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo comn (g/L)Peptona 10,0 NaCl 5,0 Agua destiladacsp 1000 mLpH 7,0

Agar comn (g/L)Peptona 10,0 NaCl 5,0 Agar 15,0 Agua destiladacsp 1000 mLpH 7.0

Caldo nutritivo (g/L)Peptona 10,0 NaCl 5 ,0Extracto de carne 3,0 Agua destilada csp 1000 mLpH 7,0

Agar nutritivo (g/L)Peptona 10,0 NaCl 5,0 Agar 15,0 Extracto de carne 3,0 Agua destilada csp 1000 mLpH 7,0

1.2.2 Medios especiales a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgnicos como sangre, yema de huevo, suero, etc.Agar sangreAgar comn fluidificado y enfriado a 45 C95 mLSangre citratada 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos e inhiben a otros acompaantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio.Agar Chapman (g/L)Peptona10,0 Extracto de carne 1,0 NaCl 75,0 Manitol10,0 Agar 15,0 Agua destiladacsp 1000 mLRojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)pH 7,4

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos y a la vez los diferencian segn la utilizacin del sustrato. Ejemplo: Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)Peptona 17,0 Peptona proteosa 3,0 Lactosa 10,0 Sales biliares 1,5 Cristal violeta 0,001 NaCl 5,0 Agar 15,0 Agua destilada csp 1000 mLRojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)pH 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioqumica de los microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)Peptona5,0Extracto de Levadura3,0Dextrosa1,0Lisina 10,0Ctrato amnico frrico0, 5Tiosulfato de sodio0, 04Prpura de bromocresol 0, 02Agar 15 gAgua1 000 mLpH 6,7

1.3 Clases de medios segn su consistencia1.3.1 Lquidos1.3.2 Slidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacrido extrado de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 100 C y de solidificarse a 40 C. As mismo, el agar no es degradado por las bacterias.1.3.3 Semislidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiologa.2.2 Adquirir destreza en la preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

3. Procedimiento3.1 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivoa. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y adicionar la cantidad de agua destilada requerida.b. Disolver en Bao Mara.c. Enfriar y ajustar el pH segn convenga.d. Colocar un tapn de algodn en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y asegurar con pabilo.e. Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 libras de presin durante 15 minutos.

3.2 Metodologa para servir medios de cultivoa. Fluidificar los medios slidos al calor, enfriar a 50 C y frente a la llama del mechero servir en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.b. Servir los medios lquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidosa. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 C.b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algn microorganismo (contaminanate).

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Llevar a control de esterilidadLlevar el medio a autoclaveServir los medios a placasLlevar el medio de cultivo a control de esterilidad.Agua destilada

Adicionar los ingredientes en el matraz.

Los tubos son inclinados y llevados a control de esterilidad.Los tubos son llevados a autoclaveLos tubos son colocados en una gradia y son taponados con algodnServir el medio de cultivoHomogenizar el medio de cultivoAgua destilada

Figura 4.1 Metodologa para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo slidos y lquidos

4. Referencias bibliogrficas Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Prctica VSiembra y aislamiento de bacterias

1. IntroduccinSembrar es la accin de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para trasplante.La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo comn sta presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos. Generalmente se utiliza la tcnica de agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple. Cuando se desea contar el nmero de bacterias se utiliza la tcnica de placa vertida. La siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie microbiana (cepa). Tambin se denomina repique. El objetivo es el mantenimiento del microorganismo conocido cambindolo a un nuevo medio de cultivo.

La siembra por trasplante puede ser: De un medio slido a otro medio slido De un medio slido a un medio lquido De un medio lquido a otro medio lquido De un medio lquido a un medio slido

2. Objetivos- Realizar una siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple.- Realizar una siembra por difusin en placa o placa vertida- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento3.1 Siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simpleSe realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biolgica. Tomar una alcuota de la muestra (inculo) y depositarla en uno de los extremos superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido y controlado. Realizar movimientos en zig zag (estras) muy juntos en el primer tercio de la placa para agotar el inculo. Posteriormente realizar estras muy separadas de un extremo a otro lado de la placa no tomando nuevo inculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la placa. Incubar a 37 C (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusin en placa o placa vertidaSe utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biolgica. Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de Petri estril y vaca. Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 50 C. Homogenizar por movimientos de rotacin de la placa de Petri para la dispersin de microorganismos en forma ms o menos homognea, hasta la solidificacin. Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar el recuento de colonias.

3.3 Obtencin de un cultivo puro de bacteriasa. Tratamiento de la muestraPara estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biolgicas que pueden ser de varios tipos:a.1 Muestras que contienen abundante nmero y tipo de microorganismos en las que previamente se deben realizar diluciones en solucin salina fisiolgica estril. Ejemplo suelo.a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el nmero del microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningn pre-tratamiento. Ejemplos sangre,

b. Aislamiento primarioUna vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a travs de la siembra en placa de Petri mediante la tcnica de estra en la superficie de medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales (agar Mac Conkey). Despus de un periodo de incubacin de 24 horas (puede variar en funcin del microorganismo), se observarn las colonias de bacterias (masas constituidas por millones de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una clula). Se observar el tamao y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada gnero y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como caracterstica diferencial. A continuacin se realizar una tincin de Gram para determinar la morfologa y reaccin tintorial de las bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre el medio de cultivo

c. Aislamiento secundarioEn caso que la morfologa y reaccin tintorial de las clulas bacterianas coincidan con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a travs de una siembra para trasplante o transferencia de una pequea porcin de la colonia hacia un tubo con medio de cultivo inclinado que permitir el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (poblacin de bacterias que procede de una clula) y que a su vez puede ser mantenido e identificado merced a sus propiedades culturales y fisiolgicas.

4. Referencias bibliogrficas Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Prctica VIIDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. IntroduccinUna vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificacin del gnero y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificacin comienzan con el estudio morfolgico de la colonia, estudio morfolgico de las clulas, motilidad, prueba de catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidacin fermentacin, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas segn la bacteria que va a ser identificada.

2. Objetivos2.1 Caracterizar morfolgicamente las colonias bacterianas.2.2 Caracterizar morfolgicamente las clulas bacterianas.2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidacin-fermentacin2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfolgico de las colonias bacterianasDeterminar el tamao, forma, borde, elevacin, consistencia, aspecto y color de la colonia bacteriana.a) Tamao: Pequeo, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo, invadiendo toda la superficie del medio.b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.d) Elevacin: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

FormaElevacin

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevacin de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasaLa catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo a los estreptococos.Tcnica del porta objetos: En una lmina portaobjetos depositar una colonia bacteriana procedente de un cultivo joven y aadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes.

Interpretacin: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxigeno molecular.

2 H202 = 2 H20 + 02Utilizacin: Se usa para diferenciar cocos Gram positivos

Figura 6.1 Reaccin positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivasMorfologaReaccin

catalasaGram

CocosStaphilacocusMicrococcusStreptococcusEnterococcus++--++++

Bacilos esporuladosBacillusClostridium+-++

Bacilos no esporuladosListeriaCorynebacteriumErysipelotrix++-+++

3.3 Estudio morfolgico de las clulas bacterianasRealizar un frotis de una pequea porcin de la colonia y una tincin de Gram para determinar la morfologa celular y reaccin tintorial de las clulas bacterianas.

3.4 Prueba de oxidacin fermentacinDetermina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la va oxidativa, el aceptor final de electrones es el oxgeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la va fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgnico procedente de la misma va, por consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez. La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas producen cido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias fermentativas producen mucho cido en todo el tubo.Tcnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de los tubos con vaselina o aceite de parafina estril. Incubar a 37 C por 24 horas, aunque a veces es necesario una incubacin de hasta 14 das.Interpretacin: Si la va es oxidativa, slo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en la parte superior al amarillo y ms tarde se extender por todo el tubo, pero nunca con produccin de gas. Si la va es fermentativa, se observar un viraje intenso al amarillo que se inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin produccin de gas.Utilizacin: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratosInvestigar la fermentacin de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formacin de acidez (medio RMVP), utilizacin del citrato como fuente de carbono y energa (medio citrato de Simmons) e hidrlisis del almidn (agar almidn).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenadosInvestigar la descarboxilacin de la lisina (agar LIA) y formacin de indol (caldo peptonado)

AGAR TSI(Agar triple azcar de hierro) (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composicin Extracto de carne3,0 gExtracto de levadura3,0 gPeptona 15 gPeptona proteasa 5,0 gLactosa 10 gSacarosa 10 gGlucosa 1,0 gSulfato ferroso (FeSO4)0.2 gCloruro de sodio5,0 gTiosulfato de sodio (Na2S2O3)0,3 gAgar 15 gRojo de fenol0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)Agua csp1 litropH7,4

2. FundamentoEste medio se utiliza para la identificacin de enterobacterias segn su capacidad para metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formacin de sulfuro de hidrgeno (H2S) y gas.Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentacin de la glucosa se lee al fondo del tubo (amarillo), la fermentacin de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la fermentacin de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo).Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las protenas que alcalinizan el medio por la formacin de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo acentuado, debido a que la pequea cantidad de glucosa (0.1%) se consume rpidamente en la superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo).En la produccin de sulfuro de hidrgeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio hasta hidrgeno sulfurado (o sulfuro de hidrgeno) y ste se une al fierro (del FeSO4) formando un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier parte del tubo, especialmente en el fondo.En la formacin de CO2 e H2 durante la fermentacin de los carbohidratos: el agar se rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.

3. Tcnica Sembrar por puntura y estra en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI. Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

rojoamarillo

rojo

negroamarillo

amarilloamarillo

K/A amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superiorGas (-)H2S (+)glucosa (+)lactosa (-)sacarosa (-)K/A amarillo en el fondo del tubo y rojo en la parte superiorGas (-)H2S (-)glucosa (+)lactosa (-)sacarosa (-)A/A amarillo todo el tuboGas (+)H2S (-)glucosa (+)lactosa (+)sacarosa (+)

CBA Medio MRVP(Rojo de Metilo Voges Proskauer)

1. Composicin (g/L)Polipeptona7,0 Glucosa5,0 Fosfato dipotsico5,0 Agua c.s.p.1000 mLIndicador rojo de metilopH 4,5 = RojopH 6,3 = AmarillopH 6,9

2. FundamentoEste medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba de rojo de metilo detecta la formacin de cidos (lctico, actico, frmico) por fermentacin cido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de cidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener el pH bajo despus de una incubacin prolongada de 48 horas.3. Tcnica Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP. Incubar a 37 C durante 48 horas. Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.4. LecturaEl desarrollo de un color rojo estable indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de cido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. sta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna amarillo.

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MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composicin (g/L)Fosfato amnico1,0 Citrato sdico 2,0 Cloruro sdico5,0 Fosfato bipotsico1,0Indicador azul de bromotimol0,08 pH 6 = amarillo, pH 7.6 = azulSulfato magnsico0.20Agar15Agua c.s.p1000 mLpH6.92. FundamentoEste medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono y energa. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultneamente los microorganismos utilizan el fosfato amnico como fuente de nitrgeno y liberan amonaco. La presencia de carbonatos, bicarbonatos y amonaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira del verde al color azul.3. Tcnica Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar citrato inclinado. Incubar a 37 C durante 24 horas. Observar el cambio de coloracin del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.4. LecturaEn caso positivo se observar el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador, observndose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observar crecimiento de la bacteria y el medio permanecer de color verde.

MEDIO AGAR ALMIDN

1. Composicin (g/L)Agar nutritivo 100 mLAlmidn1.0

2. FundamentoEl almidn es un polmero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidn a molculas ms simples como la maltosa y glucosa, stas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloracin azul. 3. Tcnica Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar almidn inclinado. Incubar a 37 C durante 24 horas. Adicionar dos gotas de lugol. Observar la presencia o no de una coloracin azul.

4. LecturaEn una hidrlisis positiva del almidn, despus de adicionar el lugol no se observar coloracin alguna. Por el contrario, en una hidrlisis negativa despus de adicionar el lugol se observar una coloracin azul.

AGAR LIA(Agar Lisina Hierro)

1. Composicin (g/L) Peptona5,0Extracto de levadura3,0Dextrosa1,0Lisina 10,0Ctrato amnico frrico0, 5Tiosulfato de sodio0,04Prpura de bromocresol 0,02Agar 15,0Agua1 litropH 6.7

2. FundamentoEste medio permite evidenciar la descarboxilacin de la lisina y la formacin de cido sulfhidrico (H2S). Para que se lleve a cabo la descarboxilacin tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0) por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo debe utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color violeta (K / K). La produccin de H2S se evidencia por la coloracin negra debido al sulfuro de fierro formado. Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un cetocido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales frricas y un color rojizo bajo la influencia del oxgeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A). Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Tcnica Sembrar por puntura y estra en superficie en un tubo conteniendo medio LIA Incubar a 37 C durante 24 horas. Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

AmarilloAmarilloVioletaAmarilloRojoNegroVioleta

K / K R / A K / A A / A

LIA (-)

LIA (+)

.

MEDIO CALDO PEPTONADO 1. Composicin (g/L)Peptona10,0Na Cl 3,0H2O csp1000 pH7,0 Reactivo de Kovac : Alcohol amlico o isoamlico puro 150p dimetilaminobenzaldehido 10HCl concentrado502. FundamentoEste medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrlisis del aminoacido triptfano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido del p dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac)3. Tcnica Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio. Incubar a 37 C durante 24 horas. Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac. 4. LecturaObservar la formacin de un anillo coloreado en la zona de reaccin (color rojo) = Indol (+)

Tabla 6.2. Reaccin a ciertas pruebas bioqumicas claves para la diferenciacin de bacterias entricasGneros H2SIndolRojo de metiloLisina descarb.

Citrato Gas (glucosa)Lactosa

Escherichia-++d-++

Enterobacter--+++++

Shigella-+/-+----

Salmonella+-+++/-++

Klebsiella---++++

Citrobacter+/--+-++d

Proteus+/-+/-+-D+/--

4. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per. MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per. Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental Doyle, M., Beuchat, L. y Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Prctica VIIMICROORGANISMOS INDICADORES

1. IntroduccinMicroorganismos indicadores son aquellos cuya presencia en nmero superior a un lmite establecido evidencia la presencia de un patgeno ecolgicamente relacionado. Ejemplo Escherichia coli indica que probablemente exista Salmonella o Shigella (las cuales son difciles de aislar). Permiten determinar la calidad y seguridad del alimento respecto a su inocuidad y tiempo de vida til.

Coliformes termotolerantes : Indican contaminacin con una probable fuente fecal Microorganismos aerobios mesfilos: Indicador del estado microbiolgico de un alimento. Coliformes totales: Indicadores de un proceso o estado sanitario defectuoso. Escherichia .coli: Indicador de contaminacin fecal reciente. Enterococcus: Indicador de contaminacin fecal muy remota. Staphylococcus: Indica contaminacin por manipulacin inadecuada.

La numeracin de microorganismos aerobios mesfilos viables en los alimentos ha sido uno de los indicadores microbiolgicos de calidad mas convenientemente utilizados. Sus valores indican si la limpieza, desinfeccin y control de la temperatura durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado en forma adecuada. Esta determinacin permite tambin informacin sobre la alteracin incipiente de los alimentos, su probable vida til, la descongelacin incontrolada de los alimentos congelados o las fallas en el mantenimiento de las temperaturas de refrigeracin en los alimentos refrigerados. Asimismo, pone de manifiesto el origen de la contaminacin durante el proceso de elaboracin de los alimentos.

Las coliformes son bacterias Gram negativas en forma de bacilos, aerobios, no esporulados, que fermentan la glucosa y la lactosa con produccin de gas luego de 24 48 horas de incubacin a 35C y son: Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacte y Klebsiella. Las coliformes termotolerantes son las bacterias que fermentan la glucosa y la lactosa con produccin de gas a 45 c y son: E. coli, Enterobacter.sp.

E. coli es un microorganismo que se encuentra en el tracto intestinal de los mamferos y el hombre cuya presencia en un alimento sugiere una falta general de limpieza en el manejo del mismo y un almacenamiento inadecuado. Tambin evidencia el riesgo de que pudieran existir en el alimento otras bacterias patgenas como Salmonella y Shigella que no pueden ser tan fcilmente detectadas en pequeas cantidades.

2. Objetivos2.1 Determinar el nmero de microorganismos mesfilos viables en una muestra de alimento.2.2 Determinar el nmero ms probable de coliformes totales y termotolerantes en una muestra de alimento.

3. Procedimiento3.1 Numeracin de microorganismos mesfilos viables Se utiliza el mtodo de Recuento estndar en placa o Recuento en placa de microorganismos aerobios o Recuento en placa por siembra en todo el medio. Se usa el medio de cultivo Plate Count Agar que es un agar peptona de casena glucosa extracto de levadura exento de sustancias indicadoras y de inhibidoras.

a. Pesar 10 g o medir 10 mL de la muestra y depositarlos en un recipiente conteniendo 90 mL de agua peptonada 0,1%.b. Homogenizar durante 30 segundos.c. Realizar diluciones decimales con 9 mL de agua peptonada al 0,1 % ms 1 mL de la dilucin anterior. d. Pipetear 1 mL de cada dilucin a placas de Petri, estriles y debidamente codificadas e. Verter en cada placa de Petri el agar fundido y temperado a 44 46 C. Acto seguido mezclar por movimientos de rotacin.f. Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubar a 35C durante 48 horas g. Contar las colonias resultantes utilizando el contador de colonias.

Clculo del recuento estndar en placa

10-310-210-1

20 10 15

200 280 320

IncontablesElegir las dos placas correspondientes a una dilucin que presenten entre 30 a 300 colonias. Hallar la media aritmtica de los valores y multiplicarla por el factor de dilucin.200 +280480 2240 x 100 = 24 000- 00 240 = 2.4 x 104 UFC/mL

10-210-310-1

21 15 10 58 73 94 200 280 340

Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 3000 caloras, hallar los recuentos de cada dilucin y dar como resultado la media de los dos valores obtenidos.200 +58 + 2400 + 280947600480 2 152 2 10000 2- - - 240 x 1012 76 x 100 5000 2400 - 7600= 5 x 103 UFC/mL

400 mL capacidad

HOMOGENIZAR 3090 mL H2O peptonada 0,1%1 mL1 mL9 mL H2O peptonada9 mL H2O peptonada10-210-31 ml1 mL

Contar el nmero de colonias en placas que presentan entre 30 y 300 colonias.1 mL de dilucin sobre placas estriles.Verter agar fundido y temperado 44-46C.Homogenizar por rotacin.Dejar solidificar.Incubar 35C x 48 hDilucin 10-1

10 g o 10 mL3.2 Numeracin de bacterias coliformes totales y termotolerantes : Mtodo de Tubos mltiples de Fermentacin - Nmero ms Probable (NMP)a. Pesar 10 g de la muestra y depositarlos en un recipiente de 400 mL de capacidad con 90 ml. de agua peptonada al 0,1%b. Homogenizar durante 30 segundos.c. Realizar diluciones decimales con 9 mL. de agua peptonada al 0,1% ms 1 mL de la dilucin anterior.d. De cada dilucin transferir 1ml. a tres tubos con 10 mL. de caldo EC. Trabajas con tres diluciones consecutivas.e. Incubar a 35-37 C por 24 horas a 48 horas. f. Examinar los tubos para determinar gas luego de 24 horas. Reincubar los tubos negativos por 24 horas adicionales. Tomar una ansada de cada tubo positivo e inocular en caldo Brila y caldo EC.g. Incubar los tubos con caldo Brila a 35-37 C por 24 a 48 horas. Determinar la presencia de gas y anotar el nmero de tubos positivos en cada dilucin. Expresar los resultados como NMP de coliformes totales / g o mL, considerando las diluciones.h. Incubar los tubos con caldo EC a 44,5 C por 24 a 48 horas. Determinar la presencia de gas y anotar el nmero de tubos positivos en cada dilucin. Expresar los resultados como NMP de coliformes termotolerantes / g ml. considerando las diluciones.

4. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per. MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per. Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental Doyle, M., Beuchat, L. y Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Practica VIIIReconocimiento de hongos: mohos y levaduras

1. Introduccin Los hongos son organismos hetertrofos, eucariotas que pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares (mohos). Entre las levaduras la ms reconocida es Saccharomyces cerevisiae y entre los mohos los gneros Aspergillus y Penicillium.

1.1. Gnero AspergillusReino FungiPhyllum AscomycotaClase EuascomycetesOrden EurotialesFamilia TricomaceaeGnero Aspergillus

Para identificar a los hongos del gnero Aspergillus se les cultiva en medio Czapek durante 8 das y se observa la pigmentacin de las colonias, longitud de los conidiforos, forma de la vescula, presencia de mtulas y posicin de las filides.

El gnero Aspergillus se caracteriza por presentar: Conidiforos que terminan en vesculas dilatadas. Filides o estructuras en forma de botella que originan a las conidias. Conidias dispuestas en cadena. En algunas especies se presentan las mtulas o estructuras de soporte de las filides y las clulas de Hlle o estructuras hialinas de funcin desconocida.

1.1.1 Aspergillus nigera. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son lanosas y blancas en un inicio y posteriormente son negras. En el reverso presentan un color crema o gamuza.b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas son esfricas cubiertas en su totalidad por las mtulas, filides y conidias.- Biseriado: Mtulas grandes y filides pequeas.- Conidias lisas en un inicio y posteriormente rugosas.

1.1.2 Aspergillus terreusa. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son aterciopeladas de color canela beige o marrn y posteriormente se tornan granulosas con un exudado color mbar. En el reverso presentan matices amarillos y marrones.b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas tienen forma de cpula cubiertas solo en el tercio superior por la mtulas, filides y conididas.- Biseriado: Mtulas y filides.- Conidias elpticas y lisas.

Figura 8.1 Aspergillus terreus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.1.3 Aspergillus fumigatusa. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son vellosas y blancas en un inicio y posteriormente se tornan aterciopeladas o granulosas, color azul verdoso, gris verdoso o verde esmeralda. En el reverso presentan un color blanco o crema.b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas tienen forma de cpula, cubiertas en su mitad superior o dos tercios de su superficie por las filides.- Uniseriado: Filides.- Conidias globulosas y equinuladas.

Figura 8.2 Aspergillus fumigatus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.1.4 Aspergillus clavatusa. Caractersticas macroscpicas: Las colonias tienen aspecto de fieltro y color verde azulado o verde petrleo. En el reverso presentan tonalidades marrones.b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas son claviformes y alargadas.- Uniseriado: Filides.

Figura 8.3 Aspergillus clavatus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observacin microscpica

1.1.5 Aspergillus flavusa. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son aterciopeladas de color amarillo, verdoso, marrn o verde amarillento. En el reverso presentan un color dorado a marrn rojizo.b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas estn cubiertas totalmente por las mtulas, filides y conidas.- Uniseriado o biseriado: Filides o mtulas y filides.

Figura 8.4 Aspergillus flavus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.2 Gnero PenicilliumReino FungiPhyllumAscomycotaClase EuascomycetesOrden EurotialesFamilia TricomaceaeGnero Penicillium

Para identificar a los hongos del gnero Penicillium se les cultiva en PDA (Agar papa dextrosa) durante 7 das y se observa la morfologa y color de las estructuras microscpicas.

El gnero Penicilliun se caracteriza por presentar: Conidiforos ramificados, distinguindose ramas y mtulas. Mtulas son las penltimas ramas que sostienen a las filides. Todas las clulas entre las mtulas y el conidiforo principal (estipe) son denominadas ramas. El patrn de ramificacin puedes ser simple, con una ramificacin, con dos ramificaciones o con tres a ms ramificaciones. Las colonias son de color verde con aspecto pulverulento fino.

2 Objetivos2.1 Diferenciar macroscpicamente levaduras y mohos2.2 Diferenciar microscpicamente levaduras y mohos2.3 Diferencias macroscpicamente Aspergillus y Penicillium2.4 Diferenciar microscpicamente Aspergillus y Penicillium

3 Procedimiento4.1 Caractersticas macroscpicas de levaduras y mohosLevaduras: Las colonias se asemejan a las de las bacterias pero son ms grandes, cremosas, mucosas, brillantes, de consistencia muy pastosa y a veces rugosaMohos: Las colonias son irregulares. Pueden ser algodonosas, aterciopeladas, filamentosas, secas y presentar diferentes coloraciones.

Figura 8.5 Colonias en medios de cultivo a. Levaduras, b. Mohos.

4.2 Caractersticas microscpicas de levaduras y mohos Levaduras: Estn formadas por clulas esfricas u ovaladas, algunas de las cuales pueden estar gemando.Mohos: Estn formados por estructuras tubulares, filamentosas, denominadas hifas, que pueden presentar septas (hifas septadas) o carecer de ellas (hifas cenocticas).

ba

dc

Figura 8.6 Caractersticas diferenciales de mohos y levaduras. a y b. Clulas levaduriformes c. Hifa cenoctica d. Hifa septada.

4.3 Caractersticas macroscpicas diferenciales de los gneros Aspergillus y Penicillium

Figura 8.7 Colonias en medio de cultivo, a. Aspergillus niger, b. Penicillium sp.

3.4 Caractersticas microscpicas diferenciales de los gneros Aspergillus y Penicillium

Figura 8.8 Observaciones microscpicas, a. Aspergilluis niger, b. Penicllium sp.

Figura8.9 Caractersticas microscpicas del gnero Aspergillus

Figura 8.10 Caractersticas microscpicas del gnero Penicillium

5. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A. Muntaola, M. (1999). Gua de los Hongos Microscpicos. Barcelona, Espaa: Ediciones Omega, S.A.

Prctica IXAISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus aureus

1. IntroduccinPara aislar Staphylococcus aureus se utiliza el agar Baird Parker que es altamente selectivo y permite el fcil reconocimiento de las colonias. Es un medio para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos en alimentos y muestras clnicas. Contiene cloruro de litio y telurito que inhibe la biota acompaante en tanto que el piruvato y la glicina favorecen relativamente el crecimiento de estafilococos. Sobre este medio opaco por su contenido de yema de huevo las colonias de S. aureus muestran liplisis y protelisis a travs de halos y anillos caractersticos y debido a la reduccin del telurito a teluro se desarrollan colonias negras.La reaccin en la yema de huevo y la reduccin de telurito se presentan con notable paralelismo con la prueba de coagulasa positiva y por lo tanto puede utilizarse como ndice de esta ltima.S. aureus utiliza la lipoprotena de la yema de huevo (lipovitelina) originando en el entorno y debajo de la colonia reas de aclaramiento. Tambin se puede observar un precipitado blanco en las reas total o parcialmente aclaradas debido a la formacin de sales de calcio y magnesio de los cidos grasos liberados.

Agar Baird- Parker (g/L)Peptona de caseina10,0Extracto de carne5.0Extracto de levadura1,0Piruvato sdico10Glicina12Cloruro de litio5,0Agar- Agar15Agua destilada csp 1000 ml.pH 6.80.2

Despus de esterilizar, enfriar a 45- 50C y aadir mezclando 50 mL de una emulsin de yema de huevo y 3 mL de telurito de potasio.2. Objetivos2.1. Adquirir destreza en el aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de muestras de alimentos

3. Procedimiento3.1 Pesar 10 g. o medir 10 mL de muestra y homogenizar con 90 mL de agua peptonada 0.1% durante 30 segundos (10-1).Si es necesario realizar diluciones 10-2 y 10-3.3.2 Depositar 0,1 mL de la ltima dilucin en la superficie de placas de Petri con agar Baird Parker y extender el inculo con la ayuda del ansa bacteriolgica en anillo. (estriar en toda la superficie)3.3 Incubar las placas de Petri a 37C por 48 horas.3.4 Seleccionar las colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco rodeadas de reas claras que se extienden en el medio opaco y repicar a viales con agar Tripticasa soya (TSA). La probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus es muy elevada (sucede lo contrario con las colonias negras brillantes con o sin margen estrecho blanco pero que no presenten el rea de aclaramiento).3.5 A cada colonia sospechosa se le realiza la prueba de la coagulasa la cual debe salir positiva para confirmar S. aureus. Para realizarla sembrar cada colonia en caldo BHI (caldo infusin cerebro corazn) e incubar 24 horas a 37C.3.6 Tomar 0,2 ml de caldo BHI y llevar a tubos conteniendo 0,2 ml. de plasma (sangre de conejo oxalatada)3.7 Incubar a 37C. Examinar los tubos a las 4 horas para detectar la presencia de cogulos. Si no se observan volver a leer a las 24 horas. La presencia de cogulos demuestra una prueba de coagulasa positiva.La presencia de S. aureus en un alimento en un nmero mayor de 104 clulas/g puede indicar una manipulacin o condiciones sanitarias deficientes. Esto significa que la contaminacin generalmente se da despus de la coccin, donde debido a una mala manipulacin la bacteria se multiplica y forma suficientes cantidades de toxina como para desarrollar una intoxicacin.

Figura 9.1 Staphylococcus aures, a. Colonias de S. aureus sobre medio Baird Parker, b. Observacin microscpica de S. aureus.

4. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per. Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental Doyle, M., Beuchat, L. y Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

PRCTICA XRECONOCIMIENTO DE ALGUNAS BACTERIAS PATGENAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS

1. IntroduccinLas enterobacterias son agrupadas de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa: fermentadoras rpidas (coliformes: Escherichia, Enterobacter y Klebsiella), fermentadoras lentas (coliformes: Citrobacter, Serratia, Hafnia, Yersinia) y no fermentadoras de la lactosa (no coliformes: Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Providencia y Edwarsiella). Debido a su accin patgena se distinguen Salmonella, Shigella, Yersinia y algunas cepas de Escherichia coli. Como enterobacterias oportunistas son consideradas Klebsiella, Serratia, Hafnia, Citrobacter, Proteus, Morganella, E. coli y Providencia, que en ciertas ocasiones pueden comportarse como patgenos originando infecciones gastrointestinales, urinarias, supurativas, etc.

Escherichia coli es un habitante comn de la microbiota facultativa del tracto gastrointestinal de las personas y animales de sangre caliente. La mayora de las cepas de E. coli son comensales inofensivos, sin embargo, algunas son patgenas y provocan enfermedad diarreica. Estas cepas se agrupan en E. coli enteropatgenas (EPEC), enterotoxigncias (ETEC), enteroinvasoras (EIEC), de adherencia difusa (DAEC), enteroagregantes (EAggEC) y cepas de E. coli enterohemorrgicas (EHEC). El serotipo E. coli 0157:H7 es la causa de muchos brotes a nivel mundial. El carcter grave de los sntomas de la colitis hemorrgica y del sndrome urmico hemoltico (HUS) producidos por E. coli 0157:H7, sitan a este patgeno como uno de los ms graves transmitidos por alimentos.

Salmonella spp. son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con un crecimiento ptimo a 37 C, catabolizan la D-glucosa con produccin de cido y gas y no fermentan la lactosa o la sacarosa.. La mayora son mviles por medio de flagelos peritricos, aunque hay algunas especies inmviles, son catalasa positivas y oxidasa negativas, crecen en citrato como nica fuente de carbono, generalmente producen sulfuro de hidrgeno y decarboxilan la lisina con una reaccin alcalina por la produccin de cadaverina en el agar lisina hierro.

Las especies de Shigella son bacilos inmviles, con incapacidad para fermentar la lactosa o para utilizar el cido ctrico como fuente de carbono, no producen H2S, y excepto por lo que se refiere a S. flexneri, no producen gas de la glucosa. La disentera bacilar o shigelosis es causada por las especies de Shigella y es una enfermedad de origen alimentario.

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, esporgeno, mvil, aerobio, pero crece bien en anerobiosis y produce dos tipos diferentes de intoxicaciones alimentarias: el tipo diarreico y el tipo entrico. Es un organismo saprfito habitual de la tierra y se propaga fcilmente a varios tipos de alimentos, especialmente de origen vegetal, pero tambin se aisla con frecuencia en la carne, huevos y productos lcteos. En los ltimos aos la aparicin de cepas psicrtrofas en la industria lechera ha conducido a una vigilancia aumentada de Bacillus cereus.

2. Objetivos2.1 Reconocer Escherichia coli, Salmonella sp. Shigella sp. y Bacillus cereus.

3. Procedimiento3.1 Reconocimiento de Escherichia coli

Medio de aislamiento: Agar Mac ConkeyColonias rojas Lactosa (+)Reaccin tintorialGram (-)Morfologa celularBacilosMovilidad(+)TSI A/AGas (+)H2S(-)LIAK/KH2S(-)Citrato(-) Indol(+)

3.2 Reconocimiento de Salmonella sp.Agar Mac ConkeyColonias incoloras, lactosa (-)Agar SSColonias incoloras o transparentes con o sin centro negro.Reaccin tintorialGram (-)Morfologa celular BacilosMovilidad (+)TSIK/AH2S (+)Algunos H2S (-)Gas (+)Algunos Gas (-)LIAK/KH2S (+)Citrato(+)Algunos (-)Indol: (-)

3.3 Reconocimiento de Shigella sp.Reaccin tintorial Gram (-)Morfologa BacilosMovilidad (-)Agar Mac Conkey Colonias incoloras, lactosa (-) Agar SS Colonias incoloras o transparentesTSIK/AH2S(-)Gas (-)LIAK/AH2S(-)Citrato (-)Indol (-) Algunos (+)

ba

Figura 10. 1 Colonias desarrolladas en agar Mac Conkey, a. Lactosa positivas, b. lactosa negativas.

Figura 10. 2 Colonias de Salmonella sp. circulares con centro negro desarrolladas en agar SS.

3.4 Reconocimiento de Bacillus cereusMedio de aislamientoAgar manitol yema de huevo polimixinaReaccin tintorial Gram (+)Morfologa Bacilos esporulados. Espora central no deformanteMovilidad (+)Fermentacin de la glucosa (+)Reduccin de nitrato a nitrito (+)Hidrlisis de la gelatina (+)Almidn (+)B hemolisis (+)Manitol (-)Arabinosa (-)Aerobio y anaerobio facultativo

4. AnexoAgar Mc Conkey (g/L)Peptona de casena17,0Peptona de carne3,0Cloruro de sodio5,0Lactosa10,0Sales biliares1,5Rojo neutro0,03Cristal violeta0,001Agar- Agar15,0H2O C sp1000 mLpH 7.1

Las placas servidas con este medio de cultivo son claras y de color rojo parduzco. Es un medio diferencial para enterobacterias. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gram (+) y de algunas otras Gram (-) no entricas. Las bacterias fermentadoras de la lactosa forman colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH menor de 6.8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias no fermentadoras aparecen incoloras o transparentes.

Agar SS (Agar para Salmonella- Shigella) (g/L)Extracto de carne5.0Peptona proteasa5.0Lactosa10,0Bilis de buey disecada8,5Citrato sdico8,5Trisulfato sdico8,5Citrato de amoniaco frrico 1,0Verde brillante0,0003Rojo neutro0,025Agar- agar14,0H2O C sp1000 mlpH7,00,1

Las placas servidas con este medio de cultivo son claras y parduzcas. La mezcla de sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante inhiben a la biota Gram positiva y lo hacen en parte con el grupo de coliformes permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. El tiosulfato sdico adems de ser inhibidor, permite demostrar el poder de formacin del sulfuro al unirse con iones de hierro del citrato amoniacal frrico. En este caso las colonias presentarn un ennegrecimiento. La lactosa permite diferenciar a las bacterias que la fermentan de las que no la fermentan.Salmonella y Shigella presentan colonias incoloras, transparentes lisas. Algunas Salmonellas producen H2S formando colonias con el centro negro. E. coli presenta colonias de color rosa o rojo.

Agar Manitol yema de huevo polimixina (g/L)Peptona10,0Extracto de carne1,0D manitol10,0Cloruro sdico10,0Rojo de fenol0,025Agar- agar12,0Emulsin de yema de huevo100 mLPolimixina B sulfato0,01 a 0,1H2O csp1000 mlpH 7,10,1Este medio permite diferenciar Bacillus cereus de Bacillus thuringiensis. B. cereus forma lecitinasa y al actuar sobre la yema de huevo sta se acumula alrededor de las colonias formando un precipitado blanco. B. thuringienses no forma lecitinasa.B. cereus resiste frente a ciertas concentraciones de polimixina que inhiben a la biota usual de acompaamiento (0,01 a 0,1 g/litro de medio), es manitol negativo y forma colonias amarillas secas aserradas en la periferia de la colonia.

5. Referencias bibliogrficas Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque, Per. Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental Doyle, M., Beuchat, L. y Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A. Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Prctica XIAislamiento, identificacin y mantenimiento de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano

1. IntroduccinLeuconostoc mesenteroides es un microorganismo gramnegativo, con un porcentaje de G + C en su ADN que