ASOCIACION

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

Escuela Profesional de Estomatologa

GUA DE PRCTICA

Ciclo : III

Curso : MICROBIOLOGIA

Docente : C.D. Lzaro Sierra Garmendia

Semestre Acadmico : 2013 II

PRIMERA SEMANA

PRACTICA No. 1

INSTRUMENTOS Y MATERIALES BSICOS EN EL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGIA

OBJETIVOS:

A. Conocer los principales instrumentos, equipos y material de vidrio usados en un

laboratorio de microbiologa, para el diagnstico de enfermedades infecciosas.

B. Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de instrumentos,

materiales y reactives en la prctica microbiolgica.

INSTRUMENTOS:

El laboratorio de microbiologa requiere de equipos y materiales de vidrio, metlicos o

de otra naturaleza, con funciones especficas que permitan el estudio de los diversos

microorganismos patgenos que afectan al hombre.

Es casi imprescindible en el diagnstico de las enfermedades infecciosas el uso de los

Anlisis Clnicos o. Anlisis de Laboratorio; que incluyen: Hematologa, Bioqumica,

Toxicologa," Serologa y Microbiologa, entre otros. La importancia de su uso es tan

significativa que sus resultados ratifican o rectifican el diagnstico presuntivo del

mdico o estomatlogo.

Siendo la estomatologa una especialidad mdica y existiendo muchas infecciones en

el sistema estomatogntico causados por diversos microorganismos; la asignatura

trata de impartir en la parte prctica los conocimientos bsicos de:

Microbiologa e Inmunologa

Principales Tcnicas de Laboratorio

Interpretacin de Anlisis

Terminologa de uso ms frecuente.

Con esta finalidad en esta primera prctica conoceremos los materiales, instrumentos

y equipo ms utilizados y sus condiciones de uso en los procedimientos de laboratorio

ms frecuentes en microbiologa como son los siguientes:

a) Toma de muestra

b) Coloracin

c) Cultivo

d) Serologa

A continuacin se mencionan los instrumentos, indicando alguna caracterstica de uso

y su funcin especfica.

MICROSCOPIO

Los microscopios ms usados son el ptico de campo claro (hasta 2000 aumentos) y

el electrnico (hasta 100,000 aumentos), adems existen otros con fines ms

especficos como los microscopios pticos de inmunofluorescencia, el de campo

oscuro, el de contraste de fases.

Se describe a continuacin las caractersticas del microscopio ptico.

Partes:

1. Mecnica

2. ptica

3. Sistema de Iluminacin

1. Mecnica:

a) Pie

b) Platina (Circular o rectangular fija o mvil, el vernier y el sistema de movimiento

o tren)

c) Tubo ptico, revlver

d) Sistema de enfoque: tornillos micromtricos y macromtricos (cremallera)

2. Sistema ptico:

a) Oculares; 05-10-20X

b) Objetivos; 05-10-40-100X

Objetivos de observacin en seco y en inmersin.

3. Sistema de iluminacin:

a) Espejo: Plano y Cncavo

b) Condensador

c) Diafragma filtros

d) Fuentes de iluminacin natural y artificial

Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la

del objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente. (Utilice

los objetivos secos para pequeos aumentos).

A menor aumento se requiere menor iluminacin, Jo cual se consigue bajando el

condensador y cerrando parcialmente el diafragma.

La observacin de las muestras hmedas, es decir en fresco se hace con lentes de

menor aumento o sea sin inmersin; este queda para las muestras coloreadas y en

general para aquellos casos en que se requiere la mxima cantidad de luz y se

practica con el auxilio del aceite de cedro u otra sustancia que tenga un ndice de

refraccin parecido.

Para la observacin microscpica proceda segn el siguiente orden:

Ilumine empleando el espejo cncavo o plano; la eleccin depende de la fuente

de luz, aumentos empleados y otros factores.

Enfoque de preferencia con la lente de menor aumento que por lo comn tiene

un tope inferior que impide la ruptura de las lminas la observar.

Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revlver y utilice el objetivo deseado.

Si se va a usar el de inmersin, coloque previamente una gota de aceite de

cedro sobre la preparacin. Al colocarse la lente en posicin debe haber una

continuidad entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micromtrico.

Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.

Al terminar la observacin limpie el objetivo con un papel especial para lente o

con algodn o, un lienzo fino. Si hay impregnacin de aceite utilice xilol en

pequea cantidad y seque bien. Las lminas una vez observadas, se

depositarn en un recipiente apropiado el que contiene mezcla sulfocrmica.

La composicin de la mezcla es como sigue:

Bicromato de potasio 100 grs. Acido sulfrico 100 grs. Agua destilada 1000 ml.

Esta mezcla es empleada en los frascos

en la que se desecha todo material contaminado.

AUTOCLAVE

Destinado a la esterilizacin con calor hmedo y presin (121 Cx15' a 15 Lbs/pulg2),

se esteriliza: materiales de desecho, medio de cultivo, ropa de sala de operaciones,

agua destilada, etc.

HORNO

Destinado a la esterilizacin con calor seco (se llama tambin horno Pasteur o

Poupinel).

La temperatura usual es de 160-180C por 1-2 horas.

Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metlicos.

ESTUFA O INCUBADORA

D una temperatura que se mantiene fija mediante un termostato; esta temperatura se

elige segn el requerimiento del germen a cultivar. Generalmente es a 37C.

REFRIGERADOR O NEVERA

Permite conseguir bajas temperaturas y se utiliza con fines de conservacin de

grmenes, de medios de cultivos, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a

temperatura de 00 a 4C.

CENTRIGUGA

Aparato de muy diversa capacidad que permite separar una sustancia slida en

suspensin del lquido respectivo.

Por ejemplo para centrifugar orina o sangre, para obtener el "sedimento urinario o el

suero" respectivamente.

LA BALANZA

Se usa en bacteriologa para pesar colorantes; componentes de medios de cultivos,

reactivos etc. Las hay de diferentes tipos segn su aplicacin y su sensibilidad.

BAO MARIA

Permite la transmisin indirecta y atenuada de calor, de un lquido sobre una sustancia

a travs de un recipiente.

Evita el calor directo.

Se emplea entre otras cosas para licuar medios y para inactivacin de sueros, Existen

diversos modelos segn su aplicacin.

AGITADOR MECNICO

Es un equipo de diversos diseos y con frecuencia variable por el nmero de veces

que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y lminas

excavadas.

POTENCIOMETRO

Aparato destinado a determinar la concentracin de iones H (pH en una solucin). El

ms perfeccionado es el de Beckman.

BOMBA DE VACIO

Produce presin negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua

potable, a travs de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias

contaminantes.

CONTADOR DE COLONIAS

De la marca (Quebec) se utiliza para el recuento de colonias en un placa de cultivo; de

una manera ms exacta y con mayor facilidad.

MATERIALES DE VIDRIO:

Tubos de ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas, pipetas,

placa Petri, placas de Roux, placas de Brewer, tubos de centrfuga, tubos de vidrio de

diversos calibres pipetas Pasteur, jeringas, frascos, goteros, perlas de vidrio,

embudos, micropipetas de la marca EPPENDORF o de la marca OXFORD, etc.

OTROS MATERIALES. VIDRIO CORRIENTE, MADERA Y PORCELANA

Lminas excavadas de vidrio, lminas portaobjetos y cubreobjetos, termmetros,

mechero de alcohol, gradillas ASA DE KOLLE o asa Bacteriolgica, pinzas de madera,

piln y mortero de porcelana.

SEGUNDA SEMANA

PRACTICA No. 2 Y 3

MEDIOS DE CULTIVO

1. OBJETIVO:

a. Conocer algunos medios de cultivo cuyo uso en microbiologa es frecuente.

b. Comprender que los microorganismos requieren variados nutrientes los que

deben tenerse en cuenta al preparar los diversos medios de cultivo.

2. FUNDAMENTEO TEORICO:

MEDIOS DE CULTIVO:

Son sustancias nutritivas lquidas o slidas que se utilizan en el laboratorio para

proporcionar sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicacin de los

microorganismos (bacterias, hongos, etc.) pudiendo ser similares a substratos

naturales, en los cuales estos crecen normalmente. Sus componentes bsicos

deben satisfacer las mnimas exigencias nutricionales para el desarrollo

microbiano y varan segn el tipo de bacteria.

Incluyen: Agua, nutrientes como fuentes de nitrgeno, de carbono y energa y en

ciertos casos factores de crecimiento.

La mayora de los medios empleados para el desarrollo inicial y aislamiento de

microorganismos heterotrficos, son ricos en componentes proteicos obtenidos de

carnes de animales (especialmente de corazn, cerebro, etc.). protenas vegetales

como soya, que se obtiene por digestin con enzimas proteolticas (pepsina,

tripsina o papaina). Los diversos medios de cultivo tienen como ingredientes

bsicos: extracto de carne, peptona, agar, extracto de levadura, etc.

Los medios de cultivo son sustancias nutritivas estriles que sirven para el

crecimiento bacteriano.

Los medios de cultivo permiten:

a. Desarrollo y crecimiento de los grmenes

b. Aislamiento e identificacin de los grmenes

c. Clasificar a los grmenes

d. Obtencin de los productos bacterianos, como enzimas (glutamato monosdico

o ajinomoto)

e. Cosechar cepas bacterianas y de esta manera poder fabricar vacunas

f. Obtener toxinas para estudiarlas y crear antitoxinas

Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias

que requieren para la sntesis de sus materiales celulares y para la generacin de

energa.

Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo debe tener, por

tanto, todos los nutrientes, necesarios en cantidad apropiadas a los requerimientos

especficos de los microorganismos para los que han sido diseados.

Sin embargo, los microorganismos son extraordinariamente diversos en cuanto a

sus propiedades fisiolgicas especficas y, por consiguiente, diversos en cuanto a

sus requerimientos de nutrientes especficos. Literalmente hablando, son miles de

medios diferentes los que existen.

AGUA.-

Para la preparacin de los medios de cultivo y de los reactives solo se debe usar

agua destilada o agua desmineralizada que se haya ensayado previamente y se

haya encontrado exenta de huellas de metales disueltos y de compuestos

bactericidas o inhibitorios.

EXTRACTO DE CARNE.-

Se puede usar cualquier marca conocida de extracto de carne que conduzca a

resultados satisfactorios. No se debe usar infusin de carne.

PEPTONA.-

Es una Protena degradada parcialmente que bajo esa forma es de fcil

asimilacin por los microorganismos, se puede usar cualquier peptona que por

pruebas comparativas previas, haya demostrado que conduce a resultados

satisfactorios.

AZUCARES.-

Todos los azcares que se usen para la preparacin de los medios de cultivo

deben ser qumicamente puros y adecuados para propsitos bacteriolgicos.

AGAR.-

Producto gelatinoso obtenido de ciertas algas marinas. El agar que se emplea ya

sea granular o fragmentado ser de calidad bacteriolgica.

REACTIVOS GENERALES.-

Todos los reactives generales que se empleen como ingredientes en los medios de

cultivo deben ser de grado CS o de calidad analtica.

COLORANTES.-

Para la preparacin de los medios solo se deben emplear colorantes certificados

A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio capaz de permitir el

crecimiento de muchas bacterias hetertrofas.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS.

Aunque muchos de los hetertrofos se desarrollan muy bien en agar nutritivo, otros

no crecen bien porque necesitan nutrientes especficos por ejemplo; vitaminas,

factores de crecimiento etc.

A los medios de cultivo se les puede clasificar de la siguiente manera:

1. Medos Comunes: Tienen los componentes esenciales y destinan para cultivar

la mayora de la bacteria, por ejemplo: Agua peptonada, Agua comn, Caldo

nutritivo, Agar nutritivo, Gelatina, etc.

2. Medios especiales:

Son aquellas que se forman a partir de un medio basal o comn. Al que se le

aade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada y pueden ser:

Medios Enriquecidos

Cuando se le adiciona sustancia de mayor poder nutritivo como: huevos,

extracto de levadura, sangre, vitaminas etc.

Sirven para cultivar microorganismos exigentes en sus necesidades

NUTRICIONALES,

Ejm.:

- Agar Sangre.- Cuando un medio basal o comn se le aade entre 5 a

10 % de sangre (la mayora de bacterias patgenas).

- Agar Ogawa o Lowenstein.- Jensen (bacilo de Koch).

- Agar Chocolate.- Cuando el agar sangre se calienta entre 60-80C

hasta que tome un color chocolate (gonococos y meningococos).

- Caldo Cerebro, Corazn (Brain, Heart Infusin, BHI), microorganismos

exigentes.

- Caldo de carne+Hemina y vitamina K (microorganismos anaerobios

exigentes).

Medios Selectivos:

Que tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de una bacteria y al mismo

tiempo inhibe el desarrollo de otras, para este fin se adicionan sustancias

de efectos conocidos llamados INHIBIDORES (sal, colorantes, sales

biliares o antibiticos).

Estos medios son llamados tambin MEDIOS DE AISLAMIENTO:

- Agar Mac Conkey (E. coli y otras enterobacterias)

- Agar Cetrimide (Pseudonomas).

- Agar Manitol Salado. (Estafilococos)

- Agar Mitis Salivarius (Streptococos orales)

- Agar Clindamicina (Eikenella corrodens)

- Agar GMC (gelatina, metronidazol y cadmio), sirve para el aislamiento

de Actinomyces viscosus, A. naeslundii y A. odontolyticus.

- Agar TCBS(Vibrio cholerae)

- Agar Sabouraud (Hongos)

Medios Diferenciales:

Son los que nos permiten evidenciar las actividades bioqumicas de un

microorganismo, frente a un sustrato determinado, cambiando sus

caractersticas observables; esto gracias a los indicadores de pH que tienen

estos medios.

Ejm.

- Medio Ox-Ferm.- (Oxidacin - Fermentacin).

- Citrato de Simons (determinar el uso de citrato como fuente de carbono)

- TSI (triple azcar hierro) (determinar uso de: lactosa y glucosa)y

adems la produccin de H2S

- LIA (lisina agar - determinar el metabolismo de lisina).

- Agar Manitol Salado. (determina uso del manitol)

- Agar Urea

- Agar SIM.

Medios de Transporte:

Son medios de cultivo especiales, que permiten mantener viables a las

bacterias, mientras son conducidas a los laboratorios, desde el lugar de

toma de muestra.

Ejm.:

- Medio Cary Blair

- Medio Stuart

- Medio Amies

- Caldo Hajna

A veces se combina las caractersticas de cada uno de estos medios y por

lo tanto el medio resultante ser enriquecido, selectivo diferencial.

La divisin planteada no es rgida, sino por el contrario flexible y didcticas.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO MATERIALES:

- Agar comn deshitratado

- Placas petri

- Tubos de ensayo

- Mechero

- Algodn

- Matraces o balones

- Cocina elctrica

- Plumn marcador

PROCEDIMIENTO

1. Pesar las sustancias indicadas en los medios respectivos calculando

en relacin con los volmenes requeridos.

2. Disolverlas en la cantidad de agua necesaria y hervir en un matraz.

3. Esterilizar en el autoclave a 121C por 15

4. Repartir en tubos o placas siempre en ambiente estril (frente a un

mechero)

5. Se comprueba la esterilidad de los medios, colocndolos en una estufa

a 37C por 24 horas.

SEGUNDA SEMANA

PRACTICA No. 3 Y 2

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

1. OBJETIVOS:

Ensear al estudiante de Estomatologa, la manuabilidad y las tcnicas necesarias

para sembrar diferentes muestras procedentes de la cavidad bucal en medios de

cultivo.

2. INTRODUCCION:

La siembra es uno de los pasos principales e iniciales en el estudio completo de

un microorganismo dado; por lo tanto es indispensable ejecutarlo correctamente.

(Teniendo en cuenta las mximas condiciones de esterilidad, desde la toma de

muestra hasta la accin misma del sembrado. Efectuar la siembra a la brevedad

posible).

Es necesario precisar algunos trminos:

SIEMBRA: Es la accin de trasladar las bacterias de un medio natural y ponerlas

en contacto con un medio artificial como es el medio de cultivo. Si el medio es

slido se formarn colonias y si el medio es lquido se observar: turbidez,

sedimento, pelcula o flculo, etc.,

RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Permite lograr la pureza de un cultivo, consiste

en extraer con el asa de kolle o aguja de kolle una fraccin de colonia y sembrarla

en un medio lquido o slido.

TRASPLANTE O REPICAJE: Significa la separacin primaria de la cepa a un

medio de cultivo apropiado que puede ser lquido o slido contenido en un tubo.

Conservndose la cepa pura y por subsiguientes transplantes en medios

especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas, dando

como resultado la identificacin especfica de aquella.

Los transplantes se pueden realizar:

a. De lquido a slido.

b. De lquido a lquido.

c. De slido a lquido.

d. De slido a slido

COLONIA: Conjunto de microorganismos que crecen en un medio slido, y

que est constituido por un mismo tipo de bacterias.

CULTIVO PURO: Es aquel que consta de una sola especie bacteriana a partir

de sta se estudia sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas.

CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonoma

correspondiente, gracias a los mtodos de identificacin bacteriana

bioqumicos serolgicos o genticos.

MUESTRAS BIOLOGICAS: Las muestras biolgicas pueden proceder de

diferentes parte del organismo humano y pueden ser: sangre, orina, esputo,

heces, lquido cefaloraquideo, uas, pelos, piel, fluido gingival, placa dental,

saliva, abcesos, etc.

MATERIALES:

- Medio de agar nutritivo (en placas y tubos)

- Caldo nutritivo Asa de kolle

- Mechero

- Hisopos

- Lmina portaobjetos

- Aguja de Kolle

- Solucin salina fisiolgica

- Tubos de prueba.

PROCEDIMIENTO:

Las modalidades de siembra varan segn los medios que se usan (puede ser

medios lquidos o slidos). Si el medio es lquido bastar tocar la superficie de

ste con el inculo, si l medio es slido puede ser por estras, por puntura, por

diseminacin, por agotamiento o por incorporacin.

SIEMBRA POR INOCULACION: Con el asa de siembra previamente esterilizada

tomar una cantidad suficiente de inculo y ponerla en contacto con el medio

lquido.

SIEMBRA POR ESTRIA: Deslizar suavemente en zigzag el asa sobre la

superficie del medio slido ya sea en petri o en plano inclinado de un tubo. (Es til

para el estudio bioqumico y desarrollo bacteriano).

SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA: Consiste en tomar una pequea

cantidad de la muestra, con la aguja de kolle y sembrar introduciendo la aguja

hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio slido. (Esta modalidad es

utilizada por ver el comportamiento bioqumico de las bacterias).

SIEMBRA POR INCORPORACIN: Consiste en diluir la muestra y aadir el

medio de cultivo licuado y enfriado a 45C, repartir esta mezcla en placas petri,

dejar enfriar sembrar e incubar. (Sirve para el recuento de bacterias y ver si son

anaerbicas facultativas o microaerofilas).

SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O DISPERSION: Consiste en repartir el inculo

sobre la superficie del medio slido en zig zag en 3 o 4 campos de la placa o por

estriado simple en toda la placa. Es til para obtener colonias aisladas.

RECOMENDACIONES:

Una vez realizado la siembra con la modalidad adecuada se debe incubar en

la estufa a 37C por 24 horas al cabo de los cuales se hace la lectura

correspondiente.

En la estufa, las placas deben quedar con las tapas hacia abajo para que el

agua de condensacin desprendida por el calor de la estufa, no malogre la

siembra.

El asa se esteriliza antes y despus del uso.

La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volverlos a tapar.

Todas las manipulaciones de siembra, se realizan frente a una llama de un

mechero de alcohol o de gas.

Los tubos y las placas se marcan con un plumn de tinta indeleble poniendo

nombre, fecha u otros datos de importancia.

TERCERA SEMANA

PRACTICA N 4

LECTURA E INTERPRETACION DE LAS COLONIAS

1. OBJETIVOS:

Reconocer los diversos tipos de crecimiento bacteriano en medios lquidos y

slidos.

Relacionar las caractersticas del crecimiento bacteriano con los microorganismos

Probables, para llegar a su identificacin final.

2. INTRODUCCION:

Si ha seguido bien las instrucciones podr visualizar sobre algunos planos del

medio, definidas masas microbianas separadas entre s, llamadas colonias en

medio slido, y turbidez, pelcula o flculo, en medio lquido.

Cada colonia es resultado de la multiplicacin logartmica de una clula bacteriana

depositada en un punto del medio slido que en condiciones ptimas de

crecimiento forman su progenie con sus caractersticas de especie o de grupo.

Estas caractersticas de crecimiento nos ayudarn en la identificacin de las

bacterias.

3. MATERIALES:

- Cultivos en placas petri, sembradas por estras o por diseminacin o cualquier

modalidad

- Cultivos en medio diferenciales de microorganismos diversos

- Asas de siembra, lpiz, gradilla

- Set de Coloracin Gram

- Microscopio y aceite de cedro.

4. PROCEDIMIENTO:

1. Realice las lecturas de las colonias desarrolladas en placas y/o tubos

describiendo sus principales caractersticas morfolgicas.

2. Realizar las lecturas en medio lquido, determinando la forma de crecimiento,

formacin de pelcula, floculacin, turbidez, sedimentacin y olor (que puede

ser aromtico o fecaloide).

Describir las principales caractersticas morfolgicas de las colonias en medio

slido, teniendo en cuenta los siguientes aspectos:

a. Tamao: medir el dimetro de la colonia en mm

b. Forma: redondeada, esfrica, ovalada, irregulares, en roco, ameboide,

rizoide.

c. Elevacin: Plana, convexa, crateriforme, umbilicada, cnica, papilada.

d. Superficie: lisa, rugosa, granular, escamosa, en ondas.

e. Borde: entero, filamentoso, aserrado, irregular, ondulado.

f. Consistencia: cremosa, membranosa, gomosa o mucosa.

g. Cromognesis: pigmentos de color amarillo, anaranjado, violeta, azul, rojo,

verde.

h. Grado de transparencia: transparente, translcido, opaco.

C. Radiaciones

Afectan el crecimiento y desarrollo bacteriano.

a) Rayos Infrarrojos: efecto y accin calorfica.

b) Rayos Ultravioleta: el efecto depende -d9Jj intensidad y distancia al

foco.

c) Rayos ionizantes: rayos x y rayos 8, penetran ms que rayos

ultravioletas; e ioniza tomos inactivando enzimas y genoma

bacteriano.

Uso: esterilizar jeringas descartables, catteres endovenosos,

medicamentos (hormonas, vitaminas, antibiticos), prtesis)

AGENTES QUMICOS

Tienen dos tipos de actividad segn su concentracin: bacteriostticos o

bactericidas a altas concentraciones.

Segn el mecanismo de accin, pueden afectar las siguientes estructuras

bacterianas.

Membranas Citoplasmticas y Pared Celular

Mecanismo: alteracin. Sntesis de pared.

- Se combina con lpidos (agentes tensoactivos: detergentes).

- Altera mecanismo de transporte activo y accin osmtica.

- Accin corrosiva (cidos y lcalis)

- Inhibe cadena transportadora de electrones (hexaclorofeno)

Protenas y Enzimas

Mecanismo: coagulacin y desnaturalizacin de protenas del citoplasma

a. Sales de metales pesados.

Mercurio: Mercuriocromo

Merthiolate

Plata: Nitrato de plata

Sulfato de cobre

Alcohol: isoproplico, benzlico, etlico, glicoles y etilenglicoles, xido

de etileno.

Fenoles: fenol, timol, crisoles, hexaclorofeno.

b. Txico sobre enzimas: por oxidacin radicales libres oxidantes.

Halgenos: cloro y derivados

- Leja, hipocloritos

- Lodo y derivados

Otros: H2O2

- Permanganato de potasio

c. Alteracin del ncleo: alteracin de los genes por combinarse con

grupos sulfricos o nucleoprotenas.

Aldehidos:

- Formol

- Agentes alquilantes

CUARTA SEMANA

PRACTICA No. 5

COLORANTES Y COLORACIONES

1. OBJETIVOS:

1. Que el estudiante conozca los colorantes y las principales tcnicas de

coloracin utilizadas en Bacteriologa.

2. Estudiarla morfologa y las estructuras bacterianas.

2. INTRODUCCION:

El uso de los colorantes nos permite ver las estructuras bacterianas. Existen 2

coloraciones diferenciales importantes en Microbiologa una de ellas es la

coloracin Gram y la otra es la: Ziehl Neelsen. La primera se utiliza con carcter

taxonmico porque nos permite clasificar a las bacterias en Gram Positivas (color

violeta) y Gram negativas (color rojo). La coloracin Ziehl Neelsen nos permite la

observacin del Mycobacterium tuberculosis, M. Leprae y otras Mycobacterias.

3. COLORANTES

3.1 Por su naturaleza: se clasifican en colorantes naturales y artificiales.

3.1.1. Los colorantes naturales: pueden ser de origen animal y vegetal.

Por ejemplo: El Carmn es obtenido de la cochinilla; la hematoxilina

y el tornasol que son obtenidas de las plantas.

3.1.2. Los colorantes artificiales o sintticos: son obtenidos como derivados

del carbn de piedra o hulla y son conocidos como anilinas (azul de

metileno, safranina, violeta de genciana, etc.)

3.2 Por su afinidad tintorial: De acuerdo al comportamiento qumico del colorante

se clasifica en:

a. Colorantes cidos

b. Colorantes bsicos

c. Colorantes neutros

a) Colorantes cidos: Se dice que un colorante es cido o aninico, cuando

la parte bsica o catinica es incolora y la parte cida o aninico es

coloreada y tiene afinidad por el citoplasma. Ejemplo: Acido pcrico,

Fucsina cida, Eosina, etc.

b) Colorantes bsicos: Son colorantes catinicos los que tienen la parte

bsica o catinica coloreada y la parte cida o aninica incolora, tienen

afinidad por el ncleo. Ejemplo: Cristal violeta, Violeta de genciana,

Fucsina bsica, Hematoxilina, Tionina, etc.

c) Colorantes neutros: Son aquellos que tienen la parte cida y bsica

coloreada y tien al ncleo de un color y al citoplasma de otro color.

Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright, Eosinato azul de metileno, etc.

4. TINCION:

El proceso de tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre

colorantes y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula.

4.1 Tipos de coloracin

Existen 2 tipos de coloracin: Simple y Compuesta o combinada.

4.1.1.1 Simple: cuando se utiliza un solo colorante. Ejemplo: Azul de metileno.

4.1.1.2 Compuesta: donde se usa ms de un colorante, generalmente dos.

Ejemplo: Coloracin Gram y Coloracin Ziehl-Neelsen.

4.2 Coloracin diferencial

Son procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto diferencias entre

clulas bacterianas o partes de la estructura bacteriana, siendo las ms

conocidas:

4.2.1.1 Coloracin Gram: que permite la clasificacin de las bacterias en

Gram (+) de color violeta y las Gram (-) de color rojo.

4.2.1.2 Coloracin Ziehl-Neelsen: Para grmenes cido-alcohol resistentes

como las mycobacterias las que producen enfermedades como la

tuberculosis y la lepra.

5. PASOS GENERALES DE UNA COLORACION:

a) Extensin.- Consiste en colocar sobre una lmina portaobjetos la muestra

extendindola uniformemente.

b) Fijacin.- Fijar la muestra sobre la lmina portaobjeto utilizando alcohol o ter o

flameando suavemente sobre el mechero o dejarlo simplemente al medio

ambiente.

c) Tincin.- Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad

por un tiempo determinado.

d) Lavado.- Lavar utilizando un chorro suave de agua

e) Secado.- Dejar secar la lmina al calor del mechero

f) Observacin.- Observar utilizando aceite de cedro con el objetivo de inmersin.

6. MATERIALES:

Lminas portaobjetos

Mechero

Aceite de inmersin

Microscopio compuesto Set para coloracin GRAM:

a) Cristal violeta

b) Lugol

c) Alcohol acetona

d) Safranina.

7. ESQUEMA DE LA PRACTICA:

Utilizar para el desarrollo de esta prctica, como material para colorear frotices de

placa dental, raspado de mucosa bucal, saliva; etc.

Seguir los pasos de la coloracin GRAM y observar con objetivo de inmersin

anotando la morfologa, la coloracin y la agrupacin de los grmenes.

COLORACION GRAM: Creada por Christian Gram (1884-1886)

Procedimiento:

a) Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de cristal violeta. Dejar por 2 o 3 minutos

b) Lave suavemente y cubra con solucin de lugol dejando actuar el mordiente

durante 1 o 2 minutos.

c) Lavar y decolorar con alcohol acetona

d) Lavar y cubrir con safranina por 30 segundos o por 1 minuto.

e) Lave, seque y observe, adicionando aceite 'de cedro o aceite de inmersin.

Al final de la coloracin los grmenes pueden quedar teidos de violeta o rojo; las

bacterias que toman color violeta se llaman GRAM (+) y las que toman color rojo

se llaman GRAM (-).

Los grmenes GRAM (+) son los que por accin del lugol consiguen una mayor

fijacin del cristal violeta. .

En trminos generales son GRAM (+) todos los cocos excepto las Neisserias y

Veillonellas, todos los bacilos son GRAM (-) a excepcin de los esporulados

gneros: (Clostridium Bacillus) Lactobacillus, Actinomyces, Bacterionema, etc.

COLORACION ZIEHL - NEELSEN (BK):

1. Preparar frotis

2. Cubrir ntegramente con el colorante fucsina fenolada

3. Calentar a la llama hasta desprendimiento de vapores, por tres veces

consecutivas sin llegar a ebullicin.

4. Lavar intensamente a chorro de agua

5. S. Decolorar con alcohol-cido. lavar

6. Colorear con azul de metileno por 30 seg.

Los grmenes que retienen el color rojo a pesar de la decoloracin con el alcohol

cido son los llamados cido alcohol resistente (a.a.r.) y destacan en un fondo de

color azul, cuando se usa el azul de metileno.

Aquellos grmenes no cido alcohol resistente ceden su color al decolorante

alcohol cido y al quedar desprovistos de coloracin tienen aptitud para tomar el

colorante de fondo (azul).

Por lo tanto las mycobacterias se observaran de color rojo o rosado y las que no lo

son (Streptococos, Stafilococo y otros bacilos) se tien de color azul.

COLORACIONES ESPECIALES:

Utilizadas para teir estructuras bacterianas especiales

a. WIRTZ para observar esporas bacterianas

b. SCHAEFFER-FULTON: Para observar esporas bacterianas

c. MANEVAL: para ver cpsulas

d. ANTHONY-WELCH: para ver cpsulas

e. Coloracin de Tinta China o Nigrosina: Para ver cpsulas

f. ALBERTI Para ver grnulos metacromticos

g. LEIFSON: para ver flagelos

h. CASARES-GIL: Para ver flagelos

i. FEULGEN: Para observar regin nuclear

QUINTA SEMANA

EXAMEN PARCIAL PRCTICO

SEXTA SEMANA

PRACTICA N 6

ANTIBIOGRAMA: KIRBY BAUER

Incluir 4 o 5 colonias de microorganismos en estudio en 5ml de TSB o Mueller Hinton Broth.

Diluir el inculo con SSF estril, hasta encontrar el STANDARD DE TURBIDEZ

Introducir un hispo estril en el cultivo y exprimir el exceso del lquido, rotando el algodn

contra la pared del tubo.

Sembrar las placas de TSA o Mueller Hinton Agar por estras en tres diferentes

direcciones. Dejar que el inculo seque durante 5 minutos por lo menos y 20 minutos

como mximo

Distribuir los discos de sensibilidad sobre la superficie del agar. Se presionan suavemente los

discos sobre la superficie del medio empleando pinzas estriles. La distancia entre disco y

disco debe ser no menor de 15 cm.

INCUBAR A 37 X 24 h

LECTURA DE LAS ZONAS DE INHIBICIN

(Medir los halos en mm)

SENSIBLES INTERMEDIO RESISTENTE

Nota: La sensibilidad o resistencia de las bacterias, est expresada en las TABLAS DE

INTERPRETACION de las zonas de inhibicin, que es imprescindible consultar cuando se

realiza la lectura de un antibiograma.

Agente antimicrobiano Cdigo Concentracin Resistente Intermedio Sensible

AMIKACINA MK-AK 30 g 14 15 - 16

AMOXICILINA /AC CLAVULANIC AM ESTAFILOCOCOS 20/10 g 19 AMPICILINA GRAM NEGATIVOS 10 g 11 12 -13

ESTAFILOCOCOS 10 g 28 ESTREPTOCOCOS 10 g 21 AGUMENTIN - ESTAFILOCOCOS 20/10 g 19 CARBENICILINA PSEUDOMONAS CB 100 g 17 18 - 22

CEFAMANDOL MA 30 g 14 15 - 17

CEFAZOLINAS CZ 30 g 14 15 - 17

CEFACLOR CEC-CC 30 g 14 15 - 17

CEFALOTINA CF 30 g 14 15 - 17

CEFOPERAZONA CFP 75 g 15 16 - 20

FECOTAXIMA CTX 30 g 14 15 - 22

CEFOXITINA FOX-CFT 30 g 14 15 - 17

CEFTRIAXONA CRO 30 g 13 14 - 20

CEFUROXINA RBA 30 g 14 15 - 17

CINOXACINA CIN 100 g 14 15 - 18

CIPROFLOXACINO CIP 5 g 15 16 - 20

CLINDAMICINA CM-DA 2 g 14 15 - 16

CKORANFENICL C 30 g 12 13 - 17

DOXICICLINA D 30 g 12 13 - 15

ERITROMICINA E 15 g 13 14 - 17

GENTAMICINA GM-GE 10 g 12 13 - 14

IMIPENEM IPM-LDP 10 g 13 14 - 15

KANAMICINA K 30 g 13 14 - 17

METICILINA - ESTAFILOCOCOS ME 5 g 9 10 - 13

MINOCICLINA MI 30 g 14 15 - 18

NAFCILINA - ESTAFILOCOCOS NF 1 g 10 11 - 12

ACIDO NALIDIXICO NAL 30. g 13 14 - 18

NITROFURANTOINA FD 300 g 14 15 - 16

NORFLOXACINA NOR 10 g 12 13 - 16

OXACILINA - ESTAFILOCOCOS AO 1 g 10 11 - 12

PENICILINA G - NEUMOCOCOS P 1 g 19 -

ESTAFILOCOCOS 10U 28 -

N. Gonorrhoeae 10U 19 -

SULFONAMIDAS G 250 g 12 13 - 16

TETRACICLINA T 30 g 14 15 - 18

TOBRAMICINA NN 10 g 12 13 - 14

TRIMETOPRIMA TMP 5 g 10 11 - 15

TRIMETOPRIMA + SULFAMETOXAZOL SXT

70 g

23.75 g 10 11 - 15

VANCOMICINA V 30 g 9 10 - 11

SEPTIMA SEMANA

PRACTICA N 7

INMUNOLOGIA

FAGOCITOSIS IN VIVO E IN VITRO

INTRODUCCION

Si un agente agresor vence las barreras naturales de la inmunidad, un segundo

mecanismo de defensa entra en actividad: LA FAGOCITOSIS.

La FAGOCITOSIS, es una forma de defensa que puede ser medida por una variedad

de clulas asociadas con el sistema sanguneo, siendo los ms importases, los

neutrfilos polimorfonucleares y macrfagos, tanto fijos como circulantes, ambos tipos

de clulas son extradas a los lugares de infeccin o dao tisular por una serie de

factores quimiotcticos solubles, lo que vendra a constituir el primer paso dentro de

todo el proceso fagocitario.

Una vez que las clulas fagocitarias llegan al lugar donde se encuentra el agente

extrao, entra en contacto con l, mediante una actividad mecnica u opsnica. El

paso siguiente es la ingestin del antgeno y la consecuente formacin de los

FAGOSOMAS, que son vesculas delimitadas por la membrana celular que se van a

internar en el citoplasma. Los granos celulares adquieren gran movilidad y se

aproximarn al fagosoma, depositando en su interior su contenido corla consecuente y

final digestin del antgeno.

El estudio de la fagocitosis es importante pues permite en casos, determinar

deficiencias en los mecanismos de defensa a travs de:

1. ndice de fagocitosis

Que se realiza, colocando en una suspensin de leucocitos frescos de

partculas inertes.

Despus de un periodo de incubacin, se observan las propiedades

Polimorfonucleares, que tienen en su interior partculas fagocitadas.

2. La actividad bactericida

Que se efecta en forma similar a la anterior, pero en lugar de partculas

inertes, se colocan en suspensin bacterias y posteriormente con tcnicas de

cultivo se establece la propiedad de bacterias destruidas por las lizosimas de

los fagosomas de los leucocitos.

RESULTADOS

OBSERVACIONES 10' 20' 30'

N de bacterias fagocitadas

FAGOCITOSIS IN VIVO

MATERIALES Y METODOS

- Cultivo en caldo de Escherichia coli (24 horas)

- Cultivo en caldo de Escherichia coli (calentado)

- Ratones

- Estuche de diseccin

- Lminas portaobjetos

- Jeringa de tuberculina

- Torradas de algodn

- Agujas N 25 de

- Cmara de ter

- Colorante Wright

- Agua tamponada

- Alcohol yodado

PROCEDIMIENTO

1. Inocular un ratn albino, 0,5 ml de un cultivo de Escherichia coli calentado por 10' a

80C, por va intraperitoneal.

2. Dejar el ratn en reposo por una semana, controlndole peridicamente.

3. Dos horas antes de la prueba, el ratn que ha sido previamente inoculado, inyectar

por va intraperitoneal 0,5 ml de cultivo en caldo de Escherichia coli, ajustando al

tubo N 3 de escala de Mac Farland

4. Hacer una inoculacin igual a otro ratn, al que no ha sido inoculado previamente.

Otro servir de control.

SHOCK ANAFILACTICO

INTRODUCCIN

La anafilaxia es una forma especial de hipersensibilidad que puede ser provocado

artificialmente en animales de experimentacin. En la produccin de anafilaxia siempre

intervienen sustancias denominadas sensibilizantes o anafilactgenos que despus de

un periodo, de incubacin colocan al organismo en condicin de reaccionar de manera

especial cuando estas mismas sustancias son inyectadas nuevamente. A esta

segunda inyeccin (dosis desencadenarte) la reaccin es tumultuosa c. inmediata de

un conjunto de sntomas que se denomina SHOCK ANAFILCTICO. Este representa

el grado mximo de los fenmenos de hipersensibilidad.

OBJETIVOS

Que el alumno conozca una de las formas ms generalizadas de hipersensibilidad.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES

- Albmina de huevo 1/100

- Albmina bovina 1/100

- Conejos

- Jeringas

- Agujas hipodrmicas

- Alcohol

- Algodn

PROCEDIMIENTO

PREPARACIN PRELIMINAR (dosis sensibilizante)

a) Tomar 3 conejos y marcarlos con las letras A, B y C

b) Inyectar por va intraperitoneal 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A,

repetir esta operacin con el conejo B usando 1 ml de albmina bovina y no

inyectar al conejo C.

DOSIS DESENCADENANTE

a) Despus de un lapso de 10 das a 3 semanas de la primera inyeccin inocular

va intracardiaca 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A y C inyectar 1 ml

de solucin de suero bovino al conejo B.

b) Observar las reacciones en los conejos.

OCTAVA SEMANA

PRCTICA N 8

REACCIONES SEROLGICAS

OBJETIVOS

Conocer las pruebas serolgicas de uso ms frecuente en el diagnstico de

enfermedades infecciosas en nuestro medio.

INTRODUCCIN

Las reacciones o pruebas serolgicas son reacciones antgeno anticuerpo que se

realizan in vitro. Estas pruebas sirven para detectar por ejemplo anticuerpos presentes

en el suero, para lo cual el antgeno debe ser conocido (prueba indirecta).

Si lo que se desea es encontrar antgenos, entonces los anticuerpos correspondientes

debern ser conocidos (prueba directa).

Estas reacciones pueden ser CUALITATIVAS 0. CUANTITATIVAS; las primeras

determinan presencia o ausencia de antgenos o de anticuerpos y las segundas

cuantifican los anticuerpos o antgenos. Este ltimo tipo es el que tiene mayor uso en

el diagnstico de enfermedades infecciosas.

El tipo de reaccin serolgica que se usa depende bsicamente del estado fsico del

antgeno con que se cuenta y/o de la enfermedad que se quiere diagnsticas.

Existen muchos tipos de-reacciones serolgicas, siendo los que a continuacin se

indican, los tipos ms usados.

A) AGLUTINACIN

Es la reaccin donde el antgeno, se caracteriza por ser celular, o particulado o forme

(g. No soluble) y que al unirse con su anticuerpo correspondiente forma grupos.

(Aglutinacin (+).

Este tipo reaccin se utiliza para diagnosticar serolgicamente algunas enfermedades

como la brucelosis, Tifoidea y otras; adems es muy usada en la determinacin de

grupos sanguneos.

B) PRECIPITACIN

Es una reaccin antgeno anticuerpo, y se caracteriza porque el antgeno est en

solucin (Ag soluble) y cuando se encuentra con su anticuerpo especfico se forma

una zona o anillo de precipitacin.

Este tipo de reaccin se usa:

a) Determinacin en el laboratorio de enfermedades como la sfilis (VDRL) a esta

prueba tambin se le llama de floculacin, tambin es til para el diagnstico de

CARBUNCO o NTRAX, de HIDATIDOSIS etc.

b) Tambin se usa este tipo de reaccin para la identificacin de sangre u lquido

seminal en manchas de ropa, armas y otros con fines mdicos legales.

c) Otro de los fines de esta reaccin de descubrir adulteraciones de alimentos, por

ejemplo carne (vender carne de equino por carne de vacuno).

NOVENA SEMANA

PRCTICA N 9 Y 10

BACTERIOLOGA: ESTREPTOCOCOS

1. OBJETIVOS

Que el alumno conozca las caractersticas morfolgicas, de tincin, de cultivo,

serolgicas y antgenas de este grupo bacteriano.

2. INTRODUCCIN

Los estreptococos son bacterias de forma esfrica de ah su nombre de cocos, se

presentan agrupados en cadenas pares, algunas especies son anaerobias

estrictas como los peptococos y los peptoestreptococos, las dems especies son

anaerobias facultativas. Son Gram +, fermentan los carbohidratos produciendo

CO2 + cidos (lctico y pirvico) y ATP; algunos son pigenos y todos con catalasa

(-).

Los estreptococos se clasifican teniendo en cuenta diversos criterios; 2 de los ms

importantes son:

a. Por el grado de hemlisis que producen

- Alfa hemlisis o hemlisis parcial (halos verdes) Ejs. Estreptococos del grupo

viridans, Estreptococo pneumoniae,

- Beta hemlisis o hemlisis completa (halos transparentes) Ejs. S. Pyogenes, S.

Agalactiae.

- Gamma hemolisis (no existe hemolisis) Ejs. S. Bovis.

b. De acuerdo al carbohidrato "C" de su pared celular

Lancefield (Dra. Rebeca Lancefield)

Los estreptocosos se clasifican en 22 grupos serolgicos de la A a la W

(excepto I. J, LL, )

ESTREPTOCOCOS DE INTERS MDICO

Especies Grupo

lancefield

Tipo de

hemlisis Enfermedad que originan

S. pyogenes A Beta Faringitis, fiebre reumtica,

glomerulonefritis, erisipela

S. agalactiae B Beta Fiebre puerperal, septicemia,

faringitis, piodermia, meningitis

y neumona del recin nacido.

S. Grupo C-G C y G Beta Sinusitis, bacteremia,

endocarditis.

S. Faecalis D Alfa Infecciones del tracto urinario y

biliar.

S. del grupo

Viridans

H

Alfa

Endocarditis, caries,

enfermedades

periodontolgicas.

S. pneumoniae - Alfa

Neumona, sinusitis, otitis

media

DIAGNSTICO DE LABORATORIO

Muestras

Secrecin faringea (hisopado faringeo), esputo, material purulento, sangre, orina,

heces, etc.

Coloracin

GRAM +

Microscopa

Cocos dispuestos en cadenas

Cultivo

Se utiliza comnmente agar sangre (bacterias exigentes) para determinar el tipo de

hemlisis. Para aislar estreptococos bucales, se usa en el medio Agar mitis salivarius.

(Se utiliza las pruebas bioqumicas correspondientes para determinar las

especies).

Los antibiogramas son recomendados, una vez que han sido identificados los

estreptococos.

Serologa: Actualmente se utiliza la prueba de ELISA para identificar antgenos o

anticuerpos en algunas infecciones estreptoccicas.

Existe una prueba serolgica Ilamada Antiestreptolisina "O" (aeo; aso) para el

diagnstico de fiebre reumtica glomerulonegritis, (enfermedades de origen

estreptoccicas) y consiste en determinar cuantitativamente anticuerpos reaccin

contra el antgeno estreptolisina "O" de los estreptococos.

Una cantidad por encima de 160 - 200 unidades TODD indican una infeccin reciente

la faringitis, fiebre, reumtica o glomerulonefritis.

La prueba serolgica es indirecta y cuantitativa.

RECONOCIMIENTO BIOQUMICO DEL P. PNENUMONIAE

Prueba de la optoquina: Esta prueba demuestra la susceptibilidad del diplococcus

pneumoniae a la optoquina (reactivo cprico).

En una placa de agar sangre se siembra por diseminacin la muestra, luego

aspticamente se coloca con pinza el disco de optoquina y se incuba a 37C por 24

horas, la prueba es positiva si se forma un halo de inhibicin alrededor del disco mayor

de 14 mm.

NOVENA SEMANA

PRCTICA N 10 Y 9

BACTERIOLOGA: ESTAFILOCOCOS

1. OBJETIVOS

Reconocer los aspectos morfolgicos, fisiolgicos, tintoriales y de cultivo,

necesarios para la identificacin de este importante gnero bacteriano.

2. INTRODUCCIN

Los estafilococos, son cocos Gram+, generalmente muy pigenos, se presentan

dispuestos en racimos o en pequeos grupos, pueden ser aerbicos y

anaerbicos facultativos.

Desde el punto de vista clnico, los estafilococos patgenos dan lugar a la lesin

tpica como es el furnculo o absceso localizado, sin embargo, tambin pueden

diseminarse a travs de los vasos linfticos y sanguneos a diferentes regiones del

organismo, dando lugar a neumonas, meningitis, empiemas, endocartitis, etc.

Otros estafilococos de baja invasividad pueden dar lugar a procesos drmicos

tales como el acn y el imptigo.

Algunas cepas de estafilococos producen una enterotoxina causante de una

intoxicacin alimentaria de pocas horas de duracin (vmitos, diarreas) y con

ausencia de fiebre. Los estafilococos son beta hemolticos, catalasa + y slo el

staphylococcus aureus es coagulasa(+).

Una caracterstica importante a resaltar es que los estafilococos tienden a resistir

la accin de los antibiticos, especialmente de la penicilina (mediante mecanismos

genticos donde intervienen sus plsmidos, "R". Se puede determinar en el

laboratorio la resistencia a los antibiticos beta lactmicos usando como patrn la

meticilina u oxacilina.

Algunas especies de inters mdico:

Staphylococcus aureus (es la especie ms patgena) ocasiona bacteremia,

endocartitis, neumona, osteomielitis, meningitis.

S. Epidermitis (flora normal de la piel y vas respiratorias) ocasiona infecciones

drmicas (Acn)

S. Albus (flora normal bucal)

S. saprophyticus (flora vaginal)

MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIN EN

LABORATORIO

Muestras:

Material purulento, exudado de lesiones superficiales, sangre, hisopado traqueal,

LCR, abscesos periapicales, osteomielitis de maxilares, etc.)

Tambin se examinan los alimentos o bebidas (para buscar estafilococos

productores de enterotoxinas)

Coloracin

Gram +

Cultivo

Se utilizan frecuentemente:

1. Agar Manitol Salado (el medio se torna cido y degrada al manitol produciendo

una coloracin amarilla del medio, el estafilococo puede vivir en un medio

hipertnico como es el de este medio donde el alto contenido de Na CI (7.5 gr.)

inhibe a otros gneros bacterianos.

2. Agar sangre (para determinar la hemlisis)

3. TSB o TSA

PRUEBAS BIOQUMICAS PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE

ESTAFILOCOCOS:

Coagulasa: (prueba para determinar la pagotenidad del estafilococo)

En un tubo de ensayo se coloca plasma citratado de conejo al que se le aade un

cultivo de estafilococos, se incuba a 37C por 4 horas y luego se pueden leer los

siguientes resultaos: Si hay coagulacin del plasma Coagulasa + (presencia de S.

Aureus).

Si no hay coagulacin del plasma Coagulasa (presencia de otros estafilococos

diferentes a S. Aureus).

Catalasa:

En una lmina portaobjeto estril, se deja caer una gota de perxido de hidrgeno

(agua oxigenada) y con el asa de Kolle estril se transporta la muestra de

estafilococos, la que al ponerse en contacto con perxido, produce la inmediata

formacin de burbujas pues la enzima catalasa ha descompuesto al perxido en

agua y oxgeno naciente, segn frmula: "2H2O2 + catalasa 2H2 + O2"

Gelatinasa

En un tubo de prueba conteniendo gelatina se siembra por puncin o picadura con

el agua de Kolle una muestra de estafilococos, se lleva el tubo a incubacin a

37C por 24 horas, a la lectura se observar que se ha producido la licuefaccin

del medio en forma de cono invertido.

Ureasa:

Esta prueba nos permite determinar como un (en este caso el estafilococo)

microorganismo es capaz de descomponer la molcula de urea (NH2 CO-NH2)

por accin enzimtica generando 2 molculas de amoniaco y una de carbonato de

amoniaco las que aumenta el ph haciendo virar el indicador de rojo a fucsia o

grosella: ureasa (+)

REDUCCIN DE NITRATOS A NITRATOS (NO3 A NO2)

Esa reduccin se lleva a cabo con un ambiente anaerobio y cuando al cultivo

incubado las 24 horas se le agrega 2 reactivos (Caldo de cultivo) 1 gota de dimetil

naftilmina y 1 gota de cido sulfanilico.

La reaccin es positiva cuando hay un viraje de color amarillo a rojo en el punto de

contacto de los reactivos con el microorganismo.

DECIMA SEMANA

EXAMEN PARCIAL PRCTICO

DECIMA PRIMERA SEMANA

PRCTICA N 11

NEISSERIAS

OBJETIVO:

- Diferenciar el papel de las especies de Neisserias no patgenas y otras especies

de Neisserias patgenas para el ser humano,

- Identificacin de estos microorganismos mediante las diferentes tcnicas de

laboratorio.

INTRODUCCIN:

El gnero Neisseria constituye un grupo de microorganismos de inters odontolgico

ya que podemos encontrar considerable nmero de especies en la mucosa

orofarngea, adems que especies como N. gonorrhoeae puede producir lesiones a

nivel de la mucosa bucal.

Adems debemos considerar que la N. gonorroeae al patgeno ms frecuente de este

gnero puede producir lesiones a nivel bucal.

Las Neisserias son cocos gramnegativos que suelen encontrarse en pares(diplococos)

de aspecto arrionado de alrededor de 0,6 a 1,5micras, poco resistentes a las

condiciones ambientales, cuyos requerimientos nutricionales son algo exigentes y

requieren una temperatura ptima para su desarrollo de 37C. Son microaerfilas y

anaerobias facultativas.

La prueba de oxidasa es clave para la identificacin de estos microorganismos ya que

en forma general, todas las Neisserias producen oxidasa (oxidasa +); son no

esporulados ni presentan movilidad, adems que algunas especies pueden ser

capsuladas y presentar fimbrias. La mayora de Neisserias fermentan carbohidratos y

producen cidos, sin producir gas.

Tomando como referencia la patogenicidad las Neisserias pueden ser:

a. Neisserias de la flora bucal normal (no patgenas): forman parte de la microbiota

normal de la mucosa nasofarngea: N. flavescens, N. cinerea, N. elongata, N. sirca,

N. subflava, N. mucosa, N. lactamica.

b. Neisserias patgenas para el hombre:

- N. gonorrhoeae: agente etiolgico de la gonorrea.

- N. meningitidis: ageffle etiolgico de la meningitis.

N. gonorrhoeae y N. meningitidis se encuentran de manera tpica, relacionados

con leucocitos polimorfonucleares o dentro de los mismos. Gonococos y

meningococos tienen una homologa del DNA de 70%

DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE NEISSERIA GONORRHOEAE (Gonococo)

Muestras biolgicas:

Secreciones uretrales, secreciones de cuello uterino, recto, garganta, lquido sinovial,

conjuntiva; sangre (solo en infecciones generalizadas)

Microscopa:

Se pueden observar en el interior de los leucocitos polimorfonucleares(PMN)

diplococos gramnegativos; esta prueba tiene una sensibilidad del 90%, especialmente

si la muestra es un exudado uretral del varn. Por el contrario, la sensibilidad de esta

prueba se reduce al 50% si la muestra es del cuello uterino. En las mujeres, cuyo

exudado uretral d resultados negativos, es necesario efectuar los cultivos.

N. gonorrhoeae en el interior de

Leucocitos PMN a partir de un

Frotis cervical

Cultivo:

Por lo general, se utilizan dos medios enriquecidos: Agar Thayer-Martn modificado y

Agar chocolate; en ambos casos a estos medios se les aade antimicrobianos que

actan inhibiendo la flora acompaante (Vancomicina, Anfotericina B, colistina y

Trimetoprim).

Despus de 48 horas de incubacin a 37C se observan colonias pequeas,

circulares, transparentes o ligeramente grises de bordes enteros o ligeramente

festoneados de 1-4mm de dimetro.

Serologa:

No es usual realizar pruebas serolgicas debido a que los gonococos poseen

diversidad de antgenos, los anticuerpos son lentos en aparecer y pueden estar

presentes en personas no enfermas de gonorrea.

Pruebas bioqumicas:

- Reaccin de la oxidasa: todas las especies de Neisserias, producen la

enzima oxidasa, que cuando se encuentra en presencia de oxgeno

atmosfrico, citocromo "C" y un reactivo oxidasa (tetra metil-para-

fenilendiamina 2 HCI al 1%) oxida al reactivo para formar un compuesto

coloreado.

Para la prctica, se embebe una tira de papel de filtro con el reactivo oxidasa,

luego se toma una azada de la muestra biolgica, se realiza el frotis de la

misma sobre el papel y se espera dos minutos. Si el color de la tira de papel se

oscurece es oxidasa (+), pero si el papel no cambia de color, la prueba es

oxidasa negativa.

- Degradacin de carbohidratos: N. gonorrhoeae no fermenta maltosa, pero si

degrada glucosa.

DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE NEISSERIA MININGITIDIS

(Meningococo)

Muestras biolgicas:

Lquido cefalorraqudeo (LCR), sangre (para hemocultivo), hisopado nasofarngeo

(para investigar portadores).

Hisopado nasofarngeo

Microscopa:

Se pueden observar en el interior como en el exterior de los leucocitos

polimorfonucleares (PMN) diplococos gramnegativos.

Cultivo:

Se utilizan dos medios enriquecidos: Agar Thayer-Martin modificado y Agar

chocolate; en ambos medios se les aade antimicrobianos que actan inhibiendo

la flora acompaante (Vancomicina, Anfotericina B, colistina y Trimetoprim).

Despus de 48 horas de incubacin a 37C se observan colonias de 1 a 4 micras

de dimetro, opaco blanquecinas o ligeramente amarillentas de bordes irregulares.

Jarra de anaerobiosis que permite la

Incubacin en condiciones anoxignicas

(sin oxgeno)

DECIMO SEGUNDA SEMANA

PRACTICA N 12

MICOBACTERIAS: M. TUBERCULOSIS

1. OBJETIVO:

- Conocerlas principales caractersticas morfolgicos tintoriales y de cultivo

de Mycobacterias y especficamente de M. tuberculosis.

- Comprender los principales procedimientos de diagnstico de tuberculosis.

2. INTRODUCCIN:

Las micobacterias son bacterias bacilares finas, aerobias, no forman esporas,

caracterizadas porque su cubierta externa, es sumamente rica en cidos

grasos especialmente en cidos miclicos, lo que le confiere a estos bacilos

resistencia a la desecacin, a la coloracin y a muchos agentes qumicos.

Existen aproximadamente 50 especies de Mycobacterium, de las cuales 3 so-i

las ms prevalentes, produciendo enfermedad en humanos: M.t., M. leprae y

M. bovis y 11 o 12 son potencialmente patgenas entre las que destacan M.

avium y M. kansaii y pueden trasmitirse por agua, suelo, aves y otros animales

e infectan a personas inmunodeficientes.

Las especies de micobacterias de mayor inters mdico son dos:

- M. tuberculosis (descubierto en 1882 por el mdico alemn Dr. Roben

Koch). Son bacilos delgados, exigentes, es el agente etiolgico de la

Tuberculosis la que al principio afecta los pulmones para luego invadir otros

rganos como rin, piel, huesos, intestinos, etc. Los bacilos de la

Tuberculosis son resistentes a la desecacin y pueden vivir varios das en

aspectos secos.

- M. leprae (descubierto por el mdico Noruego Dr. Gerald Hansen 1873).

Este bacilo es el agente etiolgico de la Lepra, cuya localizacin es

bsicamente en la piel las mucosas, este bacilo no ha sido posible cultivarlo

en el laboratorio (in vitro); pero se puede inocular en las patas de los

armadillos (in vivo) donde se desarrolla una lepra lepromatosa.

El diagnstico de la enfermedad se realiza por aspecto clnico de las lesiones y

por la Microscopia de las muestras coloreadas con Ziehl Neelsen.

MATERIAL BIOLGICO

MUESTRAS:

- Esputo, lavado gstrico, lquido cefalorraqudeo, lquido articular,- orina y

biopsias de diversos tejidos.

- Previamente a su estudio, las muestras deben descontaminarse con NaOH,

neutralizarse y con un buffer concentrarse por centrifugacin.

PROCEDIMIENTOS:

Los procedimientos o mtodos de laboratorio ms usuales para diagnosticar

TBC son: La coloracin Ziehl-Neelsen (BK, baciloscopia o coloracin a.a.r), la

Prueba de Tuberculina y el cultivo.

COLORACIN Z.N.

Se realiza el frotis de la muestra y se procede a colorear con la tcnica descrita en

la Prctica 2. Cuando la muestra es orina o lavado micobacterias no patgenas

que pueden estar en tales muestras y las

Tambin es posible usar la microscopia por fluorescencia

La coloracin Z.N. Es el mtodo ms usado para diagnosticar tuberculosis en el

Per.

CARACTERSTICAS AL REALIZAR LA BACILOSCOPIA (BK)

a. Verificar la calidad y cantidad de expectoracin, debindose obtener una

muestra de volumen suficiente a 2 ml. Que contenga partculas slidas o

purulentas y no solamente saliva.

(La expectoracin proviene de una tos profunda y arrastra un fluido

mucopurulento proveniente del rbol respiratorio).

b. Para la preparacin del frotis: el lugar en donde existen mayores

probabilidades de encontrar bacilos es en las partculas slidas de la

expectoracin.

c. La lectura se realiza con el lente de inmersin, la misma que debe efectuarse

sistemticamente, empezando por la periferia y concluyendo en el centro.

d. El nmero de bacilos encontrados es muy importante como elemento de

informacin, dada su relacin con el grado de contagiosidad del paciente, as

como con la severidad de la enfermedad, por esta razn el examen no slo es

cualitativo sino eminentemente cuantitativo.

La lectura de la coloracin, se hace teniendo en cuenta el nmero de

microorganismos observados:

BK(+) 0-1 por campo, en 100 campos microscpicos

BK(++) = 1-9 por campo, en 50 campos microscpicos

BK(+++) = +10 por campo, en 20 campos microscpicos

e. La eliminacin de las lminas una vez ledas, ser en depsitos que contengan

mezcla sulfo-crmica.

CULTIVO

El medio de cultivo ms adecuado y ms usado en nuestro medio es el Lowenstein

Jensen. Tambin se est utilizando el medio Ogawa.

La bacteria requiere por lo menos de 15 das para presentar un desarrollo visible

macroscpicamente sobre el medio de cultivo y necesita hasta 8 semanas de

incubacin, debindose incubar un promedio de 30 das; sus colonias son de color

blanco cremoso, son secas rugosas opacas, polimorfas y de dimensiones variables.

Para identificar M. tuberculosis, se debe tener en cuenta la tasa de crecimiento, la

morfologa de las colonias, la pigmentacin y las pruebas bioqumicas, tales como la

reduccin de nitratos, ureasa, catalasa, niacina, arilsulfatosa, etc.

Es necesario mencionar que hay algunas micobacterias-cromgenas, producen

pigmento en luz, y en oscuridad, hecho que se considera un criterio de clasificacin.

En la actualidad las pruebas genticas representan uno de los mtodos ms sensibles

de identificacin de micobacterias.

Otro de los mtodos de identificacin es la CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA

RESOLUCIN; se basa en determinar tipos y cantidad de cidos micolicos, los que

varan de una especie a otra.

Los laboratorios especializados, realizan pruebas de susceptibilidad antibitica

(antibiograma) de las cepas aisladas y que ofrecen resistencia al tratamiento

convencional.

PRUEBA DE TUBERCULINA

- Inocular intradrmicamente en el antebrazo 0.1 ml. De PPD (derivado proteico

purificado) de Mycobacterias.

- Esperar 24-48 horas.

- Determinar la formacin de una ppula y medir su dimetro. Se mide > 10 mm.

Se considera la prueba (+).

NOTA: Esta es una prueba complementaria, por s sola no indica presencia de

enfermedad.

DECIMO TERCERA SEMANA

PRACTICA N 13

AISLAMIENTO DE ENTERO-PATOGENOS: COPROCULTIVO

Materiales:

- Medio de transporte: Cary y Blair (CB)

- Isopo

- Medio Mac Conkey (MC)

- Medio Desoxicolato citrato (DC)

- Caldo selenito (CS)

- Asa bacteriolgica en argolla

Procedimiento:

1. La muestra en el medio de transporte (CB) se sembrar segn indicaciones del

profesor de prcticas en los medios de aislamiento primaria. Para estas prcticas

se usar: el (MC) y el (DC).

2. Sembrar el medio de enriquecimiento (CS),. Siguiendo las indicaciones del

profesor.

3. Incubar a 37C por 24 horas.

Comentario:

Los enteropatgenos actan por invasividad, pudiendo llegar hasta la sangre. Tambin

lo hacen por toxigenicidad en ambos casos es posible el aislamiento del agente a

partir de las heces fecales. Sin embargo un solo medio o cultivo no es suficiente para

aislar todos los agentes de infecciones entricos, siendo necesario el uso de varios

medio de cultivo para el aislamiento primario y otros tantos para el aislamiento previo

enriquecimiento. En nuestras prcticas se incidir mayormente en

ENTEROBACTERIACEAE.

DIFERENCIACIN BIOQUIMICA

Materiales:

- Placas con colonias en (MC - DC)

- Tubos de TSI (5)

- Tubos de LIA (5)

- Papel para indol (5)

- Caldo selenito sembrado

- Placas con SS agar

- Asa en aguja

Procedimiento:

1. Estudiar las caractersticas de las colonias en los diferentes medios de cultivo.

2. Con el asa en aguja picar la colonia escogida y repicar por una sola vez en TSI

hasta el fondo y con el mismo inculo repicar por tercera vez en el espeso del

medio LIA hasta el fondo.

3. Colocar el papel para indol en el tubo de LIA.

4. Sembrar con el asa en argolla el medio S:S agar a partir del selenito.

5. Incubar a 37C por 18 24 horas.

Comentario:

La prueba bioqumica permite diferenciar a los patgenos de otros inocuos. Estas

pruebas son bsicas y previas al estudio o paso siguiente que son las pruebas

serolgicas.

El medio TSI tiene como sustrato: la glucosa (1%), lactosa (10%) adems se puede

leer la produccin de H2S y la produccin de gas a partir de los azcares usados. La

produccin o no de gas y de H2S en TSI pude dividir en dos grupos a las

ENTEROBACTERIACEAE. Segn el cuadro adjunto:

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE TSI:

Gas (+) Gas (-)

H2S (+) SALMONELLA

ARIZONA

EDWARDSIELLA

CITROBACTER

PROTEUS

SALMONELLA TYPHI

H2S(-) ECHERICHIA

ENTEROBACTER

KLEBSIELLA

PROVIDENCIA SERRATIA

SALMONELLA PARATI/A

SHIGELLA

YERSINIA

PROTEUS

PROVIDENCIA SERRATIA

ESCHERICHIA ENTEROBACTER

El medio LIA tiene como sustrato principal a la Lisina la cual puede ser desaminada,

descarboxilada o bien no ser lisada. Como sustrato diferencial este medio tiene

glucosa (1%). Segn estas indicaciones se puede observar las siguientes divisiones.

ESTUDIO DE BACILOS AEROBIOS ESPORULADOS: BACILLUS

A este gnero pertenecen microorganismos de forma bacilar, Gram + (positivo)

esporulados, que se agrupan en cadenas y que requiere O2 para su metabolismo; son

en su mayora saprofitos (B. cereus, B. subtilis), excepto el B. anthracis que es

patgeno para el hombre y animales. En la presente prctica se pondr en evidencia

los caracteres microscpicos (forma del bacilo, localizacin de las esporas), culturales,

presencia de hemlisis, accin sobre las protenas (gelatina), movilidad y accin sobre

el almidn.

A. OBSERVACION MICROSCOPICA: COLORACION DE GRAM Y WIRTZ

1. Tomar una muestra de espcimen clnico o cepa de Bacillus y hacer frotis en 2

lminas. Teir una de ellas con Gram y la otra con Verde Malaquita (col. De

Wirtz).

2. Secar las lminas y observar al microscopio con lente de Inmersin.

B. SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

Medios de cultivo a usarse: Agar Sangre, Medio SIM, Medio Gelatina, Agar

Almidn, 2 de cada uno.

Material: Cepas de B, anthracis y B. subtilis en caldo

Mechero, Asa de Kolle

Procedimiento:

1. Sembrar por estra las cepas de B. anthracis y B. subtilis en una de cada placa

de Agar Sangre y Agar Almidn.

2. Sembrar cada cepa, por puntura en el medio SIM, hace lo mismo con los tubos

del medio Gelatina.

3. Incubar a 37C por 24 horas, marcando previamente cada placa y tubo.

Resultados:

MEDIO BACILLUS anthracis BACILLUS subtilis

Agar Sangre

(Hemlisis)

Negativo, o Alfa

Leve

Beta

Agar almidn No hidroliza el

Almidn

Hidroliza del

Almidn

Gelatina No lica o lo hace

lentamente

Lica rpidamente

Medio SIM No Mvil

Pino invertido

Mvil

Nota: Para observar la hidrlisis del Almidn, dejar caer unas gotas de lugol sobre

la superficie de la placa con este medio, tratando de que se distribuya

regularmente. La zona del medio en la que no ha habido hidrlisis del almidn se

teir de azul, mientr4as que aquellas en que si ha ocurrido la hidrlisis se teir

de color marrn propio del lugol.

GENERO CORYNEBACTERIUM.-

Introduccin: Son bacilos Gram(+), no esporulados, Inmviles; algunas especies

forman parte de la flora normal del Sistema Respiratorio, piel, etc. La especie

patgena representativa de este gnero es el C. diphtheriae productora de una

poderosa exotoxina causante del cuadro clnico en el hombre.

El aspecto morfolgico es caracterstico, presentando forma alargada con

dilatacin de uno de sus extremos, en su interior se observan los grnulos

Metacromticos que son teidos intensamente por los colorantes bsicos. El

cultivo se realiza en el Medio de Suero Coagulado de Loeffer o en Gelosa Sangre

cistina-telurito en el cual se puede diferenciar los tres tipos de C. diphtheriae: Mitis,

Gravis e Intermedius.

Materiales: (observacin del crecimiento)

- Cepa de C. diphtheriae

- Placas con medio de cultivo

- Asa y mechero

Procedimiento

- Coger 2 azadas del caldo que contiene C. d. y sembrar en la placa por estras.

- Llevar a la incubadora por 24 hrs.

- Hacer la lectura para identificar las diferentes variedades al siguiente da.

Materiales: (Observacin morfolgica y grnulos metacromticos) Coloracin de

Gram y Albert.

- Cepas de C. Diptherae

- Lminas

- Azul de metileno

- Lugol

Procedimiento: (Col. De Albert para observar grnulos metacromticos)

- Fijar la muestra

- Cubrir la lmina con azul de metileno de 1 a 2 min.

- Lavar con agua corriente

- Aplicar lugol por 1 min.

- Lavar con agua

- Secar y observar a inmersin

- Haga otro frotis, colores con tincin de Gram para obs. morfologa.

GENERO CLOSTRIDIUM (BACILOS Anaerobios Esporulados)

Introduccin.- Son bacilos Gram (+) producen esporas, son anaerobios. Su hbitat

natural es el suelo o el intestino del hombre, existen especies saprofitas y otras

patgenas, dentro de estas ltimas tenemos:

C. Botulinum causa el Botulismo

C. tetani causa el Tetanos

C. perfringens causa la Gangrena gaseosa

Estos microorganismos para su crecimiento requieren de condiciones especiales

como es la ausencia de O2 (medio anaerobis), el cual puede lograrse utilizando la

cmara Brewer o el Gaspack y medio reductores como el caldo carne, o el empleo

de agentes reductores como el thioglicolato.

Para la observacin de la morfologa se debe tener presente la posicin de las

esporas en la diferentes especies antes mencionadas.

Materiales.- (Observacin del crecimiento)

- Cepa de Clostridium

- Tubos con caldo carne o thioglicolato

- Asa y mechero

Materiales.- (Observacin de la morfologa y esporas)

- Cepas de clostridium

- Colorante de verde de malaquita y safranina

- Asa y mechero

Procedimiento.- Coloracin Wirtz

- Fijar la muestra tomndola de la parte ms turbia del tubo.

- Agregar verde de malaquita y realizar 3 flameados en 5 min.

- Lavar a chorro lento

- Agregar colorante de contraste

- Lavar y secar

- Observar las esporas

DECIMO CUARTA SEMANA

PRACTICA N 14

MICOLOGA: LOS HONGOS

1. OBJETIVOS:

- Conocer la metodologa para diagnosticar micosis en el laboratorio

- Reconocer las principales caractersticas macro, microscpicas de los hongos.

- Identificar las diferentes especies de inters mdico - estomatolgico

2. INTRODUCCIN:

Los hongos son organismos eucariontes, sus paredes celulares estn compuestas

por carbohidratos complejos tales como la quitina, glucano, manano, celulosa , etc.

Son seres heterotrofos, no realizan fotosntesis por carecer de clorofila.

Aproximadamente existen 150,000 especies de hongos, de ellos 100 ms o menos

son patgenos, otros son no patgenos y un gran grupo son utilizados en diversas

industrias.

Desde el punto de vista celular los hongos pueden ser de dos clases Unicelulares

o levaduriformes y miceliales o pluricelulares.

3. MATERIALES PARA LA PRACTICA:

- Placa petri con Agar Sabouraud y otro con Agar Sangre

- Hidrxido de potasio al 20%

- Azul de lactofenol

- Lminas montadas de hongos unicelulares, pluricelulares

- Lminas petri cultivadas

- Microscopio binocular

4. PROCEDIMIENTO :

Muestras biolgicas de micosis superficiales: Piel, cabellos o uas.

En micosis sistmicas que afecten rganos internos como pulmones, intestinos,

ganglios linfticos, cavidad bucal, etc. la muestra ser SANGRE, esputo ,

biopsias, etc.

Coloracin y Microscopia:

Las muestras de micosis superficiales deben ser desqueratinizadas con hidrxido

de potasio al 10 o al 20% , luego se colorean con Azul de Lactofenol.

Siembra Micolgica:

Los medios de cultivo ms utilizados son

- Agar sabouraud

- Agar sangre

- Infusin de cerebro y corazn (BHI)

- Agar Levadura

- Mycobiotic Agar

- Czapeck

- Agar Mycophil

- Agar Mycosil

- Agar Sangre Glucosa cisteina

- Agar Lactosado de Sabouraud

Los hongos unicelulares o levaduriformes se incuban a 37 por 72 horas mientras

que los pluricelulares o miceliales se incuban a la temperatura ambiental de 5 a 7

das.

Mtodos indirectos para diagnostico de micosis sistemicas o profundas

A. Intradermo reacciones:

- Histoplasmina

- Paracoccidiodomicotina

- Esporotriquina

- Candidina

B. Reacciones Serologicas:

- Aglutinacin

- Precipitacin

- Fijacin de complemento Inmunodifusin

- Prueba adicional: Lmpara de Wood.

DIAGNOSTICO DE ALGUNAS MICOSIS SISTMICAS

1. Candidiasis

Muestras:

Incluyen frotis y raspado de lesiones superficiales, sangre, lquido

cefalorraqudeo, biopsia de tejido, orina, exudados, material retirado del catter

intravenoso.

Microscopa:

Buscando clulas en gemacin y seudohifas (lo que confirma la presencia de

Candida albicans.

Cultivo:

En sabouraud se observan las colonias cremosas y pequeas

Serologa: Estas pruebas tienen uso limitado, pudiendo usarse tambin

intradermo reacciones como candidina.

2. Histoplasmosis

Muestras para cultivo:

Esputo, orina, raspado de lesiones superficiales, aspirado de medula sea.

Coloracin y Microcospia:

Los cortes histolgicos se colorean con Giemsa, se observan levaduras en

forma de clulas ovoides dentro de las clulas del tejido afectado.

Cultivo:

En sabouraud (a 25 30C) Tambin puede emplearse Agar sangre glucosa

cisteina a 37C (la incubacin es de cuatro semanas como mnimo).

Serologa:

Las pruebas se hacen positivas entre la segunda a quinta semana despus de

la infeccin.

Intradermo-reaccin:

Esta prueba cutnea con histoplasmina se hace positiva despus de la

infeccin y permanece positiva durante varios aos.

3. Paracoccidiadomicosis

Muestras Biolgicas:

Esputo, exudado de las lesiones bucales, biopsia.

Microscopa:

En la Microscopa directa de estas muestras, aparecen las levaduras.

DECIMO QUINTA SEMANA

PRACTICA N 15

ESTUDIO DE BACTERIOFAGOS, METODO DE AISLAMIENTO DE VIRUS

BACTERIANO

El descubrimiento de los bacterifagos se hizo en 1915 por Twort, quien aport mucho

es en estudios de organizacin y replicacin del material gentico. Existe un

bacterifago para cada especie bacteriana, esta especialidad es debida a receptores

especficos existentes en las bacterias, la accin de los bacterifagos en ellas puede

ser:

a: Interaccin ltica.- Donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria.

b: Interaccin transformadora.- Donde el genoma viral se integra al genoma del

husped.

El ciclo de multiplicacin viral se divide en:

- Absorcin (atraccin cnica y receptores especficos)

- Penetracin (Ingreso del citoplasma viral al husped)

- Multiplicacin (en la bacteria receptora)

Procedimiento:

- Colocar en un tubo de prueba: 0.5 cc de fago, agregar 0.2 de cepa de E. coli

(incubado previamente durante 4 horas), agregar Cloruro de Calcio 2 gotas

- Preparar placas Petri con agar slido

- En los tubos con agar semislido agregar la mezcla de fago

- Mezclar bien los contenidos del tubo y agregar la superficie de la placa de agar

slido.

- Mover la placa suavemente de tal manera que el agar forme una capa uniforme

sobre el agar slido.

- Marcar las placas. Incubar a 37C y examinar a las 24 horas.

LECTURA DE LAS PLACAS CON BACTERIOFAGO. INOCULACION DE HUEVOS

EMBRIONADOS

Los Virus respiratorios son los principales responsables de la afecciones

Respiratorias.

Producen cuadros respiratorios altos, el virus de la influenza y el adenovirus.

Producen resfriado comn y gripe: Rhinovirus

Afecciones de vas respiratorias bajas, bronquitis: Virus Respiratorio Sincisial

Producen Traqueitis y neumonitis: Virus de Parainfluenza

Algunos de estos virus son ADN o ARN, y tiene afinidad por la mucina

Inoculacin en huevos embrionados de 7 a 9 das por va alantoidea y

amnitica:

Procedimiento:

Va alantoidea

- Visualizar al mebrin en el ovoscopio, marcar al embrin y la cmara de aire.

- Perforar la cscara en el borde de la cmara de aire.

- Usando una jeringa de 1 cc con agua calibre 22 inocular a travs de la perforacin

de la cscara y en un ngulo de 45 en relacin al eje longitudinal del huevo y

alejado del embrin, en zona libre de vascularizacin, inyectar 0.1 de la muestra.

Va amnitica:

- Visualizar en la forma anterior

- Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.

- Sostener el huevo en el ovoscopio y con jeringa de 1 cc de aguja calibre 22 de 1 y

pulgadas inocular en direccin del embrin 0.1 del inoculo en la cmara

amnitica.

OBSERVACION DE LAMINAS CON EFECTO CITOPATICO

En cultivo de clulas el virus ingresa y prolifera en las clulas y en muchos sistemas

clula virus, las clulas llegan a granular ya a desintegrarse despus de una hora o

das. Este efecto destructivo producido por el virus es conocido como efecto

citoptico.

Una lnea de clulas no es susceptible a todos los virus, por lo que es necesario

emplear diferentes clulas para los distintos virus.

Materiales:

- Lminas coloreadas con H.E. (Hematoxilina Eosina) de la lnea de clulas

establecidas Hep2 normal

- Lmina coloreada con H.E. Hep-2 infectada con poliovirus

- Lmina coloreada con H.E. Hep-2 infectada con adenovirus

- Microscopio

Lectura de las lminas:

1. Lmina Hep-2 normales se observa una capa de clulas poligonales unidas unas

con otras, formando una alfombrilla.

2. Lmina infectada con polioviorus (heces positivas de poliomielitis), se apreciar un

efecto citopatognico, con clulas redondeadas refringentes y desprendimiento

celular (lisis celular)

3. Lmina infectada con adenovirus (exudado amigdaliano positivo), se observa

retraccin celular, las clulas pierden su forma normal, el efecto citoptico es

caracterizado por la agrupacin de clulas formando racimos.

DECIMO SEXTA SEMANA

SEMINARIO

DECIMO SEPTIMA SEMANA

EXAMEN FINAL PRCTICO