guia p. microbiologia medica

ASOCIACIN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUIA DE PRCTICA DE

MICROBIOLOGIA MDICA

CUARTO CICLO

SEMESTRE ACADMICO 2013-II

ASOCIACIN




RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE

MICROBIOLOGA MDICA

1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas, mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.

2. No se podr ingresar sin mandil a la sala de prcticas, para evitar contaminaciones 3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles

contaminaciones.

4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes. 5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura 6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que se

tian la mesa de trabajo, ropa o manos.

7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco. 8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan

debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.

9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con desinfectante.

10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes anotaciones:

Nombre o iniciales de los estudiantes

Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra

Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias

Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas

Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C

11. Al finalizar el trabajo:

Limpiar con algodn los objetivos del microscopio

Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no queden lminas sobre la platina

Limpiar la mesa de trabajo

Comprobar que la llave de gas este cerrada

Lavarse prolijamente las manos con jabn carblico.

12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.

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PRACTICA N 1

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. OBJETIVO

1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto. 2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.

II. MATERIALES

Microscopios

Lminas portaobjetos

Laminillas cubreobjetos

Lminas coloreadas

Suero fisiolgico

Pipeta Pasteur

Plumn indeleble

Papel lente

Tela de felpa(25 cms)

Fibra de pelo y lana

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:

PARTE MECANICA

Tubo portalentes y cremallera

Tornillos macro y micromtrico

Revolver

Platina

Condensador

Brazo y Pie

Charnela

PARTE OPTICA

Ocular

Objetivos

Espejo

Lentes de condensador

Diafragma

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina. 2. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma. 3. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera 4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10, 20x, 40,

y 100x.

MICROBIOLOGIA MEDICA Pgina 4

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PRACTICA N 1 - A

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES., DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

INTRODUCCION

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:

A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromfero) es el anin llamados colorantes cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.

B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina (cido). Para los trabajos bacteriolgicos generales se usan colorantes bsicos como el azul de metileno, cristal de violeta,

fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina.

Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:

A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de metileno B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl - Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como la coloracin de

Leishman, Vago, etc.

A. COLORACIONES SIMPLES

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los microorganismos.

MATERIAL

Muestra con mezcla bacteriana

Lminas portaobjetos

Laminillas cubreobjeto

Asa bacteriolgica de Kolle en aro

Colorante Azul de metileno

Colorante Tinta China

Colorante Azul de lactofenol

Mechero de Bunsen

Varillas para coloracin

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente

Microscopio de luz con objetivo de inmersin

COLORACIN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor 2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos 3. Lavar con agua y dejar secar 4. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro.


RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos 2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana 3. Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto 4. Observar con lente de menor y mayor aumento.

RESULTADO: Los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro

COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos 2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante 3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto 4 Observar con lente de menor y mayor aumento

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste

PROTOCOLO

CLASE DE

COLORACION SIMPLE

MORFOLOGIA DEL

MICROORGANISMO

ESQUEMA DE LA

OBSERVACION

AZUL DE METILENO

TINTA CHINA

AZUL DE LACTOFENOL


CUESTIONARIO

1. Que tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol, cido, bsico, neutro? 2. Cules son los componentes del azul de metileno 3. Qu estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?

B. COLORACIONES DIFERENCIALES

Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante

de contraste. Entre los mas usados tenemos la coloracin de Gram y la de Ziehl Neelsen o tambin llamado cido-

alcohol resistente

COLORACION DE GRAM

Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, segn la

estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas

no estn entrelazadas; en las Gram positivas la mayora presenta muchas capas de cadenas mucopptidas .

Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff

MATERIAL

Muestra con mezcla de bacterias Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Asa bacteriolgica de Kolle en aro Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:

Violeta de Cristal violeta (colorante primario)

Bicarbonato de sodio

Lugol (mordiente)

Alcohol- acetona (decolorante)

Fucsina bsica (colorante de contraste) Mechero de Bunsen Varillas para coloracin Microscopio de luz con objetivo de inmersin Aceite de cedro Xylol Papel lente

PROCEDIMIENTO

1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis. 2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la lmina

portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparacin en capa fina.

3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen.

4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin. 5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, agregar 1- 2 gotas de la solucin de bicarbonato de sodio,

dejar actuar por 2 minutos.

6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis) 7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos. 8. Lavar con agua.


9. Decolorar el frotis con la solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que no arrastre colorante) mximo por 10 segundos.

10. Lavar con agua. 11. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. 12. Lavar con agua. 13. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen 14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

RESULTADO

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

PROTOCOLO

CATEGORIA

BACTERIANA

MORFOLOGIA

BACTERIANA

ESQUEMA DE

LO OBSERVADO

GRAM POSITIVAS

GRAM NEGATIVAS

CUESTIONARIO

1. A que se debe que las bacterias Gram negativas no retengan el complejo cristal violeta- yodo? 2. A que se debe que los colorantes bsicos tian el ncleo de las clulas? 3. Con que clase de colorante teira el protoplasma de la clula?


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PRACTICA N 2

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION

Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido de lpidos, como el

gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcohol-resistente. Al teirse los microorganismos

con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que es soluble en sustancias lipodes y aplicando el calor, el colorante

es forzado a penetrar en la clula y en esta forma resistir a la decoloracin.

MATERIAL

Lminas con frotices de bacilo tuberculoso Set de coloracin Ziehl-Neelsen:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)

Azul de metileno (colorante de contraste) Mechero de alcohol

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces , evitando que hierva el colorante.

2. Lavar con agua corriente. 3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada. 4. Lavar con agua corriente 5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto. 6. Lavar con agua corriente 7. Secar y observar con lente de inmersin.

RESULTADO

Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se tien de color azul.

PROTOCOLO

LAMINA

MORFOLOGA

ESQUEMA

COLORACION DE

ZIEHL- NEELSEN


CUESTIONARIO

1. Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente. 2. Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada 3. A que se denomina colorante primario y colorante de contraste

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PRACTICA N 3

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

INTRODUCCION

Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de anilina

como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de microorganismos presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN

Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en

sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES

Frotis de sangre con Bartonella Solucin de colorante Leishman Agua destilada tamponada Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos. 2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos 3. Lavar con agua de cao y dejar secar 4. Observar con objetivo de inmersin 5. Anotar los resultados en el protocolo.

COLORACIN DE VAGO

Es utilizado para la coloracin de grmenes fuso-espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el mtodo de Gram,

ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.


MATERIALES

Lmina portaobjetos Palito mondadientes Solucin fisiolgica al 0.85% Set de coloracin de Vago:

Mercuro cromo al 2%

Violeta de genciana

Asa de siembra en aro Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO

1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85% 2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina extendiendo en

sentido espiral de adentro hacia fuera.

3. Fijar el frotis al calor suave 4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos 5. Lavar con agua corriente 6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos 7. Lavar con agua corriente 8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.

RESULTADOS

Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro

Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la flora normal

de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

PROTOCOLO

LAMINA

MORFOLOGIA

ESQUEMA

COLORACION

LEISHMAN

COLORACION VAGO


CUESTIONARIO

1. Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente 2. Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada 3. A que tipo de colorante pertenece el colorante Leishman 4. A que grupo bacteriano se les denomina grmenes fuso-espirilares


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PRACTICA N4

MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES, DIFERENCIALES Y ENRIQUECIDOS

INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios especiales con una

determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y

temperatura. Segn su utilizacin pueden ser: simples, enriquecidos y diferenciales.

MATERIALES

Probetas de 100 ml. Balones de 250 ml. Tiras de Papel indicador de pH Frasco con solucin NaOH (N/10) Frasco con solucin HCl (N/10) Pinzas rectas Bagetas de vidrio

Goteros de vidrio Trpodes con malla de Asbesto Tubos de 16x150 mm Tubos de 13x100 mm Placas Petri Frascos estriles Agua destilada Tubo con sangre citratada

Caldo nutritivo Agar simple

Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Agua destilada 100 ml Agua destilada 100 ml pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g

pH 7.0 - 7.4

Caldo peptonado Peptona 2.0 g Cloruro de sodio 1.0 g

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado. 6.0 gr. de Agar SS deshidratado. 6.5 gr. de Agar TSI. 2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons 2.1 gr. de Agar Urea. 1.7 gr. de Caldo MR VP 3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

PREPARACION

I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

1. Para el Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es cido agregar gota a gota la solucin

de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y

dejar en refrigeracin hasta su utilizacin.

2. Para el Agar simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl. Luego envasar y esterilizar a 121C por

utilizacin.


II. MEDIOS ENRIQUECIDOS

1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar enfriar hasta una

obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de

esterilidad. Mantenerlo en refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.

2. Para el Agar chocolate torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de esterilidad y dejarlo despus en

refrigeracin.

3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su completa disolucin. Autocl

4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor hasta su completa disolucin . Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.

III. MEDIOS DIFERENCIALES

1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares);disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir hasta su completa

autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final tendr un color rojo naranja.

2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color verde.

3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin; mezclar homogneamente y repartir en tubos

de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendr un color amarillo.

4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de 13x100mm y autoclavar

5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolucin y repartir en tubos no inclinado.

PROTOCOLO

Realizar un cuadro indicando:

A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

C. Materiales que usaron para la preparacin.


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PRACTICA N 4- A

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del

nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las 24 horas y otras necesitan un perodo ms

prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.

Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y el resultado de la

multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un

medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por

estra, por dispersin-agotamiento, por inoculacin y por puntura.

Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:

FORMA : Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.

ELEVACIN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.

SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.

TAMAO : Dimetro en milmetros.

CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa y mucosa.

CROMOGENESIS: Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.

MATERIALES

Tubos con suero fisiolgico estril Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo Tubos de 16x150 con Agar nutritivo Placas con Agar nutritivo Placas con Agar Mac Conkey Tubos de 16x150 con medio hipertnico de Chapman Placas con Agar hipertnico de Chapman Tubos con Agar Sabouraud Torundas estriles Asas de siembra en aro y punta

PROCEDIMIENTO

A) TIPOS DE SIEMBRA

Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana sobre la superficie del

medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.

Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la superficie del

medio de cultivo

que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.

Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con ayuda del Asa de siembra

en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar.


Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo hasta el fondo del

tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo.

B) LECTURA :

Con la ayuda del profesor:

1. El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos sembrados. 2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.

PROTOCOLO

METODOS DE SIEMBRA

DESCRIPCION DE LA SIEMBRA

MEDIO DE CULTIVO

USADO

ESTRIA

DISPERSION AGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIN

CARACTERISTICA DE LA

COLONIA

OBSERVACION DE COLONIAS

MEDIO DE CULTIVO

USADO

FORMA

ELEVACIN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAO

CONSISTENCIA

CROMOGENESIS

RESULTADO DE LAS SIEMBRAS REALIZADAS:


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PRACTICA N 5

METABOLISMO BACTERIANO

INTRODUCCION

La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y

morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano

desconocido, para identificarlo a nivel de gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que

son nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin.

En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia bacteriana aislada

en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que permiten detectar

cambios del pH o la presencia de subproductos especficos.

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un medio ambiente

anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). Este

trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirn como

fuente de energa y carbono.

Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de cidos mixtos producidos,

dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de

fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del

medio slido.

A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la capacidad potencial de

estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno (H2S).

El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar

los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH

8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).

Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden

ser fundamentalmente tres:

1. Fermentacin de glucosa nicamente. 2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos. 3. No fermentacin de carbohidratos.

Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeas

burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.

El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al

reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).


MATERIAL

Tubo con medio TSI en plano inclinado. Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. aeruginosa

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la superficie del pico de flauta.

2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.

1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja

concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente

para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser

utilizados.

Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en

contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.

3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo que el tubo permanece amarillo.

4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.

5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica valiosa para identificar

especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa.

Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos frecuentemente producen

suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto

cido lmite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.

2. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es

metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metil- carbinol(Acetoina)un subproducto

neutro de la va 2,3- butilenglicol.

La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin del KOH y Oxgeno

atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica del Alfa naftol y Creatinina.

MATERIALES

Cepa bacteriana MR positivo y negativo Cepa bacteriana VP positivo y negativo Reactivo Rojo de metilo Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%) Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella

PROCEDIMIENTO

1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.

2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.


INTERPRETACION

1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre, cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la

negativa de color amarillo- naranja.

2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante aadir los reactivos en

el orden especfico.

Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada dentro de los

primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo,

siendo esta una interpretacin falsa positiva.

En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.

II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido triptofano,

produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio

rico en triptofano, observando la aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de

papel), luego de agregar una solucin que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

MATERIALES

Cepa indol positivo y negativo. Medio lquido peptonado y/o Medio SIM Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido). Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.

PROCEDIMIENTO

La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos despus de

haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las

bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este

aparecer sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.

III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las

cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de los carbohidratos, utilizando el citrato de

sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se

emplee para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos.

El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye uno de los

metabolitos del ciclo de Krebs.

PRINCIPIO

La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formacin

de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio, un anin como nica

fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.

Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin

de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido de amonio(NH4OH),

detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH

6.9(verde) y pH 7.8(azul).


MATERIALES

Cepa control citrato positivo y negativo. Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo la cepa citarto positiva y negativa.

2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie

del medio inclinado.

Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV. HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la

urea, segn el siguiente esquema:

O

NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3 Ureasa

El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un

aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.

MATERIALES

Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus ) Medio Agar urea segn Christensen

PROCEDIMIENTO

1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el fondo. 2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C

INTERPRETACION

Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.

Prueba negativa: El medio permanece del color original

V. PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativa anaerobias.

El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los

carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.

La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin:

2 H2O2 --------> 2 H2O + O2

La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativa) de los

estafilococos (catalasa positiva).


MATERIALES

Cepas Controles: S. aureus, Streptococcus Enterococcus Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3% Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen

actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.

PRUEBA EN LMINA

a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.

b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3% c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo. d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.

PRECAUCIONES

1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.

2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.

3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USARSE AGUA.

INTERPRETACION

Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son indicativas de

catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando

pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas no son catalasa positivas.

VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena

respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se

encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar a organismos que

carecen de la enzima o son anaerobios estrictos.

En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p-

fenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados comnmente oxidasa).

MATERIAL

Cepa control: sembrada en Agar nutritivo

Reactivo de oxidasa

PROCEDIMIENTO

1. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo. 2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos o tiras de

papel que tienen ya el reactivo de oxidasa

INTERPRETACIN

Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un intenso color azul

oscuro.


VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA

Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias txicas que pueden ser

detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos,

segn el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.

MATERIALES

Cepa bacteriana

Placas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre 2. Incubar por 18 24 horas a 37 C

INTERPRETACIN

Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido a la salida

de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina

Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa del eritrocitos observndose una zona clara alrededor de la colonia

VIII. PROTOCOLO

PRUEBAS

BIOQUMICAS

MEDIO DE

CULTIVO

REACTIVO Y /O

INDICADOR

LECTURA

TSI

(Fermentacin- H2S)

VOGES- PROSKAUER

(VP)

ROJO DE METILO

(MR)

INDOL

CITRATO

CATALASA

UREASA

CITOCROMO OXIDASA

HEMOLISINA


ASOCIACIN




PRACTICA N 6

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCION

Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibiticos y

quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.

La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:

Mtodo de dilucin Mtodo de Difusin en Agar

OBJETIVOS

1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los antibiticos. 2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado. 3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.

DILUCION EN TUBO

Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin inhibitoria mnima

(CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro bacteriano. Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio agar al cual se

inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas, se puede observar la CIM como la

dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de

material que se utiliza.

DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)

Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o quimioterpico ms adecuado

en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una

placa de Agar y colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24

horas, se observan las zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en

el disco difiere para los distintos frmacos.

MATERIALES

Placas de Agar nutritivo Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya Tubos con caldo nutritivo Tubos con Agar semi- slido Tubos con cultivo bacteriano Asas de siembra Torundas estriles Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck). Pinzas Mecheros


PROCEDIMIENTO

1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.

2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.

4. Incubar a 37C durante 24 horas.

LECTURA

a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos, incluyendo el dimetro del disco.

b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el microorganismo es Resistente ( R) , intermedio (I), o susceptible (S) a los diferentes antimicrobianos utilizados.

Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis

altas del antibitico.

La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad de difusin en el agar.

c) Anotar e interpretar los resultados.

PROTOCOLO

Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica desarrollada.

CUESTIONARIO

1. Cul es la importancia de su aplicacin. 2. En que casos usted indicara esta prueba 3. Que indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microorganismo en esta prueba.


ASOCIACIN




PRACTICA N 7

REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN

La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en el que uno de los

reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de

ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser

suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos

Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento.

AGLUTINACION BACTERIANA

Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno de los ms simples es la

aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del antgeno con el suero del paciente en una

lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo rpido para anlisis de rutina.

MATERIALES

Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas) Antgeno bacteriano Suero de paciente Pipetas serolgicas de 0.2 ml Palitos mondadientes

PROCEDIMIENTO

1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina de vidrio excavada. 2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente. 3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota. 4. Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos.

RESULTADO

La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a agruparse en la periferia de la

gota. Anotar los resultados en su protocolo.

PROTOCOLO

REACTIVOS

TUBOS

1 2

3 4 5

ANTISUERO

0.08

0.04

0.02

0.01

0.005

ANTIGENO

AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

TITULO

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

RESULTADO:

Ttulo del suero: .


ASOCIACIN




PRACTICA N 7- A

FAGOCITOSIS

La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el englobamiento de

partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se incrementa cuando intervienen anticuerpos

especficos o complementos. Entre las clulas fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos

(monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la

fagocitosis se les llama OPSONINAS.

FAGOCITOSIS IN VITRO

Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras pruebas serolgicas, pero en

ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre total (conteniendo los anticuerpos, complemento y

leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de estas mezclan se colorean.

El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la sangre.

MATERIAL

Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Klebsiella Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al 1% Una jeringa de 5 ml con aguja N 20 Pipetas Pasteur con perilla de jebe Lminas portaobjetos Colorante Wright Agua tamponada Bao Mara a 37C Centrfuga Gradilla Microscopio con objetivo de inmersin Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO

1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa. 2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente. 3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente. 4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos. 5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo. 6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada tubo. 7. Realizar los frotices y colorear con Wright:

Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos. Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla. Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao. Secar y observar con objetivo de inmersin.

RESULTADO

Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.


ASOCIACIN




PRACTICA N 8

REACCION DE PRECIPITACION

INTRODUCCION

Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se mezcla un antgeno

soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de equivalencia y visibles por lo general

macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin pueden realizarse en un gel como el Agar.

INMUNODIFUSION SIMPLE

Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en el suero humano. En el

que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja gelificar; luego se realizan perforaciones en

el Agar donde se coloca el antgeno, procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose

la formacin de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.

INMUNODIFUSION DOBLE

Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos precipitantes, anticuerpos

antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se

efectan perforaciones, los cuales se llenan con los elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24

horas de incubacin a temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.

INMUNOELECTROFORESIS

Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar componentes sricos:

IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.

Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los antgenos son colocados

en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su movilidad en un campo elctrico, luego de una

corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las

protenas que han migrado. Luego de incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas

reaccionantes.

MATERIALES

Suero positivo Antgeno Lminas de vidrio con Agar noble al 1% Placas Petri Pipetas capilares Lminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central. 2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar. 3. Colocar las lminas en una cmara hmeda.

RESULTADO

Observar las bandas de precipitacin que se forman:

Identidad total : Las bandas de precipitacin se unen.

Identidad parcial : Se observa un espoln.

No identidad : Las bandas se cruzan.


ASOCIACIN




PRACTICA N 9

PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA

INTRODUCCION

En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos virales como de anticuerpos

especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).

Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin o la prueba de Fijacin

de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).

Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada utilizando colorantes

fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una reaccin de color.

Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmunoabsorbencia Ligada a Enzimas (enzime- linked immunosorbent assay) ELISA.

La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es necesario un observador

experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras simultneamente en forma rpida y

automatizada.

PROCEDIMIENTO

Determinacin de Anticuerpo en fase slida

Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.

Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la

peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.

Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno. Aadir el sustrato de la enzima. Observar la presencia de color.

LECTURA

El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un espectrofotmetro. A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.


PRUEBA DE ELISA

(ESQUEMA)


REACCIN DE PRECIPITACIN

(ESQUEMA)


ASOCIACIN




PRACTICA N 10 - 11

SEMINARIO I: VACUNACIN Y SEROTERAPIA.

1. Objetivos de la vacunacin y Requisitos de una buena vacuna.

2. Tipos de vacunas y Consecuencias patolgicas de la vacunacin.

3. Practicas de vacunacin actual y Medidas de control

INMUNIDAD

4. Clulas del Sistema Inmune.

5. Respuesta inmunitaria en infecciones bacterianas y virales.


ASOCIACIN




PRACTICA N 12

PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS

INTRODUCCION

Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce la formacin de

anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en presencia de factores accesorios, pueden

reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a fenmenos perceptibles.

Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos, hematies, suero, etc.

Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y generalmente progresivas con

las siguientes finalidades.

1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere inmunidad adquirida activa.

2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en: a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc., en las cuales se

administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una inmunidad adquirida pasiva.

B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de clasificacin, como el

de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt-

Vahlne para Escherichia coli.

I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES,A PARTIR DE

CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.

A. MATERIAL

Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo) Pipetas graduadas estriles de 5 cc. Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc. Embudos y gasa, estriles para filtrar Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml. Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml. Pipetas de Pasteur, estriles Escala de MacFarland (tubo N 3) Pipetas graduadas de 1 ml. Tubos vacos estriles de 16x150 ml. Algodn y Alcohol yodado Agar nutritivo en placas y tubos

B. PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos bacterianos presentados en medio slido

2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar agar 3. Filtrar a travs de gasa estril 4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100


5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una concentracin de 0.5%.

Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la ebullicin durante

dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.

6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentracin del 0.5%

7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108 grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de suero fisiolgico, gotas de cada uno de los

antgenos concentrados hasta alcanzar una turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.

Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno y apreciar la turbidez

obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro o determinndola con exactitud mediante un

Espectrofotmetro.

El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:

Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%

Otra de cido sulfrico al 1%.

Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles

Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO N

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Cl2Ba 1%

0.1 cc.

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

H2SO4 1%

9.9 cc.

9.8

9.7

9.6

9.5

9.4

9.3

9.2

9.1

9.0

Bacterias

por cc.

3.0 x

108

6.0 x

108

9.0 x

108

1.2 x

109

1.5 x 10

9

1.8 x 10

9

2.1 x 10

9

2.4 x

109

2.7 x 10

9

3.0 x 10

9

La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al homogenizarse da una

turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario empleado. A cada tubo corresponde una

concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo sealado en el cuadro.

C. CONTROL DE ESTERILIDAD

Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o agar sangre, con la finalidad de controlar su esterilidad

Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.

Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.

D. INOCULACION

1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.

2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.

D. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)


ASOCIACIN




PRACTICA N 13

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STAPHYLOCOCCUS

INTRODUCCION

Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organsmos redondos u ovales, agrupados

generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los cultivos jvenes. Son habitantes

naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que

van desde fornculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas

S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena S. aureus

produce una enzima llamada coagulasa.

MATERIALES

Tubos con secrecin purulenta Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman Placas Petri con Agar sangre Tubos con Caldo plasma Lminas portaobjetos Set de colorantes para Gram Asa de platino en aro

PROCEDIMIENTO:

1. Sembrar la muestra problema en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre, empleando el mtodo de dispersin-agotamiento

2. Realizar un frotis de la muestra y colorearla con Gram. 3. Observar placas sembradas con Staphylocococcus con 24-48 horas de incubacin a 37C, estudiando las

caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman (tamao, forma ,

pigmento, hemolisis, etc.)

4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la coagulasa)

5. Realizar la prueba de la Catalasa.

RESULTADOS:

1. Caractersticas macroscpicas de la muestra: 2. Resultado de la coloracin realizada 3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula el plasma. 4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de burbujas. 5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de S. aureus y S.

epidermidis. 6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre


PROTOCOLO:

Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la colonia, forma que

presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la practica.

CEPAS

BACTERIANAS

TRABAJADAS

MH

AS

COAGULASA

CATALASA

GRAM

Caracterstica

morfolgica

CUESTIONARIO:

1. Que factores condicionan la patogenicidad de Staphylococcus aureus. 2. Que caractersticas fisiolgicas identifican a Staphylococcus aureus. 3. Mencione de que cuadros infecciosos son causantes las especies de Staphylococcus. 4. Cul es la composicin del Medio hipertnico de Chapman


ASOCIACIN




PRACTICA N 14

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS

INTRODUCCION

El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S.

pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y

Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos

adoptando formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora

normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.

Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en

base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glbulos rojos que rodean a la colonia son

parcialmente daados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina.

El grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus pueden desarrollar

en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la diferenciacin de las especies de

Streptococcus.

MATERIAL

Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI Placas con Agar sangre de carnero Torunda estril y bajalengua Tubos con Thioglicolato Tubos con caldo Inulina Discos de Bacitracina Discos de Optochin Solucin de Desoxicolato al 2% Tubo con ClNa al 6.5% Lminas portaobjetos Set de colorantes de Gram- Kopeloff Asas de Kolle, pinzas Microscopio, aceite de inmersin.

PROCEDIMIENTO

1. Observar el desarrollo de la cepa de Streptococcus en el medio de caldo BHI, observe si el crecimiento produce turbidez o sedimenta.

2. Tomar una muestra de la garganta con ayuda de la torunda estril, y sembrar en el Agar sangre por el mtodo de dispersin y agotamiento, rotular, incubar a 37C por 18- 24 horas. Con la misma torunda realizar un frotis en la

lmina portaobjetos y colorear por Gram.

3. Realizar la siembra de la cepa en la otra placa con Agar sangre por el mtodo de dispersin agotamiento, en el primer cuadrante colocar un disco de Bacitracina, en el segundo cuadrante el disco de Optochin, incubar a 37C por

18- 24 horas.

4. Sembrar la cepa en el medio de Thioglicolato. 5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina. 6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%


LECTURA

1. Observar el desarrollo en el Agar sangre sembrada con muestra de la garganta, determinar que colonias son sospechosas de Streptococcus . Realizar el frotis de las colonias sospechosas y colorear por Gram.

2. Observar el tipo de hemlisis, la sensibilidad a la Bacitracina y Optochin en la otra placa de Agar sangre. En la misma placa agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias aisladas e incubar a 35C

durante 30 minutos. De otra colonia aislada, realizar un frotis y colorear por Gram.

3. Observar el metabolismo a la Inulina. 4. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. 5. Observar el desarrollo en la solucin de ClNa al 6.5%

PROTOCOLO

Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada

IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS

ORGANISMO

SENSIBILIDAD

CAM

P

Hidrlisis

De

Metabo

Lismo

De

La

Inulina

Desarro

llo

NaCl

6.5%

Lisis por

Bilis

Baci

tra

cina

Opto

chin

Hipu

Rato

Escu

lina

Desoxi

colato

Sodio

- hemolticos GRUPO A

S. pyogenes

S

R

N

N

N

N

N

N

GRUPO B

S. agalactiae

R*

R

P

P

N

N

P*

N

GRUPO C, F, G

R

R

N

N

N

N

N

N

- hemolticos GRUPO Viridans

R*

R

N

N

N*

N

N

N

S. pneumoniae

R

S

N

N

N

P

N

P*

S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable

CUESTIONARIO

1. Que prueba de laboratorio realizara para diferenciar Str. Pneumoniae de los Streptococcus del grupo viridans 2. El Streptoccocus beta hemoltico es causante de que tipo de infecciones. 3. Cual es la importancia de la cpsula polisacrida que presenta el Pneumococo


ASOCIACIN




PRACTICA N 15

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA

INTRODUCCION

Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los lados adyacentes

aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas N. Gonorrhoeae, y N. Meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien

adicionalmente con el colorante azul de metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.

Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que le proporciona una

rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.

La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una tensin de CO2 entre 5 a

10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2 a 7.6.

Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros microorganismos

morfolgicamente similares.

La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y

lactosa.

El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el laboratorio.

Se debe considerar los siguientes aspectos:

a) Recoleccin correcta de la muestra. b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio. c) Seleccin del medio de cultivo apropiado d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.

MATERIALES

Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria Muestra clnica de secrecin endocervical. Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram Reactivo de Citocromo- oxidasa Reactivo de catalasa Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Set de coloracin de Gram Colorante de Azul de metileno Microscopio Asas de siembra en aro y punta Solucin de alcohol yodado Algodn y Xilol.


METODOLOGIA

1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de bordes continuos, blanco- grisaceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. Gonorrhoeae y si es N.

Meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares, translcidas o ligeramente opacas.

2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.

3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lmina control. 4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de metileno.

PROTOCOLO

MEDIO DE CULTIVO

MUESTRA

COLONIAS

TAMAO

GRAM

AZUL DE

METILENO

AGAR THAYER MARTIN

AGAR CHOCOLATE

SECRECION

ENDOCERVICAL

PRUEBAS BIOQUIMICAS

OXIDASA

CATALASA

Cuestionario:

1. Como diferenciara bioqumicamente Neisseria gonorrhoeae de N. meningitidis 2. Porque necesitan de un medio enriquecido como el Agar chocolate para su desarrollo 3. Que otras Neisserias conoce y cual es su habitat.


ASOCIACIN




PRACTICA N 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:

GENERO BACILLUS

INTRODUCCION

El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que pueden sobrevivir en

el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis

causante de la enfermedad conocida como "carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B.

mycoides son saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire.

La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta como un bacilo

rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con

bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo

envejece forman esporas.

MATERIALES

Muestra bacteriana Placas Petri con Agar nutritivo Placas Petri con Agar sangre Tubos con Caldo nutritivo Tubos con Agar semi-slido Tubos con gelatina Lminas para frotices Set de coloracin de Gram Set de coloracin de Hiss para cpsula Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas Asa de Kolle

PROCEDIMIENTO

1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina. 2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.

COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

1) Preparar un frotis 2) Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de

De vapores por 30 segundos

3) Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%. 4) Lavar con agua corriente y secar 5) Observar al microscopio con lente de inmersin


COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis 2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de

vapores por 5 minutos (adicionar colorante cada vez que falte)

3) Lavar con agua corriente 4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar 6) Observar al microscopio con lente de inmersin

LECTURA:

EN LOS CULTIVOS

En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoflica en las especies patgenas y - hemolticas en

las especies saprofitas.

En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados

En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.

En Agar semi-slido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido

En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis.

EN LAS LAMINAS COLOREADAS

Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el centro de

bacilo.

Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incolora.

Wirtz Conklin : El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.

RESULTADOS

A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

GENERO BACILLUS

ESPECIE PATGENA

ESPECIE SAPROFITA

Caldo nutritivo

Agar nutritivo

Agar sangre

Agar semi-slido

Hemolisis

Hidrlisis de la gelatina

Prueba de la Catalasa

Fermentacin salicina

Movilidad


ASOCIACIN




PRACTICA N 16 - A

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO LISTERIA

INTRODUCCION

El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y presentan flagelos

peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V de Y. Esta ampliamente distribuido en

la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo, en las heces de los portadores sanos animales y hombres.

La especie patgena es Listeria monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual

compromete los ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.

El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla bien en medios de

cultivo comunes.

MATERIAL

Tubos con Caldo nutritivo Tubos con medios semislidos (Motilidad) Placas Petri con Agar sangre Placas Petri con Agar nutritivo Tubos de 13x100 con:

Agar urea de Christensen Citrato de Simmons Caldo rojo de fenol con glucosa Caldo rojo de fenol con sacarosa Caldo rojo de fenol con lactosa Caldo rojo de fenol con manita Caldo rojo de fenol con salicina Caldo esculina Caldo MR-VP

PROCEDIMIENTO

1. Hacer frotices a partir de una colonia en Agar y colorearla con Gram. 2. Preparar una lmina en fresco a partir de una suspencin bacteriana en caldo nutritivo, entre lmina y laminilla. 3. Sembrar la muestra en el medio semi-slido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los diferentes medios

diferenciales

4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.

LECTURA

FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos. LAMINAS EN FRESCO : Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos. EN CALDO NUTRITIVO : Se observar una turbidez tenue y homognea. EN AGAR SANGRE : Se observar colonias pequeas con hemolisis tipo Beta. EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar

MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +

HEMOLISINA + SACAROSA - VP +

CATALASA + LACTOSA -

OXIDASA - MANITA -

UREA - SALICINA +

CITRATO - ESCULINA +


ASOCIACIN




PRACTICA N 17 - 18

"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA

INTRODUCCION

La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo

de la vida. Los organsmos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutricin y medio ambiente del

individuo, por lo que es difcil determinar la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores

antes enunciados; ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto

gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un gran desarrollo de

levaduras.

La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides, y

cocos gramnegativos.

La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias anaerobias.

La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos gramnegativos, en ella puede

poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S.

pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.

MATERIALES

Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)

Agar nutritivo en placas

Agar sangre en placas

Agar chocolate en placas

Medio hipertnico de Chapman en placas

Agar Mac Conkey en placas

Agar Sabouraud en tubos

Torundas estriles (2 x tubo)

Baja lengua

Asa de Kolle en aro

Laminas portaobjetos

Set de colorante Gram

Varillas para coloracin

PROCEDIMIENTO

A. PRIMER DIA

1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe. 2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo. 3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C

B. SEGUNDO DIA

LECTURA

Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos.

IDENTIFICACION

Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se

requiere.

- Caldo plasma en tubo

- Disco de Bacitracina

- Disco de Optochin

- Reactivo de Citocromo- oxidasa

- Reactivo de catalasa

PROTOCOLO

El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.


ASOCIACIN




PRACTICA N 19 - 20

AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.

INTRODUCCION

Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar, poseen un alto

contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los

cuales son exigentes con los componentes nutritivos.

Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el aire, en el agua y en la

tierra.

Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad Hominis, que puede infectar

cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y digestiva los mas frecuentes y el esputo es el

espcimen clnico ms comn para establecer el diagnstico especfico a travs de la baciloscopia.

Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium,

Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, tambin, son patgenos.

MATERIALES

Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas Lminas con extensiones de M. Tuberculosis var. Hominis Lminas con extensin de otros tipos de Mycobacterias Set de colorante de Gram Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.) Cepas patrones sembradas en medio Lownstein jensen + verde de malaquita

PROCEDIMIENTO

1. Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento. 2. Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la lmina portaobjetos

nueva.

3. Fijar la preparacin. 4. Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen

El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, etc.

LECTURA

Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen porque no son cidos

alcoholes resistentes.

El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en un fondo azul.


EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO

Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la longitud de los 2/3 del

extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los resultados, segn el siguiente cuadro:

Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.

Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.

Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.

Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.

La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y permite detectar aquellos que

sean resistentes al tratamiento.

TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS

Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en grupos.

I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.

GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.

Ejemplo: M. kansasi , M. simiae

GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo: M. scrofulaceum

GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso.

Son no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano

y M. tuberculosis var. Bovina

II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.

GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita

PROTOCOLO DE TRABAJO:

Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.


ASOCIACIN




PRACTICA N 21 - 22

SEMINARIO II: ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS

1. Clases de agentes antibacterianos 1.1: Inhibidores de la sntesis de la pared celular

1.2: Inhibidores de la sntesis de protenas

2. Clases de agentes antibacterianos y antituberculostticos 2.1: Inhibidores de la sntesis de cidos nucleicos

2.2: Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica

3. Resistencia a los agentes antibacterianos 1. : Gentica de la resistencia 2. : Mecanismos de resistencia

4. Clases de agentes antivirales 4.1: Gentica de la resistencia

4.2: Mecanismos de resistencia

5. Clases de agentes antimicticos 5.1: Gentica de la resistencia

5.2: Mecanismos de resistencia


ASOCIACIN




ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA

PRACTICA N 23

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONA

INTRODUCCION

La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con flagelos polares

monotricos y multitricos, no poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes para su desarrollo In Vitro.

Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana, principalmente

quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados bronquiales, esputo y tracto genital femenino.

En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo de vida fatales.

La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P. aeruginosa, la

mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y desarrollan bien a 42C.

MATERIAL

Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo. Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150 Agar nutritivo en Placa Petri Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150 Agar semi-slido en tubo de 13 x 100 Medio TSI Reactivo de Oxidasa Frasco con cloroformo Set de colorantes Gram Lminas portaobjetos

PROCEDIMIENTO

1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de Gram. 2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas conocidas. 3. Incubar a 37C por 24- 48 horas.

RESULTADOS

COLORACION DE GRAM : Bacilos pequeos, Gram negativos.

CALDO NUTRITIVO : Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso

y un olor caracterstico.

AGAR MAC CONKEY : Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.

MEDIO TSI : No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no

fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa

en el medio de oxidacin- fermentacin (OF)].

AGAR NUTRITIVO : Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el agar, y realizar la

prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.

CALDO TRIPTICASE : Agregar 1 ml de cloroformo p

guia p. microbiologia medica

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