guia de practica microbiologia 2016

8/17/2019 Guia de Practica Microbiologia 2016

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UNIVERSIDAD ALAS PERUANASFACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

GENERAL Y ESTOMATOLÓGICA

GUIA DE PRÁCTICA

AUTOR: Mg CD ELOY GAMBOA ALVARADO

DOCENTES COLABORADORES:

Dr. CD CARLOS ENRIQUE GUILLEN GALARZA

Mg Blga. CARMEN LUISA AQUIJE DAPOZZO


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RECOMENDACIONES GENERALES

1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas correctamente uniformado de blanco y

llevando consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Además plumón

indeleble para escritura en vidrio y lápices de colores.

2. El alumno que incumpla el ítem anterior no podrá ingresar a sala de prácticas.3. Está prohibido comer, beber y fumar en sala de prácticas.

4. Sobre la mesa de trabajo sólo colocará materiales, guía práctica y libreta de apuntes.

5. Antes y después de cada práctica el estudiante desinfectará la mesa de trabajo, para lo

cual deberá contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodón y gasa.

6. Finalizada la práctica el estudiante eliminará los materiales de desecho al depósito

correspondiente.

7. Las láminas preparadas deberán ser colocadas en una caja para su archivo.

8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados serán colocadas en las canastillas

para su autoclavado y desecho.

9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en recipientes con boca anchaconteniendo desinfectante.

10. Los cultivos a incubarse deberán rotularse con los siguientes datos:

a. Nombre o iniciales del estudiante.

b. Nombre del microrganismo, número de mesa, sección y fecha.

c. Las placas se colocarán en forma invertida, salvo indicación contraria del docente.

d. Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas.

e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura

y tiempo adecuados.

f. Los alumnos son responsables de la observación macroscópica tras la incubación.

11. Al finalizar la práctica, el estudiante se responsabiliza de:a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodón y alcohol isopropílico.

b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no

queden láminas sobre la platina.

c. Desinfectar la mesa de trabajo.

d. Cerrar la válvula de gas.

e. Lavarse las manos con jabón carbólico.

12. El protocolo será controlado por el docente al final de cada práctica.


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PRÁCTICA N° 01

EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS:

Identificar y reconocer los principales equipos, instrumentos y materiales

utilizados en el Laboratorio de Microbiología. Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de los equipos,

instrumentos y materiales usados en las diversas prácticas de microbiología.

I. EQUIPOS:

MICROSCOPIO

Aparato óptico formado por un juego de lentes que permiten la observación de la imagen

de un objeto amplificado. Existen varios tipos, siendo los más usados el óptico de campo

claro (hasta 2000x) y el electrónico (hasta 100000x), además existen otros con fines

específicos como los microscopios ópticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro y

el de contraste de fases. Es usado para reconocer características morfológicas, tintoriales y

detectar las diferentes estructuras que poseen los microrganismos.

Partes.

Mecánica.

Óptica.

Sistema de Iluminación.

A. Mecánica:

a) Pie.

b) Platina (Circular o rectangular fija o móvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren)

c) Tubo óptico, Revólver.

d) Sistema de Enfoque: Tornillos Micrométricos y Macrométricos (Cremallera)

B. Sistema Óptico:

a) Oculares: 05 – 10 – 20x

b) Objetivos: 05 – 10 – 40 – 100x

Objetivos de observación en seco y en inmersión.

C. Sistema de Iluminación:

a) Espejo: Plano y Cóncavo

b) Condensador.

c) Diafragma filtros.


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d) Fuentes de iluminación natural y artificial.

Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del

objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente.

Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden:

La elección de la iluminación depende de la fuente de luz, aumentos empleados y

otros factores.

Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo común

tiene un tope inferior que impide la ruptura de las láminas a observar.

Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado. Al

usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la

preparación. Al colocarse el objetivo en posición debe existir una continuidad

entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico.

Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.

Al terminar la observación limpie le objetivo con papel especial para lente,algodón o un lienzo fino, embebido con alcohol isopropílico o xilol en pequeña

cantidad y secar. Las láminas ya observadas, se depositarán en un recipiente de

boca ancha con solución sulfocrómica.

AUTOCLAVE

Destinado para la esterilización con calor húmedo y pres ión (121°C x 15’ a 15 Lbs/pulg2 ).

Permite la esterilización demateriales de desecho, medios de cultivo, ropa quirúrgica, agua

destilada, etc.

HORNO (Horno Pasteur o Poupinel)

Destinado para la esterilización a calor seco. La temperatura usual es 160 – 180°C por 1 – 2

horas. Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metálicos.

ESTUFA O INCUBADORA

Permite obtener temperaturas fijas permanentes gracias a un termostato. La temperatura

se elige según el requerimiento del microrganismo a cultivar. Generalmente es de 37°C.

REFRIGERADOR O NEVERA

Permite obtener temperaturas bajas y se utiliza con fines de conservación demicroorganismos, medios de cultivo, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a

temperatura de 0 a 4°C.


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CENTRIFUGA

Equipo de diversas capacidades y que permite separar una sustancia sólida en suspensión

del líquido respectivo. Se puede centrifugar orina o sangre para obtener el “sedimento

urinario” o “suero” respectivamente.

BALANZA

Se usa en bacteriología para pesar colorantes, medios de cultivo, reactivos, etc. Existen de

diferentes tipos según su aplicación y sensibilidad.

BAÑO MARIA

Permite la transmisión indirecta y atenuada de calor, de un líquido sobre una sustancia a

través de un recipiente contenedor. Evita el calor directo. Se usa entre otras cosas para

licuar medios de cultivo y para inactivar sueros. Existen diversos modelos según aplicación.

AGITADOR MECÁNICO

Equipo de diseño diverso y con frecuencia variable por el número de veces que oscilan por

minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y láminas excavadas.

POTENCIOMETRO

Equipo destinado a determinar la concentración de iones H (pH en una solución).

BOMBA DE VACIO

Produce presión negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable,

a través de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes.

CONTADOR DE COLONIAS

Utilizado para el recuento de colonias en una placa de cultivo, de manera más exacta y con

mayor facilidad.

II. MATERIALES DE VIDRIO

Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecánicas y cambios bruscos

de temperatura, tener bajo coeficiente de dilatación y una mínima cantidad de álcali libre.

PLACA PETRI

Formado por dos cristalizadores, haciendo de tapa el más grande y de base el más

pequeño. Existen en medidas de 10x60 y 15x100, encontrándose en el mercado incluso

con divisiones internas.


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PLACAS BREWER

Son más gruesas y pesadas que las anteriores. La tapa encaja perfectamente sobre la base,

dejando espacio sólo el necesario para colocar el medio de cultivo. Es usado generalmente

para el aislamiento y cultivo de microrganismos anaerobios.

TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo).

Presentes en tamaños variados y cuyas medidas se dan en mm del diámetro de la boca y el

largo del tubo. Los más frecuentes son de 13x100 mm, 16x150 mm y 18x150 mm. Una

variante de ellos posee tapa de bakelita y se emplea para realizar pruebas bioquímicas,

cepario, estudios de fermentación, reacciones diversas, etc. Los tubos para centrífuga son

de paredes gruesas y de fondo cónico, pueden tener graduación y sirve para reunir el

sedimento de los líquidos.

MATRACES Y BALONES

Recipientes de base esférica con fondo plano y forma cónica o de globo, con cuello de

boca ancha que termina en reborde. Existen con medidas volumétricas desde 50 ml hasta

5000ml, y son empleados para la preparación de medios de cultivo, colorantes, soluciones,

reactivos diversos, etc.

PIPETAS

De forma tubular y abierta en ambos extremos, graduado en su extremo proximal y son

usados para medir soluciones en cantidades pequeñas y exactas. Son de diversas clases:

Pipetas con bulbo, llamadas así por el abultamiento que presentan en su parte intermedia;

Pipetas de sangre, que poseen un pequeño bulbo y graduaciones que permiten relaizardiluciones en citometría hemática; también están las Pipetas Pasteur que no poseen

marcas ni graduaciones y son utilizadas para medir volúmenes pequeños.

Las pipetas poseen las siguientes abreviaturas: TC (Tocontainer), las que contiene un

determinado volumen , pero al vaciar no suministra la totalidad del líquido; y TD

(Todeliver), al vaciar la pipeta suministrará la totalidad del volumen especificado.

PROBETA

De paredes gruesas y graduadas, con base para estabilidad. Existen de diferentes

capacidades, de 10 a 1000ml, y son usadas para medir soluciones o sustancias líquidas.

FIOLAS

Matraces volumétricos con cuello largo y base globosa, poseen una línea de aforo y son

usados para la preparación de reactivos valorados.


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MATRAZ DE PRECIPITADO

Recipientes cilíndricos de boca ancha y con pico en el borde. Generalmente se usa para

preparar soluciones diversas.

LAMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS

Láminas de vidrio rectangulares o cuadrangulares con diferentes dimensiones, las más

comunes son de 65x35 mm y 22x22mm. Son usadas para hacer extensiones y coloraciones

de muestras biológicas y observaciones en fresco.

En otros materiales de vidrio pueden considerarse embudos, jeringas hipodérmicas,

frascos, goteros, baguetas, perlas de vidrio, etc.

III. OTROS MATERIALES

MANGOS DE KOLLE

Vástagos de metal con cubierta de ebonita (aislante de calor), en cuyo extremo distal

presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o micrón que formará el asa de

siembra. Usado en la toma de muestras de microrganismos y en la siembra de los mismos.

ESPÁTULAS DE METAL

Usado para pesar medios de cultivo y reactivos. Los de níquel no se oxidan.

TRIPODE

Soporte de tres pies generalmente de metal, empleados para soportar recipientes durante

el calentamiento.

Entre otros materiales también se consideran: soportes universales, agujas hipodérmicas,

gradillas para tubos de ensayo, rejillas de asbesto, tapones de jebe, mangueras de jebe,

papel indicador de pH, etc.

CUESTIONARIO

1. Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados.

2. Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri.

3. Qué material de laboratorio utilizaría para medir volúmenes pequeños y exactos?.

4. Qué equipo de laboratorio utilizaría para esterilizar medios de cultivo?.


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PRÁCTICA N°02

MEDIOS DE CULTIVO.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS – LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS

OBJETIVOS

Identificar y reconocer los medios de cultivo de uso frecuente en microbiología.

Conocer y describir los requerimientos nutricios necesarios para el crecimiento de

microrganismos.

Preparar y autoclavar medios de cultivo.

Conocer e identificar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de muestras

microbianas en medios de cultivo.

Conocer e identificar los tipos y características de crecimiento bacteriano en medios de

cultivo para su identificación final.

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

El término Cultivo hace referencia al crecimiento de microrganismos, por lo que los medios de

cultivo son sustancias nutritivas líquidas o solidas, que sirven en laboratorio para proporcionar

sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicación de los microorgansimos. Sus componentes

básicos deben satisfacer las exigencias nutricionales para el crecimiento microbiano y varian según

el tipo de bacteria.

Las condiciones que deben tomarse en cuenta para el crecimiento en medio de cultivo son:

Temperatura.

Grado de humedad.

Presión de oxígeno.

pH.

Los medios de cultivo permiten:

Crecimiento y desarrollo de microrganismos.

Aislamiento e identificación de los microrganismos. Clasificación de los microrganismos.

Obtención de productos microbianos.

Obtención de cepas microbianas para la fabricación de vacunas.

Obtención de toxinas para la síntesis de antitoxinas


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Para su crecimiento los microrganismos deben tomar del ambiente que lo rodea, todas las

sustancias que requiere para la síntesis de sus materiales celulares y energía. A estas sustancias se

les denomina nutrientes y un medio de cultivo debe tener la concentración adecuada de los

mismos acorde a los requerimientos específicos de los microrganismospara los que han sido

preparados. Y siendo los microrganismos extraordinariamente diversos, los medios de cultivo son

también muy diversos en cuanto a número y características nutricias.

AGUA

Para la preparación de medios de cultivo y reactivos diversos, sólo debe utilizarse agua destilada o

agua desmineralizada, libres de metales disueltos y compuestos bactericidas o bacteriostáticos.

EXTRACTO DE CARNE

Se puede usar cualquier marca de extracto de carne siempre y cuando produzca resultados

positivos, lo que no se debe usar es la infusión de carne.

PEPTONA

Es una proteína degradada para su fácil asimilación por los microrganismos. Se puede utilizar

cualquier peptona que previas pruebas conduzcan a resultados satisfactorios en el crecimiento de

microrganismos.

AZUCARES

Todos los azúcares usados para la preparación de medios de cultivo deben ser químicamente

puros y adecuados para propósitos bacteriológicos.

AGAR

Agente gelatinoso obtenido de algas marinas y que se emplea de forma granular o fragmentado

para la preparación de medios de cultivo.

REACTIVOS GENERALES

Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de

grado ACS o de calidad analítica.

COLORANTES

Para la preparación de los medios de cultivo sólo deben emplearse colorantes certificados.

A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el

crecimiento y desarrollo de diversos microrganismos heterótrofos.


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TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

A los medios de cultivo se les puede clasificar de las siguientes maneras:

I. SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

1. MEDIOS LIQUIDOS: Son los que se presentan en este estado. Se les denomina

Caldos.

2. MEDIO SÓLIDOS: Se preparan a partir de los medios líquidos , a los cuales se les

adiciona un agente gelificante, el Agar agar. Se les denomina Agares.

3. MEDIOS SEMISÓLIDOS: Se les prepara a partir de los medios líquidos y a los que

se les adiciona un agente gelificante pero en menor proporción que para los

sólidos.

II. SEGÚN LA FUNCIÓN QUE CUMPLEN:

1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales

mínimos para permitir el crecimiento de bacterias que no necesiten

requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar Nutritivo, Agar TSA

(Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc.

2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio común al

cual se le adiciona diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden

ser:

2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder

nutritivo como huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven

para cultivar microrganismos exigentes en sus necesidades nutricionales. de

Ejemplos:

Agar Sangre: Cuando a un medio común se le adiciona entre 5 y 10%

de sangre. Permite el cultivp de bacterias patógenas.

Agar Ogawa o Lowenstein – Jensen: Medio enriquecido que permite el

cultivo de Mycobacteriumtuberculosis(Bacilo de Koch).

Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura

entre 60 – 80°C, tomando el color chocolate característico. Sirve para


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el crecimiento de Neisseria meningitis (meningococo) y

Neisseriagonorrhoeae (gonococo).

Caldo Cerebro – Corazón (Brain, Heart Infusión. BHI): Sirve para

microrganismos exigentes.

Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de

microrganismos anaerobios exigentes.

2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de

favorecer el crecimiento y desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo

inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan sustancias con

efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibióticos o sales biliares. A

estos medios también se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos:

Agar Mac Conkey, para E.coli y otras enterobacterias.

Agar Cetrimide, para Pseudomonas.

Agar Manitol Salado, para estafilococos.

Agar MitisSalivarius, para estreptococos orales.

Agar Clindamicina, para Eikenellacorrodens.

Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el asilamiento de

Actynomicesviscosus, Actynomicesnaeslundi y

Actynomicesodontolyticus.

Agar TCBS, para Vibriumcholerae.

Agar Sabouraud, para hongos.

2.3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son los medios que permiten evidenciar las

actividades bioquímicas de un microrganismo frente a sustrato determinado,

cambiando sus características observables y permitiendo su identificación.

Ejemplos:

Medio Ox – Ferm, para procesos de Oxidación y Fermentación.

Citrato de Simmons, para determinar el uso del citrato como fuente

decarbono.


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TSI (Triple Azúcar Hierro), para determinar el uso de Lactosa, Glucosa

y producción de H2S.

LIA (Lisina Agar), para determinar el metabolismo de la Lisina.

Agar Manitol Salado, para determinar la reacción con el Manitol. Agar Urea.

Agar SIM.

2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los

microrganismos y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el

laboratorio. Ejemplos:

Medio Cary Blair.

Medio Stuart.

Medio Amies.

Caldo Hajna.

Caldo de Tioglicolato.

A veces se combina las características de cada un de estos medios y por lo tanto el medio

resultante será Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificación es flexible y se plantea con

fines didácticos.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIALES:

Agar común deshidratado.

Placas Petri.

Tubos de ensayo.

Mechero.

Algodón.

Gasa.

Papel kraft.

Hilo pavilo.


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Matraces o balones.

Cocina eléctrica.

Plumón marcador.

PROCEDIMIENTO

Pesar los medios respectivos en relación con los volúmenes requeridos.

Disolver los medios en agua destilada y hervir en un matraz.

Esterilizar en autoclave a 121°C/15PSI por 15’.

Repartir en placas y tubos dentro del área de seguridad que brinda el mechero.

Se comprueba la esterilidad de los medios colocándolos en la estufa a 37°C por 24 horas.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS – LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS

INTRODUCCIÓN

I. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a

las 24 horas y otras necesitan un periodo prolongado para alcanzar su máximo desarrollo. Por esta

razón la siembra es uno de los pasos principales e iniciales del estudio completo de unmicrorganismo y es indispensable ejecutarlo cumpliendo con las máximas condiciones de

esterilidad, desde la toma de muestra hasta la siembra, que debe ser efectuada a la brevedad

posible.

Es necesario precisar algunos términos:

SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto un microrganismo con el medio de

cultivo. Si el medio es sólido se formarán colonias y si el medio es líquido se observará turbidez,

sedimento, película, etc.

RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Consiste en extraer, con un asa o aguja de kölle, una fracción decolonia y sembrarla en un medio líquido o sólido, logrando así la pureza del cultivo.

TRANSPLANTE O REPICAJE: Consiste en la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo

adecuado contenido en un tubo. Conservándose la cepa pura y por seguidos transplantes en

medios especiales, se conocerá las propiedades culturales y bioquímicas, lográndose su

identificación específica de aquella. Los transplantes se pueden realizar:


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a) De líquido a sólido.

b) De líquido a líquido.

c) De sólido a líquido.

d) De sólido a sólido.

COLONIA: Es el conjunto de microrganismos resultantes del crecimiento y multiplicación en unmedio de cultivo sólido, y que está constituido por un mismo tipo de microrganismos.

CULTIVO PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus

características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.

CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonomía correspondiente.

MUESTRA BIOLÓGICA: Es cualquier material biológico de origen humano susceptible de

conservación y que alberga microrganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uñas,

pelos, fluido gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc.

TÉCNICAS DE SIEMBRA

La técnica de siembra a utilizar varía según el medio de cultivo a usar, ya sea líquidos o sólidos. Si

es líquido la Siembra por Inoculación será la indicada; si el medio es sólido las técnicas a usar

pueden ser Estría Simple, Por Puntura, Por Incorporación o Por Dispersión o Agotamiento.

SIEMBRA POR INOCULACIÓN

Con el asa de siembra previamente esterilizada, tomar una cantidad

suficiente de inóculo y ponerla en contacto con el medio líquido.

SIEMBRA POR ESTRÍA SIMPLE

Útil para estudio bioquímico y desarrollo bacteriano. Consiste en deslizar suavemente, en zigzag,

el asa de siembrasobre el medio de cultivo sólido contenido en una placa Petri o tubo.


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SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA

Sirve para estudio bioquímico bacteriano. Con la aguja de kolle, tomar una pequeña cantidad de

muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio

sólido(a); después al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estría simple(b).

SIEMBRA POR INCORPORACIÓN

Técnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaeróbicas facultativas o

microaerófilas. Consiste en diluir la muestra y añadir el medio de cultivo licuado y enfriado a 45°C,

luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.

a)

b)


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SIEMBRA POR DISPERSION O AGOTAMIENTO

Técnica utilizada para obtener colonias aisladas y consiste en repartir el inóculo sobre la superficie

del medio sólido en zigzag en 4 o 5 campos de la placa o también por estría simple en toda la

placa.

MATERIALES

Agar TSA en placas y tubos.

Caldo nutritivo.

Mechero.

Asas de siembra.

Aguja de kölle.

Hisopos.

Solución salina fisiológica.

Tubos de ensayo

Láminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO

Identificar la técnica adecuada para la siembra y proceder a realizarla ya sea en un medio

líquido o sólido. Siempre con el asa o aguja de siembra esterilizada antes y después de suuso.

La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volver a tapar.

Las manipulaciones de siembra se deben realizar en el área de seguridad que brinda el

mechero.

Una vez realizada la siembra y rotuladas las placas y tubos, proceder a incubar en la estufa

a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se hace la lectura correspondiente.

Giro de placa

45°

45°45°

45°


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LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS

Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio,

se podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre si, llamadas colonias en medio

sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.

Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un

punto del medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus

características de especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

FORMA: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

ELEVACIÓN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.

SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada.

TAMAÑO: Diámetro en milímetros.

CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa, mucosa.

CROMOGENENESIS: Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente, translúcido, opaco.


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MATERIALES

Cultivos en placa Petri, sembradas por técnicas diversas.

Cultivos en medio diferenciales de diferentes microrganismos.

Set de coloración Gram.

Lápices. Gradilla.

Microscopio.

Aceite de cedro.

PROTOCOLO

TÉCNICA DE SIEMBRA DESCRIPCIÓN DE LA SIEMBRA MEDIO DE CULTIVO USADO

ESTRÍA SIMPLE

DISPERSIÓN AGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIÓN

CARACTERISTICAS DE LA COLONIA OBSERVACIÓN DE COLONIAS MEDIO DE CULTIVO USADO

FORMA

ELEVACIÓN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAÑO

CONSISTENCIA

CROMOGÉNESIS

GRADO DE TRANSPARENCIA

RESULTADO DE SIEMBRAS REALIZADAS:


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CUESTIONARIO

1. Investigue y señale la composición del Agar Nutritivo y Agar Sangre.

2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia.

3. esquematice las precauciones que se debe tener en la preparación de los medios de

cultivo: pesado, preparado y autoclavado.

4. Cuál es el fin de usar una siembra por estría simple?

5. Cuál es el objetivo de la siembra por estría por dispersión o agotamiento?

6. Para qué sirve la siembra por puntura?

7. De sus placas y tubos sembrados, describa las características morfológicas de las colonias

encontradas.

8. Esquematice y dibuje lo realizado.


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PRÁCTICA N° 03

TINCIONES BACTERIANAS

OBJETIVOS

Identificar y reconocer los colorantes y las principales técnicas de coloración utilizadas enBacteriología.

Identificar y reconocer la estructura y morfología bacterianas.

INTRODUCCION

COLORANTE: Sustancia química de origen natural o sintético que otorga color.

Por su naturaleza, se clasifican en colorantes naturales y artificiales.

Naturales: Son de origen animal y vegetal. Ejemplo: El Carmín es obtenido de la cochinilla,

la hematoxilina y el tornasol que son obtenidas de las plantas. Artificiales o Sintéticos: Obtenidos como derivados del carbón de piedra o hulla. Son

conocidos como anilinas. Ejemplo: azul de etileno, safranina, violeta de genciana, atc.

Por su afinidad tintorial, es decir de acuerdo al comportamiento químico del colorante, se clasifica

en:

a) Colorantes Ácidos

b) Colorantes Básicos.

c) Colorantes Neutros.

a) Colorantes Ácidos: Se dice que un colorante es ácido o aniónico, cuando la parte básica o

catiónica es incolora y la parte ácida o aniónica es coloreada, teniendo afinidad poe le

citoplasma. Ejemplo: Ácido pícrico, Eosina, Fucsina ácida, etc.

b) Colorantes Básicos: Son los colorantes que tienen la parte básica o catiónica coloreada y la

parte ácida o aniónica incolora. Tienen afinidad por el núcleo. Ejemplo: Violeta de

genciana, Fucsina básica, Tionina, etc.

c) Colorantes Neutros: Son los colorantes que tienen la parte ácido y básica coloreada y

tiñen al núcleo de un color y al citoplasma de otro. Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright,

Eosinato azul de metileno, etc.

COLORACIÓN O TINCIÓN

Proceso en el que se produce un intercambio de iones entre los colorantes y los sitios activos de la

superficie o del interior de la célula.


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Las coloraciones según el número de colorantes pueden ser:

A) Simples

B) Diferenciales

C) Especiales

A) COLORACIONES SIMPLES.

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para la observación de la

morfología de los microrganismos. Ejemplos: Coloración de azul de metileno, Tinta china y

la de azul de lactofenol.

B) COLORACIONES DIFERENCIALES.Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante. Generalmente al primer

colorante se le denomina Colorante Primario, mientras que al segundo se le denomina

Colorante Secundario o de Contraste. Permiten observar diferencias entre células

bacterianas o partes de la estructura bacterianas. Ejemplos: Coloración Gram y Coloraciónde ZiehlNeelsen (también llamada ácido alcohol resistente).

C) COLORACIONES ESPECIALES.

Cuando se utilizan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares.

Ejemplo: Giemsa, Wrigth, Leishman, Vago, etc.

PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN:

a) Extensión: Consiste en colocar la muestra sobre una lámina portaobjetos, extendiéndola

uniformemente.

b) Fijación: Fijar la muestra sobre la lámina portaobjeto utilizando alcohol, éter o flameado

suavemente sobre el mechero o simplemente dejarlo al medio ambiente.

c) Tinción: Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad por un

tiempo determinado.

d) Lavado: Enjuagar usando un chorro suave de agua.

e) Secado: Dejar secar la lámina al calor del mechero.

f) Observación: Observar con el objetivo de inmersión usando el aceite de cedro.

COLORACION DE AZUL DE METILENO

1. Prepara un frotis con la muestra bacteriana y fijar al calor.2. Cubrir el frotis con 3 gotas del colorante azul de metileno y dejar actuar por 3 – 5 minutos.

3. Lavar con chorro tenue de agua y dejar secar.

4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.

RESULTADO: Los microrganismos se observan de color azul intenso.


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PROTOCOLO

COLORACION SIMPLE MORFOLOGÍA DELMICROORGANISMO

ESQUEMA DE LAOBSERVACIÓN

AZUL DE METILENO

COLORACIÓN GRAM

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular y 2/3 para la preparación del frotis.

2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en

el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, paraobtener una preparación en capa fina.

3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis por flameado con la ayuda del

mechero.

4. Colocar la lámina sobre la varilla o puente de coloración.

5. Cubrir el frotis con 03 gotas de Cristal Violeta (colorante primario), dejar actuar por 2

minutos.

6. Lavar con agua corriente (evitar la caída directa del chorro sobre el frotis).

7. Cubrir con Lugol durante 1 – 2 minutos.

8. Lavar con agua.

9. Decolorar el frotis con la solución de Alcohol Acetona (inclinar la lámina y decolorar hastaque no arrastre colorante), máximo por 30 segundos.

10. Lavar con agua.

11. Cubrir con 03 gotas del colorante de contraste Safranina durante 2 minutos.

12. Lavar con agua.

13. Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de la llama del mechero.

14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.


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RESULTADO: Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas

de color rojo grosella o rosado.

PROTOCOLO

CATEGORÍA BACTERIANAMORFOLOGÍA BACTERIANA


GRAMPOSITIVAS

GRAMNEGATIVAS


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COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

1. Cubrir el frotis con 05 gotas de Fucsina Fenicada y calentar la preparación con el mechero

de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por

03 veces, evitando que hierva el colorante.

2. Lavar con agua corriente.3. Decolorar con Alcohol Ácido hasta que se aprecie una coloración rosada, máximo hasta 01

minuto.

4. Lavar con agua corriente.

5. Cubrir con el colorante de contraste, Azul de Metileno, 03 gotas, durante 01 minuto.

6. Lavar con agua corriente.

7. Secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADO: Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido

alcohol resistente se tiñen de color azul.

PROTOCOLO

LÁMINA MORFOLOGÍA DELMICROORGANISMO


COLORACIÓN DE ZIEHLNEELSEN


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CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol?

2. ¿Cuáles son los componentes del azul de metileno?

3. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?

4. ¿A qué se debe que las bacterias Gramnegativas no retengan el complejo cristal violeta-yodo?

5. ¿A qué se debe que los colorantes básicos tiñan el núcleo de la célula?

6. ¿Con qué clase de colorante teñiría el protoplasma de la célula?

7. ¿Para qué clase de microrganismos es recomendable la coloración ácido alcohol

resistente?

8. ¿Cuál es la función de la fucsina fenicada?

9. ¿A qué se denomina colorante primario y colorante de contraste?


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PRÁCTICA N°04

INMUNOLOGIA

REACCION ANTIGENO ANTICUERPO - FAGOCITOSIS

OBJETIVOS:

Reconocer, identificar y describirlas fases de la fagocitosis.

Reconocer la aglutinación como una reacción antígeno anticuerpo.

INTRODUCCION

La aglutinación es un proceso inmunológico resultante de una reacción antígeno – anticuerpo, en

el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas

pueden ser bacterias, eritrocitos, partículas de látex, etc., y se encuentran recubiertas en forma

natural o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse

con antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables asimple vista o con lentes de poco aumento.

Existen muchos métodos para demostrar la aglutinación, de los más conocidos son la

Determinación del Grupo Sanguíneo y la Prueba de Widal (aglutinación bacteriana).

REACCION ANTIGENO ANTICUERPO

I. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

Es un método para decirle cuál es el tipo específico de sangre que usted tiene. El tipo de sangre

que usted tenga depende de si hay o no ciertas proteínas, llamadas antígenos(Aglutinógenos), ensus glóbulos rojos, los cuales al ponerse en contacto con los Anticuerpos (Aglutininas), van a

formar el complejo Ag-Ac que será visible a través de la aglutinación.La sangre a menudo se

clasifica de acuerdo con el sistema de tipificación ABO. Este método separa los tipos de sangre en

cuatro categorías:Tipo A, Tipo B, Tipo AB y Tipo O.

El tipo de sangre (o grupo sanguíneo) depende de los tipos que haya heredado de sus padres.

MATERIALES

01 Lanceta.

01 Micropipeta. 01 Placa de toque.

Antisueros Anti A, Anti B y Anti D.

Palitosmondadientes.

Alcohol yodado.

Algodón.


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PROCEDIMIENTO

Con una lanceta realizar un pequeña injuria en el pulpejo del índice derecho.

Con una micropipeta tomar 03 gotas de sangre y colocarlas en la placa de toque.

Colocar una gota de cada uno de los antisueros (Anti A, Anti B y Anti D) en las gotas

respectivas. Mezclar con la ayuda de un mondadiente distinto para cada una de las gotas.

Rotar la placa de toque durante 2 o 3 minutos y observar la presencia de aglutinación.

INTERPRETACION

Tipificación ABO:

Si sus glóbulos sanguíneos se pegan o aglutinan al mezclarse con:

Suero anti-A, usted tiene sangre tipo A.

Suero anti-B, usted tiene sangre tipo B. Sueros anti-A y anti-B, entonces usted tiene sangre tipo AB.

Si los glóbulos sanguíneos no se pegan o aglutinan cuando se agrega suero anti-A y anti-B, usted

tiene sangre tipo O.

Tipificación del Rh:

Si los glóbulos sanguíneos se pegan o aglutinan al mezclarlos con suero anti-Rh (Anti D),

usted tiene sangre de tipo Rh positivo.

Si la sangre no coagula al mezclarse con suero anti D, usted tiene sangre de tipo Rh

negativo.

PRUEBA DE WIDAL

La reacción de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los

antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre

tifoidea.

En la reacción de Widal, también hay que considerar los falsos negativos como toda pruebade laboratorio, entre sus causas tenemos:

Antibioticoterapia temprana, la cual, retrasa la aparición de anticuerpos (descritoprincipalmente con cloranfenicol).

Utilización de corticosteroides.

Medición temprana de anticuerpos (primera semana).

Inmunodeficiencias adquiridas y congénitas.

Portadores crónicos de Salmonella typhi.

Relacionadas a estandarización de la prueba.


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MATERIALES

Lámina excavada para aglutinación.

Antígenos bacterianos: Tifico O y Tifico H.

Suero del paciente.

Piepetas serológicas de 0.2 ml. Palitos mondadientes.

PROCEDIMIENTO

Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocillos de una

lámina de vidrio excavada.

Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero del paciente.

Mezclar con ayuda de un mondadiente distinto para cada gota.

Hacer rotar la lámina por espacio de 2 a 3 minutos y realizar observación.

INTERPRETACION

La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tienden a agruparse

en la periferia de la gota.

II. FAGOCITOSIS

Esun tipo de endocitosis por el cual algunas células rodean con sumembrana

citoplasmática partículas sólidas y las introducen al interior celular, formando alrededor de él

una vesícula, llamada fagosoma, la cual se fusiona posteriormente con lisosomas ( fagolisosoma)

para degradar el antígeno fagocitado.

Es un fenómeno inespecífico, que se incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos y

complementos. Entre las células fagociticas se encuentran los polimorfonucleares y los

macrófagos (monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los

antígenos más susceptibles a la fagocitosis de les denomina Opsoninas.

Las fases de la fagocitosis son:

a) Quimiotaxis: las células fagocitarias se acercan a los antígenos.

b) Adherencia: La unión a receptores sobre la membrana de los leucocitos y otros fagocitos

actúan como mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos

microbianos específicos o sobre opsoninas del sistema inmune del hospedador.

c) Ingestión:La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación

intracelular que resultan en la evaginación de la membrana del fagocito rodeando al

receptor y su ligando patogénico, formando el Fagosoma.

d) Digestión:Intervienen los lisosomas, los cuales se unen al fagosoma conformando

un fagolisosoma, y liberando enzimas hidrolíticas que destruirán al antígeno.

e) Excreción: La forma de deshacerse de estos residuos es mediante la exocitosis.


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FAGOCITOSIS IN VIVO

MATERIALES

Cultivo de Candida.

Ratones.

Estuche de disección.


Jeringa de tuberculina.

Cámara de éter.

Colorante Wright.

Agua tamponada.

Alcohol yodado.

Algodón.

PROCEDIMIENTO

Inocular un ratón albino con 0.5 ml de cultivo de candida calentado por viaintraperitoneal.

Dejar el ratón en reposo por unas 03 horas, controlándosele periódicamente.

Sacrificar el ratón con la ayuda de la cámara de éter y ubicarlo de cubito dorsal sobre un

campo e papel kraft de 30x30.

Realizar una incisión vertical a lo largo del abdomen y exponer las vísceras.

Con la lámina portaobjeto hacer una impronta del líquido peritoneal y fijarla a

temperatura ambiental.

Realizar Coloración Wright.

Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Identificar las células fagocitarias y las fases de la fagocitosis.

CUESTIONARIO

1. Elabore un cuadro con los resultados obtenidos en la práctica.

2. Grafique los procedimientos realizados en la práctica de laboratorio.

PRÁCTICA N°05

PRIMERA PRÁCTICA CALIFICADA


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PRÁCTICA N°06

PRUEBAS BIOQUIMICAS BACTERIANAS

OBJETIVOS:

Reconocer e identificar los diferentes sistemas enzimáticos usados en el metabolismo

bacteriano.

Utilizar las características metabólicas para el aislamiento e identificación bacteriana.

INTRODUCCIÓN

La identificación bacteriana en forma inicial pude realizarse mediante la determinación de las

características de las colonias y a través de las diferentes tinciones; sin embargo para identificar

una bacteria desconocida a nivel de género y especie, no basta con un aislamiento, sino que deben

llevarse a cabo ciertos estudios de los sistemas enzimáticos que son únicos para cada género yespecie y sirvan como marcadores de identificación.

A nivel de laboratorio, estos sistemas enzimáticos se van a identificar sembrando una porción de

colonia bacteriana aislada en los diferentes medios de cultivos que contienen sustrato e

indicadores químicos específicos que nos permiten detectar cambios de pH o la presencia de

subproductos específicos, características que nos permitirán la identificación bacteriana.

I. REACCIONES DE OXIDACION – FERMENTACION DE AZUCARES

MEDIO TSI (Triple SugarIron)

Este medio de cultivo fue diseñado para la diferenciación de bacilos gramnegativos,

basándose en la capacidad de estas bacterias para fermentar azúcares, producir sulfuro

de hidrogeno (H2S) y producir Gas.

El medio contiene tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de

1:10:10 respectivamente, y para detectar los productos ácidos generados, se emplea u

indicador de pH, el rojo fenol, cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8

(amarillo). Los patrones de fermentación de los bacilos gramnegativos ante los azúcares

presentes en el medio, pueden ser fundamentalmente tre:

a) Fermentación de glucosa únicamente.b) Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos

carbohidratos.

c) No fermentación de carbohidratos.

Como producto de fermentación de los azucares, se puede formar Gas, que se detecta por

la presencia de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.


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De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre

para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de

color negro insoluble denominado Sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL

Tubo con TSI en plano inclinado.

Cepas de control: Escherichiacoli,StaphylococcusaureusySalmonellatyphi .

PROCEDIMIENTO

Con el asa de kolle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI.

Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION

1. FERMENTACIÓN DE AZUCARES

Alcalina/alcalina: Lactosa y Sacarosa (-), Glucosa (-)(K/K): Rojo/rojo o anaranjado

Ejemplo: Pseudomonas

Acida/Acida: Lactosa y Sacarosa (+) y Glucosa (+)(A/A):Amarillo/ amarillo

Ejemplo: E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, etc

Alcalina/Acida: Lactosa y Sacarosa (-) y Glucosa (+)(K/A): Rojo/amarillo

Ejemplo: Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -), Yersinia.

2. PRODUCCION DE H2S

Producción de pigmento negro en fondo de tubo: H2S (+)

No pigmento negro en fondo de tubo: H2S (-)

3. PRODUCCION DE GAS

Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio : Gas (+)

No burbujas, no grietas, no desplazamientos: Gas (-)

II. PRUEBA DE LA CATALASA

La Catalasa es una enzima que posee la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias

facultativas y que va a convertir el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxigeno, de

acuerdo a la siguiente reacción:

2H2O2 2H2O + O2


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El peróxido de hidrogeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los

carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.

Esta prueba es vital para la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) y los

estafilococos (catalasa positiva)

MATERIALES

Cepas control: S. aureus y Streptococcus o Enterococcus.

Solución de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3%.

Láminas portaobjeto.

Asa de siembra.

Gotero.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de siembra estéril, transferir parte el inóculo a una lámina portaobjeto. Añadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.

Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después de añadir las gotas

de H2O2 al 3%.

Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.

Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos

más viejos pueden perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Además

evitar el contacto de peróxido de hidrogeno con la piel.

INTERPRETACION

Formación de burbujas o efervescencia : Catalasa Positiva.

No formación de burbujas y efervescencia : Catalasa Negativa.

Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el

H2O2 dando pocas burbujas diminutas durante 20 – 30´, estas no son Catalasa positiva.

III. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los Citocromos son hemoproteínas que actúan como último eslabón de la cadena

respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formación de agua. Este

sistema de citocromos se encuentran en los microrganismos aerobios y anaerobios

facultativos, permitiéndonos identificar a los microrganismos que carecen de la enzima y

los anaerobios anaerobios estrictos.

En laboratorio se ahce reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o

tetrametil - p – fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solución, discos

o tiras llamados comúnmente oxidasa.


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MATERIAL

Cepa control: sembrada previamente en agar nutritivo.

Reactivo oxidasa.

Goteros.

PROCEDIMIENTO

Método Directo: Se añade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas

02 o 03 gotas del reactivo oxidasa.

INTERPRETACION

Colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa viran a color lavanda :

Oxidasa Positivo

Colonias bacterianas sin actividad citocromo oxidasa no viran de color :

Oxidasa Negativo

IV. PRUEBA DEL MANITOL

Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial

que permite el crecimiento de estafilococos, y que en su composición cuenta con el

sustrato Manitol, el cual tras su fermentación se libera ácidos que serán detectados por el

indicador rojo fenol el cual hará viraje a color amarillo.

Esta prueba permite diferenciar Staphylococcusaureus del Staphylococcusepidermidis y

otras especies perteneciente a este género bacteriano.

MATERIAL

Cepas de S.aureus y S. epidermidis.

Placas Petri con agar manitol salado.

Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO

Realizar siembra por estría simple de ambas cepas bacterianas.

Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION :A la observación macroscópica de las colonias bacterianas en agar

manitol salado:

Presencia de colonias amarillas y medio con halos de color amarillo :

Manitol Positivo

Presencia de colonias blancas o cremas con medio sin cambio de color:

Manitol Negativo


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V. PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS

Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden

ser detectadas al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la

lisis de los eritrocitos. Esta capacidad de los microorganismos se relaciona directamente

con su virulencia y patogenicidad. Ahora según el tipo de lisis que producen se puedenclasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y

Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa.

MATERIAL

Cepa bacteriana.

Placas con Agar Sangre.

PROCEDIMIENTO

Con el asa de kölle realizar una siembra por estria simple en una placa con agar

sangre.

Incubar a 37°C por 24 horas.

INTERPRETACION

Hemólisis Parcial ------- Presencia de halos verduzcos grisáceos -------- Hemólisis Alfa

Hemólisis Total ------- Presencia de halos transparentes -------- Hemólisis Beta

No hemólisis ------- No presencia de halos -------- Hemólisis Gamma

En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del

tipo de la metahemoglobina, que al ser oxidado ser convierte en un compuesto del tipo dela biliverdina.

VI. PRUEBA DE LA COAGULASA

La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la

conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre

diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la

muestra contiene S. aureus.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama

staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina.

Esto hace que se coagule la sangre.

La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y

puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que

está cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que

esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.


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MATERIALES

Cepa de S.aureus y S. epidermidis.

Tubos con plasma sanguíneo.

Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO Con el asa de kölle, realizar una siembra por inoculación en los tubos de plasma

sanguíneo.

Incubar a 37°C por 4 horas.

INTERPRETACION

Si hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Positivo

No hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Negativo

VII. PROTOCOLO

PRUEBA BIOQUIMICA MEDIO DE CULTIVO REACTIVO OINDICADOR

LECTURA

TSI:a) Glucosa:b) Lactosa:c) H2Sd) Gas

CATALASA

CITOCROMO OXIDASA

MANITOL

HEMOLISINAS

COAGULASA

CUESTIONARIO:

Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioquímicas

anteriormente realizadas.


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PRÁCTICA N°07

PRUEBA DE DIAGNOSTICO VIROLOGICO

PRUEBA DE DIAGNOSTICO MICOLOGICO

OBJETIVOS Reconocer la metodología para diagnosticar micosis en el laboratorio.

Reconocer las principales características macro y microscópicas de los hongos.

Identificar las especies de interés médico – estomatológico.

Reconocer la metodología para el diagnóstico de laboratorio para virus.

Identificar virus de interés médico – estomatológico.

INTRODUCCION

MICOLOGIA

Ciencia que estudia a los hongos, organismos eucariotas, cuyas paredes celulares estáncompuestas principalmente por Quitina, y además porglucano, manano, celulosa, etc; es decir

carbohidratos complejos. Además son seres heterótrofos, no realizan fotosíntesis (no tiene

clorofila). Existen aproximadamente 150000 especies de hongos, de ellos 100 más o menos son

patógenos, otros son no patógenos y un gran grupo son utilizados en diversas industrias.

Desde el punto de vista celular, los hongos pueden ser de dos tipos:

Unicelulares o Levaduriformes.

Pluricelulares o Miceliales.

MATERIALES

Placas con Agar Sabouraud.

Azul de lactofenol.


Microscopio binocular.

PROCEDIMIENTO

Observación de características de hongos superficiales de frutas o pan.

Obtener parte de la muestra anterior y realizar coloración con azul de lactofenol.

Siembra de muestra de esputo y saliva en placa con agar sabouraud e incubar a 37°C por

72 horas.

Toma de muestra ambiental en placa con agar sabouraud y mantener a temperatura

ambiente por 72 horas.

RESULTADOS


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Determinar las características morfológicas macro y microscópicas.

Determinar las características macroscópicas de los hongos que han crecido en las placas

con agar sabouraud.

VIROLOGÍA

Ciencia que estudia a los virus, organismos parásitos intracelulares obligados, que poseen un solo

ácido nucleico (ADN o ARN), protegido por una estructura denominada Cápside y algunos

presentan Envoltura.

Para estudio en laboratorio se utiliza a los bacteriófagos, descubiertos en 1915 por Twort, quien

aportó mucho en los estudios de organización y replicación del material genético. Existe un

bacteriófago para cada especiebacteriana, debida a los receptores específicos existente en las

bacterias. La acción de los bacteriófagos en ellas puede ser:

Interacción Lítica, donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria.

Interacción Transformadora, donde el genoma viral se integra al genoma del huésped.

El ciclo de multiplicación viral se divide en:

Absorción : Atracción cónica y receptores específicos.

Penetración: Ingreso del citoplasma viral al huésped.

Multiplicación, en la bacteria receptora.

Los virus respiratorios son los principales responsables de las afecciones respiratorias, que

incluyen:

Cuadros respiratorios altos: Virus de la Influenza y el Adenovirus. Producen resfriado común y gripe: Rhinovirus.

Afecciones de vías respiratorias bajas y bronquitis: Virus Respiratorio Sincisal.

Producen Traqueitis y neumonitis: Virus de Parainfluenza.

PROCEDIMIENTO: INOCULACIÓN DE HUEVOS EMBRIONADOS

Vía Alantoidea:

Visualizar al embrión en el ovoscopio, marcar el ojo del embrión y la cámara de aire.

Perforar la cáscara en el borde de la cámara de aire.

Usando una jeringa de 01 cc con aguja calibre 22, inocular a través de la perforación de lacáscara y en un ángulo de 45° en relación al eje longitudinal del huevo y alejado del

embrión en la zona libre de vascularización, inyectar 0.1 de cristal violeta como muestra.

Vía Amniótica:

Visualizar en la forma anterior.

Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.


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Usando una jeringa de 01 cc con aguja calibre 22, inocular a través de la perforación de la

cáscara y en dirección del embrión, inyectar 0.1 de safranina como muestra.

RESULTADO

Observar sus resultados depositando el contenido del huevo embrionado en una placa

Petri.

CUESTIONARIO

1. Esquematizar los resultados de los procedimientos realizados en Micología.

2. Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.


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PRÁCTICA N°08

PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO PARASITARIO

OBJETIVOS

Identificar, reconocer y describir las características morfológicas básicas de los parásitos.

Reconocer los principales parasitos protozoos.

Reconocer los principales parásitos metazoos.

Identificar las métodos de diagnóstico de labopratorio usados para identificar protozoos y

metazoos.

INTRODUCCION

Las enfermedades asociadas a protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en

la población mundial algunas de ellas acompañadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso

del paludismo y la tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos intestinales

como Giardialamblia y Entamoebahistolytica son causa de mal nutrición, pérdida de peso

y diarreas severas; otros, como Plasmodiumsp, Trypanosomasp y Leishmaniaproducen afecciones

cardíacas y del SNC, dañan las membranas mucosas, la piel y diferentes órganos de la economía.

Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y complejos. El conocimiento de éstos

permite realizar una toma de la muestraen el momento adecuado con el fin de observar el agente

biológico y con ello realizar el diagnóstico certero de la enfermedad. Demostrar e identificar el

agente infectante se considera la regla de oro en el diagnóstico parasitológico.

Diagnóstico de los protozoos sanguíneos: Dentro de los protozoos sanguíneos se destacan por su

incidencia e importancia epidemiológica Plasmodiumsp, Trypanosomacruzi, Trypanosomabrucei y

Leishmaniadonovanii.

Toma de la muestra: Es necesario tener en cuenta el período en el cual el parásito de

acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre (parasitemia) o se encuentra presente

en determinados órganos y/o tejidos (sitios de inoculación) en los que produce lesiones

características. Atendiendo a ello las muestras pueden ser: Sangre periférica, Tejidos,

LCR, Exudado de las lesiones, Aspirado del chancro inicial o del ganglio linfático.


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Métodos de diagnóstico: Pueden ser indirectos o directos. Los primeros se basan en la

determinación de la respuesta inmune del organismo ante la infección parasitaria a través

de pruebas inmunoserológicas y los directos se sustentan en la observación de las formas

parasitarias. Los métodos directos son los más empleados. Estos pueden ser:

o Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de sangre entre cubre y

portaobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco de 40x.

o Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre sobre un portaobjeto, se seca

al aire y se fija con metanol. Teñimos por el método de Giemsa y observamos al

microscopio con objetivo de inmersión (100x).

Dentro de los protozoos intestinales se destacan por

su interés clínico Entamoebahistolytica y Giardialamblia.

Toma de la muestra: La muestra ideal son las heces las que deben ser colectadas

preferiblemente en un recipiente de cristal o plásticocorrectamente lavado y seco. Deben

ser además frescas (recién emitidas) y procesadas rápidamente en particular cuando

queremos observar los trofozoítos de estos parásitos. De no ser posible el procesamiento

inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden ser:refrigeración a 4°C,

en formol al 5 ó 10 %, alcohol polivinílico (PVA) ó en una solución de Mertiolato-yodo-

formol (MIF). La muestra debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocadoen el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las sustancias aquí presentes

pueden dañar los trofozoítos. En los parasitismos es común que no se excreten

constantemente las formas parasitarias, este fenómeno está estrechamente relacionado

con el ciclo de vida del parásito y se conoce como fase de excreción negativa, por tal

motivo se recomienda siempre indicar de tres a seis exámenes de heces con un periodo de

dos a tres días entre uno y otro (exámenes seriados). En los casos de alta sospecha clínica

de giardiosis se puede obtener también una muestra de aspirado duodenal o de biopsia

duodenal para realizar el diagnóstico, siempre que los análisis de las heces hayan

resultado negativos.

Métodos de diagnóstico:

o Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca una pequeña porción de las

heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solución salina


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fisiológica, se coloca sobre la preparación una lámina cubreobjeto y se examina al

microscopio con objetivo de 40x.

Los metazoarios o helmintos son mucho más complejos que los protozoos, sus células se agrupan

formando órganos y tejidos; se reproducen sexualmente pudiendo ser hermafroditas o presentar

sexos separados. Son ovíparos con excepción de filarias, Dracunculusspp y Trichinellaspp, que son

vivíparos.

Los helmintos incluyen dos Phylum o clases:

Platelmintos: gusanos de cuerpo plano, entre los que se incluyen:

Cestodos: Son hermafroditas, tienen el cuerpo plano y segmentado, y cuando parasitan al

hombre en su estadio adulto, se ubican en intestino delgado. El órgano de fijación es el

escólex, provisto de estructuras especialmente adaptadas para esta función, estas pueden

ser ventosas y bótrides o ganchos. Del escólex surge un cuello del que se genera el cuerpo,

por brotación, constituido por segmentos, denominados proglótides. Cada proglótide es

una unidad funcional completa; a medida que se alejan del cuello van madurando,

denominándose a los más distantes proglótides maduros. En ellos el útero ocupa casi su

totalidad y se encuentran repletos de huevos, los que se liberarán al romperse los

segmentos. Se los conoce como tenias por ejemplo Taeniasaginata, Taeniasolium,

Echinococcusgranulosus, etc.

Trematodos: A excepción del género Schistosoma, también son hermafroditas y su cuerpo

es chato pero indiviso. El estadio adulto es parásito de vertebrados, está cubierto por una

cutícula resistente y presentan discos suctorios, órganos de fijación, en la cara ventral.

Poseen un tubo digestivo incompleto que se inicia en la boca, llamada citostoma. Poseen

un poro genital por donde se eliminan los huevos. El ciclo evolutivo es indirecto y cumplen

parte de él en el agua. Los huevos, a excepción del género Schistosoma, presentan un

opérculo por el que se libera la larva, denominada miracidio. El primer huésped

intermediario es un molusco, puede haber un segundo huésped intermediario

dependiendo de la especie.

Nematelmintos o Nematodos: Son gusanos cilíndricos, tienen sexos separados. Su cuerpo está

recubierto por una cutícula, con cavidad pseudocelómica, tubo digestivo completo que se inicia en


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la boca y termina en el ano. La boca está rodeada por tres labios, salvo en las uncinarias que

presentan una cápsula bucal con elementos cortantes; estas estructuras producen pequeños pero

múltiples traumas en la mucosa intestinal que contribuyen a la producción de la anemia

macrocítica que suele asociarse a estas parasitosis. Los huevos tienen diferentes características

que son útiles para el diagnóstico de las diversas especies. Del huevo se liberará una larva, en el

tubo digestivo o en el medio ambiente. Los estadios larvarios son varios y se producen mudas

entre estadio y estadio. El hombre se infecta por vía oral, como en el caso de Ascarislumbricoides,

por vía cutánea, como en el caso de las uncinarias o por vía parenteral, como por ejemplo las

filarias. Sólo unas pocas especies son parásitos del hombre y existen, a diferencia de los cestodes y

trematodes, muchos nematodos de vida libre.

MATERIALES

• Frotis de sangre periférica teñido con Giemsa.

• Láminas portaobjetos y cubreobjetos

• Microscopio óptico

• Muestras de heces conservadas en formol

• Aplicadores

• Guantes

• Lugol

PROCEDIMIENTO

Para el examen de las heces, guarde las medidas adecuadas de bioseguridad, colóquese los

guantes y mascarilla antes de proceder:

Coloque en la lámina portaobjeto una gota de reactivo de lugol.

Con un aplicador tome una pequeña porción de heces y mezclela con la gota de lugol en el

portaobjetos haciendo un pequeño círculo. (Utilice una lámina para cada muestra).

Coloque encima una lámina cubreobjetos.

Lleve la lámina al microscopio óptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr

una imagen nítida, pase al objetivo de 40x.


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Observe detenidamente las características de los quistes observados y realice en su

cuaderno un esquema de las diferentes formas parasitarias.

Para observar la lámina de sangre periférica:

Adicione sobre la preparación una gota de aceite de inmersión

Enfoque con objetivo de inmersión 100x

Realice en su cuaderno un esquema de las características de las formas

de Plasmodium observadas.

RESULTADOS

Realice un esquema de lo observado en cada una de las preparaciones.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las formas infectantes de Giardialamblia y Entamoebahistolytica y cuáles sonsus características más sobresalientes?

2. ¿Qué requisitos deben cumplir las muestras de heces para estudio parasitológico y en

particular para la búsqueda de protozoos intestinales? ¿Qué otra muestra puede ser útil

para el diagnóstico de la giardiosis?

3. Ante un paciente con sospecha clínica de paludismo, ¿Qué examen usted indicaría? ¿qué

muestra sería necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este parásito, ¿qué

formas parasitarias pudiera encontrar en dicha muestra?.

4. Elabore un cuadro comparativo entre los platelmintos y nematelmintos.

5. Elabore un cuadro comparativo entre cestodos y trematodos.

PRÁCTICA N°09

EXAMEN PARCIAL


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PRÁCTICA N°10

BACTERIAS GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS DE INTERES ORAL Y GENERAL

OBJETIVOS:

Reconocer, identificar y describir los principales géneros y especies bacterianasgrampositivas.

Identificar y describir las principales pruebas bioquímicas utilizadas para el reconocimiento

delas bacterias grampositivas.

Identificar y diferenciar las especies de Neisserias mediante las diferentes técnicas de

laboratorio.

Identificar y diferenciar las diferentes enterobacterias utilizando diferentes técnicas de

laboratorio.

INTRODUCCION

GÉNERO STAPHYLOCOCCUS

Los estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae, y son microorganismos grampositivos

en cultivos jóvenes, de forma esférica o redonda, agrupados generalmente en forma de racimos,

no esporulados y anaerobios facultativos. Son habitantes naturales de la flora nasofaríngea, piel e

intestinos; y relacionado con procesos infecciosos supurativos (forúnculos y abscesos),

intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales.Las especies más conocidas son S. aureus,

S. epidermidis y S. saprophyticus; siendo la primera la más patógena y la única en producir

Coagulasa.

MATERIALES

Tubos con secreción purulenta.

Tubos estériles.

Placas Petri con agar manitol salado.

Placas con agar sangre.

Tubos con caldo nutritivo.


Set coloración Gram.

Asa de siembra en aro.

Microscopio y aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

Sembrar la muestra problema en placas con agar manitol salado y agar sangre, empleando

el método de estría por agotamiento.

Llevar las placas sembradas a incubación a 37°C por 24 horas.

Realizar un frotis de la muestra y colorearla con Gram.


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Sembrar por inoculación los tubos con caldo plasma e incubar a 37°C, para la prueba d

elacoagulasa.

Realizar la prueba de la catalas

Observar las placas incubadas, identificando las características de las colonias (tamaño,

forma, borde, cromogénesis, manitol, hemólisis, etc).

RESULTADOS

Características macroscópicas de la muestra.

Observación microscópica de coloración Gram.

Resultado de la Reacción de Coagulasa.

Resultado de la reacción de catalasa.

Resultado de la reacción de manitol.

Observar la presencia de hemólisis.

PROTOCOLO

Realizar un protocolo de trabajo indicando: especie bacteriana, tamaño de la colonia, forma,

pigmento, hemolisis y otras características que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.

CEPABACTERIANATRABAJADA

MS AS COAGULASA CATALASA GRAM MORFOLOGIA


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GÉNERO STREPTOCOCCUS

Este género comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield en los

grupos A (S. pyogenes), B (S.agalactiae), C (S.equi), D (Enterococos), G (S.canis), H (S.sanguis), K

(S. salivarius) y Streptococcuspneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Son esféricos o

redondos, grampositivos, adoptan forma de cadenas y son generalmente anaerobios facultativos

pero también existen algunas especies anaerobias estrictas (Peptoestreptococcus). Algunos son

patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del

cuerpo humano y otros son saprofitos.

Los estreptococos se desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite

diferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida (α hemólisis, β hemólisis o γ

hemólisis). Asimismo son numerosas las pruebas bioquímicas que permiten la diferenciación de las

especies de Streptococcus.

Es necesario destacar la existencia del Grupo Estreptococos Viridans donde se incluyen a todos los

estreptococos de la cavidad oral. Son α hemolíticos

MATERIALES

Cultivo de Estreptococos.

Placas con agar sangre.

Hisopos estériles.

Bajalenguas.

Viales estériles.


Asas de siembra.


PROCEDIMIENTO

Sembrar la muestra de estreptococos en la placa Petri con agar sangre.

Tomar muestra de secreción faríngea y sembrar en agar sangre.

Incubar ambas placas a 37°C por 24 horas.

Realizar frotis de la muestra en una lámina portaobjeto y colorearla con Gram.

RESULTADOS


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Observar las placas con agar sangre y determinar que colonias son sospechosas de

estreptococcus. Realizar frotis y colorear con Gram.

Determinar el tipo de hemólisis.

A la observación microscópica determinar tipo de Gram y morfología.

PROTOCOLO

MICROORGANISMO ASTIPO DE

HEMÓLISISMORFOLOGÍADE COLONIA

GRAMMORFOLOGIABACTERIANA

S. pyogenes

S.agalactiae

S. pneumoniae

Grupo Viridans

INTRODUCCION

GÉNERO NEISSERIA

El género Neisseria agrupa a microorganismos de interés estomatológico ya que se les encuentra

en gran número en la mucosa orofaríngea, además la especie N. gonorrhoeae puede producir

lesiones a nivel de la mucosa oral.

Son cocos gramnegativos que se disponen en pares (diplococos) de aspecto arriñonado de 0.6 a

1.5 micras, poco resistentes a las condiciones ambientales y de requerimientos nutricionales

exigentes y requieren de temperatura óptima de 37°C. Son aerobias estrictas (en su mayoría),

microaerófilas y anaerobias facultativas.

Todas las Neiserias son Oxidasa positiva, no esporulados, no presentan movilidad y algunas

especies son encapsuladas y presentan fimbrias. La mayoría fermentan carbohidratos, producen

ácidos y no producen gas.


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De acuerdo a su patogenicidad, se clasifican en:

a) Neisserias de Flora Oral Normal (No Patógenas): Forman parte de la microbiota normal

de la mucosa nasofaríngea, destacándose N. flavescens, N. cirenea, N. elongata, N. sirca,

N. subflava, N. mucosa y N. lactamica.

b) Neisserias Patógenas para el Hombre: N. gonorrhoeae, agente etiológico de la Gonorrea;y N. meningitidis, agente etiológico de la meningitis. Ambas especies patógenas se

encuentran relacionados con leucocitos polimorfonucleares o dentro de los mismos.

Además gonococos y meningococos tienen una homología de ADN en 70%.

MATERIALES

Muestra biológica: Secreciones uretrales, secreciones de cuello uterino,recto, orofaringe,

conjuntiva y sangre (solo en infecciones generalizadas) para Neisseriagonorrhoeae.

Muesra biológica: LCR, sangre (para hemocultivo), hisopado nasofaríngeo (para investigar

portadores).

Placas con Agar Thayer Martin.

Placas con Agar Chocolate.



Asas de siembra en aro.


Agua destilada

Suero fisiológico.

PROCEDIMIENTO

Obtención de las muestras biológicas.

Siembra de las muestras en placas con agar thayermartin y agar chocolate.

Incubas las placas a 37°C y jarra de anaerobiosis.

Realizar frotis en una lámina portaobjeto por cada muestra biológica y colorearlas con

Gram.

Observación microscópica a 1000x con aceite de inmersión.

RESULTADOS

A la observación microscópica, determinar morfología bacteriana y tipo de Gram.

Lectura de las características morfológicas de las colonias en las placas de thayermartin y

agar chocolate.

PROTOCOLO


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MUESTRABIOLOGICA

MEDIO DECUTLIVO

MORFOLOGÍADE COLONIA

GRAMMORFOLOGIABACTERIANA

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias(Escherichiacoli, Salmonella, Shigella, Klebsiela, entre otras), microorganismos anaerobios

faculattivos y aerobios, algunos de los cuales son patógenos para el hombre y causantes de

diferentes enfermedades.

El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el

Coprocultivo, es decir el cultivo de heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislameinto

del agente patógeno bacteriano.

La mayoría de las enterobacterias tiene una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal

produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de

alimentos contaminados con heces humanas.

Escherichiacoli , es un bacilo gramnegativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en

determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite

causar infecciones en el tracto gastrointestinalasi como en el sistema urinario. La

E.colienterotoxigenico (ECET) es la causa común de la “Diarrea del viajero” y produce en el

organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.colienteroinvasiva (ECEI)

y la E.colienterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.

Klebsiellapneumoniae, bacilos gramnegativos a veces con capsula, producen infecciones

oportunistas en el huésped comprometido. El tracto respiratorio y urinario son loslugares de

infección más frecuentes. Es difícil distinguir entre colonización e infección y son productoras deendotoxinas.

Salmonella typhi , bacilo gramnegativo móvil peritrico. Son exclusivas del hombre y causan fiebre

tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyphi

A, B o C.


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El género Shigella, comprende especies bacilos gramnegativos inmóviles, causan Disentería

bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La

especie S. dysenteriae e la más virulenta.

El género Proteus, presenta especies que son bacilos gramnegativos rectos, móviles, peritricos,

anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infeccionesurinarias, heridas crónicas adquiridas en ambiente nosocomial.

MATERIALES

Muestra de heces

Muestras bacterianas diversas

Placas con Agar McConkey.

Placas con Agar SS.

Tubos con Agar TSI

Tubos con Agar LIA. Set de coloración Gram


Microscopio con aceite de inmersión.

Asas de siembra en aro y en aguja.

Agua destilada.

Suero fisiológico.

Goteros.

PROCEDIMIENTO

Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (aspecto, color, presencia de

sangre, moco, etc).

Realizar un estudio microscópico de las muestras con tinción Gram.

Realizar la siembra de las muestras en:

o Placas con agar Mac Conkey, por estría por agotamiento.

o Placas con agar SS, por estría por agotamiento.

o Tubos con TSI, por picadura.

o Tubos con LIA, por picadura.

Incubar las placas y tubos a 37°C por 24 horas.

RESULTADOS

A la observación microscópica, determinar morfología bacteriana y tipo de Gram.

Lectura de las características morfológicas de las colonias en las placas y tubos con los

diferentes medios utilizados.

Observar los resultados de las diferentes pruebas bioquímicas en los diferentes medios

utilizados.


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PROTOCOLO : DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

ENTEROBACTERIA TSI LIA MC SS Colonia

ESPECIEBACTERIANA

Glu Lac H2S Gas Desc. Desa. Lactosa Crec. Morfología

E. coli

Klebsiella

Salmonella typhi

Shigella

Proteus

CUESTIONARIO

1. Qué factores determinan la patogenicidad de Staphylococcusaureus?

2. Qué características fisiológicas identifican aStaphylococcusaureus?

3. Mediante un mapa conceptual identifique los cuadros infecciosos producidos por las

especies de estafilococos.

4. Fundamente Usted los tipos hemólisis producidas por los Streptococcus.

5. Qué patología producen los estreptococos β hemolíticos?

6. Mediante un mapa conceptual identifique los cuadros infecciosos producidos por las

especies de estreptococos.

7. Realice esquemas de los procedimientos y resultados de lo observado en la práctica de

bacterias gramnegativas.8. Fundamente mediante mapas conceptuales las pruebas bioquímicas referidas en la

presente práctica de laboratorio para bacterias gramnegativas


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PRÁCTICA N°11

DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO DE CARIES DENTAL

OBJETIVOS Reconocer y describir los géneros y las especies de microorganismos asociados con el

inicio y progresión de la caries dental.

Identificar y fundamenta el concepto de pH crítico en la cariogénesis.

INTRODUCCION

La caries es una enfermedad multifactorial que se caracteriza por la destrucción de los tejidos del

diente como consecuencia de la desmineralización provocada por los ácidos que genera la placa

bacteriana a partir de los restos de alimentos, que se exponen a las bacterias que fabrican ese

ácido, de la dieta. La destrucción química dental se asocia a la ingesta de azúcares y ácidos

contenidos en bebidas y alimentos. La caries dental se asocia también a errores en las técnicas de

higiene así como pastas dentales inadecuadas, falta de cepillado dental, ausencia de hilo dental,

así como también con una etiología genética. Se estudia aún la influencia del pH de la saliva en

relación a la caries. Tras la destrucción del esmalte ataca a la dentina y alcanza la pulpa dentaria

produciendo su inflamación, pulpitis, y posterior necrosis (muerte pulpar). Si el diente no es

tratado puede llevar posteriormente a la inflamación del área que rodea el ápice (extremo de la

raíz) produciéndose una periodontitis apical, y pudiendo llegar a ocasionar un absceso, una

celulitis o incluso una angina de Ludwig.

MATERIALES

01 Incubadora

06 Microscopios ópticos

01 Jarra Gaspak

18 Placas de agar mitis salivarius(con telurito de potasio 1%, bacitracina)

18 Placas de agar sangre

06 pH metros

12 Tubos estériles.

12 Asas de siembra redondas


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06 Cajas metálicas con 03 curetas para dentina y 03 espejos bucales c/u esterilizadas para

la toma de muestra en paciente(ítem 4.1). Por mesa de trabajo.

06 Cajas metálicas con 05 curetas para dentina y 05 espejos bucales c/u esterilizadas para

la toma de muestra in situ(ítem 4.3). Por parejas.

08 Conos de papel estériles, por mesa de trabajo

04 kits Coloración GRAM

06 frascos con agua destilada

06 Frascos con aceite de inmersió

guia de practica microbiologia 2016

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