manual de microbiologia 2014 72 pgs

Centro de Bachillerato Tecnolgicoindustrial y de servicios No. 46

MANUAL DE TRABAJO DEL SUBMDULOCUANTIFICA MICROORGANISMOS CON

BASE A NORMAS

Especialidad: Tcnico Laboratorista qumico Titular: BQ. Nadia Patricia Altamirano Medina

Nombre del Alumno:

INDICE

1Anlisis Microbiolgico De Aguas 1.1Tema Desarrollado 1.2Guia De Estudio 1.3Tabla De Hockings1.4Informes

2Anlisis Microbiolgico De Productos Crnicos2.1Tema Desarrollado 2.2Guia De Estudio 2.3Cuestionario De ETAs2.4Formulas Para Calcular La UFC2.5Informes

3Anlisis Microbiolgico De Productos Lcteos3.1Tema Desarrollado 3.2Guia De Estudio 3.3Informes

4Anlisis Microbiolgico De Cereales4.1Tema Desarrollado4.2Informes

5Anlisis Microbiolgico De Bebidas Carbonatadas Y Alcohlicas5.1Tema Desarrollado 5.2Informes

6Anexos 6.1 Pruebas Bioqumicas

NORMAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DEMICROBIOLOGA

1.- Es imprescindible el uso del material de higiene y seguridad en el laboratorio. El materialde higiene y seguridad (Bata blanca de manga larga, cofia, cubre bocas y guantes) tienen lafuncin de proteger de contaminaciones qumicas y biolgicas, por lo tanto, no se debe salirdel laboratorio de Microbiologa con una bata que se emplee para tal fin.

2.- Trabajar con respeto, responsabilidad pero sobre todo con tica, procurando no distraeral resto de los compaeros en el laboratorio.

3.- Al iniciar la prctica de laboratorio se deber sanitizar el rea de trabajo y colocar unpliego de papel de estraza para cubrir el rea de trabajo a utilizar.

4.- Al inicio y al trmino de cada prctica es necesario lavarse las manos con abundanteagua y jabn para evitar una posible contaminacin.

5.- Queda estrictamente prohibido comer, beber o realizar cualquier otra actividad ajena alas prcticas programadas por el docente o llevarse las manos a la boca, nariz, ojos u odosmientras se estn manipulando microorganismos.

6.- Material como carpetas, libros, abrigos, etc. debern permanecer apartados del rea detrabajo.

7.- Las muestras debern de manejarse siempre alrededor de la llama, para evitaraccidentes.

8.- No se debe pipetear nunca con la boca, de preferencia utilizar adaptadores de pipeta operillas.

9.- Por proteccin al medio ambiente y a nuestra persona, para desechar las muestrascontaminadas estas tendrn que ser previamente esterilizadas y depositadas en losrecipientes adecuados para su traslado.

10.- Queda estrictamente prohibido el desecho de muestras contaminadas directamente enlas tarjas o botes de basura sin previa esterilizacin.

11.- Bajo ningn concepto deber sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

12.- En caso de derrame, rotura del contenido de un tubo o matraz que contenga algunamuestra con microorganismos, avisar inmediatamente al responsable del laboratorio,dejando a una persona que vigile para evitar que otros se contaminen. Lo recomendable escubrir el derrame con un desinfectante (cloro o alcohol) y evitar que objetos de uso personaltengan contacto con la muestra contaminada.

13.- Uno de los riesgos principales en un laboratorio de microbiologa es la generacin deaerosoles que contengan microorganismos, ya que son fcilmente inhalados, todas lasacciones bruscas en las que se manejan lquidos pueden generar aerosoles, que incluyencentrifugaciones, vertidos rpidos (pipeteos, trasvases, etc.) y el manejo rpido del asa desiembra. Por lo tanto, se debe trabajar con calma y responsabilidad.

14.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contienen cultivosrepresentan un riesgo evidente. Un lugar peligroso son las estufas ya que ayudan a la

proliferacin de microorganismos, lo recomendable es sacar de la estufa todo el material quese va a emplear de una sola vez, y acumular aquello que se deba incubar para introducirlojunto al final. Colocar las placas, y otros recipientes de forma segura para evitar que caigan yse genere una contaminacin.

15.- En caso de incendio de disolventes, en un laboratorio de microbiologa es frecuente elempleo de disolventes inflamables (alcohol, acetona). Es conveniente tener los recipientescon este tipo de disolventes sobre una pequea bandeja, de forma que si se incendia y sederrama, el disolvente no se extienda por el laboratorio. En el caso de que se provoquealgn pequeo fuego no se deber soplar nunca sobre el disolvente ni emplear un extintor sino es estrictamente necesario, ya que un chorro fuerte de aire extendera el disolvente portoda la zona. Se deber emplear una manta o toalla empapada en agua para cubrir elrecipiente, bandeja o zona incendiada. Si el fuego se extiende, usar el extintor dirigindolo ala base de las llamas.

PRINCIPALES TECNICAS DE CULTIVO

Las tcnicas de cultivo en medios slidos por siembra en profundidad, se caracterizanpor la inoculacin llevada a cabo cuando el agar esta en forma liquida, templado a unatemperatura aproximadamente a 45C. Estas tcnicas se aplican tambin para obtener uncultivo puro de microorganismos.

En general se puede considerar la siguiente tcnica para este grupo.

Vertido en placa: Esta tcnica consiste en hacer las diluciones directamente en elagar, para despus verter en la placa y dejarlo solidificar.

Tcnicas que se emplean en medios slidos por siembra en superficie, estas tcnicasse caracterizan porque la inoculacin se lleva a cabo sobre agar slido, mediante lasmismas se pueden observar los caracteres morfolgicos de las colonias que se desarrollansobre la superficie del agar.

Estas tcnicas resultan tiles cuando se hacen estudios sobre morfologa colonial, para elaislamiento de cultivos o bien cuando se quiere lograr una buena separacin de las coloniasde bacterias, de una suspensin concentrada de clulas.

Entre las ventajas que estas tcnicas presentan, se pueden sealar que losmicroorganismos termo sensibles no son inactivos, como pueden ocurrir cuando se mezclancon el agar fundido, adems las placas preparadas de antemano pueden guardarse ytrasladarse perfectamente, teniendo cuidado de que no sufran contaminacin.

No es conveniente aplicar estas tcnicas de cultivo cuando la concentracin demicroorganismos es muy baja.

Las tcnicas ms importantes son las siguientes.

Siembra en agar inclinado: Consiste en la preparacin de un tubo en el cual se dejasolidificar el agar en forma inclinada, para inocular despus sobre la superficie del

mismo.Siembra por estra: Consiste en colocar una gota de muestra microbiana sobreseparacin de las colonias. La superficie del agar solidificado en una caja de petri yextenderla de tal manera de que se vayan formando estras. Durante la inoculacin,al comienzo del estriado, las clulas permanecen juntas, pero conforme el estriadocontinua, menos y menos clulas son conducidas, logrando de esta manera un buenaislamiento. Siembra en extensin por superficie: Consiste en colocar una gota de muestramicrobiana sobre la superficie de agar solidificado en una caja de petri y distribuirlamediante un extensor de vidrio, para lograr que las colonias que se desarrollen estnbien separadas. Siembra por gotas en superficie: Consiste en sealar dos o tres reas en el fondo deuna caja de petri y sembrar diferentes diluciones de una muestra en la superficiecorrespondiente a cada una de dichas regiones. De esta manera, con pocas placas,se pueden sembrar varias diluciones.

ANLISISMICROBIOLGICO

DE AGUAS

ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAParmetros Biolgicos del Agua:El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran nmero deactividades humanos. Su creciente degradacin por disminucin de su calidadimplica la reduccin del nmero de usos que se le da; es por ello, lo que se hacenecesario la realizacin de estudios que permitan determinar la calidad de esa agua.

Los anlisis que se pueden realizar al agua para controlar su calidad son: fsicos,qumicos y microbiolgicos.Todos los organismos que se encuentren en el agua son importantes en elmomento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si tienensu medio natural de vida en el agua o pertenecer a poblaciones transitoriasintroducidas por el ser humano; si su crecimiento lo propician los nutrientespresentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales municipales o lo frenanlos venenos procedente de la actividad agrcola o industrial, y si tienen capacidadpara intoxicar a las personas y a los animales superiores.Se deben conocer la forma de los patgenos hdricos y determinar su presencia yorigen, la magnitud y oscilacin de su nmero, el curso de su ciclo vital y el ndicede su supervivencia. Los parmetros biolgicos en las aguas potables son demucho inters, los microorganismo que pueden haber en el agua son virus,bacterias, hongos, algas y potrosos. Aquellos que son inocuos para el hombre notienen significacin sanitaria, por lo que el control microbiolgico del agua se va acentrar en las especies patgenas para el hombre. Dado que buscar todo tipo demicroorganismos patgenos, por su diversidad, es costoso y complicado y como larelacin patgenos / no patgenos es muy pequea, se realiza un control del aguaa travs de indicadores microbiolgicos de contaminacin.

Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad de unagua. As, segn predominan unos organismos u otros, podremos saber el estadode un agua.

1.- Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua

2.- Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos patgenos.

3.- Debe soportar mejor a los desinfectantes

4.- Debe ser fcil de aislar a los desinfectantes

5.- Debe ser fcil de aislar, identificar y contar

6.- Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios.

La normatividad recoge una serie de anlisis microbiolgicos segn se efectu sobreel agua un anlisis mnimo: Coliformes totales y fecales; uno normal; los anterioresmas; bacterias aerobias a 37C, Estreptococos Fecales y Clostridios Sulfito-Reductores; o completo.

PRACTICA

ANLISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA

OBJETIVO: Que el alumno utilice las tcnicas adecuadas para realizar un anlisismicrobiolgico del agua y determine la condicin de la misma, es decir si estacumple con los estndares que determina la norma para cada tipo de agua.

INTRODUCCIN: El agua ha sido considerada como el seno de la vida, ya que lacapacidad de reproduccin, por primera vez sucedi en el agua.

No solamente fue nuestro medio original hace aproximadamente 3500 millones deaos, sino que sigue siendo vital para las plantas, los animales y los humanos.

Los humanos necesitan del agua para sentir, pensar y para una serie de procesosindustriales que exigen grandes cantidades de agua.

Las grandes civilizaciones surgieron en la costa, junto al ro o a un lago; el agua lesproporcion el alimento, transporte, comunicacin, energa, etc. favoreciendo consus usos el incremento de la poblacin humana.

La sobrepoblacin humana implica el uso y contaminacin de exorbitantescantidades de agua.

MATERIAL:

Tubos de fermentacin

Campanas Durham

Cajas de petri

Asa de Nicromel

Matraz Erlenmeyer

Parrilla elctrica

Lmpara de alcohol o Mechero

Incubadora y Medios de cultivo

METODOLOGA PARA ANLISIS DE AGUA PURIFICADA: De acuerdo a laNorma Oficial NOM-CO-SSA-2002. (Aplica de igual manera para hielo para consumohumano preenvasado y a granel segn especificaciones sanitarias).

PRIMER MTODO

1.- Colocar 10ml. de agua purificada en 10 tubos con 7ml. de caldo lauril sulfato desodio con sus respectivas campanas Durham e incubar a 37C durante 24hrs.

2.- Una vez transcurrido el tiempo de incubacin verificar si hay produccin de gas.Si se presenta formacin de gas se registra coliformes totales > 1.1NMP y si no haypresencia de gas en los medios se registra coliformes fecales < 1.1 NMP. (Valoresdeterminados a partir de una escala de referencia).

SEGUNDO MTODO

1.- Colocar 1ml. de agua purificada en 1 tubo con 10ml de solucin peptonada.Dilucin 1:10.

2.- Enseguida de ese mismo tubo se tomaran 0.5ml. y se aadirn a 9 tubos conmedio de cultivo de caldo lactosado de manera que cubra sus respectivas campanasde Durham. (EXPLICAR LA DILUCIN).

3.- Incubar a 44.5C durante 24hrs.

4. Si al cabo del tiempo estipulado hay presencia de gas se siembra de las muestraspositivas en tubos con medio de cultivo caldo verde brillante bilis.

5.- Se incuba a 37C, durante un lapso de 24hrs.

6.- Si el resultado es ausencia de gas, se reporta coliformes totales < 1.1 NMP y sihay presencia de gas en los medios se reporta como coliformes totales > 1.1NMP.

METODOLOGIA PARA EL ANLISIS DE AGUAS FRUTALES: De acuerdo a laNorma Oficial Ley General de Salud y Reglamento de Control Sanitario Productosy Servicios.

METODOLOGA PARA COLIFORMES

1.- Colocar 1ml. de agua frutal y realizar las diluciones aadiendo 1ml. de agua frutalal primer tubo con solucin peptonada (Dilucin 1:10), de la dilucin 1:10 tomar 1ml.de dilucin y aadir al segundo tubo de solucin peptonada (Dilucin 1:100) yfinalmente de la dilucin 1:100 tomar 1ml. de dilucin y aadir al tercer tubo consolucin peptonada (Dilucin 1:1000).

2.- Enseguida de cada una de las diluciones se tomarn 0.5ml para inocular muestraen los 9 tubos con caldo lactosado previamente preparado, tomando en cuenta quepor cada dilucin se deben inocular 3 tubos de caldo lactosado.

3.- Una vez inoculada la muestra, incubar a 44.5C, durante un lapso de 24hrs.

4.- Si hay presencia de gas, se toma una asada de la muestra donde haya habidopresencia de gas y se inocula en caldo verde brillante bilis, se incuba a 44.5Cdurante 24hrs.

5.- Si hay presencia de gas se reporta coliformes totales 4NMP/ml. Valordeterminado con una escala de referencia.

METODOLOGA PARA DETERMINACIN DE Salmonella

1.- En un matraz con 100 ml. de caldo lactosado, colocar 25ml. de agua frutal eincubar a 37C, por un lapso de 24hrs.

2.- Una vez transcurrido el tiempo tomar 1ml. de la muestra e incorporarlo a 1 tubode cultivo con 7ml. de caldo tetrationato.

3.- Incubar a 37C durante un lapso de 24hrs. (enriquecimiento)

4.- Posteriormente se asla en medio de cultivo XLD, SS y agar verde brillante.

5.- Se incuba a 37C durante 24hrs.

6.- Si se presenta un escaso desarrollo de colonias se reporta como desarrollo deSalmonella no significativo.

METODOLOGA PARA DETERMINACIN DE E. coli

1.- Preparar 2 tubos de fermentacin con caldo lactosado y sus respectivascampanas Durham.

2.- Agregar a cada tubo 1ml. de las diluciones elaboradas para las anteriorespruebas.

3.- Incubar los tubos a 37C durante 48hrs.

4.- Examinar en cada tubo, la posible formacin de gas, se considera una pruebapositiva si al cabo de 24hrs. hay presencia de gas.

5.- Para la realizacin de la prueba confirmatoria se preparan dos cajas de petri conagar ENDO EMB.

6.- Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos e inocular por estra en losmedios de cultivo anteriormente mencionados.

7.- Incubar las cajas y los tubos a 37C por un lapso de 48hrs.

8.- Si dentro del periodo de incubacin aparecieran colonias tpicas de Escherichiacoli en el agar EMB (Eosina Azul de Metileno), se presentan de color verde conbrillos metlicos.

Cuestionario

1.- Un anlisis microbiolgico consta de cuantas pruebas y explica la importanciade la realizacin de cada una de estas para obtener un resultado del anlisisconfiable?

2.- Menciona algunos de los microorganismos patgenos que se pueden aislar enuna muestra de agua residual?

3.- En relacin a la respuesta anterior, que tipo de afecciones o enfermedadespueden ocasionar estos microorganismos en animales y seres humanos? Para cadauna es necesario que mencione su sintomatologa.

4.- Representa de forma grafica las morfologas de los principales microorganismospatgenos presentes en muestras de agua contaminada.

GUIA DE ESTUDIO (ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA)1.- Un anlisis microbiolgico consta de cuantas etapas y etapas y explica laimportancia de la realizacin de cada una de estas para obtener un resultadode anlisis confiable

2.- Menciona algunos de los microorganismos patgenos que se pueden aislaren una muestra de agua residual.

3.- En relacin a la respuesta anterior que tipo de afecciones o enfermedadespueden ocasionar estos microorganismos en animales y seres humanos(sintomatologa).

4.- Representa de forma grafica la morfologa de los siguientes

Salmonella E.coli Shigella Vibrio cholerae

5.- Cual es la importacin del control microbiolgico en alimentos?

6.- Que es una infeccin alimentara?

7.- Define calidad microbiolgica

8.- Que utilidad tienen los criterios microbiolgicos en el control de alimentos:

9.- Que significan las siglas NMP/ml y UFC/ml o g?

10.- Qu es la calidad higinica sanitaria:

11.- De que se encarga la microbiologa alimentara:

TABLA DE HOSKINSNumero de tubos positivos del total es:

3 tubos de 10 ml 3 tubos 1 ml 3 tubos 0,1ml ndice delNMP/100ml

0 0 1 30 1 0 31 0 0 41 0 1 71 1 0 71 1 1 111 2 0 112 0 0 92 0 1 142 1 0 152 1 1 202 2 0 212 2 1 283 0 0 233 0 1 393 0 2 643 1 0 433 1 1 753 1 2 1203 2 0 933 2 1 1503 2 2 2103 3 0 2403 3 1 4603 3 2 1100

ANLISIS MICROBIOLGICODE PRODUCTOS CRNICOS

ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOSCRNICOS

La carne es uno de los productos qumicos ms perecederos. El procesado de lacarne para la posterior elaboracin de productos derivados tiene como finalidad, poruna parte mejorar la calidad del consumo y, por otra conseguir un aumento en lacapacidad de conservacin.

Vas de Contaminacin de la carne

Matadero:

- Salud de los Manipuladores

- Insectos y rodeadores.

Animal:

-Piel (Micrococcus, Pseudomonas y otros gramnegativos, Staphylococcus,Lactobacillus)

-Contenido Intestinal: (Coliformes, E. coli, Clostridium, Streptococcus y a vecessalmonella)

La carne puede contener parsitos helmintos (cestodos y nematodos) Protozoarios ybacterias patgenas:

-Taenia Solium, parsito del cerdo. El hombre se infesta por ingestin de carne concisticercos (Cisticercos cellulosae). La forma adulta se fija en el intestino del hombre.

-Tenia Saginata, el hombre se infecta por ingestin de carne con cisticercos.

Cisticercosis

Con mucha frecuencia, los parsitos permanecen en los msculos y no causansntomas.

Cuando s se presentan sntomas, dependen del lugar donde se encuentra lainfeccin.

Las lesiones cerebrales pueden ocasionar convulsiones o sntomas similares a untumor cerebral.

Las lesiones oculares pueden ocasionar una disminucin en la visin o ceguera.

Las lesiones en el corazn pueden llevar a que se presente ritmo cardaco anormal oinsuficiencia cardiaca (poco comn).

Las lesiones en la columna vertebral pueden llevar a

que se presente debilidad o cambios en la marcha.

Nematodos

Triquinella espiralis, las larvas de este parsito se desarrolla en los msculosestriados del husped, hasta su estado infestante. Dichas larvas se sitan en lamicrofibrillas del msculo, luego se enrollan y se encapsulan en quistes calcificados.

La triquinosis

se adquiere al consumir carne con larvas del parsito. Presenta sntomasgastrointestinales (diarrea), dolor muscular y articular.

Sntomas

Fiebre

Dolor abdominal

Calambres

Diarrea

Dolor muscular

Palpitaciones

Edema palpebral

Rash cutneo

Cefalea, visin borrosa

Protozoarios

Toxoplasma gondii transmitido por la carne de cerdo.

Sarcisystis se transmite por carne de cerdo y ovino.

Bacterias

Salmonelosis (Salmonella)

Aparecen escalofros, cefalea, nuseas, anorexia, tos y diarrea o estreimiento. Lafiebre es prolongada y vara de 38,5 C a 40 C. Entre un 20 y un 40 % de los casospresentan dolor abdominal.

Brucelosis (Brusella)

El inicio de las manifestaciones clnicas se caracteriza por fiebre, artralgias, mialgiasy diaforesis.

Mal rojo (Erysipelosthrix)

El cuadro clnico puede ser hiperagudo, agudo o crnico. Los ndices demorbilidad son variables, la mortalidad suele ser alta sobre todo en los casosobreagudos y agudos (las muertes sbitas son ms habituales en animalesde 45 a 90 kg), aunque al tratarse de una enfermedad de fcil tratamientopuede controlarse relativamente bien.

Frecuentemente se observa fiebre alta, adems de disnea, artritis (lasarticulaciones aparecen calientes y dolorosas al tacto), cojera, inapetencia,prdida de peso y abortos.

NORMAS SANITARIAS OFICIALES

*-NORMA Oficial Mexicana NOM-213-SSA1-2002, Productos y servicios. Productoscrnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Mtodos de prueba.

*-NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-145-SSA1-1995, productos carnicos troceadosy curados. Productos carnicos curados y madurados. Disposiciones yespecificaciones sanitarias.

*-NOM-122-SSA1-1994, "Productos crnicos curados y cocidos y curadosemulsionados y cocidos. Especificaciones sanitarias".

PRACTICA

ANLISIS MICROBILOGICO DE CHORIZO

OBJETIVO: Determinar la calidad de una muestra de chorizo comercial aplicandolas tcnicas de anlisis microbiolgicos para la deteccin de microorganismospatgenos segn la norma sanitaria NOM 145 SSA1 1995. Productos crnicos,curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias.

INTRODUCCIN: A lo largo de los tiempos, la carne fresca ha sido procesada, ydentro de los distintos animales consumidos, el cerdo cobr una especial atencin,dado no slo por su gran capacidad reproductiva, sino tambin por el mximoaprovechamiento de su carne, y la facilidad de almacenamiento como tal o a travsde embutidos. Asimismo el embutido era una manera de aprovechar las peorespiezas y desperdicios diversos.

La gran tradicin de embutidos es probablemente de origen romano y griego, y as lodemuestra que nombres como longaniza y salchicha vienen de los embutidosromanos lucanica y salsicius. A los griegos se le atribuye la invencin de la morcillade sangre.

MATERIAL:

Tubos de fermentacin Placas de agar verde brillante

Campanas de Durham Placas de agar EMB

Caldo lactosado Placas de agar XLD

Caldo tetrationato

Caldo verde brillante bilis

Solucin peptonada

Bolsa hermtica

Placas de agar Baird Parker

Placas de agar SS

METODOLOGA

PRIMER MTODO PARA DETECTAR PRESENCIA DE COLIFORMES FECALES.

1.- Pesar 25gr. de muestra de chorizo comercial y disolverlo perfectamente bien conla ayuda de 225ml. de caldo lactosado.

2.- Trasvasar la preparacin a una bolsa hermtica y agitar el contenidovigorosamente, de tal manera que la solucin resultante sea homognea.

3.- Realizar las diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 para asegurar que el proceso se estarealizando de manera estandarizada.

4.-Posteriormente de cada una de las diluciones preparadas previamente, setomaran 0.5ml para aadirlos en tres tubos de fermentacin con caldo lactosado consus respectivas campanas Durham, obteniendo de esta manera un total de 9 tuboscon la muestra de chorizo a analizar.

5.- Se incuban a 44.5C, durante un lapso de 24hrs. si transcurrido ese lapso detiempo se observan burbujas (gas +), se realiza una contraprueba en caldo verdebrillante bilis, se incuba nuevamente a 44.5C por 24hrs. y se registran resultados, sihay presencia de gas, reportar Coliformes fecales en NMP/g segn la normasanitaria NOM 145 SSA1 1995.

SEGUNDO MTODO PARA DETECTAR PRESENCIA DE S. aureus

1.- De la dilucin 1:10 previamente elaborada con muestra de chorizo y aguapeptonada tomar 0.1ml. de dilucin e inocularlo en placas de agar Baird Parker,dejar secar e incubar a 37C por un lapso de 24 a 48hrs. segn se requiera.

2.- Transcurrido el lapso de incubacin observar el crecimiento bacteriano en elmedio de cultivo, si hay desarrollo bacteriano significativo se realizar la prueba decoagulasa, para determinar si se trata de S.aureus.

3.- Si se trata de este microorganismo, por lo tanto la prueba de la coagulasa ser(+), por lo que se observara la formacin de un pequeo coagulo en el fondo deltubo con plasma.

TERCER MTODO PARA DETECTAR PRESENCIA DE E. coli

1.- Despus de haber incubado la dilucin 1:10 por 24 hrs. se toma una pequeacantidad de muestra con el asa y se siembra en tres campos en los medios decultivo XLD, Verde bilis brillante y EMB.

2.- Una vez inoculada la muestra en los medios, se incuba a una temperatura de37C por un lapso de 24hrs.

3.- Si se observa presencia de colonias caractersticas se reporta E.coli en UFC/gdetectables segn la norma sanitaria NOM 145 SSA1 1995.

CUARTO MTODO PARA DETECTAR PRESENCIA DE Salmonella

1.- De la dilucin 1:10 se toma 1ml. de muestra para inocularla en un tubopreviamente preparado con 10ml. de caldo tetrationato.

2.- Se incuba a 37C durante un lapso de 24 hrs.

3.- Si al trmino del lapso de incubacin se produce un precipitado blanco, seproceder a inocular una pequea cantidad de muestra en placas de agar XLD,Verde bilis brillante y agar SS.

4.- Se incuban a 37C por 24hrs. si se observa presencia de colonias caractersticas,se reporta Salmonella spp. Detectable en 25g de muestra segn la norma sanitariaNOM 145 SSA1 1995.

GUIA DE ESTUDIO (ANLISISMICROBIOLGICO DE PRODUCTOS

CRNICOS)1 Qu tipo de microorganismos patgenos se podran encontrar en unamuestra de chorizo contaminada?

2Menciona que tipo de enfermedades puede ocasionar este tipo demicroorganismos y cul es su sintomatologa?

3 Menciona una norma oficial sanitaria mexicana que especifique lascondiciones ideales para la elaboracin de este producto crnico y especificanen que consiste esta?

4 Describe cuales son las ETAS y describe la causa de estas.

5 Describe y representa a travs de dibujos la morfologa de microorganismospresentes en una muestra de chorizo contaminado.

Salmonella E. coli S. aureus

CUESTIONARIODE LAS ETA`s

1 Menciona dos tipos de microorganismos queden como resultados negativosal realizarse la tincin de Gram.

2 Cual es la utilidad de las pruebas bioqumicas en el anlisismicrobiolgico, aplicados a productos alimenticios?

3 De manera general menciona cual es la clasificacin de las enfermedadestransmitidas por alimentos contaminados.

4 Qu son las ETAS?

5 Cules son los microorganismos de mayor accin patgena que puedenocasionar las ETAS?

6 Norma oficial mexicana en cuestin a control de calidad encargada deverificar la preparacin de disoluciones empleadas en un anlisismicrobiolgico de alimentos.

7 Prueba bioqumica que se utiliza para identificar bacterias de acuerdo a sumotilidad reaccin al indol y la descarboxilacin de la ornitina.

8 Su principal objetivo es detectar la presencia de la enzima triptofanasa enbacterias que degradan el aminocido triptfano a indol.

9 Esta prueba bioqumica separa al gnero estreptococos de grupo B de lasdems estreptococos que crecen en un medio de cultivo 40% en presencia debilis.

10 prueba bioqumica que permite identificar al microorganismoStreptococcus agalactiae de los Staphylococcus hemolticos los cualesproducen zona de hemlisis.

11 Mediante un cuadro sinptico detalle coloraciones tpicas ymicroorganismos que pueden aislar o identificar en los siguientes medios decultivo utilizados en el anlisis de alimentos.

Mac Conkey XLD EMB E.coli Proteus mirabilis Salmonella, Pseudomona, E.coli, Shigella flexneri, Salmonella,Enterococcus fecalis, salmonella, Shigella Klebsiella pneumaniae, Klebsiella pneumoniae. Enterococcus faecalis.

S.S Verde brillante Baird ParkerSalmonella E.coli, Salmonella typhi, E. Coli, P. mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. S. aureus, S. epidermidisEnterococcus fecalis.

12 Define que es la salmonella.

13 Su funcin es catalizar la glucosa, lactosa y otros azucares ya que este esincapaz de utilizar urea y citratos. 14 Bacteria Gram negativa perteneciente al grupo de las enterobacteriasconformada de un bacilo recto y flagelos pertricos, produce motilidad en elmedio SIM.

15 Es un coco Gram Positivo productor de una protena inalterada que se unea la penicilina como a las cefalosporinas.

16 Menciona la norma oficial que se encara de encontrar y proporcionar lasvas generales para la preparacin de disoluciones para el examenmicrobiolgico de productos crnicos.

17 Menciona los limites permisibles de UFC sobre ml o r de microorganismospatgenos presentes en un producto crnico.

18 Cuales son los tipos de intoxicaciones y cuales microorganismos losproducen

Frmula deUFC:

Las "Unidades Formadoras de Colonias"(UFC) se miden en (UFC por mililitro).

ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS LCTEOS

ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOSLCTEOS

La leche es un alimento completo rene en ella casi todos los componentes de losotros alimentos, tiene las protenas de la carne y del pescado la grasa del aceite ymanteca pos azcar y contiene las sale minerales y vitaminas de las levaduras yfrutas, es por esta razn que la leche es un alimento ideal tanto como para elhombre como para los microorganismos.

La leche como producto natural analizada contiene microorganismos deben serestudiados por su utilidad y otros por la capacidad de alterar la composicin ycaractersticas organolpticas de la leche y derivados lcteos o por ser agentescausales de enfermedad en los consumidores, es as que en ella puedenencontrarse microorganismos de los diferentes grupos: bacterias, hongos (mohos ylevaduras) y virus.

En este tipo de anlisis microbiolgico se utilizan varias tcnicas para determinacinde microorganismos algunas son tcnicas de sembrado y diluciones, incluso abarcahasta las tinciones utilizadas para determinar que tipo de microorganismo se trata,como algunas bacteria que se desarrollan en la leche son bacterias Gram + o seutiliza la tcnica de tincin de Gram.

Los principales microorganismos que pueden encontrarse en leche cruda son.

Bacterias: Las ms importantes son las bacterias lcticas y las bacterias Coliformes;

Las mas comunes encontradas en la leche son la E. coli, Enterobacter aerogenes,Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia. S. aureus.

PRCTICA

ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE

OBJETIVO: Determinar la calidad microbiolgica de una muestra leche crudaobtenida en un comedor popular y verificar si esta cumple con los estndaresestablecidos de acuerdo a la normatividad vigente.

INTRODUCCIN: La leche es un alimento completo como lo hemos dicho antes, yes tambin un medio de cultivo para el crecimiento de una variedad demicroorganismos.

La importancia del estudio microbiolgico de la leche se basa en tres partes:Producen cambios deseables en las caractersticas fsicas-qumicas de la lechedurante la elaboracin de diversos productos lcteos. Los productos lcteos y laleche pueden contaminarse con microorganismos patgenos o sus toxinas yprovocan enfermedades en el consumidor, pueden causar alteraciones de la leche yproductos lcteos haciendo inadecuados para el consumo, en la leche se encuentranmicroorganismos como bacterias, hongos (mohos y levaduras).

La contaminacin de la leche puede ser por medio de dos vas:

Mamaria: Los microorganismos alcanzan la ubre, pueden llegar a contaminar laleche antes o despus del ordeo. Estos pueden alcanzar la leche por vamamaria por dos vas igualmente.

Ascendente: Lo que hacen las bacterias que se adhieren a la piel de la ubre yposterior al ordeo, entran a travs del esfnter del pezn. (Staphylococcusaureus, Streptococcus y coliformes).

Descendente: o tambin llamada hematgena, son los microorganismos quepueden causar enfermedad sistmica o tienen la propiedad de movilizarse por lasangre y a travs de los capilares mamarios llegan a infectar la ubre.(Salmonella, Brucellas y Mycobacterium tuberculoso).

Medio externo: La contaminacin se produce una vez extrada de la glndulamamaria. Los utensilios, tanques de almacenamientos, transportes e incluso elpersonal que manipula la leche, son fuentes de contaminacin.

Fuentes de contaminacin de la leche cruda

Animal: Cualquier lesin en el animal puede causar una elevada contaminacin,la ubre esta en contacto con el suelo, heno, etc., animales enfermos de mastitis(inflamacin de la glndula mamaria), los causantes de esta enfermedad es elStaphylococcus aureus, el cual es resistente al tratamiento de antibiticos y no esdestruida por la pasteurizacin, la entero toxina que produce por su resistenciapudiendo llegar a causar enfermedades al consumidor.

Aire: Representa uno de los medios mas hostiles por la constante exposicin aloxigeno, cambios de temperaturas y humedad relativa, radiacin solar, etc. En elaire se pueden encontrar Micrococcus, Streptomyces y Aspergillus.

Agua: Usada para la limpieza de los equipos y utensilios de ordeo, higiene delanimal y del personal, y encontramos microorganismos como Pseudomonas ypor contaminacin de estos de Bacterias coliformes.

Suelo: Principal fuente de microorganismos termoduricos (microorganismoscapaces de soportar altas temperaturas) y termofilos (microorganismos que sedesarrollan a los 45 C).

El ordeador o personal: Juega un papel importante si se ordea de maneramanual, si no se lava las manos y peor aun se las humedecen la leche mismapara lograr lubricacin que facilite el ordeo. Aparece la contaminacin conmicroorganismos patgenos.

Estircol: Fuente principal de microorganismos coliformes.

Utensilios y transportes: Es importante una buena higiene por medio deagentes desinfectantes, afecta significativamente la calidad de la leche. La floramicrobiana de esta fuente puede ser diversa, pero la mas frecuente es la floratermoresistente, razn mas que suficiente para exigir al mximo la higiene.

El empleo de sistemas de ordeo mecnico ayuda a reducir la contaminacin apartir del animal, ordeadoras, aires y suelo. De manera que la contaminacin eneste caso estar mayormente en los tanques de almacenamiento y en el sistema

de ordeo en si mismo; a travs de campaas de educacin se puede reducir lacontaminacin por parte del personal, as como una supervisin cercana paraevitar que personas enfermas participen en la labor diaria del ordeo.

MATERIAL:

20ml. de leche cruda

Caja de medio S.S y agar nutritivo

Matraz Erlenmeyer

Agua destilada

METODOLOGA

1.- Tomar por lo menos de 10 a 15 ml. de muestra de leche cruda (bronca).

2.- Tomar una asada de muestra e inocular en un tubo de agar nutritivo parafavorecer el crecimiento bacteriano.

3.- Incubar a 37C durante un lapso de 24hrs.

4.- Tomar una asada de muestra e inocular de forma directa en los medios de cultivoagar SS y agar nutritivo.

5.- Incubar a 37C, durante un lapso de 24hrs. Transcurrido el tiempo de incubacinverificar las muestras y realizar una tincin de Gram para determinar de que tipo demicroorganismo se trata y realizar las anotaciones correspondientes para presentarsu reporte.

METODO POR LACTOFERMENTACIN

1.- En un tubo estril se colocan 10ml. de leche cruda y se incuba a 37C durante unperiodo de 12 a 24hrs.

2.- El aspecto del cogulo despus de 24hrs. permite deducir la actividadmicrobiana, si es homogneo y gelatinoso indica fermentacin homolctica; si es deaspecto esponjoso o con burbujas de gas indica posible presencia de coliformes.

METODO DE BREED

1.- Se extiende de 0.01 a 0.05 ml. de la muestra a analizar, en este caso (lechecruda) sobre un portaobjetos, en un espacio de 1 a 4cm.

2.- Se deja secar la muestra

3.- Una vez seca, se desengrasa con Xilol y se fija con alcohol, teniendo cuidado deno barrer la muestra.

4.- Finalmente se tie con azul de metileno al 0.3% y se observa al microscopio.

PRACTICA

ANLISIS MICROBIOLGICO DE QUESO FRESCO

OBJETIVO: Determinar la calidad microbiolgica en una muestra de queso frescoobtenido en un puesto de expendio particular (mercado).

INTRODUCCIN: El queso es un alimento slido elaborado a partir de la lechecuajada de vaca, cabra, oveja, u otros mamferos rumiantes. Es la conserva idealpues muy difcilmente se estropea con el transcurso del tiempo ya que al secarsemejoran sus cualidades en relacin al peso. La leche es inducida a cuajarse usandouna combinacin de cuajo (o algn sustituto) y acidificacin. Las bacterias seencargan de acidificar la leche, jugando tambin un papel importante en la definicin

de la textura y el sabor de la mayora de los quesos. Algunos tambin contienenmohos, tanto en la superficie exterior como en el interior.

Una de las ramas de la industria lctea que depende en gran manera de la actividadde los microorganismos es la elaboracin de los quesos, hay una gran variedad dequesos que se elaboran bajo la actividad enzimtica de especies bacterianas yfngicas. Hay otros microorganismos. Que no se pueden usar por su capacidad dealterar la composicin y caractersticas organolpticas de la leche y derivadoslcteos o por sus agentes causales de enfermedad en los consumidores.

MATERIALES:

25 gr. de queso fresco

100 ml. de caldo lactosado

placa de Agar SS

placa de Agar nutritivo

placa de agar Baird Parker

METODOLOGA

1.- Pesar 25gr. de muestra de queso fresco y aadir 100ml. de caldo lactosado hastaobtener una solucin homognea.

2.- Tomar una asada, inocular en un tubo con caldo nutritivo para favorecer elcrecimiento de los microorganismos presentes en la muestra e incubar a 37C por24hrs.

3.- Tomar nuevamente una asada y sembrar de manera directa en el agar SS y en elagar Baird Parker, de igual manera incubar a 37C por 24hrs.

4. Transcurrido el lapso de incubacin verificar si se presento crecimiento, en casode no presentarse crecimiento en ninguno de los dos medios, del tubo de caldonutritivo sembrar de manera directa en agar SS y agar nutritivo, y realizar una tincinde Gram para descartar la presencia de cualquier tipo de crecimiento bacteriano.

2 METODOLOGA PARA ANLISIS DE QUESO FRESCO (Segn la norma oficialsanitaria NOM 121-SSA1-1994).

Preparacin de las diluciones y determinacin de Coliformes fecales

1.- Colocar 1ml. de la solucin homognea utilizada en la prueba anterior y realizarlas diluciones aadiendo 1ml. de solucin al primer tubo con solucin peptonada(Dilucin 1:10), de la dilucin 1:10 tomar 1ml. de dilucin y aadir al segundo tubo desolucin peptonada (Dilucin 1:100) y finalmente de la dilucin 1:100 tomar 1ml. dedilucin y aadir al tercer tubo con solucin peptonada (Dilucin 1:1000).

2.- Enseguida de cada una de las diluciones se tomarn 0.5ml para inocular muestraen los 9 tubos con caldo lactosado previamente preparado.

3.- Una vez inoculada la muestra, incubar a 44.5C, durante un lapso de 24hrs.

4.- Si hay presencia de gas, se toma una asada de muestra de la dilucin 1:10 y seinocula en caldo verde brillante bilis, se incuba a 44.5C durante 24hrs.

5.- Si hay presencia de gas se reporta coliformes 4NMP/gr. (Valor determinado conuna escala de referencia).

Determinacin de S. aureus.

1.- Sembrar por estra de las diluciones anteriormente realizadas de forma directa enplacas de agar Baird Parker.

2.- Si la prueba es positiva, se presentara formacin de colonias de color negro.

3.- Para realizar un anlisis mas completo es recomendable tomar una pequeacantidad de colonia e inocular en caldo infusin cerebro corazn con plasma, si alcabo de 24hrs. de incubacin a 37C hay formacin de cogulo se reporta como S.aureus positivo (+).

Determinacin de Salmonella.

1.- De la dilucin 1:10 tomar una asada e inocular en caldo de tetrationato con yodoo yoduro.

2. Incubar por 24hrs. a 37C.

3.- Transcurrido el lapso de tiempo sembrar en agar XLD, SS y verde brillante.

4.-Incubar por 24hrs. a 37C.

5.- En caso de crecimiento bacteriano reportar como (+) (-) segn sea el caso.

PRACTICA

ANLISIS MICROBIOLGICO DE CREMA DE HELADO

OBJETIVO: Determinar la calidad microbiolgica de una muestra de crema dehelado obtenida de un vendedor ambulante.

INTRODUCCIN: La causa principal de los casos de enfermedad relacionada con elconsumo de helados contaminados con microorganismos o sus toxinas esprincipalmente Salmonella causante de infecciones; Staphylococcus aureus,formadores de toxinas y espordicamente Shigellas y cepas enteropatgenas deEscherichia coli.

Cuando se aplican criterios microbiolgicos para garantizar la seguridad de losalimentos, el objetivo es reducir o eliminar un potencial de riesgo de toxiinfeccinalimentara, cada grupo de alimento debe ser testado cuidadosamente por medio deun anlisis de riesgo para determinar los peligros potenciales y su efecto sobre losconsumidores.

Cuando un alimento se ve implicado repetidas veces en brotes de toxiinfeccionesalimentaras, la aplicacin de criterios microbiolgicos debe ser muy til al desarrollarprocedimientos seguros y eficaces de pasteurizacin adems de establecer criteriosmicrobiolgicos sobre el producto.

Salmonella: Bacilos Gram negativos, mviles, no forman endosporas, poseen unmetabolismo oxidativo y fermentativo. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae.

MATERIAL:

Muestra de crema de helado

Agua destilada

Placa de agar SS, agar nutritivo y Baird Parker

Caldo nutritivo

METODOLOGA

1.- Agregar aproximadamente 10ml. de muestra de crema de helado en 15ml. deagua destilada hasta obtener una solucin homognea.

2.- Tomar una asada, inocular en un tubo con caldo nutritivo para favorecer elcrecimiento de los microorganismos presentes en la muestra e incubar a 37C por24hrs.

3.- Tomar nuevamente una asada y sembrar de manera directa en el agar SS y en elagar nutritivo, de igual manera incubar a 37C por 24hrs.

4. Transcurrido el lapso de incubacin verificar si se presento crecimiento, en casode no presentarse crecimiento en ninguno de los dos medios, del tubo de caldonutritivo sembrar de manera directa en agar SS y agar nutritivo, y realizar una tincinde Gram para descartar la presencia de cualquier tipo de crecimiento bacteriano.

GUIA DE ESTUDIOS (ANLISISMICROBIOLGICO DE PRODUCTOS

LCTEOS)1 Que tipo de microorganismos son parte de la flora normal en la leche cruda (bronca).

2 Que tipo de microorganismos patgenos podemos encontrar en la leche cruda.

3 Menciona las fuentes de contaminacin que puede sufrir la leche en el interior de la ubre.

4 Representa de manera grafica la morfologa de los principales microorganismos presentes en la leche cruda.

Brucella abortus Bacillus cereus Clostridium Corynebacterium

perfringens

Pseudomana aeruginosa Staphylococcus

5 Menciona por lo menos una norma oficial sanitaria para el tratamiento de laleche y sus derivados, menciona en que consiste.

6 Cuales son las medidas de higiene necesarias para la obtencin de un producto de calidad.

ANLISIS MICROBIOLGICODE CEREALES

ANALISIS MICROBIOLOGICO DECEREALES

FUENTES DE CONTAMINACIN

1.- Ambiente

2.- Fertilizantes

3.- Animales e Insectos

4.- Procesado

ALTERACIONES

Disminuye la calidad de la harina

Disminuye la germinacin de la malta

Aumenta la concentracin de cidos grasos

NORMAS PARA SU CONTROL

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-147-SSA1-1996. Bienes y servicios.Cereales y sus productos. Harinas de cereales, smolas o semolinas.Alimentos a base de cereales, de semillas comestibles, harinas, smolas osemolinas o sus mezclas. Productos de panificacin. Disposiciones yespecificaciones sanitarias y nutrimentales.

Que se complementa con las siguientes:

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994. Bienes y servicios.Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-113-SSA1-1994. Bienes y servicios.Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios.Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos.

MEDIDAS DE PREVENCIN

Mantener los granos secos con adecuada ventilacin para remover humedady prevenir condensacin.

Fumigar matando insectos que daan los granos.

Lavado antes de la molienda para remover polvo y disminuir cargamicrobiana.

ANLISIS MICROBIOLGICO DE BEBIDAS CARBONATADAS Y ALCOHOLICAS

ANLISIS MICROBIOLGICO DE BEBIDASCARBONATADAS Y ALCOHOLICAS.

Las bebidas carbonatadas: son el resultado de la produccin de aguasefervescentes semejantes a los de fuentes naturales, con la nica diferencia que noesta, se le agrega dixido de carbono, azcar y algn tipo de cido.COMPOSICIN:

-*cido ctrico*cido fosfrico*cido tartarico

Su funcin de estas es la fijacin del color, sabor y actuar como conservadores.

- Preservativos (Conservadores): El gas carbnico es de gran ayuda para evitar el desarrollo de hongos.Los refrescos que contienen zumo de frutas y los que embotellan singas o conpoco gas, conservan benzoato de sodio.

- Fsicos:Los cambios fsicos se pueden originar por la luz solar, altera el color, sabor ytextura del producto,

- Microorganismos: La multiplicacin de microorganismos puede ser causada de que en la bebidase forme nota, nebulosidad, sediment etc. Los microbios causantes sonprotozoos; algas, hongos, bacterias y levaduras.

Requisitos microbiolgicos:-E.coli o termo tolerantescoliformes bateras 1x250ml:

No deben detectarse en ningunamuestra.

-Bacterias Coliformes (total)1x250ml :

Si 1 o 2 se realiza un segundoexamen.

Estreptococos Fecales 1x250ml: Si 1 o 2 se realiza un segundoexamen.

Pseudomonas aeruginosa1x250ml:

Si 2 se rechaza.

Bacterias anaerobias de sulfito1x50ml

Si 2 se rechaza.

PRUEBAS UTILIZADAS PARA EL ANALISIS DE AGUAS CARBONATADAS:

*Mtodo de hockins (tcnica del nmero ms probable)

*Prueba de ureasa (prueba bioqumica para detencin de microorganismos)

NORMAS:

Norma oficial mexicana NOM-142-SSA1-1995. Bienes y servicios. Bebidasalcohlicas. Especificaciones sanitarias. Etiquetado sanitario y comercial.

Norma oficial mexicana NOM-CCA-016-1995. Establece los lmites mximospermisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales a cuerposreceptores, y provenientes de la industria de bebidas gaseosas.

BEBIDAS ALCOHOLICAS: Este tipo de bebidas tambin poseen efervescenciapero se hace la distincin de acuerdo a su grado alcohlico, ya que estas poseencomo componente principal el alcohol etlico se pueden diferenciar por lo siguiente.

FERMENTACION ALCOHOLICA: Vino, Cerveza.

DESTILACION: Licores; por ejemplo el zanquee, bebida alcohlica a partir de arrozagua ardiente, tequila.

MICROORGANISMOS PATOGENOS PRESENTES EN MUESTRASALCOHOLICAS:

E. coliStaphylococcus aureusSalmonellaColiformes totalesColiformes fecales

*Medios de cultivo utilizados para el aislamiento de dichos microorganismos:

Base el medio Cromo Cen AGN Base de medio Cromo Cen SCCromo Cen CCAgar Cereloro corazn BHIA

1.-Apropiada para el recuentro de salmonella, E. coli, Coliformes totales, y coliformesfecales.

2.- Utilizada para la deteccin y aislamiento de salmonella (excepto salmonella typhiy Coliformes totales)

3.- Medio cromo gnico-flurogenico para la deteccin y recuento de E. Coli yColiformes.

5.- Medio nutritivo que al aadirle antibitico se puede utilizar para el cultivo yaislamiento de hongos.

ENFERMEDADES CAUSADAS:Clera, sepsis, enteritis, apendicitis, por lo cual se recomienda verificar laautenticidad de las bebidas alcohlicas y su calidad microbiolgica principalmentelas elaboradas de manera artesanal.

Norma Oficial mexicana NOM-142-SSA1-1995, Bienes y servicios, bebidasalcohlicas especificaciones sanitarias. Etiquetado Sanitario nacional.

Norma Oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, Bienes y servicios. Practicas dehigiene y sanidad para el proceso de alimentos bebidas no alcohlicas y alcohlicas.

PRUEBAS BIOQUIMICASBACTERIAS GRAM NEGATIVAS

INTRODUCCIN

Las bacterias vistas al microscopio generalmente aparecen como esferas o como bastones rectos ocurvos, estas pueden clasificarse dependiendo de su forma, en cocos (esfricas), bacilos (bastonesrectos) y espirilos (bastones curvos). Otra forma de clasificar las bacterias es aerobia, las quenecesitan aire para vivir, anaerobia, que no pueden vivir en presencia de aire y por ltimo, aquella queindiferentemente pueden vivir con aire o sin ste.

Tambin las bacterias se pueden dividir en dos grupos: Gram Positivo (+) y Gram negativo (-). Estadivisin se basa en la capacidad de reaccin de las bacterias frente al mtodo de coloracin,desarrollado por Christian Gram en 1884. Las que se tien con el colorante son Gram + y aquellasque no toman el colorante son Gram -.

Normalmente a los gneros de Gram negativos y positivos se les realiza pruebas bioqumicas comoson: LIA, MIO, SIM, CITRATO, KLIGGER, TSI, UREA, FENILALANINA entre otras...que ayudan en suidentificacin, en el caso de las Gram negativas, existen otros tipos de medios de cultivo, as comopruebas, como es el caso de la cataraza y coagulasa.

Uno de los gneros mas importantes del mundo microbiolgico bacteriano son las enterobacterias lascuales son de tipo Gram negativo, que por definicin son microorganismos entericos que producenenfermedad en el hombre y en todas las especies, como enteritis o la tpica diarrea, su aislamiento ycultivo son en medios selectivos diferenciales y perfiles bioqumicos. Una de las especies mssobresalientes es la E.coli.

La Escherichia Coli es una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales,incluido el humano y, por ende, en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 porTheodor von Escherich, bacterilogo alemn, quin la denomin Bacterium coli. Posteriormente lataxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.

sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Ademsproduce vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram, esanaerobio facultativo, mvil por flagelos pertricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, escapaz de fermentar la glucosa y la lactosa, en 48 horas con produccin de gas y cidos orgnicos(fermentacin cido mixta). Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como lasconcentraciones de estos azcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad decido (que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todoel tubo (pico y fondo) virar al color amarillo (cido). Es decir las colonias que fermentan la lactosaproducirn suficiente cido para causar el vire del indicador.

La supervivencia de estas bacterias en medios no entricos es limitada por lo que su presencia indicauna contaminacin reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo ndice ideal para ladeteccin de contaminaciones recientes.

Los Proteus mirabilis son una bacteria Gram.-negativa, facultativo anaerobia que pertenece a lafamilia de las Enterobacteriaceae, este demuestra salida en enjambre, motilidad, y actividad delureasa. Los cuales causan el 90% de todas las infecciones del Proteus.

Es decir al igual que otras enterobacterias como E.coli, causa con ms frecuencia infeccin urinaria ycutnea. Est tambin implicado en septicemia especialmente en pacientes inmuncomprometidos, yocasionalmente produce infeccin pulmonar. Se cree que el germen alcanza la va area porinhalacin, implicndose el papel de la colonizacin intestinal como posible reservorio. Los mirabilisdel Proteus, se pueden diagnosticar en el laboratorio debido al motilidad caracterstico de la salida enenjambre, y la inhabilidad de metabolizar la lactosa (en una placa de agar de Mac Conkey, porejemplo.) a causa de ello originan coloraciones incoloras. Es decir el agar de Mac Conkey es de granapoyo ya que es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizanlactosa y las que no lo hacen, por decir si la bacteria es lactosa positiva la hidrlisis de la lactosaproduce cidos orgnicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo o rosa, en el caso deque las colonias fueran lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio vira a amarillo porla subida de pH que origina la utilizacin de las protenas (peptona) que se encuentran en el medio.

Generalmente los Proteus son susceptibles a la mayora de los antibiticos aparte de la tetraciclina,no obstante 10%-20% de tensiones de los mirabilis del Proteus.

Las caractersticas ms comunes del genero Proteus es que pueden utilizar la urea y el citrato, aligual que producir el gas del sulfuro del hidrgeno, y formar las pelculas claras en medios delcrecimiento.

Comnmente las bacterias pueden ser encontradas a travs de las piedras, y estas bacterias queestn al acecho en las piedras pueden dar una infeccin despus del tratamiento antibitico.

En el caso de los entericos positivos como los estafilococos, estreptococos, Corinebacterias,Clostridios entre otros, crecen en medios enriquecidos como el agar sangre o normalmente losmedios suelen ser combinados, por ejemplo: Un medio de eosina azul de metileno es un medioselectivo diferencial. Este medio se utiliza para diferenciar las bacterias Gram positivas, a las queinhibe el crecimiento, de las Gram negativas como las enterobacterias (E. coli). Este medio contienelactosa como nutriente, y al ser tomado por las enterobacterias se produce cido, que hace que el pHdel medio baje, por lo que el color del medio pasar a ser violeta oscuro. Si por el contrario lasbacterias existentes en el medio no utilizan lactosa, no se produce cido, por lo que dan lugar acolonias incoloras.

Las infecciones bacterianas son las ms frecuentes, representando entre el 50 y 80% de todas lascomplicaciones infecciosas generalmente representadas por bacterias Gram positivas que negativas,prevaleciendo el Staphylococcus aureus, pero ninguna bacteria esta exenta de causar enfermedad,por que en casos son indispensables ciertos factores.

MATERIALES Y METODOS

A partir de una cepa microbiana, etiquetada como cepa numero 12 y 13 se tomo una muestra, la cualse sembr en agar Mac Conkey, en forma de estriado, para despus incubar a 37 C, durante 24horas. Pasado el tiempo, se realizaron las observaciones en cada placa, a partir de ello se procedi ala identificacin de microorganismos con la ayuda de una tincin Gram, la cual fue necesaria para laobtencin de datos mas cercanos al microorganismo presente.

Debido a la obtencin de una colonia lactosa negativa y positiva, se realizaron pruebas bioqumicas,es decir se tomo una pequea muestra del cultivo y se inoculo de forma recta y estriado en cada unade las pruebas, segn halla sido el caso, despus del sembrado del microorganismo se incubaron a37 C, durante 24 horas, para despus discutir las observaciones.

RESULTADOS

Basndonos en la actividad realizada, se discuti lo siguiente:

En la siembra de la cepa 12, en medio Mac Conkey se observo que la colonia era de forma redonda yde tamao pequea, con un color rosa plido, en base a sus caractersticas fsicas se dedujo que eralactosa negativa.

Para la cepa 13 se observaron colonias en forma redondas, de tamaos grandes y chicos, con uncolor rosa fuerte, en base a sus caractersticas fsicas se dedujo que era lactosa positiva.

En el caso de las pruebas bioqumicas, mediante cambios de coloracin, motilidad y presencia deH2S, segn haya sido el caso, se dedujo la presencia de E.coli en la cepa nmero 13 y Proteusmirabilis en cepa 12.

PRUEBA DE CATALASA

Introduccin

Estafilococo, del griego Staphyl, que significa racimo de uvas, es una variedad bacteriana de lafamilia de los cocos. Poseen forma esfrica y se agrupan formando grandes masas bacterianas enforma de racimo. Son del tipo conocido como Gram Positivo. Los estafilococos son la variedad ms

Crecimiento de E. coli enagar Mac Conkey.

Crecimiento de Proteus Mirabilis en agarMac Conkey

virulenta de la familia de los cocos, y son responsables de un gran espectro de enfermedades, desdeinfecciones cutneas hasta neumona, sepsis, etc.

Estos microorganismos estn presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otrosmamferos y aves. El gnero comprende en la actualidad a 32 especies y 15 subespecies, muchas delas cuales se encuentran en los humanos. Las especies que se asocian con ms frecuencia a lasenfermedades en humanos son Staphylococcus aureus (el miembro ms virulento y conocido delgnero), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophticus, Staphylococcus capitis yStaphylococcus haemolyticus.

Los estafilococos crecen fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en condicionesaerbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor velocidad de crecimiento es a 5-25C. Pero tambinse puede ver en activa fisin binaria entre 30 y 27 C

Los Estafilococos producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos.

Staphylococcus Streptococcus

Fundamento

La enzima descompone el perxido de hidrgeno H2O2

Mtodo:

Aadir una gota de H2O2 a un cultivo denso y buscar burbujas (O2)

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de lasbacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin esStreptococcus.

2H2O2 ---Catalasa---> 2H2O + O2

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).

Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes yC.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)


Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas:

1-. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre unportaobjetos limpio de vidrio.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlocon el cultivo.

Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirsefalsos positivos.

RESULTADOS

Al realizar la prueba de la Catalasa arrojo un resultado positivo indicando que el microorganismoencontrado se trata de un Staphylococcus y no un Streptococcus. La funcin de esta prueba esdiferenciar los gneros de Staphylococcus de los gneros de Streptococcus.

PRUEBA DE COAGULASA

Introduccin

Los estafilococos coagulasa negativos son un grupo de microorganismos frecuentes en la piel, causade infecciones nosocomiales sobre todo en recin nacidos de bajo peso y en pacientesinmunocomprometidos (con SIDA, con cncer, etc.). Una alta proporcin de los estafilococoscoagulasa negativos aislados son portadores del gen mcA que le confiere resistencia a lasbetalactamasas (meticilina). Se han identificado hasta el presente 37 especies de estafilococos

coagulasa negativos, de ellas 13 pueden originar infecciones en humanos. La sensibilidad a lanovoviocina se utiliza para clasificar el estafilococo coagulasa negativo en dos grupos. La cepas consusceptibilidad a la novoviocina incluyen entre otras Staphylococcus epidermidis, Staphylococcushaemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, y Staphylococcus schlefier i; porel contrario entre las cepas resistentes a la novoviocina se incluyen Staphylococcus saprophyticus yStaphylococcus xylosus que originan infecciones urinarias en huspedes inmunocompetentes.

Al ser el estafilococo coagulasa negativo un comensal habitual de la piel, la distincin entre infecciny contaminacin puede resultar en ocasiones difcil. Por ello, habitualmente se considera como criterionecesario de infeccin adems de un hemocultivo positivo, la existencia de manifestaciones clnicasde infeccin o una elevacin de algn parmetro inflamatorio. Algunos son ms estrictos en loscriterios diagnsticos de infeccin por estafilococo coagulasa negativo y consideran necesario almenos 2 hemocultivos positivos.

Staphylococcus coagulasa negativa Sthaphylococcus aureus

Fundamento

Esta prueba se utiliza para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otrasespecies del gnero Staphylococcus. La coagulasa es una enzima que estimula la conversin delfibringeno en fibrina, por lo que comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasmapor accin de esta enzima. Si es coagulasa positivo, se produce una turbidez alrededor de la colonia,debida a la coagulacin del plasma. Por otro lado, realizamos esta prueba cultivando a las bacteriasen un medio rico en manitol (adems de plasma).

El manitol es un azcar y gracias a este medio podremos distinguir si el microorganismo lo utilizacomo fuente de carbono. Si es capaz de usarlo, se produce una acidificacin del medio, lo que dalugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo.


Para esta prueba se aade una suspensin densa de bacterias a un tubo pequea con plasma. Y seincuba a 37 oC. Se observa la coagulacin a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa, si aparece uncoagulo en la suspensin el resultado ser positivo, de no observarse nada en la solucin, elresultado se tomara como negativo.

RESULTADOS

El resultado arrojado despus de haber realizado la prueba de la coagulasa fue negativo por lo quese compraba que el microorganismo encontrado es un Staphylococcus coagulasa negativo. Con esteresultado se puede asegurar de que la especie estudiada no se trata de un Staphylococcus aureus.

SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

Introduccin

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro dehidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento

El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena,que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjuntode enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo deKovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarseen este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que

aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro desulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Reacciones Produccion de indol

Triptofano ( C11H12N2O2 ) indol ( C8H7N )

Produccion de H2S

+ H+ H2S

Cisteina on hidrogeno Acido sulfhidrico


Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja deinoculacin recta.

Se debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio decultivo desde la superficie.

IncubacinDurante 24 horas, a 35-37C, en aerobiosis. Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.

RESULTADOS

Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea de siembra. Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio.

Triptofanasa

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Sulfuro indol motilidad

Se observa la produccin de sulfuros, que se precipitan con iones frricos, a partir del tiosulfato desodio presente en el medio. La prueba positiva se muestra un precipitado negro en el medio de cultivodonde creci la bacteria as tambin una turbidez en el medio debido ala motilidad de la bacteria

Sulfuros indol motilidad

Se observa una coloracin caf oscuro alrededor de la puncin lo que indica el crecimiento, astambin la motilidad de la bacteria y la falta de produccin de sulfuro en el medio.

Sulfuro indol motilidad

Se

observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el triptfano por medio de la enzima triptofanasa yproducir INDOL. Al adicionar Kovacs sobre el medio cuando hay produccin de Indol se forma unanillo rojo (tubo de la derecha). De lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro y laizquierda).

Resultados obtenidos en la realizacin de la prueba

MO. Encontrado Prueba Movilidad Indol H2S

bioqumica

E. coli SIM Positivo Positivo Negativo

P.mirabilis SIM Negativo Positivo Positivo

PRUEBA DEL CITRATO

Introduccin

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente decarbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocandouna alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientesgneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sinembargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer conesos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio yfosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimolcomo indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse eneste medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar unafuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verdea azul.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio esla nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Lassales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodiomantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul enmedio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces deutilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno,con la consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travsdel ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato ypiruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al serutilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entoncesvira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. Independientemente de losproductos terminales producidos, el primer paso de la fermentacin del citrato da por resultado laproduccin de piruvato. La degradacin del piruvato depende entonces, del pH del medio.

Reacciones del citrato

Citrato oxalacetato + acetato

Piruvato + CO2

Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del medio. Si el pH aumenta(alcalino), se produce ms acetato y formato con una disminucin de la produccin del lactato y CO2,por encima de pH 7 no hay produccin de lactato y los productos son:

Citrato CO2 + cido formico + 2 cido actico

Con el pH cido el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los principales productos deutilizacin del citrato. Independientemente de los productos terminales producidos, el primer paso dela fermentacin del citrato da como resultado la produccin de piruvato. La degradacin del piruvatodepende entonces del pH del medio


Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja deinoculacin recta y estriado en la superficie.

IncubacinDurante 24 horas, a 35-37C, en aerobiosis.

RESULTADOS

Prueba de citrato Simmons positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.

Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde)

POSITIVA NEGATIVO


Moo. Encontrado Prueba bioqumica Resultado

E. coli Citrato Negativo

P.mirabilis Citrato Negativo

MIO (MOTILIDAD, INDOL, ORNITINA DESCARBOXILASA)

Introduccin

Medio usado para la identificacin de Enterobacterias basndose en su movilidad, actividad deornitina descarboxilasa y produccin de indol.

Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura,peptona y tripteina. Adems, la tripteina aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de laenzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbonofermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina descarboxilasa, elprpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en mediocido es amarillo.

Fundamento

Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia deornitina descarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms allde la lnea de inoculacin.

La reaccin positiva a la ornitina esta dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacinde la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pHprpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones optimas para laactividad de la enzima ornitina descarboxilasa, la cual descarboxila la ornitina presente. Pordescarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el colorprpura.

El indol producido a partir del triptfano por los microorganismos que contienen la enzimatriptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o deErlich, indica un resultado positivo.


Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja deinoculacin recta. Se debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios deprofundidad del medio de cultivo desde la superficie.

IncubacinDe 18 a 24 horas, a 35C, en aerobiosis

Para la prueba de indol se aaden de 3 a 4 gotas de reactivo de Kovacs, y se agita suavemente eltubo.

RESULTADOS

Observaciones

La movilidad es indicada por turbidez del medio o por crecimiento extendido a partir de la lnea deinoculacin. La ornitina descarboxilasa es indicada por el color prpura del medio. La ornitina negativaes indicada por un color amarillo, en el fondo puede ser prpura al final.

La aparicin de color rosa o rojo en el reactivo se interpreta como prueba positiva de indol.

Interpretacin de resultados

MOVILIDAD

Positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms a all de la lnea de siembra

Negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra

ORNITINA DESCARBOXILASA

Positivo: color prpura

Negativo: color amarillo, a veces se puede observar color prpura en el fondo

PRUEBA DEL INDOL

Positivo: color rojo al agregar el reactivo de Kovacs

Negativo: el color del reactivo de Kovacs permanece incoloro-amarillento


MO. Encontrado Pruebabioqumica

Movilidad Indol Ornitina

E. coli MIO Positivo Negativo Positivo

P.mirabilis MIO Positivo Positivo Positivo

TRIPLE AZUCAR (TSI)

Introduccin

E TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido ygas a partir de la glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la identificacin dela produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en lafamilia Enterobacteriaceae. Con objetivo de diferenciar entre:

Bacterias fermentadoras de la glucosa

Bacterias fermentadoras de la lactosa.

Bacterias fermentadoras de sacarosa.

Bacterias aerogenicas.

Bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Fundamento

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de reaccindentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno esaerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia.

Al crecer un microorganismo en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol)por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo-donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de maneraque se pueden detectar la produccin de pequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojofenol). Si se inoculan microorganismo no fermentadores no se formarn cidos, pero por laproduccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo.

La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI esinoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad decido producida por fermentacin ser baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En lasprimeras horas (10 a 16 hrs.) de incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo eltubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la produccinde aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita.

Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estosazcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido (que no puede serneutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo)virar al color amarillo (cido).

La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso(negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondodel tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee comofermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse la produccin de gas(H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento delmismo hacia la superficie.


Siembra

Con un asa recta de nicromel tomar una colonia del microorganismo ainvestigar.

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para esointroducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el picocon un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 37 C durante 18-24 hrs., pero no ms de 24 hrs.


Para la prueba de indol se aaden de 3 a 4 gotas de reactivo de Kovacs, y se agita suavemente eltubo.

DISCUSION Y RESULTADOS

Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.

Bisel cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.

Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.

Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.

Taco alcalino (rojo) y Bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glcidos es fermentado.

La aparicin de burbujas en el taco indica que la fermentacin se ha efectuado con produccin degas.

Un ennegrecimiento en el medio indica la produccin de cido sulfhdrico.

A BC D

A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada

B Glucosa fermentada con produccin de cido sulfhdrico y gas

C Glucosa fermentada con produccin de cido sulfhdrico

D Ninguno de los tres azcares es fermentado

En el experimento que realizamos en el laboratorio de microbiologa inoculamos dos microorganismosdesconocidos en tubos diferentes de agar TSI. Y por medio de esta prueba bioqumica acompaadade otras mas determnanos que los microorganismos encontrados eran los siguientes.


Moo.Encontrado

Pruebabioqumica

H2S MOTILIDAD FERMENTACION DEAZUCARES

E. coli TSI Negativo Positivo Positivo

P.mirabilis TSI Positivo Negativo Negativo

LIA (AGAR HIERRO LISINA)

IntroduccinEsta prueba permite diferenciar el microorganismo. Que producen descarboxilacin o desaminacinde la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas debsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspectosimilar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar lapresencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato desodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El prpura de bromocresol, es elindicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual omayor a 6.8.

Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato-especificas, capaces de actuar sobre laporcin carboxilo (COOH) de los aminocidos, con formas de aminas de reacciona alcalina. Estareaccin conocida como descarboxilacin, produce dixido de carbono con producto secundario.Cada una de las descarboxilasas es especfica para un aminocido.

Lisina, ornitina y arginina son los tres aminocidos ensayados habitualmente en la identificacin delas enterobacterias y producen las siguientes aminas especficas.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de laglucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs. deincubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.

La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a laformacin de sulfuro de hierro.

Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina,esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgenoforma un color rojizo en la superficie del medio.

Siembra

Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriarel pico con un movimiento hacia uno y otro lado.


RESULTADOS Pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis.

Pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina negativa. Ej.:Proteus mirabilis.

Pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. coli

Pico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej.Citrobacter freundii.

Coloraciones de las reacciones de la prueba bioqumica LIA.


Microorganismo Prueba bioqumica Resultado

Escherichia coli LIA Negativa

Proteus mirabilis LIA Positiva

PRODUCCIN DE UREASA

Introduccin

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniacopor accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies deProteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo opositivo retardado. Los microorganismos que poseen la enzima ureasa tienen la capacidad dehidrolizar urea con la liberacin de amoniaco.

El caldo urea de stuart est fuertemente estabilizado con sales de fosfato a un ph de 6.8. Elorganismo en estudio debe producir cantidades relativamente grandes de amoniaco a fin de superarel sistema estabilizador y elevar el ph del medio lo suficiente como parar provocar el viaje delindicador (por encima de 8.0).El caldo urea de stuart es, por lo tanto, virtualmente selectiva paraespecies del genero Proteus.

Fundamento

Determina la capacidad de un organismo para desdoblar la urea, en amoniaco y C02, por accin de laenzima ureasa. La visualizacin del proceso se fundamenta en que la alcalinizacin producida en elmedio de cultivo se detecta mediante un indicador de pH (rojo de fenol).


Siembra

Inocular los tubos (asa recta). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Trasretirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.

IncubacinIncubar a 35-37 C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.

DISCUSION DE RESULTADOS

Se considera la prueba positiva si el medio adquiere una tonalidad rosada, y negativa si mantiene sucoloracin inicial.

Reaccin negativa

Reaccin positiva


Bacteria Prueba bioqumica Resultado

Escherichia coli Urea Negativo

Proteus mirabilis Urea Negativo

LIA (AGAR HIERRO LISINA)IntroduccinRESULTADOS

manual de microbiologia 2014 72 pgs

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