INTRODUCCIÓN

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. UN ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudan.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

OBJETIVOS:

Realizar adecuadamente una coloración simple en bacterias y de levaduras de una muestra bacteriana

Ejecutar eficientemente una coloración gran de una suspensión bacteriana Ejecutar adecuadamente una coloración negativa de una suspensión bacteriana Diferenciar la bacteria ácido y no acido alcohol resistentes Obtener simple y coloración Gram. Identificar microscópicamente las formas y agrupaciones de cocos bacilos de una muestra

microbiana Reconocer las diferencias morfologías de las colonias bacterias presentes en los medios de

cultivo solidos Describir los patrones de crecimiento de bacterias en caldo común Identificar la capsula de una muestra microbiana coloreada Afianzar las técnicas de coloración simple y de coloración Gram Identificar las esporas bacterianas de una muestra microbiana coloreada.

Materiales:

o Microscopio o Láminas y laminillas o Tubos de ensayo o Cristal violeta o Safranina o Mecheroo E. COLI,o PSEUDOMONAS, o Staphylococcus,o Bacilluso Lamina montada de tuberculosis o Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO:

1. Agrega el colorante de cristal violeta encima de la muestra seca durante un minuto 2. Elimina el exceso del colorante y lava ligeramente la lámina con agua corriente o sumergirlo

en un recipiente con agua destilada 3. Seca la lámina lavada .espera a que se enfrié4. observa las láminas primero con los objetivos de 10X luego EN 40X Y en 100x 5. procede en forma similar con la suspensión de Staphylococcus sp y agua estancada 6. Observación macroscópicamente las colonias de las placas mostradas 7. Determinar la forma ,borde .elevación ,estructura ,consistencia , tamaño y pigmento de las

colonias observadas 8. Se realiza una coloración Gram de dos colonias distintas de una placa que contiene Bacillus

subtilis - Escherichia coli y determina la forma y agrupación a la que pertenece .de igual modo ,procede con la placa que contiene Staphylococcus aerus -pseudomonas sp

9. Luego observar macroscópicamente con los objetivos 10x 40 x y 100x

Resultados:

Muestras de coloraciones simples

Medios de cultivo

o E. COLI,o PSEUDOMONAS, o Staphylococcus,o Bacillus

o Muestras de E. COLI,o PSEUDOMONAS, o Staphylococcus,o Bacillus

Aceite de cedro

Coloracion de bacillus con Coloracion de crystal violeta a 100x con aceite de cedro

Coloracion simple de E.coli con Coloracion safranina a 100x con aceite de cedro

Coloracion Gram

Coloracion simple de staphylococcus con Coloracion crystal violeta a 100x con aceite

de cedro

Coloracion simple de pseudomonas con Coloracion crystal violeta a 100x con aceite

de cedro

Coloracion gram staphylococcus con aceite de cedro a 100x

Coloracion gram positive bacillus con aceite de cedro a 100x

Coloracion gram positive pseudomonas con aceite de cedro a 100x

Lamina montada de tuberculosis con aceite de cedro a 100x

Lamina montada de esporas con aceite de cedro a 100x

Discusiones:

A diferencia de las demás muestras tuvimos un inconveniente con la coloración Gram de la bacteria E .coli ya que enjuagaron toda muestra y no se logró observar.

Conclusiones:

Hicimos las coloraciones respectivas para cada muestra Logramos observar muestras claras y además agregamos una gota de aceite de cedro Además logramos reconocer el  Mycobacterium tuberculosis en la lámina montada

Referencias bibliográficas:

Lamina montada de capsula con aceite de cedro a 100x

1. Murray PR, EJ, MA, Tenover FC. Yonken RH (editores). Manual of Clinical Microbiology, 6a edición. American Society for Microbiology, Washington, DC 1995.

2. Mims CA, Playfair JHL, Roitt IM, Wakelin D, Williams R (editores). Microbiología Médica. Mosby/Doyma Libros, Gran Bretaña, 1995

3. Shaechter M, Medoff G, Eisenstein BI (editores). Mechanisms of MicrobiaDisease. 2a edición. Williams & Wilkins, Baltimore, 1993.

4. Shulman ST, Phair JP, Sommers HM (editores). The Biology & Clinical Basis of Infectious Diseases. 4a edición W.B. Saunders Company, Philadlphia, 1992.

 

Preguntas de la practica 05

1. Por qué se dice que la coloración Gram es una coloración diferencial

Es generalmente utilizado debido a que muchas de las células patógenas son del tipo gramnegativo, aparte de esta diferencia las células Gram positivas son más susceptibles a la penicilina y más resistentes a la acción mecánica y exposición a algunas enzimas que las Gram negativas

2. Mencione 05 géneros microbianos de bacterias Gram positivas y 05 Gram negativas

Gram positivas

o Staphylococcus aerus o estreptococos pyogenes o estreptococos agalactiae o estreptococos faecalis o estreptococos pneumonae

Gram negativas

o Bacillus antracsis o Clostridium tetanio Clostridium perfingineso Salmonela tiphyo Vibrio choleare

2. ¿Qué tipo de estructuras se colorea en la coloración simple?

o Se colorea láminas donde se tienen las bacterias, staphylococcus, bacillus.

3. ¿En una coloración Gram que tipo de color adquirían las esporas de Bacillus subtilis?

Rosadas

4. ¿Qué ventaja se obtiene con la tinción negativa en enterobacter sp?

5. ¿Mencione 03 géneros microbianos distintos que son ácido alcohol resistente? o Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiológicos de la tuberculosis

(Mycobacterium tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae

6. ¿Cómo Observarias los gránulos de poli – hidroxiburico phb?o Miden unos 0.2-0.7 mm de diámetro, y que van provistos de una envuelta Proteica de

unos 3-4 nm de grosor. Pueden llegar a representar el 80% en peso de la célula. Tiene una forma algo circular son visibles a microscopio óptico en fresco, debido a su elevado índice de refringencia. Se tiñen bien mediante Negro-Sudán.

Autoevaluacion

1. ( a ) Una bacteria puede visualizar adecuadamente con el objetivo de 100 x sin necesidad de colorear por que posee diferentes índices de refracción que permite observarlo a ese aumento

2. ( c ) La cloración con azul de metileno se conoce como tinción directa por que el colorante se combina directamente con los grupos fosfatos del ADN bacteriano

3. ( a ) La capsula de leuconostoc mesenteroides puede visualizarse con tinción negativa por que el colorante no tiñe a la capsula sino al fondo

4. ( c ) La coloración Gram es una coloración diferencial por que emplea dos colorantes: lugol y safranina

Respuestas:

1) A 2) C 3) A 4) C

Preguntas de la practica 6

1. Obtendrás las mismas observaciones microscópicas de las colonias, si estos hubieran sembrado en agar común +extracto de levadura?

2. Seria las mismas caracteristicas de pigmento tamaño y consistencia observadas en las placas en comparacion con los tubos con agar inclinado

Si la estructura es de acuerdo a la opacacidad, transparencia traslucida, es muy importante porque es donde suelen presentar capsulas u otros componentes que proporcionan aspectos más compacto o rugoso.

3. Que técnicas de aislamiento ha sido empleada para aislar las colonias del ítem a?

4. Qué tipo de resultado microscópico obtendrías de una copia que presenta dos tipos de pigmentación.

o La mayoría de microorganismos carece de pigmento lo cual en su crecimiento exhibe un color blanco o gris es así como se llegaría a examinar pigmentos difusibles

5. Obtendrías los mismos resultados, si en la coloración de esporas usas azul de metileno en lugar de verde malaquita ¿?

Autoevaluacion

2) ( A ) El aislamiento por estrías en medio solido permite separar en cultivos puros de Bacillus sp porque esa técnica conforme avanza, diluye la muestra microbiana

3) ( C ) Es fácil el aislamiento en medios líquidos de cultivo puros de Bacillus sp porque esta técnica conforme se diluye la muestra microbiana, los otros microorganismos contaminantes se diluyen

4) ( E ) Escheria coli forma una colonia característica en agar común diferente a nivel de genero por esas caracteristicas mencionadas

5) ( A) Staphylococcus aerus es una bacteria no exigente nutritivamente por lo tanto crece bien en agar común.

Respuestas

1) A 2) c 3) e 4) a

PREGUNTAS EN CLASE

¿Porque la lámina no debe tener una gota de agua en una lámina de inmersión?

¿Qué tipo de coloraciones estructurales se utilizan para la capsula de flagelo?

Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados de flagelo creando Resistencia

¿Qué es el fundamento de la coloración Gram ZIEH ?

o Confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido resistente un ejemplo la tuberculosis y M.marinum este tipo de Coloracion requiere de calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras .al suspender el calentamiento y enfriar con agua provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que l colorante no puede salir de las bacterias

¿A qué se llama colorante de contrastes?

o Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo la safranina