microbiologia

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO .

Determinación de la calidad higiénica de quesos frescos comercializados en la Provincia Constitucional del callao, Perú,

mediante análisis microbiológicos.

Chira Fajardo, Rubéne-mail: [email protected]

Chumpitaz Huanqui ,Geralde-mail: [email protected]

Durand López Jackelinee-mail:

Garcia Molero Winniee-mail: [email protected]

Hurtado Ortega Rodrigoe-mail: [email protected]

Prado Chávez Josselinee-mail: [email protected]

Sevillano Pareja Dianae-mail:dallana19_sp @ hotmail.com

Velasquez Infante Milagrose-mail:[email protected]

RESUMEN: El queso fresco es un producto de alto consumo en el Perú, la materia prima principal para la elaboración de este producto es la leche. En algunos casos, las condiciones bajo las cuales se realiza la producción del queso, no son óptimas, provocando así una contaminación del producto por parte de la mala manipulación y falta de higiene en los procesos. Por esta razón, el objetivo general del presente trabajo es determinar y cuantificar a los mesófilos aerobios totales, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Salmonella spp y determinar la presencia de hongos y levaduras en muestras de queso fresco, comercializadas en los mercados y supermercados ubicados en la Provincia Constitucional del Callao, en un período comprendido entre los meses de agosto y noviembre del 2014. Para lo cual se utilizaron diversas pruebas microbiológicas para determinar y cuantificar la carga microbiana presente en las muestras. Se realizó la determinación y cuantificación de Escherichia coli, determinación y cuantificación de Staphylococcus aureus, determinación y cuantificación de Salmonella spp y la determinación de hongos y levaduras. En general se determinó que la muestra de queso de fresco presenta en su mayoría un 46% de levaduras, 27% de mesófilos, 26% de Staphylococcus aureus y en su minoría 1% de salmonella.

PALABRAS CLAVE: Escherichia coli, hongos, levadura, Queso fresco, Staphyloccocus aureus, Salmonella spp.

ABSTRACTThe cheese is a product of high consumption in Peru,

the main raw material for the manufacture of this product is milk. In some cases, the conditions under which the cheese is made, are not optimal, causing contamination

of the product by poor handling and lack of hygiene in the process. Therefore, the overall objective of this study is to determine and quantify the total aerobic mesophilic, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp and determine the presence of fungi and yeasts in samples of cheese, sold in markets and supermarkets in the Constitutional Province of Callao, in the period between August and November 2014. To which various microbiological tests to determine and quantify the microbial load present in the samples were used. The identification and quantification of Escherichia coli, identification and quantification of Staphylococcus aureus, identification and quantification of Salmonella spp and determination of fungi and yeast was done. Overall it was determined that the fresh cheese sample presents mostly yeast 46%, 27% mesophilic, 26% of the Staphylococcus aureus and Salmonella minority 1%.

KEYWORDS: Escherichia coli, fungi, yeast, fresh cheese, Staphylococcus aureus, Salmonella spp.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, se ha incrementado el interés por el consumo de alimentos de calidad, por lo que las diferentes organizaciones nacionales e internacionales, trabajan para procurar la inocuidad de los alimentos, entendida como la “propiedad de los alimentos para no causar daño a la salud pública”.

A nivel mundial, han aumentado las enfermedades transmitidas por alimentos, conocidas como “ETAs”. Mientras que en el Perú, son un importante problema de salud pública y son causados por una gran variedad de agentes infecciosos. Existen dos tipos de “ETAs”: Las intoxicaciones alimentarias, causadas por las toxinas

1


que producen los microorganismos y las infecciones alimentarias. Es por esto que una buena higiene en la manipulación de los alimentos es de suma importancia ya que de esta manera se puede prevenir este tipo de enfermedades. (1)

Uno de los alimentos de consumo popular en el Perú es el queso fresco, el cual de acuerdo con la Norma Técnica Peruana (NTP) 202.087, se define como el producto sin madurar obtenido por separación del suero después de la coagulación de la leche cruda o reconstituida, pasteurizada, entera o parcialmente descremada, o de una mezcla de estos productos, y que cumple con los requisitos especificados en esa norma (generales: color, forma, corteza, pasta, composición; fisicoquímicos; aditivos alimentarios permitidos; microbiológicos; y temperatura de conservación). (2)

La materia prima para la elaboración del queso es la leche y esta constituye un excelente sustrato para la proliferación de microorganismos debido a su alto contenido de nutrientes. La contaminación de este producto puede producirse de diversas maneras, tales como: una mala pasteurización de la leche con la que se va a elaborar el queso; puede proceder de la ubre enferma (mastitis), de heces u otras excreciones de vacas infectadas o sintomáticas, del hombre de un ambiente contaminado o del equipo de ordeño. Muchas veces el proceso de elaboración de los quesos se da en condiciones de procesamiento, transporte y comercialización que no cumplen con las mínimas normas de higiene con respecto a los equipos, medio ambiente de trabajo e higiene personal. (3)

La presencia de patógenos en el queso puede reducirse considerablemente mediante una adecuada higiene y buenas prácticas de manufactura. Es reconocido que el sistema Análisis de Peligro y Puntos Críticos de Control (HACCP), puede ser una herramienta eficaz para aumentar la seguridad de los alimentos. (4)

El presente estudio tiene como finalidad determinar y cuantificar la cantidad de Salmonella spp, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, hongos y levaduras presentes en muestras de queso fresco, comercializadas en los mercados y supermercados ubicados en la Provincia Constitucional del Callao, en un período comprendido entre los meses de agosto y noviembre. Para lo cual se realizaron análisis microbiológicos en el laboratorio de microbiología de la Universidad Nacional del Callao ubicado en Chucuito-Callao.

Nuestro objetivo general es determinar y cuantificar a los mesófilos aerobios totales, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Salmonella spp y determinar la presencia de hongos y levaduras en muestras de queso fresco, comercializadas en los mercados y supermercados ubicados en la Provincia Constitucional del Callao, en un período comprendido entre los meses de agosto y noviembre del 2014.Nuestro Objetivo específico es, evaluar la calidad higiénica de los quesos frescos comercializados en la Provincia Constitucional del Callao.

1.MATERIALES Y MÉTODOS

1.1 Escherichia coli

Materiales• 1 vaso precipitado • 2 tubos de ensayo• 18 tubos con campana Durham• 1 haza de siembra• 2 placas Petri

Reactivos• Caldo de enriquecimiento: agua

peptonada• Caldos: Lauril sulfato y E.C.• Agar EMB

Diluir 10 g de la muestra en 90 ml de agua peptonada. Después diluir 1 ml de esta mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Seguidamente diluir 1 ml de esta nueva mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Así obtendremos diluciones de 10-1, 10-2, 10-3

Siembra

Determinación del Número Más Probable (NMP)

a. Prueba presuntiva: Siembra en tubos

De cada una de las diluciones preparadas se colocó 1 ml en un tubo de ensayo (se utilizaron 3 tubos de ensayo por cada dilución) que contenía 9 ml de caldo lauril sulfato y campana de Durham invertida. Se incubaron a 35-37°C por 24 horas. Luego de este periodo de tiempo se agitó suavemente cada tubo y se observó la aparición de gas y turbiedad, ambas apreciaciones simultáneamente indicaron positividad de la prueba.

Esta prueba determina que solo hay coliformes

b. Prueba confirmativa:

Se procedió a trasladar 1ml de cada disolución ( cada disolución estaba en 3 tubos con caldo lauril sulfato) a otros tubos de ensayo ( cada tubo de ensayo contenía caldo E .C. y sus respectivos tubos durham), no olvidar que para cada disolución obtenida de la prueba presuntiva había 3 tubos de ensayo con dichas disoluciones, igual para este caso para cada tubo de ensayo de dicha disolución habrá un respectivo tubo que contiene en su interior caldo E.C. y un tubo durham, este paso se realizara igualmente con las demás disoluciones obtenidas en la prueba presuntiva. Luego se llevó a incubar a 44.5ºC/24-48 horas.

c. Prueba determinativa: Siembra por estrías de tubos positivos en agar EMB

De los tubos positivos obtenidos en la prueba confirmativa, se llevó a realizar el sembrado en placas con agar EMB (agar especial para la identificación de E. Coli). Para el sembrado se usó 2 placas con EMB, a cada placa se le dividió en 4 partes (para cada tubo) y se realizó el sembrado.

2


Identificación

Colonias típicas de color azul oscuro con brillo verde metálico.

Ilustración 1:Prueba presuntiva

Fuente:

Ilustración 2:Prueba confirmativa

Ilustración 3:Prueba determinativa en agar EMB

Fuente :Propia

1.2 Staphylococcus aureus

Materiales• 1 vaso precipitado • 2 tubos de ensayo• 1 haza de siembra• 6 placas Petri

• 2 mecheros BunsenReactivos• Caldo de enriquecimiento: agua peptonada• Agar Baird Parker

Métodos

Diluir 10 g de la muestra en 90 ml de agua peptonada. Después diluir 1 ml de esta mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Seguidamente diluir 1 ml de esta nueva mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Así obtendremos diluciones de 10-1, 10-2, 10-3.

Enriquecimiento del agar Baird Parker

Se pesó una cantidad de agar Baird Parkerde acuerdo a la información brindada en el etiquetado haciéndose los cálculos necesarios y luego se transvasó a un recipiente con la mitad de agua requerida.

Se añadió la otra mitad de agua, siendo en total para la práctica 120 ml (aprox. 20 ml/placa), se enriqueció el agar con yema de huevo con telurito de potasio (50ml/950ml) obteniendo un 6.31 ml de yema de huevo con telurito de potasio se movió para disolver el agar y posteriormente se llevó a calentar en el horno microondas en tres intervalos de tiempo (1 minuto cada uno) a 100ºC para fundir el medio y homogenizarlo. Se obtuvo el agar disuelto, homogenizado y con una coloración traslúcido a la luz .Finalmente se llevó a esterilizar el agar a 121ºC/20 min en el autoclave. Se dejó enfriar hasta 45-50ºC para servir en las placas.

Siembra

Tipo de siembra: Diseminación

Se vierte el agar Baird Parker enriquecido con yema de huevo y telurito (15 ml aprox.) a las 6 placas (previamente rotuladas) y dejamos enfriar para que se solidifique el agar. Cuando ya está solido el agar se empieza a hacer la operación de sembrado añadiendo 0.1 ml de la dilución de 10-1 en 2 placas, igual para 10-2 y 10-3 el mismo procedimiento para las demás muestras del mercado.

Se rotula las placas, se voltean y se empaquetan rotuladas parar diferenciar la dilución y finalmente se llevó a incubar a 37ºC/24horas.

Recuento

Se debe observar colonias negras brillantes con un halo blanco muy delgado.

Luego del tiempo de incubación, se procedió a observar las colonias características y se llevó a un contador de colonias, para facilitar el conteo de las placas con dilución 10-2, se dividió la placa en cuadrantes y solo se contó un cuadrante, cuyo resultado obtenido se multiplicó por 4 para obtener el total.

Como son dos placas por dilución, se obtiene dos conteos, entonces estos se promedian aritméticamente y dicho valor numérico es el representante del número de colonias por cada dilución, luego este valor se multiplicó

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por su inversa de concentración de la dilución, el mismo proceso ocurre para las demás muestras del mercado.

Ilustración 4:Siembra por diseminación

1.3 Mesófilos aerobios

Materiales• 06 Placas Petri • Una botella• 02 tubos de ensayo • Balanza analítica• Probeta• Propipeta• Pipeta• Mechero• Alcohol Reactivos• Agua Peptonada• Agar Plate Count

Métodos

Diluir 10 g de la muestra en 90 ml de agua peptonada. Después diluir 1 ml de esta mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Seguidamente diluir 1 ml de esta nueva mezcla en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua peptonada. Así obtendremos diluciones de 10-1, 10-2, 10-3

Siembra

Tipo de siembra: DifusiónA partir de la serie de diluciones decimales se

deposita con pipeta esterilizada 1 ml de la dilución en placas Petri vacías y esterilizadas cerca del mechero encendido. A continuación se vierte de 15 a 20 ml de agar Plate Count. Homogenizar la mezcla contenida en la placa cuidadosamente con finos movimientos circulares para obtener colonias dispersas. Se realiza el mismo procedimiento para cada dilución (dos placas por dilución). Incubar a 35°C durante 24 -48 horas.

Recuento

Contar las colonias crecidas en la placa cuyo número se encuentre entre 30 y 300, luego multiplicar por el factor de dilución de la placa para obtener el número de UFC/g de la muestra analizada.

1.4 Hongos y Levaduras

Materiales• Matraz Erlenmeyer • Pipetas graduadas esterilizadas de 1 ml• Seis placas Petri • 2 tubos de ensayo • Propipeta • Balanza electrónica • Horno microonda• Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25°CReactivos:• Agua peptonada• Agar Plate Count• Tetraciclina

Métodos

Preparar el agua peptonada y en un matraz Erlenmeyer vaciar 90ml y en los 2 tubos de ensayo vaciar 9ml a cada uno para realizar las diluciones.Pesar 10g de muestra de queso, vaciarlo al matraz Erlenmeyer con los 90 ml de agua peptonada y Homogenizar la solución obtenida. De la solución anterior tomar 1ml y transferirlo al tubo 1 que contenga los 9ml de agua peptonada. De la solución obtenida del tubo 1 tomar un mililitro y transferirlo al segundo tubo, del segundo tubo tomar 1ml y eliminarlo al lavadero. Obteniendo las diluciones de. 10-1, 10-2, 10-3. Preparar 120 ml de agar OGY o Saburo, calentar en el microondas para su dilución durante un tiempo de 3 minutos (1´+1´+1´), esterilizarlo en la autoclave a 121°C por 15 minutos a presión de 15 atm. Dejar que se enfrié

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0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml


la solución de agar OGY, después agregar una pastilla de tetraciclina. Vaciar la solución de agar OGY con tetraciclina en seis placas Petri previamente rotuladas De las diluciones realizadas, con una pipeta esterilizada extraer 0.1ml de dicha disolución y vaciarlo en las placas rotuladas Dejar incubar a 25°C por 3 a 5 días para la obtención de los hongos y levaduras. Finalmente realizar el conteo de colonias de cada placa después de los días de incubación, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 a 150 colonias.

Ilustración 5:Determinación de Hongos y Levaduras

2.RESULTADOS

2.1 Determinación de Staphylococcus aureus

Del total de 6 muestras recogidas, se observaron los siguientes hallazgos: 5 muestras con recuentos para S. aureus en dilución 102 (Figura 1) y para la dilución 103

(Figura 2), las cuales provienen del mercado central del callao. El cultivo en medio selectivo para S. aureus (B.P), permitió el crecimiento de colonias con actividad lecitinasa y reducción de telurito, presentando la forma específica de cocos (Figura 2)

Figura 1: Resultados del ensayo en Agar Baird Parker en dilución 10-2

Fuente: PropiaFigura 2: Resultados del ensayo en Agar Baird Parker

en dilución 10-3

Fuente: propia

2.2Determinación de de coliformes en E.C

Fuente :Propia

Figura 3: Resultados de coliformes totales en diferentes muestras de queso. Obteniendo en MCC1 y en MCC5

presencia de E.Coli.

Fuente :propia

2.3 Determinación de mesofilos

5


FFFDE

Fuente :Propia

Figura 4: Resultados de Mesofilos totales en diferentes muestras de queso

Fuente: Propia

3.DISCUSIONES

3.1 staphilococcus

Según la norma sanitaria estipulada por el MINSA/ DIGESA, que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano; la cantidad de carga microbiana permitida con respecto a Staphilococcus aureus en quesos frescos se encuentra entre 10-102 UFC/g; sin embargo los valores reportados en este estudio con respecto a las 5 muestras de quesos frescos obtenidas del mercado central del callao se encuentran por encima de los límites permitidos llegando a un promedio de 18.6x103 UFC/g ;lo cual si bien es cierto no es un inminente riesgo para la salud de la población ya que según la FDA se necesita al menos 106 UFC/g para liberar tu enterotoxina Staphiloccica , sin embargo estos valores nos indica el alto grado de contaminación alcanzado por este alimento proveniente del contacto

con la piel, boca y fosas nasales de quienes lo manipularon, así como fue observada la falta de higiene en las superficies de contacto sobre las cuales se depositaba el mismo, el cuál en muchas ocasiones se encontraba descubierto ; no obstante la cantidad reportada de carga microbiana de Staphilococcus aureus con respecto a la muestra de queso obtenida del supermercado X del callao se encuentran en los valores permitidos (102 UFC/g en una dilución 102- ) ;lo cual nos indica que este alimento fue mínimamente manipulado y contaminado debido a las condiciones de higinie en que fue expendido.

3.2 E. COLI Y COLIFORMES TOTALESSegún norma N°591.8-minsa todos los quesos

estaban por encima del mínimo 500 NMP/g en caso del queso serrano (MCC5) este estaba por debajo del minimo200 NMP/g.

En un trabajo realizado en Venezuela en quesos frescos la mayoría de muestras el NMP de coliformes tienen como resultado de coliformes NMP/g 888 x103 - 8 x 102 ; 1 x 104 -257 x 103; 1 x 102-26 x 10; estos resultados son menores a la mayoría de nuestros resultados, excepto por la muestra MCC5 que es menor comparado con la muestra uno de Venezuela esta comparación me indica que en nuestro hay un menor cuidado en el higiene del queso.

3.3 MESOFILOSSegún norma N°591.8-minsa todos los quesos estaban por encima del mínimo 500 NMP/g en caso del queso serrano (MCC5) este estaba por debajo del minimo200 NMP/g.Según la RM Nº 0568-2003-RE, norma de los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano, los resultados obtenidos, están fuera de los rangos establecidos permitidos.El valor límite de presencia de mesófilos aerobios en quesos frescos no está especificado por la NTP 202.087, sin embargo para otros productos lácteos el valor máximo permitido es de 100 000 ufc/g o mL, nuestro valor obtenido está fuera del rango debido a que obtenemos 210 250 ufc/g o mL, por lo que se puede deducir que el queso no está exento de patógenos.

4.CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos de los diferentes lugares del mercado central del Callao, evidencian que los quesos comercializados presentan inadecuadas condiciones higienicas y no cumplen con las normas y regulaciones sanitarias vigentes. No se obtuvo resultados de salmonella en los quesos estudiados, pero si hubo presencia de S.A y de coliformes en todos.Se encontró presencia de hongos y levaduras en las muestras del MCC3 y MCC5, lo que indica que son expuestos al entorno de manera inapropiada.

REFERENCIAS 1. ZAMUDIO, María; MEZA, Ana; BAILÓN, Henry; Martinez, Jaime; CAMPOS, Josefina. Experiencias en la

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vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (pfge) en el Perú. Consultado el 24 de noviembre de 2014. Disponible en http://sisbib.unmsm.edu.pe2. Perú, Instituto Nacional de Defensa de la Competencia y de la Protección de la Propiedad Intelectual (INDECOPI). Norma Técnica Nacional 202.087. Lima: INDECOPI; 19823. LANCHIPA BERGAMINI, Liliana y YOLANDA, Sosa Gutiérrez;(2003); “Evaluación de la carga microbiana patógena en la elaboración del queso fresco en el distrito de Tacna”. Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann. Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias. Consultado el 25 de noviembre de 2014. Disponible en http://www.unjbg.edu.pe4. CRISTÓBAL, Ruth y MAURTUA, Dora. Evaluación bacteriológica de quesos frescos artesanales comercializados en Lima, Perú, y la supuesta acción bactericida de Lactobacillus spp. Consultado el 25 de noviembre de 2014. Disponible en http://www.scielosp.org

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http://www.unjbg.edu.pe/

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