manual de anatomía patológica

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    1. FUNDAMENTOS BIOLGICOS DE INMUNOHISTOQUMICA

    Es una tcnica que permite localizar molculas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos (protenas del tipo inmunoglobulina G). La tcnica, por la gran especicidad \ alta anidad que tienen los anticuerpos para reconocer molculas \ unirse a ellas, permite detectar cantidades nmas de molculas presentes en el tejido. La inmensa mayora de tcnicas de inmunohistoqumica pueden aplicarse a tejido jado e incluido en parana con buenos resultados, siempre que la jaciyn tisular, su procesado e inclusiyn se realicen adecuadamente ya que la utilizacin de mtodos o reactivos inapropiados en el tratamiento tisular previo puede producir prdidas de antigenicidad que limitarn o impedirn la obtencin de resultados ables.

    A continuacin se expondrn los conceptos bsicos que permitirn la compresin de la tcnica.

    Antgenos: Son aquellas sustancias capaces de producir una reaccin inmune. Sus propiedades inmunolgicas son: inmunogenicidad (capacidad de producir una respuesta especca bien humoral yo celular), antigenicidad (capacidad de combinarse con anticuerpos yo con receptores de clulas), alergenicidad (capacidad de producir reaccin alrgica). La inmunogenicidad viene dada por una serie de factores, es decir, depender o bien de la molcula atacada (por ejemplo las protenas son las ms inmunognicas) o bien del sistema en conjunto (el hombre en este caso; problemas de respuesta inmune).Eptopos: Son cada uno de los sitios discretos de una macromolcula reconocidos individualmente por un anticuerpo especco o por un 7&5 (receptor de linfocitos 7) especco. Son regiones inmunolgicamente activas.

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    Fundamentos biolgicos de inmunohistoqumica

    Anticuerpos: La capacidad de reconocimiento especco de cualquier tipo de molcula o partcula extraa por parte del sistema inmune, es posible gracias a que cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los receptores de los linfocitos 7 (7&5), los cuales poseen las cualidades de diversidad, heterogenicidad y procedencia a partir de reordenaciones de genes.

    Los tipos de Ig que encontramos el suero son las cinco siguientes ordenadas de mayor a menor concentracin en sangre:

    1. La IgG atraviesa la va placentaria. El feto adquiere las primeras inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a menos que se produzca una infeccin, por lo que sintetizara IgM. La IgG activa la cascada del complemento por la va clsica.

    2. La IgA se encuentra en la mayor parte de las secreciones corporales, y produce la activacin de la cascada del complemento por la va alternativa.

    3. La IgM se encuentra circulante y se encarga de la activacin de la cascada del complemento por la va clsica.

    4. La IgD se encuentra como molcula de membrana en los linfocitos B.

    5. La IgE aparece en alergias e infecciones por parsitos, siendo indetectable en situaciones normales.

    Las inmunoglobulinas se pueden encontrar solubles en sangre o como parte especca del complejo de las clulas B. Estn constituidas en su estructura comn por dos tipos de cadenas proteicas: pesadas y ligeras, diferencindose por sus caractersticas sicoqumicas, siolgicas e inmunolgicas.

    Las Ig que se encuentran en las membranas de las clulas B van reconocer al antgeno, es decir anticuerpos secretados por las clulas plasmticas procedentes de activacin, proliferacin y diferenciacin de clulas B. Estos anticuerpos se encuentran en el suero, en los lquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune especco, ya que la sola unin antgenoanticuerpo no es suciente en todos los casos para terminar con l.

    En el caso de los receptores de clulas 7 aparecen slo como molculas de membrana de los linfocitos 7. 5econocen al antgeno restringido por el complejo mayor de histocompatibilidad o CMH de la clula diana o de la clula presentadora. El CMH son un conjunto de genes presentes en el cromosoma 6 implicados en la presentacin de antgenos a las clulas 7. Suministran la base de la inmunidad celular especca (en el caso de los linfocitos 7C) y del mecanismo de los linfocitos 7 colaboradores (7H).

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    x &oPpOeMo antgenoanticuerpo AgAc: Dene la unin especca entre ambos con el n de inhibir o ralentizar la toxicidad del primero. Se realiza gracias a algunas fuerzas dbiles como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van Der Waals, interacciones electrostticas e hidrofbicas. La reaccin se caracteriza por su especicidad, rapidez, espontaneidad y reversibilidad.x Antisuero: 7ambin llamado suero inPunoOygico, es el suero sanguneo

    que contiene anticuerpos policlonales derivados de diferentes lneas de clulas B. 3ara producir un anticuerpo es necesario puricar el antgeno (provocando esta reaccin). Lo ideal sera separar una clula que fabricase un tipo determinado de anticuerpo y obtener clones o progenies en medios de cultivo. Esto no es posible debido a la incapacidad de supervivencia de la clula productora de anticuerpos en medio de cultivo. Cada linfocito genera una poblacin celular o clon, genticamente idnticas (mismo anticuerpo). Sin embargo, en un suero sanguneo no encontramos un solo tipo de anticuerpos, sino una mezcla heterognea denominada antisuero o anticuerpos policlonales. Esto es debido a tres razones principalmente:

    1. La continua exposicin a antgenos hacen que haya siempre un nivel basal de respuesta inmunolgica. 2. Los antgenos suelen ir acompaados de impurezas que tambin producen respuesta inmunolgica dando lugar a otros anticuerpos.3. El sistema inmune reconoce al mismo tiempo todos los eptopos que posee un antgeno, dando lugar a distintos anticuerpos para un mismo antgeno.

    Antgeno atacado por anticuerpos policlonales

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    Fundamentos biolgicos de inmunohistoqumica

    El problema que se presenta con los Ac policlonales son los inconvenientes que existen en su uso:

    9La falta de reproductibilidad de resultados, ya que la respuesta inmune vara de unos individuos a otros dentro de una misma especie, e incluso en un mismo individuo en funcin del momento en que se haga la extraccin del suero.9 Obtencin de cantidades limitadas, que dependen de los lotes de animales inmunizados.9 3uricacin laboriosa, cuyo objetivo es eliminar los Ac que reaccionan de forma cruzada no especca.9 Incapacidad para discriminar determinantes antignicos diferentes dentro de una misma molcula o clula, ya que no pueden diferenciar entre Ag en la membrana de una misma clula.

    Para la tcnica de inmunohistoqumica, sern necesarios los anticuerpos monoclonales (puros) que slo podrn obtenerse a travs de tcnicas in vitro de una clula hbrida llamada KibridoPa. El hibridoma es la fusin de linfocitos B productores de anticuerpos y una lnea celular de mieloma (clulas B cancergenas) que no producen inmunoglobulinas propias y tienen una expectativa de vida innita. La primera fase en la produccin de anticuerpos monoclonales (o mononucleados) consiste en la seleccin del antgeno (mediante fusin celular), stos son puricados parcialmente, vgr por disgregacin subcelular, lavado con un disolvente apropiado (elucin) de bandas protenicas a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotogrco. Posteriormente, se inyecta al animal experimental con los antgenos seleccionados, esperando que cada linfocito produzca un anticuerpo especco. Los linfocitos se extraern del bazo o del torrente sanguneo, y tendrn un carcter Portal que, al fusionarlo con un mieloma asumen un carcter inPortal. La clula resultante con una nueva carga genmica, guarda su especicidad en la produccin de anticuerpos homogneos (y nicos, de all su denominacin de anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas clulas, con la rapidez del mieloma.

    Los Ac monoclonales poseen las siguientes ventajas frente a los policlonales:

    9Homogeneidad en el proceso de obtencin, consiguindose siempre Ac idnticos.9No requiere usar Ag puricados.9Los cultivos pueden proporcionar el Ac de forma ilimitada.

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

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    UNIDAD FORMATIVA 2: ASPECTOS TCNICOS DE LA

    INMUNOHISTOQUMICA2. 1. Marcaje inmunohistoqumico

    2. 2. Procesamiento en inmunohistoqumica2. 3. Aplicaciones de la histoqumica

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    2. ASPECTOS TCNICOS DE LA INMUNOHISTOQUMICA

    La inmunohistoqumica permite el estudio de tejidos procedentes de biopsias, autopsias y material citolgico.

    Existen diversos tipos de tcnicas cuya indicacin va a depender de:

    Anticuerpo a utilizar: Mono o policlonal.Material disponible: )resco, congelado o jado en formalina.Antgenos a estudiar: De supercie o membrana citoplasmticos o nucleares.

    La cuestin ms importante va dirigida a la preservacin del tejido y de los antgenos.

    En general, el proceso histolgico siguiendo una serie de pautas para dicha preservacin: La jacin se suele hacer en formaldehdo 4 tamponado a pH .4 (no ms de 244 horas) y la inclusin en parana (se recomiendan paranas de bajo punto de fusin, ya que a altas temperaturas se pierde inmunoreaccin). La temperatura no debe superar la del ambiente y si se descalcica la muestra se realizar con ED7A.

    Ser conveniente aplicar alguna forma de jacin para proteger el tejido an cuando se manejen secciones en congelacin.

    Para ello se habr de tener en cuenta que:

    x Los jadores que actan por precipitacin de protenas dan mejores resultados que los jadores por reticulacin o los que contienen oxidantes.x 8n exceso de jador reduce la inmunoreactividad del tejido.

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    x El efecto de cada jador sobre un antgeno puede ser diferente en funcin de la localizacin histolgica y anatmica de dicho antgeno.

    x En muestras de gran volumen la jacin por inmersin no convence ya que proporciona resultados variables en cuanto a positividad inmunohistoqumica dndose una mayor tincin en las zonas mejor jadas.x Hay ciertos antgenos de supercie o receptores nucleares que no deben jarse ya que puede alterar la muestra. Por ello se debe recurrir a la congelacin o jacin breve en acetona, cloroformo o una mezcla de ellos.x La jacin debe ser rpida para evitar la autolisis, si esto no fuera posible se puede frenarse el proceso a exponiendo el tejido temperaturas de 4 C o en soluciones conservantes.

    x Para acortar el tiempo de jacin puede utilizarse la jacin por microondas.La capacidad inmunoreactiva se conserva bien tras la aplicacin de algunos

    procedimientos rutinarios de decalcicacin (eliminacin de las sales de calcio tras la jacin).

    Los criterios ms importantes para la decalcicaciyn son:1) Eliminacin completa de las sales de calcio.2) Ausencia de defectos deletreos de clulas, tejido conectivo y sustancia fundamental.3) 4ue no se inhiban procesos como los de jacin y tincin (Walington 1976).

    Se suelen utilizar cidos fuertes como el cido ntrico pero aplicado a la inmunohistoqumica, acabara con la inmunoreaccin en pocas horas. Por eso se recomienda la utilizacin de ED7A a una concentracin de ,5 M, cido actico acuoso a una concentracin al 1 o cido frmico al 5.

    Respecto al corte, si el procedimiento de inmunotincin se realiza sobre tejido congelado se harn con el criostato (cortes de 4 - 6 micrmetros), que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas.

    A continuacin se jan en acetona absoluta a 4 C durante 5 minutos y se vuelven a secar al aire durante 30 minutos.

    Si la tcnica se va a retrasar en el tiempo, hay que guardar las secciones envueltas en papel de aluminio y con un desecante a 20 C. Despus se temperan las secciones a temperatura ambiente sin desechar el envoltorio de papel de aluminio. Cuando esto se consigue se vuelve a repetir el proceso durante aproximadamente 60 minutos y a continuacin se realiza una renacin con cloroformo durante 20-30 minutos

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    pasndolo por un bao de solucin tamponada por ltimo. Los cortes de parana se obtienen de un grosor de 3 - 5 micrmetros y se dejan secar toda la noche en la estufa a 37 C.

    El siguiente paso es desparanar cuidadosamente en xileno, para llevar la muestra hasta alcohol absoluto e hidratarla.

    Debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar, es frecuente que se desprendan algunos cortes. Por ello se recomienda emplear un adhesivo que je las secciones al portaobjetos, con adhesivos como albmina de huevo, gelatina o poli L-lisina. La precaucin con el adhesivo debe estar presente ya que un exceso de adhesivo puede ser causa del aumento de tincin inespecca de fondo.

    En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presentan una o varias supercies ligeramente deprimidas donde pueden adherirse los tejidos para realizar la incubacin sin que ocurran fenmenos de difusin de los reactivos.

    2.1 MARCAJE INMUNOHISTOQUMICOPara visualizar el lugar donde se produce la unin antgeno-anticuerpo es necesario

    emplear un trazador o marcador. El marcaje inmunohistoqumico se puede realizar con uorocromos (tcnicas de inmunouorescencia), tcnicas inmunoenzimticas, iones metlicos en forma coloidal (tcnica de inmuno-oro) o istopos radioactivos.

    La uorescencia es una forma de luminiscencia entendindose sta ltima como la emisin de la luz que se produce a partir de una fuente de energa no trmica y bajo el efecto de una excitacin.

    La uorescencia priParia o autouorescencia es la propiedad que presentan determinadas sustancias de forma espontnea sin necesidad de ser modicadas (la lmina elstica de las arterias muestra autouorescencia en determinadas condiciones).

    En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la uorescencia, llamndola uorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tincin histoqumica con sustancias uorescentes llamadas uorocroPos o uniendo uorocromos a antgenos dirigidos a anticuerpos tisulares.

    Los uorocromos son molculas qumicas que absorben la luz a una determinada longitud de onda emitiendo otra diferente. Se caracterizan por sus espectros de excitacin y emisin que varan segn el tipo de uorocromo. Su capacidad de absorber fotones de alta energa procedente de la radiacin ultravioleta o del espectro visible provoca una redistribucin de los electrones de las molculas uorescentes, puesta de maniesto por la emisin de una radiacin luminosa de longitud de onda distinta aunque dentro del espectro visible.

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenmeno similar al descrito y la liberacin de energa se produce de forma gradual, prolongndose la emisin de luz despus de cesar la iluminacin del objeto, estaremos ante un fenmeno llamado fosforescencia. Hay uorocromos que producen el llamado fenyPeno de 4uengcKin (se produce por la colisin entre molculas, ambas con capacidad de uorescencia, disminuyndose as la intensidad de la uorescencia emitida).

    Los uorocromos ms utilizados en las tcnicas de inPunouorescencia son:x Fluorescena: Absorbe luz azul y emite uorescencia verde manzana.x 5odaPina: Absorbe luz verde y emite uorescencia roja anaranjada.

    La nueva generacin de uorocromos como el alexa or o los dylight or son generalmente ms fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros de excitacin y emisin comparable.

    Estas sustancias pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la unin de stos a sus correspondientes antgenos, por ello esta capacidad es muy til para visualizar los lugares donde reproduce la reaccin Ag-Ac.

    La tcnica inPunoenziPtica se describe como una tcnica de inmunoensayo en el que un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable. 7ambin se le conoce como tcnica E/I6A.

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    El antgeno o anticuerpo estar marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente). As la reaccin Ag-Ac quedar inmovilizada y ms fcilmente detectada, aadiendo al nal un sustrato ms una sustancia denominada cromgeno, de tal manera que el producto de la reaccin acta sobre el cromgeno dando lugar a un precipitado insoluble, coloreado y cuanticable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

    Dentro de estas tcnicas diferenciamos varios reactivos participantes: Ac primario, que es el que se une especcamente al Ag problema del tejido, y Ac secundario o Ac puente, que es el que acta uniendo el Ac primario con la enzima que actuar como marcador. Estos Ac puente se unen a otros Ac debido a los determinantes antignicos que presenta actuando a modo de Ag frente a otros Ac, pudiendo de este modo formarse cadenas casi ilimitadas de Ag y Ac.

    Hay diferentes tipos de E/I6A: Anticuerpos Parcados: 9 E/I6A directo. 9 E/I6A indirecto: Es el ms utilizado en la deteccin de anticuerpos. . 9 E/I6A sandZicK: Heterlogo (HADAS) Doble (DAS)

    Antgeno Parcado 9E/I6A coPpetitivo: Se parte de un anticuerpo poli o monoclonal, frente a un antgeno conocido, que previamente ha sido jado en la placa. Se le denomina de competicin porque el suero problema es incubado previamente con el antgeno, antes de incubarlo con el antisuero jado en la placa, y por tanto compite con l. Los pasos siguientes sern los de adicin e incubacin del conjugado, lavado y nalizacin con el sustrato y lectura.

    7odos los tipos de ELISAs citados se pueden resumir en dos grandes grupos: 9 E/I6As para detectar antgenos: E/I6As sndZicK.

    Las fases se describen en este orden: un anticuerpo poli o monoclonal antiantgeno suele estar ya jado a la placa. A continuacin se incuba con la muestra problema, se aade el conjugado y por ltimo el sustrato. 7odos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.9E/I6As para detectar anticuerpos: E/I6As indirectos. Las fases se describen en este orden: El antgeno se pega a la placa (inmovilizacin del

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    antgeno) y se procede a la adicin del suero problema, incubacin y lavado, adicin del conjugado, incubacin y lavado, nalizando con la adicin del sustrato, el frenado de la reaccin y la lectura.

    3asos generales de un E/I6A1. 7apizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo. 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos. 3. 8nin del antgeno o anticuerpo especco al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del substrato 9. Unin del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color

    Encontramos diferencias entre ambas tcnicas ELISAs directas e indirecta estimables de mencin, en cuanto a:

    Facilidad de realizaciyn de la tcnica: La indirecta es ms fcil ya que en la tcnica directa es necesario el uso de un Ac primario especco para reaccionar con el Ag especco. Rapidez: La directa es ms rpida porque se utiliza slo un Ac primario; en la indirecta al entrar en juego el Ac secundario con una etapa adicional de incubacin, se alarga el procedimiento de ensayo.

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    6ensibilidad: La directa es menos sensible porque el Ac primario se etiqueta y esta intervencin reduce la inmunoreactividad, algo que no ocurre en la indirecta.

    7ambin en el mtodo indirecto al utilizar Ac secundarios, el nmero de eptopos para unirse el Ag es mayor y as se amplica la seal y se mejora la sensibilidad.

    Esto ltimo puede ser una desventaja en los casos en los que se produce una reaccin cruzada del antgeno y el anticuerpo, llevando a error a los resultados. En el mtodo directo este fenmeno no tiene lugar de producirse ya que el uso de un solo Ac no da la opcin de reaccin cruzada.

    La enzima ms utilizada es la peroxidasa (se obtiene del rbano), as como la segunda ms frecuente es la fosfatasa alcalina.

    La perioxidasa se puede emplear tanto unida al Ac primario, lo que sera la tcnica directa, como en unos inmunocomplejos llamados PAP (peridoxidasa + Ac anti-peroxidasa) que se unirn a un Ac puente (secundario), en tcnica indirecta.

    Amiloide del tipo AA marcado con anticuerpo monoclonal anti-AA. Se trata de una reaccin positiva de la peroxidasa (colorante unido al anticuerpo anti-AA).

    Estos complejos PAP van a actuar como trazadores de la reaccin Ag-Ac. Para obtener los Ac especcos frente a la peridoxidasa, se le inocula previamente al animal, y luego se extraen del suero para someterlos a tcnicas in vitro con la peroxidasa. As se formarn, a travs de una reaccin de precipitacin, los complejos Ac-Ag peroxidasa-antiperoxidasa o complejos PAP.

    A continuacin se procede al revelado del marcador aadiendo el agua oxigenada (perxido de hidrgeno), siendo en este caso el sustrato, junto al cromgeno adecuado para esta enzima. La reaccin que tiene lugar es al unirse la

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    enzima al sustrato, este libera oxgeno provocando la oxidacin del cromgeno y originando un producto insoluble y de color pardo.

    En caso de que los tejidos sean muy ricos en peroxidasa endgena se utiliza como trazador la fosfatasa alcalina, para cuyo revelado se utilizan otras sustancias.

    Recientemente se han introducido otros mtodos de mayor sensibilidad basados en la anidad que tienen la biotina y la actina, capaces de generar un enlace no inmune, y que se practican sobre tejidos previamente incluidos en parana. En estos mtodos los Ag a demostrar tienen que haber sido desnaturalizados en gran medida durante el procesamiento histolgico.

    La avidina es una glicoprotena de alto peso molecular contenida en la clara del huevo y en la bacteria Streptomyces Avidinii. La molcula posee cuatro regiones hidrofbicas de unin con la biotina.

    Por otro lado la biotina, es una vitamina de bajo peso molecular que se encuentra en la yema del huevo y se conjuga fcilmente con Ac y enzimas marcadoras por ligarse de forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo. Pueden unirse hasta 150 molculas de biotina por una sola molcula de Ac.

    Aunque ambas molculas pueden unirse fcilmente a Ac y enzimas, la biotina es la que se conjuga antes debido a su pequeo tamao. Con biotina se puede realizar el marcaje del Ac primario (tcnica directa) o del Ac secundario (tcnica indirecta).

    Bazo. Representa una inmunorreaccin para vPRRS (virus del sndrome respiratorio y reproductivo en cerdos) en los macrfagos de la pulpa esplnica. Complejo ABC, contrateido

    con hematoxilina. 200X.

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    La fase no inmunolgica implica aplicar un complejo de avidina formado por la avidina y un trazador enzimtico con lugares de unin a ella. De este modo se puede producir la jacin sobre el Ac secundario biotinilado. 7odo este conjunto de sustancias se conoce como Ptodo del coPplejo avidinabiotinaA%&. En resumen, podemos armar que un gran nmero de molculas de biotina pueden unirse a un Ac dando lugar a una relacin trazadorAc muy alta, lo que hace que la sensibilidad de este mtodo sea muy elevada.

    Puesto que el producto de la inmunotincin con el ABC y PAP es similar y de similar sensibilidad, algunos autores recomiendan en procedimientos con dobles tinciones o intensicaciones utilizar el PAP y el ABC de eleccin.

    En relacin a la tcnica inPunooro (in metlico en forma coloidal), podemos decir como tcnica de marcaje, que hace esta funcin gracias a la propiedad de las partculas de oro para formar, en soluciones salinas, complejos estables con molculas proteicas. Para conseguir partculas de oro de diferentes tamaos (5 a 20 nm), se manipula el pH de la solucin que lo contiene, aunque ya en el mercado existen tamaos predeterminados de partculas de oro coloidal si se mantiene a una temperatura de 4C.

    En cuanto a la metodologa del oro coloidal, hay que tener en cuenta su baja capacidad de penetracin en los tejidos y por tanto pueden enmascarar anticuerpos al unirse a jadores como glutaraldehdo o tetrxido de osmio. Su aplicacin ideal es en tejidos poco jados y cortados con crioultramicrotomos. 7ambin da buen resultado en tejidos frescos o jados y cortados con vibratomo empleando 7ritn x-100 o 7Zin 20 en las soluciones de lavado. Actualmente los problemas que sufre la muestra por jadores, detergentes y sometimiento a temperaturas ms altas, se estn disminuyendo con el uso de resinas sintticas hidroflicas que adems de polimerizar a bajas temperaturas, no requieren oxidantes ni uso de osmio (provocando menor prdida de antgenos).

    En el caso de bajas concentraciones de antgenos, se puede utilizar la plata que, mediante tcnicas de precipitacin permiten visualizar las partculas de oro.

    7ambin otra tcnica ampliamente utilizada, es la asociacin de protenas a las partculas de oro coloidal. Algunas de estas protenas son: protena A, protena G, IgG o streptavidinaavidina.

    El Parcaje con isytopos radiactivos RIA est basado en una competencia establecida entre la sustancia a cuanticar y las cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un istopo, para unirse a anticuerpos especcos. Al establecerse esta pugna resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuanticar, menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada que va unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre. Esto se hace mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados que precipitan fcilmente. Una vez medida la radiactividad se representa una curva con las cantidades de hormona sin marcar y marcada.

    En el RIA directo, a la fase slida se aade una cantidad conocida de anticuerpo. Diferentes concentraciones conocidas de Ag marcado se incuban con una concentracin constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en cuestin. El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis, pero se diferencia en que lo que se une a la fase slida es una cantidad ja de antgeno (no de anticuerpo). Para este proceso (inhibicin), se incuba una concentracin ja de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno.

    Existe una tcnica no competitiva denominada sandZicK, en la cual se une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. 7ras realizar el bloqueo, se aade el antgeno en concentraciones variables. Despus se aadir un segundo anticuerpo contra el antgeno, pero esta vez marcado.

    En la actualidad, cada vez es ms frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos con la nalidad de aplicarlo en campos como trazador en determinaciones in vitro de antgenos especcos, tcnicas inmunoradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo. Estas se tomarn como alternativa al RIA en aquellos casos en los que algunas molculas no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastsicos (inPunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas (inPunorradioterapia).

    En estos casos citados, se entiende que el anticuerpo podr ser marcado sin que merme su capacidad inmunoreactiva. El marcaje de protenas o pptidos con yodo radiactivo (I125 I132) puede realizarse por diferentes mtodos.

    2.2 PROCESAMIENTO EN INMUNOHISTOQUMICAEn el siguiente esquema se puede ver un resumen de todo el proceso, que a

    continuacin se desarrollar:

    7odas las muestras vendrn acompaadas de una hoja identicativa y explicatoria del contenido de partida, historia y necesidades as como observaciones si las hubiera. 7ambin debern incluirse controles positivos para el anticuerpo solicitado.

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    MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

    *rica resumen de la tcnica3reparaciyn de la Puestra: En apartados anteriores est tratado este punto ya que se habl de cmo preparar la muestra para alterar lo menos posible la inmunoreactividad. Es por ello que se citarn los pasos dentro del proceso sin mucho detalle:Fijaciyn: Cada antgeno, dependiendo de su localizacin histolgica y anatmica, podr jar un producto de forma distinta. Descalcicaciyn: Se deca que, habitualmente se utilizaban productos fuertes con cido ntrico, que hacen poco resistentes a los antgenos. Por tanto, un procedimiento de eleccin para conservar mejor la

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    inmunorreactividad tisular es la utilizacin de ED7A. El ED7A, tambin llamado cido etilendiaminotetraactico, es una sustancia utilizada como agente quelante o antagonista de metales pesados, que signica que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinacin octadrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y en el ms importante de los ligandos quelatos pues cuanto ms ligandos posea, ms estable es.Inclusiyn: El cambio del etanol por acetona y del tolueno o del xileno por cloroformo o benzoato de metilo mejora notablemente la inmunotincin, ya que aumenta la tincin especca y disminuye la de fondo.Cortes y adhesivos: Sobre tejido congelado se obtendrn cortes de 4 a 6 micras que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas, se jan en acetona absoluta a 4C durante 5 minutos, y se vuelven a secar al aire otros 30 minutos; mientras que para cortes en parana las secciones sern menos gruesas, entre 2 y 4 micras, y se introducirn en una estufa durante un mnimo de 20 minutos para que el corte de adhiera al portaobjetos. Se hablaba de la facilidad de algunos tejidos que se desprenden por los mltiples lavados que hay que hacer. Cuando se ha realizado digestin con proteasas o mediante calor an esto se acenta ms, por lo que es aconsejable utilizar adhesivos que jen las lminas seccionadas (ya existen portaobjetos especiales que incluyen la pelcula de adhesivo). Con el n de evitar la difusin de los anticuerpos, se puede utilizar un lpiz con diamante o rotulador especial para cercar la seccin de tejido.3revio a la inPunotinciyn.InPunotexidores autoPticos: Gracias a las nuevas tecnologas, se dispone de mquinas que llevan a cabo la inmunotincin de manera automtica. Esta modalidad, permite introducir los portaobjetos con las secciones de tejido, previamente etiquetados y con cdigos de barras para su identicacin a travs de un lector, que permitir aplicar sobre cada muestra el reactivo correcto. El proceso de la tincin automtica es muy laboriosa por la exactitud del trabajo sobre cada una de las muestras y el complejo mecanismo electrnico controlado por ordenador que incluye una fuente trmica propia para el desenmascaramiento antignico y que supone un gran avance por la reduccin de errores durante la realizacin de la tcnica (no se acortan ni se exceden tiempos, temperaturas, cantidades de reactivos, etc.). El siguiente paso tras la nalizacin de la tincin automtica es la deshidratacin de las muestras y proceder al montaje de los portaobjetos..its universales de inPunohistoTuPica: Se denomina al conjunto de reactivos utilizados en el proceso de inmunotincin. Hay kits para revelar

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    Ac mono o policlonales y se utilizan de forma distinta en funcin al procedimiento que vaya a utilizarse. Hay muchos laboratorios que estn utilizando el multilink (kit universal) cuya aplicacin es indistinta a los Ac empleados. El 5 de los kits empleados son los de estreptavidina-biotina-peroxidasa o fosfatasa alcalina. Los kits PAP se estn usando menos por la baja intensidad de la tincin y se estn sustituyendo por los FAAFA (fosfatasa-antifosfatasa-alcalina) que no cuenta con este hndicap, siendo adems muy til para la tincin de Ag de lbil expresin.La gama de cromgenos para el revelado en inmunotincin es muy amplia. 3enetraciyn de los reactivos. Detergentes: Los detergentes se utilizan para aumentar la permeabilidad de las membranas y que as los Ac puedan penetrar y as alcancen a los Ag a detectar. Estas sustancias son particularmente rentables cuando se trabaja con clulas intactas de frotis, improntas y monocapas de cultivos celulares o con cortes gruesos en congelacin o incluidos en parana. Se habr de tener muy en cuenta de qu forma pueden incidir estos productos en el tejido a nivel inmunoreactivo. %loTueo de la tinciyn de fondo: La tincin de fondo se trata de uno de los principales problemas de la tcnica inmunohistoqumica. Se dene como toda tincin que aparece all donde no debera haberla. Existen dos tipos de tincin de fondo: Especcas: Se pueden deber: 1) A la presencia del Ag bajo estudio, en lugares distintos a donde se quiere detectar; 2) por la existencia en el antisuero primario de Ac frente a Ag distintos al que se quiere determinar (problema prcticamente inexistente cuando se utilizan Ac policlonales de buena calidad o Ac monoclonales). 3) 7ambin por atrapamiento pasivo del Ag o difusin del mismo hacia lugares donde habitualmente no se encuentra. Estos errores ocurren normalmente por problemas con la jacin (se retrasa o es inadecuada), o cuando existen reas extensas de necrosis e inltrado inamatorio. Inespeccas: La forma de tincin de fondo inespecca ms comn es la uniyn no inPunolygica del Ac con ciertos componentes de los tejidos debido a fuerzas hidrofbicas y electroestticas. Habitualmente es el Ac primario el que proporciona los niveles ms altos de tincin de fondo inespecca.

    El bloqueo de tincin de fondo se realiza incubando los cortes con un anticuerpo que no interera con el Ac primario o usando el Ac primario a altas diluciones lo ms altas posibles y aadiendo bloqueantes proteicos de la tincin a utilizar. 7odo ello con el objetivo de inhibir la unin no inmune a molculas que poseen los Ac.

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    Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

    %loTueo de la actividad enziPtica endygena: Se trata de un mtodo por el que se consigue inhibir la actividad enzimtica de la enzima que se va a utilizar como marcador con el n de que no reaccione con el sustrato por anidad (muchas de ellas se encuentran de forma endgena en los tejidos). Si no se bloquea esta actividad, se inducira a error por la obtencin de falsos positivos. El mtodo ms usado para este bloqueo es la incubacin de las secciones antes del proceso inmunolgico, aplicando algn agente bloqueante especco en cada caso.DesenPascaraPiento antignico o recuperaciyn antignica: Los tejidos llegan casi todos al laboratorio jados en formalina e incluidos en parana. Las estructuras tridimensionales de las protenas tisulares se alteran en grado variable durante este proceso. Algunos antgenos tisulares (eptopes) son resistentes a la jacin con formol e inclusin en parana y son reconocidos por anticuerpos especcos. Otros eptopes pierden su reactividad antignica despus de estos procesos de rutina. La continua prctica con anticuerpos nuevos ha mejorado el proceso inmunohistoqumico y el uso de pretratamientos proteolticos (que suelen dejar un fondo de tincin mayor y favorecen el desprendimiento del tejido) consiguiendo una mejor conservacin de la capacidad inmunoreactiva. An as, el xito mayor de resultados se ha obtenido con mtodos de pretratamiento con calentamiento de los cortes histolgicos (incubacin en torno a los 100C) que desenmascaran los eptopes, mejorando ostensiblemente los resultados del proceso. Como se ha mencionado, la jacin en soluciones que contengan formaldehdo pueden causar reacciones cruzadas en las protenas y la inclusin en parana alterar la forma de las protenas. Es por ello que en el proceso de recuperacin antignica se revierten algunos de estos problemas, rompiendo las uniones cruzadas, restaurando la conformacin de eptopeantgeno y removiendo los iones clsicos con citrato. Los buffer (o tampones) para la recuperacin antignica, por su composicin y pH son utilizados en los mtodos de recuperacin antignica junto con mtodos de calor siendo cruciales para obtener buenos resultados (buffer citrato 0.01 molL con pH 6.0 y buffer trisED7A, pH 9.0). A continuacin se describirn los Ptodos de recuperaciyn antignica:

    - Digestiyn enziPtica: El pretratamiento de los cortes histolgicos jados en formalina e incluidos en parana con distintas enzimas proteolticas refuerza o mejora la reactividad inmunohistoqumica de ciertos antgenos. Los procesos varan de acuerdo a los laboratorios, la

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    jacin de los tejidos, el tipo de anticuerpo y los antgenos estudiados. Algunos de los pretratamientos enzimticos ms utilizados son el de tripsina, pronasa, y pepsina. En estos procedimientos las lminas tendrn que estar pretratadas con adhesivos y los cortes desparanados y rehidratados.

    Mtodo de pretratamiento con tripsina Cubrir los cortes con solucin de trabajo de tripsina. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 20-40 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la jacin en formol y el antgeno en estudio. Recomendamos tripsina al 0.1 durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

    Mtodo de pretratamiento con pronasa Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pronasa. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 5-10 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la jacin en formol y el antgeno en estudio. Recomendamos pronasa, 0.01 durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

    - +orno de Picroondas: Se utiliza un horno de microondas domstico de 750-00 Zatios con plato giratorio. Hay que utilizar coplins o gradillas de cristal o plstico para microondas as como lminas pre-tratadas con adhesivo. Antes de comenzar hay que desparanar y rehidratar los cortes.

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    Mtodo de pretratamiento con pepsina Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pepsina precalentada a 37C Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados C por 10-30 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la jacin en formol y el antgeno en estudio. Detener la reaccin lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

    Mtodo de horno de microondas Coloque las lminas en la gradilla y rellene los espacios vacos con lminas en blanco. Llene el recipiente contenedor con 200 mL de buffer de recuperacin antignica e introduzca la gradilla con las lminas. Cubra el contenedor para minimizar la evaporacin. Coloque el contenedor en el centro del horno. Caliente los cortes a 2x7 minutos. Rellene el contenedor con 50 mL de agua destilada entre los dos tratamientos. Los cortes no se pueden secar durante el proceder. Despus del segundo tratamiento retire el contenedor del horno y mantenga los cortes en el buffer a temperatura ambiente durante 15-20 minutos para su enfriamiento. Lavar en agua destilada. Bloquee la peroxidasa endgena y coloque las lminas en agua destilada. Enjuagar en 7BS o PBS. Contine con la tcnica de inmunohistoqumica.

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    Mtodo de calentamiento con vapor Llene el depsito de la base con agua destilada a temperatura ambiente. Coloque la rejilla de la base Coloque la cmara vaporizadora sobre la rejilla Llene el contenedor de incubacin con 200 mL del buffer de recuperacin antignica Coloque la tapa de la cmara de vaporizar. Ponga el timer por 75 minutos. El equilibrio entre el bao y la cmara de incubacin a 95C toma unos 45 minutos Remueva la tapa de la cmara y coloque las lminas en el buffer ya precalentado. Vuelva a cubrir la cmara Incube durante 20-40 minutos Retire de la cmara vaporizadora el contenedor del buffer y las laminas Enfriar las laminas por 20 minutos a temperatura ambiente Enjuague en agua destilada Bloquear peroxidasa endgena y colocar las laminas en agua destilada Enjuagar en 7BS o PBS Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

    - 2lla a presiyn: Se requiere un vaporizador (steamer) domstico y las lminas han de estar pre-tratadas con silano u otro adhesivo.

    /a inPunotinciyn propiaPente dichaDiluciones de los anticuerpos lavados e incubaciones: Cuando se diluye por primera vez un Ac o, aunque sea conocido, si se usa por primera vez sobre un tejido problema, hay que hacer pruebas de ensayo para evitar errores posteriores como falsos negativos o tincin de fondo. Por eso hay que elegir la dilucin correcta a n de obtener una tincin ptima. El objetivo ir encaminado a evitar que el diluyente no se evapore durante el proceso de incubacin y que el anticuerpo no unido al antgeno se elimine por completo antes de la incubacin siguiente. Respecto a la

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    evaporacin de diluyente, se evita incubando el tejido en un ambiente hmedo (cmaras de incubacin). La aplicacin de calor tambin va a inuir en la unin Ac-Ag, as que si la incubacin es corta se hace a temperatura ambiente y si es larga se hace a temperaturas constantes de unos 4C. Para eliminar el antisuero no unido, se utilizan soluciones tamponadas (usualmente el 7BS). Primero se lavan las secciones de tejido para extraer el exceso de antisuero y despus se cubre con el tampn elegido para enjuagarlas. Coloraciones de contraste: A n de reconocer mejor los tejidos se emplean coloraciones (cromgenos) para diferir las reas tisulares inmunoteidas de las que no lo han sido. En el apartado de tinciones generales estn descritas.Controles: Los controles se realizan para asegurarse que no hayan falsos negativos o positivos. Una tincin inmunohistoqumica especca se dene con los siguientes parPetros:

    1. No hay tincin si se excluye el Ac primario.2. Se inhibe la tincin si se absorbe el anticuerpo primario con el antgeno frente al cual se ha obtenido, pero no con otros.

    Es por todo esto que para la obtencin de un buen desarrollo de la tcnica hay que realizar controles distintos que se explican a continuacin:

    - Los negativos incluyen una omisin del Ac primario o la sustitucin del mismo por suero no inmune o solucin isotpica. Estas sustancias alternativas (no inmunes) no van a reconocer al Ag a estudiar, pero s sern reconocidas por el Ac secundario o puente. Se utiliza el mismo tejido que para el control positivo y si el resultado es positivo ser debido a una jacin inespecca. - Los controles positivos, se llevan a cabo utilizando una seccin de tejido que incluya el Ag a demostrar de forma que si el resultado es negativo la causa es un defecto de jacin o un error en el procedimiento. Es el de uso ms extendido y se utiliza en todas las preparaciones. - El control de absorciyn consiste en demostrar que desaparece la inmunorreactividad una vez el Ac primario con el Ag se hallan unido. Se utiliza para valorar nuevos Ac. No es una tcnica de control que se haga muy rutinariamente.

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    Por ltimo la tcnica de bloTueo consiste en inhibir la unin de los distintos elementos utilizados segn si la tcnica es directa (Ac primario con Ac conjugado) o indirecta (Ac puente con el complejo PAP por ejemplo). El bloqueo se consigue realizando una incubacin extra con Ac del mismo tipo de los marcados.

    Volviendo al objetivo principal de los controles para detectar falsos negativos o positivos, las causas de los falsos negativos pueden ser:

    - Enmascaramiento de los antgenos.- Desnaturalizacin de los antgenos por el calor, haciendo que sean irreconocibles por los Ac.- Errores en el procedimiento tcnico.

    Y las de los de falsos positivos:

    - Presencia de peroxidasa endgena, por una mala inhibicin de la misma (incorrecto desbloqueo enzimtico).- Reacciones cruzadas inespeccas entre Ag y Ac, de forma que algunos Ac pueden reaccionar con Ag parecidos a los que se estudian y, sobre todo, la posibilidad de una jacin qumica no inmune entre los Ac y la colgena del tejido conectivo.

    2.3 APLICACIONES DE LA HISTOQUMICANo cabe duda que la posibilidad que ofrece esta tcnica de localizar componentes

    tisulares in situ, contribuye a un importante avance en el conocimiento siopatolgico siendo especialmente til en el campo de la oncologa (para la clasicacin de algunas neoplasias con alto grado de anaplasia o de metstasis de origen incierto). 7ambin se utiliza para el estudio del rechazo de trasplantes de rganos, enfermedades autoinmunes y alrgicas.

    El espectro de anticuerpos utilizados hoy da (comercializados), van en crecimiento. Aqu podemos ver algunos:

    Ejemplos de marcadoresinm nohistoqumicosAnticuerpo Clulas/antgenos detectadosCD1a Clula de Langerhans CD4 Linfocito 7 de auxilio CD8 Linfocito 7 citotxico CD30 Clula de Reed-Sternberg CD45 Leucocitos

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    CD68 Macrfagos S100 Clulas de SchZann HMB-45 Melanocitos AE1 Citoqueratinas de bajo peso molecular AE3 Citoqueratinas de alto peso molecular DESMINA Clulas musculares GFAP Gla CEA Antgeno carcino-embrionario AFP Alfa-fetoprotena REN Receptores nucleares de estrgenos VIM Sarcomas