informe de practicas pre-prodfesionales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

FACULTAD DE INGENIERA MECNICA

INFORME DE PRCTICAS PRE-PROFESIONALES

ALUMNO : Luis Alonso Hernndez Nez

CDIGO : 20072005C

ESPECIALIDAD : M6

FECHA : 7 de Mayo de 2012

INSTITUCIN: Yale University,

New Haven, Connecticut, EEUU.

LIMA-PER

2012

Informe de Practicas Pre-Profesionales 2012 Engineering Research Assistant, Yale University

UNI | Universidad Nacional de Ingeniera Facultad de Ingeniera Mecnica (FIM)

2

Agradecimientos

En primer lugar agradezco a todos quienes fueron mis maestros

en la Universidad Nacional de Ingeniera, en especial al Dr. Alberto

Coronado y a la Dra. Elizabeth Villota, quienes fueron mis mentores

en los diversos proyectos de investigacin en los que particip

durante mi carrera. Dicha experiencia sumada a mi condicin de

primer puesto de la universidad, me permitieron acceder a esta

ventajosa prctica pre profesional en una de las mejores

universidades del mundo.

De la misma manera agradezco al Dr. Thierry Emonet, quin ha

sido y es an mi asesor en lo que respecta al trabajo de investigacin

que realizo en la Universidad de Yale.

A los doctores Amitabha Nandi, Carlotta Martelli, Yann Dufour,

Michael Sneddon, Abel Alcazar y los estudiantes de doctorado

Nicholas Frankel, William Pontius y Srinivas Gorur-Shandilya, por las

abundantes e inspiradoras discusiones cientficas y tecnolgicas

sostenidas semana a semana y por generar un ambiente de trabajo

increblemente estimulante y competitivo.

Tambin es mi deseo agradecer a mis padres y mi hermana, ya

que sin el apoyo y comprensin de ellos me hubiese sido imposible

lograr todo esto.



3

Contenido

Agradecimientos ............................................................................................................... 2

Contenido ......................................................................................................................... 3

1. Introduccin .............................................................................................................. 5

1.1 Antecedentes .......................................................................................................... 6

1.2 Objetivos ................................................................................................................. 7

1.2.1 Objetivos Generales ................................................................................... 7

1.2.2 Objetivos Especficos ........................................................................................ 7

1.2.3 Objetivos del presente informe ....................................................................... 7

1.3 Descripcin del informe .......................................................................................... 7

2. La empresa ................................................................................................................ 8

2.1 Datos de la empresa ............................................................................................... 8

2.2 Historia .................................................................................................................... 9

2.3 Organizacin ........................................................................................................... 9

2.4 Infraestructura y recursos del laboratorio............................................................ 11

2.5 Servicios ................................................................................................................ 14

2.6 Localizacin ........................................................................................................... 14

3. Actividades Desarrolladas ....................................................................................... 14

3.1 Modelamiento y simulacin del motor flagelar de la bacteria e. coli. ................. 14

3.1.1 Chemotaxis Pathway ...................................................................................... 14

3.1.2 Equivalencia con un sistema de ingeniera de control .................................. 16

3.1.3 Modelo matemtico ...................................................................................... 17

3.1.4 Consideraciones de la simulacin ................................................................. 20

3.1.5 Software creado para la simulacin ............................................................. 22

3.2 Calculo de la difusin de protenas en el citoplasma bacteriano usando soluciones numricas estocsticas espaciales. ........................................................... 22

3.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva del motor flagelar. ....................................................................................................................... 25

3.3.1 Ventajas y desventajas del fenotipo bacteriano en diferentes ambientes. . 25

3.3.2 Construccin del modelo total ...................................................................... 27



4

3.3.3 Simulacin del modelo restringido por las relaciones de la poblacin salvaje ................................................................................................................................. 29

3.3.4 Anlisis ROC (Receiver Operating Characteristic) del desmepeo bacteriano. ................................................................................................................................. 31

4. Presentacin de Resultados ...................................................................................... 33

4.1 Resultados de la simulacin de un motor flagelar de la bacteria e.coli ............... 33

4.2 Resultado de la simulacin del la difusin de la protena R ................................. 35

4.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva de la ubicacin en la curva del motor flagelar. .................................................................................... 36

4.4 Habilidades obtenidas al concluir la prctica ....................................................... 44

4.5 Observaciones, Conclusiones y Recomendaciones .............................................. 45

4.5.1 Observaciones ................................................................................................ 45

4.5.2 Conclusiones................................................................................................... 46

4.5.3 Recomendaciones para el trabajo futuro ...................................................... 46

5. Referencias ................................................................................................................. 48



5

1. Introduccin

La alta complejidad inherente a los sistemas biolgicos ha dado lugar en los

ltimos aos a la aparicin de disciplinas emergentes como biologa de sistemas,

donde empleando un abordaje de ingeniera se busca develar los principios generales

que rigen el funcionamiento de las clulas, tejidos, rganos y organismos [1,2]. Es

tanto el xito de esta nueva disciplina que muchos predicen que una nueva revolucin

cientfica se avecina [3].

En el marco de esta situacin, la Universidad de Yale integra en grupos de

investigacin a estudiantes de las principales ramas de ingeniera con estudiantes de

biologa, fsica y qumica; y empleando las habilidades diversas de los integrantes busca

responder las preguntas mas relevantes que forman hoy la frontera del conocimiento

entre ingeniera y biologa.

Mi prctica pre profesional se llev a cabo precisamente en un grupo de

investigacin multidisciplinario, donde los investigadores provenimos de carreras

diversas como: fsica, ingeniera mecatrnica, bioingeniera, microbiologa y

computacin cientfica.

Las actividades que he realizado varan desde elaborar, programar y probar el

modelo matemtico de un motor flagelar de la bacteria e.coli hasta el modelado

basado en agentes de una poblacin completa de bacterias. Para realizar trabajos de

esta complejidad me fueron de especial utilidad muchos de los cursos incluidos en la

actual currcula de ingeniera mecatrnica y las capacitaciones adicionales que recib

en los diferentes proyectos de investigacin en los que particip en la UNI, como se

describe en la seccin 1.1.

Esta experiencia me permiti exponerme a una situacin real de trabajo, ya que

ser investigador. Incluso me permiti conseguir un ventajoso contrato para

permanecer como investigador asociado de la Universidad de Yale hasta que inicie mis

estudios de doctorado.



6

1.1 Antecedentes Desde que inici la carrera de Ingeniera Mecatrnica estuve fascinado por la forma en

que las diferentes disciplinas pueden integrarse para resolver problemas que de otra

manera hubiesen quedado inexplorados. Es as que form parte de los siguientes

proyectos y grupos de investigacin:

CTIC-UNI: Nano satlite Chasqui I

Asesora: PhD. Elizabeth Villota (Docente FIM)

Tema: Diseo del control activo del nanosatlite Chasqui I.

Grupo de Modelamiento y Simulacin a Multiescala: Anlisis y deteccin de

patrones en la topologa y el espacio paramtrico de redes moleculares

oscilatorias de 2 y 3 nodos

Asesor: D.Sc. Alberto Coronado (Docente FIM)

Grupo de Bionanotecnologa: CTIC UNI-Universidad de Texas A&M

Asesor: Ph.D Jorge Seminario (Texas A&M University).

En la investigacin que realizo en la Universidad de Yale me han sido de utilidad los

conocimientos que adquir durante la carrera en cursos como:

Micro y nano manipulacin, vibraciones mecnicas, control moderno y ptimo,

mtodos numricos, inteligencia artificial, biologa de sistemas y biologa para

ingenieros.

Adems de ello, me fueron de especial utilidad algunos temas que aprend en los

grupos de investigacin arriba descritos, como:

Mecnica cuntica, dinmica molecular, programacin en python y programacin

basada en agentes.



7

1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivos Generales

Realizar labores de ingeniero practicante de investigacin en la universidad de Yale: Usando el mtodo cientfico y empleando herramientas propias de ingeniera contribuir a la realizacin de un proyecto de investigacin.

1.2.2 Objetivos Especficos Complementar la formacin que obtuve en la UNI exponindome al ambiente

real de trabajo de un investigador. Familiarizarme con procedimientos tpicos de investigacin (protocolos de

laboratorio, escritura de artculos cientficos, etc.) Aprender a cumplir fechas lmite y a desarrollar proyectos en equipo. Desarrollar ms el pensamiento crtico y afinar el planteo apropiado de un

problema de investigacin.

1.2.3 Objetivos del presente informe Mostrar la experiencia obtenida y los resultados del trabajo realizado. Explicar la trascendencia del trabajo hecho y la contribucin al conocimiento

humano que este significa.

1.3 Descripcin del informe

El presente informe est organizado segn las recomendaciones brindadas en la

pgina web de la oficina de proyeccin social de la facultad de Ingeniera Mecnica,

siguiendo todos los puntos establecidos para el desarrollo del mismo.

En el captulo 2 doy alcances respecto a la historia y visin de la universidad de

Yale, su organizacin en lo que respecta a investigacin y explico el enfoque

multidisciplinario con el que se abordan los proyectos.

Posteriormente, en el captulo 3 enumero y explico el flujo de actividades que he

realizado hasta hoy, explicando las tcnicas de modelado matemtico, principios

fsicos en cuestin y haciendo equivalencias entre sistemas biolgicos y sistemas

dinmicos propios de ingeniera de control (sensores, planta, actuadores).



8

Finalmente, en la seccin 4 presento los resultados del trabajo, as como las

conclusiones a las que he llegado, hago las observaciones pertinentes desde el

punto de vista de ingeniera y hago recomendaciones para el trabajo futuro.

2. La empresa

2.1 Datos de la empresa Yale University

Es la tercera universidad ms antigua de los Estados Unidos de Norteamrica, considerada la cuarta mejor del mundo segn el ranking ms empleado en el mbito acadmico (QS), solo detrs de Harvard, Cambridge y MIT.

Fig.1 Logo de la Universidad de Yale.

Nombre: Yale University Valor estimado: 19.1 Billones de dlares americanos. (Segunda institucin

acadmica ms cotizada del mundo, despus de Harvard University) Ranking Acadmico Mundial: 4 Estudiantes: 11, 593 Presidente: Richard Levin Ciudad: New Haven Estado: Connecticut Fundacin: 1701 Sitio web: www.yale.edu



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2.2 Historia

Fundada en 1701 con el nombre de Collegiate School, cambio su nombre a Yale College en 1718 en honor a Elihu Yale quien hizo la donacin que permiti que la universidad se establezca en sus inicios.

En 1861 la escuela de graduados de artes y ciencias de la Universidad de Yale se convirti en la primera institucin en EEUU en otorgar el grado de Ph.D.

Siendo la segunda institucin acadmica ms valiosa del mundo (19.1 billones de dlares), la universidad de Yale ha sido casa de 49 premios nobel, 5 presidentes de los Estados Unidos y varios presidentes de otros pases como Alemania, Mxico y Filipinas.

Entre los personajes ms destacados de Yale es posible encontrar al matemtico Josiah Willard Gibbs, el inventor del ciclotrn y ganador del premio nobel de fsica Ernest Lawrence, el inventor Samuel Morse e incluso la reciente ganadora del Oscar Meryl Streep.

La excelencia de Yale se mantiene en el siglo 21, con nuevas polticas para el trabajo multidisciplinario implementadas en programas de doctorado como Computational Biology y Physical Engineering Biology. Donde estudiantes y profesores de las principales disciplinas de ingeniera interactan con estudiantes de biologa y fsica para resolver los problemas ms complejos de las disciplinas en cuestin. Para esto la universidad cuenta con profesores de gran trayectoria, cuyos conocimientos integran varias de estas disciplinas. Entre ellos destaca Thomas Steitz, reciente ganador del premio nobel de qumica en 2009.

2.3 Organizacin El rgano supremo de toma de decisiones de la universidad es conocido como Yale Corporation, el cual es presidido por el presidente de la Universidad Richard Levin y consta en total de 19 miembros. A estos siguen los directores de:

Yale college (Estudios de Pregrado)

Graduate School of Arts and Sciences. (Escuela de postgrado)



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A estos les siguen los directores de las diferentes escuelas profesionales de Yale que son las siguientes:

Escuela de Arquitectura

Escuela de Arte

Escuela de Divinidad

Escuela de Drama

Escuela de Ingeniera y ciencias aplicadas

Escuela forestal y de estudios ambientales

Escuela de leyes

Escuela de administracin

Escuela de medicina

Escuela de msica

Escuela de enfermera

Instituto de Salud publica

Las prcticas pre profesionales en cuestin se llevaron a cabo en el Graduate School of Arts and Sciences, en especial en el laboratorio del profesor Thierry Emonet. A continuacin detallo la parte de la organizacin relevante para los fines de mi prctica pre profesional.

Ph.D. Thomas Pollard Director de la Escuela para

graduados en Artes y Ciencias

Ph.D. Thierry Emonet Director del laboratorio de

Complex Systems

Ph.D. Amitabha Nandi Desarrollo en Zebra Fish

Ph.D. Yann Dufour Chemotaxis en E. Coli

Ph.D. Carlotta Martelli Neuronas Olfativas en Drosophila

Ph.D. Michel Sneddon Computacin Cientfica

Lic. William Pontius Fsica

Ing. Nicholas Frankel Ingeniera

Luis Hernndez Ingeniera



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2.4 Infraestructura y recursos del laboratorio 2.4.1 Cluster de computadoras para clculos complejos y simulaciones prolongadas:

Fig.2 Supercomputadora para clculos complejos.

Datos:

Nodos: 128 Procesadores por nodo: 8

Memoria RAM por nodo: 32GB

Sistema operativo: Red Hat Enterprise Linux Server Release 5.8.

2.4.2 Microscopio de focalizacin perfecta

Fig.3 Microscopio (Nikon TI-E with perfect focus)



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Especificaciones:

Etapa motorizada:

Mesa XY (H117 ProSca). Controlador Digital (HR31) Porta muestras (H473XR)

Cmara

Andor iXonEM+ 888 back-illuminated EMCCD Camera, 1024x1024.

Software

NIS Elements Basic Research 3.0 Andor Solis. Resoluciones:

Obj. CameraLens Mag. px length FOV width

10x 1.5x 1x 0.8772 um/px 898.25 um

10x 1.5x 1.5x 0.5882 um/px 602.32 um

100x 1.5x 1x 0.0870 um/px 89.04 um

100x 1.5x 1.5x 0.0578 um/px 59.19 um

Pixel size calculated using a EM ruler slide without camera 1.5X lens

10x na 1x 1.3051 um/px 1336.42 um

10x na 1.5x 0.8718 um/px 892.68 um

100x na 1x 0.1301 um/px 133.18 um

100x na 1.5x 0.0869 um/px 88.95 um



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2.4.3 Sensor de fotoionizacin

Fig.4 Sensor de fotoionizacin

Tecnologa del detector: Foto ionizacin con 10.6 eV RF- excitacin por tubo de descarga, sin electrodos. Precisin: 5% para todos los rangos de ganancia. Limite de deteccin: 50 partes por billn. Razn del flujo de muestreo: 0.66-1.5 l/min Frecuencia de corte del filtro anti-aliasing: 1000Hz. Temperatura de operacin: 0-40 C

2.4.4 Estacin para sistemas microfludicos

Fig. 5 Estacin para sistemas microfludicos.



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2.5 Servicios El laboratorio en cuestin tiene como nico fin el desarrollo de nuevas tecnologas y la generacin de conocimientos nuevos. Es sostenido con fondos del National Science Foundation de los estados Unidos, fondos del McDonell Foundation y del Alfred Sloan Foundation. No brinda ningn servicio adicional a su fin principal.

2.6 Localizacin La localizacin de la Universidad ya fue mencionada; no obstante, el tamao de la misma hace necesario que se precise la ubicacin del laboratorio donde realizo la mayor parte de mis labores.

Ubicacin: Science Hill, Kline Biology Tower, dcimo piso. 219 Prospect Street.

Fig.6 Kline Biology Tower

3. Actividades Desarrolladas Las actividades desarrolladas durante mi prctica pre-profesional pueden dividirse claramente en 3 partes diferentes, todas pertinentes al desarrollo del mismo proyecto pero cuyos resultados aparecern publicados en 2 artculos separados.

3.1 Modelamiento y simulacin del motor flagelar de la bacteria e. coli.

3.1.1 Chemotaxis Pathway Uno de los circuitos bioqumicos ms estudiados en la historia [4] es el correspondiente al censado de qumicos en la bacteria e.coli, que ser denominado chemotaxis pathway en el resto del presente informe.



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Gracias al chemotaxis pathway las bacterias pueden orientar su direccin de nado en el sentido que le resulte ms favorable a su metabolismo; es por ello que se cree que ha sido optimizado por la evolucin volvindolo robusto, adaptable y eficiente [5]. Una caracterstica impensable en un sistema ingenieril.

Fig. 7 Circuito de chemotaxis en la bacteria e.coli

En la Fig.7 muestro el circuito en cuestin, siendo los receptores de transmembrana (de color blanco en la figura) los sensores del sistema, ya que detectan la presencia de ligandos externos. La informacin respecto a la cantidad de ligando es transmitida a la protena A que esta fija al arreglo de receptores por medio de la protena w. A activa (fosforila) a la protena B cuya funcin es desmetilar a los receptores. Esta funcin le permite a la bacteria resetearse y poder siempre detectar cambios en su ambiente independientemente de la concentracin basal de nutriente. La protena R constantemente metila a los receptores. R y B son las responsables de la adaptacin que puede ser definida como perfecta en gran cantidad de las bacterias que tpicamente forman parte de una poblacin salvaje [6].

La protena A, a su vez fosforila a la protena Y cuya funcin es unirse a la protena maestra FliM (fija al motor flagelar) [7]. Cuando esto ocurre el motor al cual pertenece FliM cambia su sentido de rotacin.

Los motores flagelares tpicamente giran en sentido antihorario, ello permite que los flagelos formen una hlice giratoria que impulsa a la clula; no obstante, cuando un motor comienza a girar en sentido contrario se rompe la hlice y se produce lo que conocemos como un tumble que no es otra cosa que el fenmeno por el cual la bacteria se detiene y cambia su direccin de nado.

Este mecanismo le permite a la bacteria nadar en la direccin ms favorable. Es decir, si se encuentra ms nutriente habr ms ligando y A no ser fosforilada, en consecuencia Y tampoco ser fosforilada y FliM no se unir con Y; esto har que el



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motor mantenga su sentido de giro y la clula seguir nadando. En cambio, cuando no se censa alimento, no hay ligando y el receptor no es metilado, en consecuencia A se fosforila, fosforila a Y, Y se une a FliM y se cambia el sentido de giro del motor. Esto hace que la clula se reoriente en una direccin ms favorable.

Finalmente queda decir que la protena Z se encarga de desfosforilar a la protena Y, esto permite terminar un tumble e iniciar el nado en la direccin hacia la cual se reorient la bacteria.

3.1.2 Equivalencia con un sistema de ingeniera de control

Como se muestra en la Fig. 8 el sistema total del chemotaxis bacteriano puede separarse en mdulos de tal manera que cada uno puede ser estudiado de manera semi-independiente [8]. Esto facilita ampliamente el potencial de exploracin del mismo desde el punto de vista matemtico y es en buena medida gracias a ello que creemos posible la obtencin de modelos matemticos para cada uno de los diferentes mdulos. Siguiendo ese razonamiento, la primera labor que realic durante el mes de enero fue modelar el motor flagelar, luego prob el modelo contra los resultados experimentales que obtuvo en su laboratorio nuestro colaborador Huengwon Park en Harvard [9].

Cabe aclarar que existen varias versiones de modelos matemticos creadas en los aos recientes (2000-2012) [10,11] respecto al motor flagelar as que esta primera labor que me encomendaron fue ms bien para validar los resultados de H. Park ya que recientemente haban surgido ciertas dudas respecto a [9] basadas en las concentraciones de CheY-P obtenidas en experimentos del laboratorio donde trabajo.

Controlado

Planta Actuador

Sensor

Set Point + -

Circuito Bioqumico

Motor y Flagelos

Escherichia Coli

Receptores de Transmembrana

Fig. 8 Chemotaxis bacteriano como un sistema de control.



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3.1.3 Modelo matemtico Pese a que ya hemos descrito el proceso por el cual el motor influye en el comportamiento global del sistema aun no se ha mostrado en detalle cmo influye el cambio de sentido de rotacin en el flagelo. A continuacin muestro la mquina de estado que gobierna los cambios conformacionales del flagelo.

Fig. 9. Cambios conformacionales de los flagelos en la bacteria E.coli. [12]

En la Fig. 9 se hace evidente que en el caso 1, la bacteria nada debido a que todos los motores giran en sentido antihorario y ningn flagelo ha cambiado su conformacin normal. En el estado 2, uno de los motores cambi su sentido de giro pero la bacteria aun nada ya que el cambio conformacional aun no se ha propagado a travs de todo el flagelo. Luego de que transcurre el tiempo de propagacin del cambio conformacional, se llega al estado 3 en el que el flagelo 3 adopt una conformacin semi-enrrollada, esto hace que se degenere la hlice y la bacteria experimenta un tumble.

El estado 3 es solo transitorio y luego de un tiempo se cambia a la conformacin Curly (estado 4) en la cual, aun cuando el motor siga girando en sentido antihorario el flagelo puede unirse a la hlice. Finalmente cuando el motor regresa a su sentido de giro original se pasa al estado 5, luego se espera nuevamente un tiempo para que se propague en el flagelo el nuevo cambio conformacional y este adopte su estado normal, con lo cual regresamos al estado 1.

1 2

3

4

5



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Una representacin matemtica apropiada de esta mquina de estado es la que muestro a continuacin:

( + )=

( + ) = () > ( + )

( + ) = + < () > ( + + ) ( + ) = () > ( + + )

()

Siendo:

() . () . ( = 0 = 1) () ()

= 0.015 . = 0.2 Esta mquina de estado, bien definida por ([12],[13]) necesita ahora ser acoplada a la curva biestable del motor con respecto a la concentracin de la protena Y fosforilada, que de ahora en adelante ser denominada como CheY-P, haciendo referencia a chemotaxis protein Y ms una P por el grupo fosfato que se ha adherido a la protena.

En la Fig. 10 mostramos el ajuste de las curvas a los datos experimentales obtenidos en [14]. Se introduce una nueva medida, denominada CW bias que hace referencia a la probabilidad de un motor de estar rotando en sentido horario cuando se encuentra en un ambiente libre de qumicos detectables por la bacteria.

Fig. 10 Curva caracterstica del comportamiento biestable de un motor flagelar de la bacteria e.coli. [14]



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Esta curva ayuda a describir la razn de cambio de un motor entre rotacin antihoraria y rotacin horaria.

Fig. 11 Transicin de estados en un motor flagelar con las razones de cambio k+.

Es conocido que el cambio de estado se produce cuando las fluctuaciones termales superan cierta barrera de energa, que denominaremos G haciendo referencia a variacin en energa libre de Gibbs. Esta variacin en la energa libre es funcin de la concentracin de la protena CheY-P y una expresin tpica es la siguiente:

() = 04 12 ( ()() + ) Donde KD, g0 y g1 son las constantes que se debern ajustar a los datos experimentales (puntos rojos) mostrados en la Fig. 10.

A su vez, las razones de cambio entre un estado y otro pueden ser definidas como:

= () Siendo el parmetro que determina la escala de tiempo en la que se producen los cambios.

El ajuste de la curva produce los siguientes valores de los parmetros:

0 = 1 = 40 = 3.06 = 1.3 1

Siendo kB la constante de Boltzman y T la temperatura en Kelvin.

Es importante aclarar que dada la naturaleza probabilstica de las variables en cuestin (CW bias es una probabilidad) y el ruido inherente al motor flagelar, se aade un componente de ruido al sistema global al momento de programarlo.

CCW CW

k+

k-



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La programacin fue realizada en C++ y la funcin resultante es llamada desde un script en MATLAB para hacer una simulacin eficiente. Los resultados se muestran y discuten en el captulo 4.

3.1.4 Consideraciones de la simulacin Una vez que el modelo ha sido elaborado y codificado, es necesario codificar medidas auxiliares que nos permitan analizar el comportamiento del motor en diferentes ambientes. Esto no solo nos permitir validar el modelo con experimentos existentes y comprobar la coherencia de experimentos aun no validados, sino hacer predicciones que guiaran el curso de experimentos futuros.

Para tal fin, se hace pertinente explicar una de las caractersticas fundamentales de la respuesta caracterstica de una bacteria e. coli a un estmulo externo.

Tiempo de adaptacin: Es el tiempo que le toma a una bacteria recuperar sensitividad luego de ser sometida a un gradiente qumico. Tiene un valor caracterstico para cada bacteria dependiendo de los niveles de expresin de las protenas que intervienen en el chemotaxis pathway. Puede ser medida experimentalmente con el siguiente procedimiento (el mismo ser programado para obtener este parmetro en la simulacin):

a. Separar a una poblacin bacteriana segn rangos de su CW bias. Tpicamente 8 grupos con igual rango entre 0 y 0.4.

b. Obtener la longitud promedio de las corridas continuas de las bacterias en ausencia de estimulo. (Denominada Run0 en el presente informe).

c. Aplicar un estimulo qumico equivalente a un escaln.

d. Tomar las medidas de las longitudes promedio de las corridas siguientes a la aplicacin del estmulo.

e. Sumar el tiempo empleado en todas las corridas y tumbles de las bacterias de cada grupo hasta que en promedio la longitud de sus corridas converja al valor basal de longitud de corrida Run0. Esta convergencia es tomada como indicador de adaptacin a un nuevo ambiente. Significa que la bacteria respondi al estimulo con un comportamiento especifico; sin embargo, al ser constante el estimulo, la desmetilacin de los receptores por parte de B le permiti a la bacteria resetearse. Ahora su nueva referencia es la concentracin actual de qumicos.



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f. A la suma de tiempo obtenida en e se le resta la longitud basal de corrida para corregir la ltima lectura que por lo general es descartada por su cercana a la corrida basal. (Es un procedimiento con sustento emprico).

Si por ejemplo, solo las 3 corridas sucesivas a la aplicacin del estimulo fueran ms largas que la basal. El tiempo de adaptacin sera:

= 1 + 1 + 2 + 2 + 3 0 De ahora en adelante el tiempo de adaptacin ser denominado .

Este tiempo de adaptacin es importante para nuestros fines, ya que determina la forma de la respuesta a un estimulo de tipo escaln. Es por ello que la etapa previa al motor de nuestra simulacin requiere este parmetro para convertir la cada en concentracin de CheY-P en una funcin de respuesta dada por:

= ( > ) ()/

Fig. 12 Curva de respuesta ante un estimulo qumico del tipo escaln.

En la ecuacin anterior y la Fig. 12:

Drop: Cada en la concentracin de CheYp producida por un gradiente qumico de tipo escaln.

Tau: tiempo de adaptacin

test: tiempo en el que se aplica el estmulo

Offset: parmetro que defino para variar los niveles de CheYp en la simulacin sin alterar la dinmica del sistema.



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3.1.5 Software creado para la simulacin

El propsito de la simulacin es confirmar los experimentos realizados en [9]. Para ello se ha desarrollado una pequea plataforma de simulacin que integra cdigo en MATLAB y C++. Incluyendo scripts que desarrollan las siguientes funciones:

SimMotorFast.cpp: Contiene el modelo de los motores y flagelos de una bacteria. Esta codificado en C++. Recibe como entrada un vector de tiempo, el tiempo de muestreo, el vector de concentraciones de CheY-P en el tiempo, la cantidad de motores de la bacteria y el ruido del motor.

ypVal.m: Funcin de la respuesta al estimulo de tipo escaln por parte de la bacteria individual.

GenerateBasicPopulation.m: Script donde he programado el modelo para obtener una distribucin de concentraciones de la protena Y en estado estacionario equivalente a la de la poblacin bacteriana del experimento. El histograma de esta poblacin coincide con el experimental.

AnalyseAllMotorSeriesFast.m: Procesa la informacin obtenida de los motores de cada bacteria.

ComputeRunsAndResponseTime.m: Calcula la longitud de las corridas de cada bacteria, y el tiempo de respuesta que es equivalente al tiempo de adaptacin.

Muchos otros archivos para generacin de graficas y creacin de poblaciones artificiales tambin han sido creados, no obstante los detallados anteriormente constituyen la base para realizar las simulaciones.

3.2 Calculo de la difusin de protenas en el citoplasma bacteriano usando soluciones numricas estocsticas espaciales.

En esta segunda parte del trabajo realic el estudio de la difusin de la protena E en el citoplasma bacteriano y las reacciones de esta con los receptores de transmembrana, esto es de gran utilidad para saber el real aporte de la constante metilacin de los receptores en la adaptacin de la bacteria.

La cantidad media de protenas R en el citoplasma esta cerca de las 140 protenas, un nmero muy pequeo, por ello es la protena crtica en el sistema total [15]. Esta caracterstica hace que el sistema no pueda ser definido como un sistema de ecuaciones diferenciales parciales; pues la concentracin media pierde sentido. En consecuencia necesitamos un abordaje numrico para resolver el sistema de ecuaciones diferenciales estocsticas.



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Otro aspecto que nos interesa investigar es el incremento del ruido en la formacin de complejos en la membrana con el tamao de la superficie de la membrana celular cubierta de receptores.

El software ms adecuado para este tipo de anlisis es VCell [16]. Emplearemos la versin 5.1 beta ya que es la nica que nos permite emplear smoldyn [17] que es el solucionador numrico que necesitamos.

A continuacin explico el entorno de VCell, como defin y restring bien la simulacin, incluyendo la generacin del volumen celular, la membrana y el posicionamiento del substrato (receptores) y las enzimas (R).

1. Definicin de la Simulacin en VCell

a. Seleccin de compartimentos bsicos de la simulacin:

Fig. 13 Compartimentos definidos en VCell

En la Fig. 13 se muestran los compartimentos definidos:

EC: Espacio extracelular.

PM: Membrana celular.

Cell: Citoplasma celular.

Tambin se muestran las protenas en cuestin.

E: enzima, en nuestro caso es R.

S: substrato, en nuestro caso es T; es decir, los receptores.

ES: es el complejo formado por encima y substrato, es decir el receptor metilado.



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b. Diagrama de reacciones

Solo muestra las reacciones, en nuestro caso solo es una.

Fig. 14 Diagrama de reacciones.

Como se muestra todas las reacciones ocurren en la membrana, dado que los receptores estn fijos en la misma, es la enzima R la que se difunde en el citoplasma y eventualmente se aproxima a S a una distancia menos al radio de reaccin, haciendo que la probabilidad de que la reaccin ocurra sea alta.

c. La geometra de una bacteria promedio se aproxima a un cilindro con terminaciones semiesfricas a ambos lados. Es por ello que definimos la geometra mediante las siguientes ecuaciones:

: (2 + 2 + 2 < 0.452) ( < 0) + (2 + 2 < 0.452) ( 0) ( < 1.6)+ (2 + ( 1.6)2 + 2 < 0.452) ( > 1.6) Obteniendo la siguiente geometra:

Fig. 15 Geometra de la Bacteria.

d. Especificaciones:

E S ES Concentracin Inicial 0.16 uM 96000(y



25

( ) = 0.08 1

Solver: Smoldyn (Spatial Stochastic Simulator)

Simulation Time: 500s Time step: 0.0001 s

e. Configuracin espacial preliminar (antes de finalizar la simulacin)

Fig. 16 Concentracin de Sustrato en la membrana.

En el captulo 4 se muestran los resultados de esta simulacin y se comenta la importancia de lo obtenido.

3.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva del motor flagelar.

En las dos actividades anteriores bsicamente se valido modelos matemticos dado que ellos sern usados para esta actividad, que en realidad es el proyecto principal en el que trabaj.

A continuacin detallo el sustento para la realizacin de este proyecto, explico y detallo el conocimiento nuevo que debe resultar del trabajo, la planeacin del mismo y su desarrollo. En el captulo 4 muestro los resultados y hago las observaciones correspondientes, finalizando con conclusiones y recomendaciones.

3.3.1 Ventajas y desventajas del fenotipo bacteriano en diferentes ambientes.

Como ya se ha explicado en la actividad 3.1 nuestro objeto principal de estudio es el chemotaxis bacteriano. Este le permite a las bacterias orientar su direccin de nado hacia regiones ms favorables. No obstante, es observable que algunas bacterias se desempean con mayor efectividad que otras en un ambiente determinado.

Para explicar este punto tomamos como ejemplo el comportamiento en un ambiente homogneo (sin gradientes de nutriente) y otro con un gradiente empinado (alto incremento de nutriente por unidad de longitud). Dichos ambientes pueden ser vecinos, como mostramos en la Fig. 17. En el ambiente homogneo, cierta

176 molculas

0 molculas



26

subpoblacin de bacterias explora mejor; es decir, hace corridas ms largas llegando a una regin espacial ms amplia; mientras que otro grupo de la poblacin, cuya longitud de corrida tpica es corta no llega a ciertas regiones y como consecuencia recibe menos informacin de su ambiente.

Fig. 17. En un ambiente homogneo se comportan mejor las bacterias exploradoras mientras que en un gradiente son las seguidoras las que muestran mejor desempeo.

En determinado momento, las bacterias que exploran mejor llegaran a detectar alguna concentracin de alimento, desde ese punto orientaran su nado en la direccin en la que se incrementa la cantidad de qumico hasta que lleguen a la fuente de alimento. En un momento ms lejano, otras bacterias tambin podrn detectar ese gradiente qumico y lo seguirn. Finalmente un grupo de bacterias cuya habilidad explorativa es muy baja, nunca detectar el alimento y morir al no encontrar nutriente.

Sin embargo, si las bacterias empezaran dentro del gradiente los papeles terminaran invertidos. Las bacterias con corridas ms cortas llegaran antes a la fuente ya que su frecuencia de muestreo es ms alta (cada vez que termina una corrida elijen una nueva direccin de nado) en base al ligando censado; esto implica que estas bacterias encuentran el camino ms rpido en presencia de gradiente mientras que no son muy aptas para salir de ambientes homogneos.

Este fenmeno de comportamiento es un complejo problema de costo beneficio, aparentemente ninguna bacteria puede ser optima en ambas tareas (seguir y explorar), mientras mejor se sigue peor se explora y viceversa. Muchos autores [18-20] han sugerido que el chemotaxis pathway ha sido totalmente optimizado por la



27

evolucin; no obstante estas recientes observaciones nos conducen a poner en cuestin dicha aseveracin. Ms an, en base a [21] creemos que 3 parmetros fundamentales rigen el comportamiento de una bacteria, ellos son tiempo de adaptacin, CWbias y ruido en las seales. Estos parmetros a su vez estn relacionados segn se midi experimentalmente en [9].

En consecuencia, nuestra hiptesis inicial es que si relajamos las restricciones entre ruido, tiempo de adaptacin y CWbias, podremos encontrar grupos de bacterias que se desempeen mejor que la poblacin salvaje. Relajar estas relaciones implicara retirar la correlacin que existe entre el nivel de expresin de las protenas del chemotaxis pathway. Esto sera equivalente a fabricar mutantes cuyo operon meche este fragmentado.

Para probar esta hiptesis empleamos una gran plataforma de simulacin llamada the Hive [22], que ha sido desarrollada durante 5 aos en el laboratorio donde realic mis prcticas. Esta plataforma me permiti integrar y comunicar los modelos matemticos que describen diferentes funciones de la bacteria: reproduccin, metabolismo, chemotaxis, desplazamiento y estructura.

Gracias a ello el paso siguiente fue implementar todo el cdigo respectivo usando dicha plataforma como soporte y verificar si nuestra hiptesis respecto de la poblacin salvaje era cierta.

3.3.2 Construccin del modelo total Las relaciones principales entre los parmetros del modelo a simular se muestran en la Fig. 18.

Fig. 18. Relacin entre el ruido, tiempo de adaptacin y CWbias. [9]



28

Implementamos esta relacin bajo el siguiente modelo de bacterial chemotaxis:

De manera similar a los modelos validados en [22-25], los dmeros de complejos receptores Tar y Tsr fueron representados con un modelo de tipo Monod-Wyman-Changeux (MWC) [26], donde los complejos cambian cooperativamente entre conformaciones activas e inactivas. La probabilidad de estar en una conformacin activa es:

1))(1(),( 10 + += LFeLMA M Donde M es el nivel medio de metilacin de un receptor del complejo, L es la concentracin del qumico externo, 0 y 1 son trminos de energa libre y F(L) es la contribucin de energa libre que resulta de la unin del ligando cono el receptor. La definimos como:

TSRTAR N

onTSR

offTSR

N

onTAR

offTAR

KLKL

KLKLLF

++

++

=11

11)(

Donde los parmetros offTARK ,

onTARK , offTSRK , y onTSRK son las constantes de disociacin de

la reaccin con el ligando en las conformaciones activas e inactivas de Tar y Tsr. NTAR y NTSR son los nmeros de dmeros de Tar y Tsr respectivamente. La adaptacin que resulta de la metilacin persistente de CheR y la desmetilacin de CheB es modelada con la siguiente ecuacin diferencial estocstica:

)()1(

)1()( 23

tAK

AkAK

Akdt

dMAG MMb

b

r

r ++

+

==

Donde kr y kb son las razones catalticas de metilacin y desmetilacin. Kr y Kb son las constantes de Michaelis Menten de CheR y CheB respectivamente. M es la desviacin estndar del ruido de metilacin, M es la escala de tiempo del ruido de metilacin, (t) es un proceso aleatorio con distribucin normal, media cero y varianza 1. Dado que la fosoforilacin de Y por parte de A es rpida con respecto a la dinmica del sistema, podemos usar el valor de estado estacionario:

AKAYY

YP +

= 0

Donde Y0 es la concentracin mxima de CheY-P, KY es la saturacin media. A partir de estas relaciones, sumadas a los modelos del motor y flagelo obtenidos en la actividad



29

3.1, ya estamos en condiciones de realizar una simulacin del comportamiento de la poblacin completa.

3.3.3 Simulacin del modelo restringido por las relaciones de la poblacin salvaje Para tener una medida cuantitativa del desempeo de la poblacin empleamos dos medidas:

Drift Velocity: Se calcula dentro de una ventana de tiempo de 1 minuto, luego del tiempo de equilibrio que en nuestra simulacin es 500s. Solo se toma en cuenta el desplazamiento en la direccin del gradiente. Por ejemplo si el gradiente solo vara en la direccin del eje x tendremos:

= _ _ Es decir la variacin de la posicin en la direccin del gradiente qumico dividida entre la ventana de tiempo en que se hace el anlisis.

Esta es una buena medida de la capacidad de una bacteria para seguir un gradiente.

Coeficiente de Difusin: Tambin es medido en una ventana de tiempo. Se calcula como la sexta parte de la pendiente de la recta que ajusta la relacin entre el desplazamiento cuadrtico medio total en una ventana de tiempo respecto al tiempo. Nos da una medida de las capacidades explorativas de una bacteria. Se mide siempre en ambientes vacos.

En resumen, cuando una bacteria tiene mayor drift velocity es una mejor seguidora, mientras que una bacteria con mayor coeficiente de difusin es una mejor exploradora.

Basndonos en ello realizamos una simulacin con las siguientes caractersticas:

Combinaciones: 80, restringidas por las relaciones de CWbias, tiempo de adaptacin y ruido.

Clulas por combinacin: 1000.

Tiempo de simulacin: 1000 s.

Tiempo de equilibrio: 500 s.

Escala de longitud de los gradientes empleados: 100 um, 300um y 1000 um.

Motores por bacteria: 4, coordinados por el ruido.

Posicin inicial de las bacterias: x=0. Direccin del gradiente: +x.



30

Con ello obtuvimos los siguientes resultados:

Gradiente Diluido

Gradiente Medio

Gradiente Concentrado

Coeficiente de difusin

Tau

Tau

Tau

50

100

50

50

100

100

150

150

150

200

200

200

250

250

250

300

300

300



0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

200

400

600

800

1000

200

400

600

800

1000

1000

800

600

400

200

Drift

Vel

ocity

Dr

ift V

eloc

ity

Drift

Vel

ocity

Fig. 19. Tradeoff de comportamiento en una poblacin salvaje



31

Es claro que hay una tendencia comn en los tres ambientes simulados, la nica manera de que una clula alcance una performance ptima en exploracin (alto coeficiente de difusin) es si sacrifica su desempeo como seguidora (bajo drift velocity).

Luego de ello decidimos realizar una simulacin mucho ms grande para explorar la hiptesis inicial, para ello gener diversas combinaciones de parmetros en diferentes bacterias, construyendo as una poblacin mutante de e.coli. Los resultados de esto y su anlisis se muestran en el captulo 4.

3.3.4 Anlisis ROC (Receiver Operating Characteristic) del desmepeo bacteriano. Pese a haber mostrado ya la existencia de un tradoff de desempeo en las bacterias e.coli. Nos quedaba pendiente explicar a qu se debe esto y sobre todo responder a la pregunta: Si la bacteria no evolucion para ser ptima en general entonces en base a qu criterio evolucion?

Se planeo resolver esto desde la perspectiva de la ubicacin de las clulas en la curva del motor. Es decir, si encontramos en que regin del motor se encuentran las mejores exploradoras y en cual las mejores seguidoras, podremos saber si las bacterias evolucionaron para decidir bien cuando van en contra del gradiente o para evitar equivocarse cuando van en la direccin correcta. Es decir para hacer ms tumbles cuando van contra el gradiente o para hacer menos tumbles cuando van a favor del gradiente.

Originalmente era esperable que ambos eventos tuviesen igual importancia, por ello asumimos que las clulas con mejor performance deberan estar en la mitad de la curva del motor. Esto es razonable dado que en caso la bacteria nade en la direccin del gradiente se mover hacia el lado izquierdo de la curva minimizando su probabilidad de generar un tumble, como se muestra en la Fig. 22. Mientras que si la bacteria nada en la direccin opuesta, se mueve a la derecha de la curva maximizando su probabilidad de generar un tumble, es decir maximizando la probabilidad de reorientarse para nadar en la direccin correcta. Estar ubicada en el centro de la curva del motor es equivalente a decir que es igualmente importante evitar tumbles cuando se nada en direccin favorable que generar tumbles cuando se nada en la direccin desfavorable.

Fig. 20 Hiptesis respecto a la ubicacin de las mejores clulas en la curva del motor.



32

Adicionalmente, necesitbamos una divisin apropiada de las probabilidades de que la bacteria decida bien dado que va en la direccin del gradiente (up) o la contraria (down). Por ello optamos por emplear una herramienta comn en machine learning como el anlisis ROC (receiver operating characteristic). Separamos nuestros casos para satisfacer la siguiente convencin:

RUN UP

True Positive (TP)

RUN DOWN

False Positive (FP)

TUMBLE UP

False Negative (FN)

TUMBLE DOWN

True Negative (TN)

Siendo nuestras medidas de desempeo las siguientes:

Sensitividad = TP/(TP+FN) = p(run|up)

Probabilidad de tomar la decisin correcta cuando nada hacia arriba del gradiente.

Especificidad = TN/(TN+FP) = p(tumble|down)

Probabilidad de tomar la decisin correcta cuando nada hacia abajo del gradiente.

Precisin = TP/(TP+FP) = p(up|run)

Fraccin de las corridas que se hacen en la direccin correcta.

Accuracy = TP+TN

Probabilidad de tomar la decisin correcta.

El anlisis de todos estos casos se hizo para muchas combinaciones de CWbias y tiempo de adaptacin, de manera que se obtuvo heatmaps de todas las variables y ello nos condujo luego a analizar histogramas de la concentracin de la protena CheY-P con respecto a la curva del motor. Todo esto ser mostrado en el siguiente captulo de resultados ya que para ser explicado en detalle requiere mostrar los resultados de las actividades anteriores y de las simulaciones descritas hasta aqu.



33

4. Presentacin de Resultados En este captulo explicamos los resultados de cada una de las actividades detalladas en el captulo 3, comentando la trascendencia de los mismos y emitiendo finalmente, conclusiones, observaciones y recomendaciones.

4.1 Resultados de la simulacin de un motor flagelar de la bacteria e.coli Como primera simulacin comparamos las longitudes de las corridas de la bacteria antes e inmediatamente despus de percibir un estmulo. Lo esperable es que la longitud de corrida sea mayor despus del estmulo ya que la bacteria queda condicionada a seguir una direccin mientras que antes se mova en direcciones aleatorias.

Fig. 21 Primera corrida despus de un estimulo vs. Corridas basales.

Ahora, si observamos a las longitudes de la segunda y tercera corrida, encontramos resultados bastante ruidosos; por tal motivo decidimos que sera mejor agrupar a las bacterias por su CWbias, y de ese modo obtuvimos resultados limpios que nos permitieran observar como la bacteria se adapta y la media se va aproximando a la longitud de corrida basal.

Fig. 22. El modelo cumple con la adaptacin esperable de la bacteria.



34

El siguiente paso con nuestro modelo fue probar lo propuesto por H. Park ([9]), para ello, probamos someter a la misma poblacin de bacterias ante 2 estmulos de magnitud diferente. El propsito de esto es demostrar que si bien la respuesta inmediata es muy diferente para ambos casos, la segunda y tercera corridas adoptan valores muy cercanos, sugiriendo que la mayor parte de la informacin respecto al estmulo se encuentra en la primera corrida, planteando adems que el mecanismo preponderante de respuesta est gobernado por la memoria de la bacteria.

Fig. 23. Primera, Segunda y Tercera corrida posteriores a estmulos de diferente magnitud. Pese a que el estmulo de 2 uM causa un impacto mayor en la primera corrida, en la segunda y

tercera casi se empareja con el estimulo de 0.5 uM demostrando lo planteado lneas arriba.

Ms an, al calcular el tiempo de respuesta confirmamos la tendencia, sugerida por P. Cluzel (2010). Para ello usamos una poblacin salvaje con distribucin de CWbias como la que se muestra la derecha en la Fig. 24.

Fig. 24 Relacin entre tiempo de respuesta y CWbias. Distribucin de CWbias en la poblacin.



35

4.2 Resultado de la simulacin del la difusin de la protena R Esta simulacin permiti cotejar clculos analticos realizados para una publicacin que se est preparando en el laboratorio [27], donde realic mis prcticas; por tal motivo, lo importante fue obtener el nivel medio de complejo formado y el ruido inherente al proceso. El resultado de la variacin de la encima y el complejo se muestra en la Fig. 25.

Fig. 25. Resultados respecto de la concentracin del complejo y la enzima.



36

4.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva de la ubicacin en la curva del motor flagelar. Como primer punto para probar nuestra hiptesis respecto a la ubicacin de las mejores bacterias en la curva del motor, generamos una poblacin de bacterias artificiales retirando la limitacin fsica de la relacin entre tiempo de adaptacin y CWbias. Obtuvimos los siguientes resultados:



37

Fig. 26 Drift velocity vs coeficiente de difusin en 3 gradientes diferentes. Las marcas varan con el tiempo de adaptacin de la bacteria y el color con el CWbias.

De la Fig. 26 resulta evidente que aun relajando algunas limitaciones fsicas del sistema, existe una cada cuando el CWbias llega a 10-4. No obstante si hacemos una comparacin con la Fig. 19, notaremos claramente que un buen grupo de clulas de la poblacin artificial o mutante conserva alto desempeo como seguidora aun en altos coeficientes de difusin.

La observacin ms relevante respecto a estos resultados resulta ser el nivel de CWbias. En el pico esta alrededor de 10-2, esto implica que nuestra hiptesis respecto a la ubicacin de las mejores clulas en la curva del motor estaba equivocada. Las bacterias no prefieren estar al medio de la curva del motor. Esto significa que no es igualmente importante decidir bien cuando se nada en contra que evitar decidir mal cuando se va a favor del gradiente.

Esto nos conduce a explorar el espacio de probabilidad condicional, usando el anlisis ROC descrito en la seccin 3.3.4. Adems exploramos la correlacin de los diferentes ndices con el drift velocity para determinar que tipo de decisiones tienen influencia directa en el desempeo de la bacteria como seguidora.



38

Sensitividad

Fig. 27 Anlisis de sensitividad en el espacio paramtrico de la poblacin mutante.

De aqu resulta increble la evidente correlacin de la sensitividad con el CWbias, esto implica que las bacterias que mejor deciden cuando van hacia arriba del gradiente son aquellas con menos CWbias. Esta grafica junto con la Fig. 26 nos sugieren que el lugar ms apropiado para las clulas en la curva del motor es cerca del umbral (como se muestra en la Fig. 28). Para probar esto, realizamos un anlisis semejante con los dems ndices de nuestro espacio de probabilidad condicional.

Fig. 28. Ubicacin de las mejores clulas en la curva del motor.



39

Especificidad

Fig. 28 Anlisis de especificidad en el espacio paramtrico de la poblacin mutante.

La tendencia es contraria, mostrando que las bacterias que deciden mejor nadando haca arriba del gradiente coincidentemente tienden a decidir peor cuando van hacia abajo del gradiente. Esto nos hace intuir que la consecuencia lgica ser que las que deciden mejor y tiene mejor performance no estarn ubicadas en los extremos sino en algn lugar al medio del heatmap, esto implicara que para cada ambiente efectivamente existe una combinacin optima de tiempo de adaptacin y CWbias.

Otra cantidad de inters es la fraccin de corrida que se hacen en la direccin correcta. Esto se debe a que no siempre la bacteria que corre mas en el sentido correcto respecto al tiempo total que corre se desempea mejor, ya que podra ocurrir que haga tantos tumbles que el tiempo total que corre sea muy pequeo. En consecuencia



40

analizar la precisin nos ayudara a descartar esa posibilidad o en su defecto a considerarla.

Precisin

Fig. 29 Anlisis de precisin en el espacio paramtrico de la poblacin mutante.

Afortunadamente, estos resultados muestran una clara correlacin con el drift velocity, lo cual nos permite descartar el caso mencionado en la pgina anterior. Adems se muestra que existe efectivamente regiones del espacio paramtrico donde se concentran las clulas mas aptas para cada ambiente. El paso que resta para la comprobacin de nuestra hiptesis es mostrar que esto se sigue cumpliendo para la probabilidad de una bacteria de decidir bien. Con ello mostraramos claramente que una bacteria que decide mejor en general tiene un equilibrio entre habilidades explorativas y de seguimiento. Siendo la consecuencia mas grande de esto que las



41

bacterias aparentemente no evolucionaron para optimizar ambas tareas o una en particular, sino que evolucionaron para tener la probabilidad mas alta de decidir bien sea que van a favor o en contra del gradiente. Esto contradice gran parte de lo asumido en la ltima dcada respecto al chemotaxis pathway.

Accuracy

Fig. 30 Anlisis de accuracy en el espacio paramtrico de la poblacin mutante.

Lo mostrado aqu confirma las sospechas descritas en la pgina anterior. La capacidad de decidir bien esta correlacionada con el desempeo independientemente del ambiente en el que se encuentre la bacteria.



42

En este trabajo no solo hemos mostrado que una bacteria no puede ser optima en sus dos tareas fundamentales; sino que adems hemos propuesto una prediccin terica importante: Las bacterias de e.coli no evolucionaron para maximizar su desempeo explorativo o de seguimiento, sino que evolucionaron para decidir correctamente cuando van a favor del gradiente; aun cuando esto pueda implicar perder performance en ciertos ambientes.

El ultimo punto que queremos demostrar es respecto a la ubicacin de las mejores clulas en la curva del motor; para ello, hemos graficado la frecuencia normalizada de la concentracin de la protena Y forsforilada (CheY-P) en todo el tiempo de simulacin y la hemos graficado sobre la curva del motor. El color de cada curva representa el drift velocity de dicho grupo de clulas.

Distribucin de frecuencias en la Curva del Motor



43

Fig. 31 Distribucin de frecuencias normalizadas de la concentracin de CheY-P en la curva del del motor, que en este caso es equivalente al tumbling bias (probabilidad de un tumble)



44

En la Fig. 31 mostramos la distribucin de frecuencias de CheYp para bacterias con diferentes tiempos de adaptacin (cada figura es para un tiempo de adaptacin distinto como se indica en su respectivo ttulo). A su vez, cada curva es para un CWbias diferente segn indica cada leyenda. El color de cada curva viene determinado por el drift velocity en el gradiente mas concentrado.

El anlisis de estas curvas lo separaremos en 3 puntos:

Rango de CheYp:

Mientras el rango de CheYp es ms amplio, el drift velocity crece siempre y cuando la distribucin este centrada lo suficientemente lejos de la concentracin 0. El caso ms representativo es el de la subpoblacin con CWbias ms alto.

Tiempo de Adaptacin y Distribucin de CheYp

Otra tendencia es el incremento de la dispersin junto con el tiempo de adaptacin. Esto se debe a que mientras mayor sea el tiempo de adaptacin, se integrar mas ligando antes de hacer un tumble, en consecuencia los saltos en variacin de CheYp eran ms grandes.

Regin de las mejores bacterias

Las distribuciones con mejor performance son aquellas que se encuentran cerca del umbral del motor, al lado izquierdo. Esto confirma nuestro replanteo de hiptesis y contradice una fuerte sospecha en el campo [28], que indicaba que la bacteria alcanzaba adaptacin perfecta porque CheYp se ubicaba en el rgimen lineal del motor.

4.4 Habilidades obtenidas al concluir la prctica Capacidad de modelar fenmenos estocsticos, y resolver de manera analtica

sistemas de ecuaciones diferenciales estocsticas. Mejora del pensamiento critico, vital para la realizacin de un trabajo de

investigacin minucioso. Mejore mis exposiciones ya que tuve que organizar semanalmente

presentaciones sobre mis avances y se me invito a realizar un seminario abierto sobre mis avances en la escuela de medicina de la universidad de Yale, hubo alrededor de 50 asistentes.

Obtuve un entrenamiento que me permite ya no solo elaborar programas separados sino realmente hacer ingeniera de software.

Anlisis probabilstico, llevar una cantidad a abundante de datos a un espacio de probabilidad donde las tendencias puedan observarse ms claramente.



45

Mtodos de optimizacin que se usaron para ajustar los modelos a los datos experimentales. En especial Markov Chain Monte Carlo Optimization.

4.5 Observaciones, Conclusiones y Recomendaciones

4.5.1 Observaciones Modelamiento y Simulacin del Motor Flagelar

La longitud de corrida disminuye con el CWbias, alargndose despus de la aplicacin de un estmulo qumico.

La diferencia entre la longitud de las corridas segunda y tercera ante 2 estmulos qumicos de diferente magnitud es mnima.

Es necesario tomar el promedio de la respuesta para cada subpoblacin de CWbias debido a la alta variabilidad celular que hace extremadamente dispersas las medidas.

Difusin de protenas en el citoplasma bacteriano

El tamao del parche de receptores de transmembrana aparentemente contribuye al ruido, si comparamos los resultados de la simulacin y los clculos analticos en una dimensin de [27].

El modelo mostrado en [27] coincide con el valor medio en estado estacionario simulado.

Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva del motor flagelar

En la poblacin salvaje existe una marcada diferencia entre las clulas que se desempean mejor como exploradoras (alto coeficiente de difusin) y las que trepan velozmente los gradientes (seguidoras).

La generacin de una poblacin artificial donde se relajan las restricciones fsicas nos permite obtener mejores combinaciones de ambas habilidades (explorar y seguir); no obstante, se sigue manifestando una cada en la curva de Drift velocity vs Coeficiente de Difusin.

Un anlisis detallado de la toma de decisiones de las bacterias nos muestra que el comportamiento global no es gobernado ni por decidir bien cuando se va arriba del gradiente ni por decidir bien cuando se va hacia debajo de l; sino por una combinacin de ambos.

La ubicacin en la curva del motor en la cual las bacterias muestran mejor desempeo es cerca del umbral hacia el lado izquierdo.

Existe una alta correlacin entre precisin, accuracy y drift velocity.



46

Un mayor tiempo de adaptacin permite integrar mas seal (ligando) y genera distribuciones ms planas en CheYp.

CWbias extremadamente bajos hacen que nunca se integre suficiente seal como para pasar el umbral del motor.

4.5.2 Conclusiones Modelamiento y Simulacin del Motor Flagelar

Dado que slo la primera corrida post-estmulo muestra diferencias significativas para las diferentes magnitudes del estimulo, podemos decir que la mayor parte de informacin es procesada por la bacteria durante el tiempo que toma la primera corrida, y la longitud de esta no se correlaciona con el tiempo de adaptacin ya que este se mide sobre el total de corridas hasta alcanzar la longitud basal. En consecuencia, la respuesta no solo depende del tiempo de adaptacin sino tambin de la memoria de la bacteria.


La correccin de los clculos de [27] para pasar de 1 a 3 dimensiones fue efectiva en base a lo observado, en consecuencia confirmamos aqu que la estructura espacial del parche de receptores de transmembrana juega un rol fundamental en la generacin de ruido dentro del sistema. Este ruido sirve para coordinar a los motores flagelares [13].


Las bacterias de e.coli no evolucionaron para maximizar su desempeo explorativo o de seguimiento, sino que evolucionaron para maximizar las corridas arriba del gradiente; aun cuando esto pueda implicar perder performance bajo ciertas condiciones ambientales.

4.5.3 Recomendaciones para el trabajo futuro Modelamiento y Simulacin del Motor Flagelar

El modelo matemtico del motor se ajusta a los resultados experimentales de [9]; no obstante, sigue siendo un misterio para la comunidad cientfica como es posible que el sistema global muestre adaptacin perfecta a pesar de que CheYp no siempre se mueve dentro del rgimen lineal del motor. En consecuencia recomiendo indagar ms en esto en el trabajo futuro.



47


Haber confirmado la importancia de la estructura espacial de receptores de transmembrana abre mas preguntas respecto a que consecuencias traera esto si se construye un verdadero modelo de compartimentos. Desde el punto de vista matemtico esto implica un reto que deber ser asumido en trabajos futuros.


Si bien hemos mostrado hasta aqu como la poblacin de bacterias define su estrategia a partir de su ubicacin en la curva del motor y explicamos hacia que fin evolucion la bacteria individual, queda pendiente para el trabajo futuro explicar como se beneficia la poblacin de esta diversidad de fenotipos en lugar de buscar evolucionar alrededor de un solo tipo de bacteria.

Recomendaciones Generales

Un factor clave para poder realizar simulaciones como las hechas aqu es integrar apropiadamente los diferentes modelos que forman parte del sistema. Adems de los mostrados se tuvo que incluir modelos para la replicacin celular, metabolismo, efectos de frontera, etc. Para ello recomendamos usar un modelo basado en agentes, donde cada modelo pueda modificar ubicaciones comunes de una base de datos. Este mtodo reduce su error si la calendarizacin de las actualizaciones es apropiada.

La presencia de mltiples escalas de tiempo hace complejo el modelamiento y programacin; no obstante, este problema puede ser parcialmente resuelto al incluir diferentes mtodos numricos para integrar las ecuaciones diferenciales estocsticas con precisiones que varen de acuerdo a la importancia de cada subsistema en la dinmica total del sistema.



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5. Referencias [1] H. Kitano, Systems Biology: A Brief Overview , Science, Vol. 295 no. 5560 pp. 1662-1664, 2002.

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[5] M. Kollman, et al, Design principles of a bacterial signaling network, Nature, Vol. 438, pp. 504-507, 2005.

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AgradecimientosContenido1. Introduccin1.1 Antecedentes1.2 Objetivos1.2.1 Objetivos Generales1.2.2 Objetivos Especficos1.2.3 Objetivos del presente informe

1.3 Descripcin del informe

2. La empresa2.1 Datos de la empresa2.2 Historia2.3 Organizacin2.4 Infraestructura y recursos del laboratorio2.5 Servicios2.6 Localizacin

3. Actividades Desarrolladas3.1 Modelamiento y simulacin del motor flagelar de la bacteria e. coli.3.1.1 Chemotaxis Pathway3.1.2 Equivalencia con un sistema de ingeniera de control3.1.3 Modelo matemtico3.1.4 Consideraciones de la simulacin3.1.5 Software creado para la simulacin

3.2 Calculo de la difusin de protenas en el citoplasma bacteriano usando soluciones numricas estocsticas espaciales.3.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva del motor flagelar.3.3.1 Ventajas y desventajas del fenotipo bacteriano en diferentes ambientes.3.3.2 Construccin del modelo total3.3.3 Simulacin del modelo restringido por las relaciones de la poblacin salvaje3.3.4 Anlisis ROC (Receiver Operating Characteristic) del desmepeo bacteriano.

4. Presentacin de Resultados4.1 Resultados de la simulacin de un motor flagelar de la bacteria e.coli4.2 Resultado de la simulacin del la difusin de la protena R4.3 Estrategias de comportamiento explicadas desde la perspectiva de la ubicacin en la curva del motor flagelar.4.4 Habilidades obtenidas al concluir la prctica4.5 Observaciones, Conclusiones y Recomendaciones4.5.1 Observaciones4.5.2 Conclusiones4.5.3 Recomendaciones para el trabajo futuro

5. Referencias

informe de practicas pre-prodfesionales

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