informe de practicas pre profesionales israel salazar

7/26/2019 Informe de Practicas Pre Profesionales Israel Salazar

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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOLOGA-MICROBIOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PRE PROFESIONALES

ANLISIS MICROBIOLGICO DE MUESTRAS DE AGUAS,

ALIMENTOS Y SUPERFICIES VIVAS E INERTES

Institucin: Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental

Presentado por: Israel Jos Salazar Quispe

15 de Febrero15 de Mayo

TacnaPer

2012


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1

INDICE GENERAL

I. GENERALIDADES.Pg.03

Razn social de la empresa o institucindescripcin .Pg.03

Ubicacin.. . Pg.04

Organizacin de la empresa o institucin.. ...Pg.05

Objetivos de la prctica....Pg.22

II. FUNDAMENTO TEORICOPg.25

Agua....Pg 25

Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano.............. ....Pg.26

Requisitos de calidad del agua para consumo humano...............Pg.28

Aspectos generales de microbiologa de aguas............................Pg.31

Alimentos.......................................................................................Pg.35

Normativa sanitaria de alimentos...................................................Pg.38

Aspectos microbiolgicos...............................................................Pg.38

Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos.....................Pg.41

III. MATERIAL Y METODO....................................................Pg.48

Preparacin y esterilizacin de medios de cultivos y diluyentesPg.48

Instructivo de preparacin y dilucin de muestras. ..Pg.53

Procedimiento de recuento de bacterias heterotrficas.. Pg.57

Procedimiento de Monitoreo Ambiental Pg.65


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Procedimiento de anlisis para la deteccin de Salmonel la sppPg.66

Procedimiento de anlisis para la numeracin de Staphy lococcusureus... ....Pg.80

Procedimiento de anlisis de coliformes fecales

por filtro de membrana Pg.94

Procedimiento de anlisis de coliformes totales, fecales y E.col i..Pg.103

Procedimiento para anlisis de superficies .Pag.114

IV. RESULTADOS..Pg.121

Muestras de Agua Potable (Cuadro 1) ..Pg.121

Muestras de Agua Natural (Cuadro 2) ..Pg.133

Muestras de Agua de Mar (Cuadro 3) .Pg.139

Muestras de Alimento (Cuadro 4) ..Pg.144

Muestras de Anlisis de superficies (Cuadro 5) ..Pg 147

V. CONCLUSIONES YSUGERENCIAS.Pg.153

5.1 Conclusiones..Pg.153

5.2 Sugerencias.......Pg.154.

VI. BIBLIOGRAFA.. Pg 157

VII. ANEXOS.Pg.159


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I. GENERALIDADES

1.1. Razn social de la empresa o institucindescripcin:

La Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental de la Direccin Regional de

Salud Tacna, es una institucin que despliega una serie de acciones de

control y asesoramiento tcnico a las diferentes empresas que desarrollan

sus trabajos en los sectores de pesquera, industria manufacturera,

agroindustria y transportes a fin de que la ejecucin de estas actividades

econmico - productivas, no ocasionen impactos negativos en el medio

ambiente y la salud humana. Para ello cuenta con el personal profesional y

Tcnico capacitado en sus diferentes divisiones.

La cul tiene como funcin bsica la direccin y coordinacin de

actividades tcnico-administrativas de alto nivel de responsabilidad en

programas de lnea asignados al rea de competencia del Ministerio de

Salud y Gobierno Regional de Tacna. La funcin bsica es lograr que se

cumpla la poltica, visin, misin, objetivos y normas nacionales y regionales

de salud.


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Relaciones internas:

Se encuentra bajo la Direccin del MINSA, y de la Gerencia

Regional de Desarrollo Social del Gobierno Regional de Tacna,

ante quienes da cuenta de su gestin.

Dirige y supervisa a las Unidades Orgnicas de la Direccin

Regional de Salud-Tacna y sus rganos desconcentrados del

Hospital Hiplito Unnue de Tacna y Direccin de Red de Salud-

Tacna.

Relaciones externas:

Entidades y organizaciones pblicas y privadas del sector y Sistema

Nacional, Macro-regional y Regional de Salud.

1.2. Ubicacin:

El laboratorio de salud ambiental se localiza en la direccin ejecutiva

de salud ambiental, ubicado en la prolongacin dos de mayo s/n segundo

piso.


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Provincia Tacna

Departamento Tacna

Distrito Tacna

1.3. Organizacin de la empresa o institucin:

La Direccin Ejecutiva de Salud Ambiental de la Direccin Regional de

Salud Tacna, como Autoridad Sanitaria tiene por funcin la Proteccin del

Medio ambiente, el Saneamiento Bsico, la Higiene Alimentaria y el Control

de Zoonosis para lo cual est dividido en cuatro grupos de trabajo los cuales

son los siguientes:

Equipo de trabajo de saneamiento bsico, higiene alimentaria y

zoonosis.

Equipo de trabajo de ecologa, proteccin ambiental y salud

ocupacional.

Equipo de trabajo de sanidad area, martima y de fronteras.

Laboratorio.


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Para ello cuenta con el personal profesional y Tcnico capacitado en

sus diferentes Direcciones.

ORGANIGRAMA ESTRUCTURAL DE LA DIRECCIN EJECUTIVA DE

SALUD AMBIENTAL

DIRECCI N EJECUTIVA DESALUD AMBIENTAL

Laboratorio

EQUIPO DE TRABAJODE SANEAMIENTOBASICO, HIGIENEALIMENTARIA Y

EQUIPO DE TRABAJODE ECOLOGA,PROTECCIN

AMBIENTAL Y SALUDOCUPACIONAL

EQUIPO DE TRABAJODE SANIDAD EREA,

MARTIMA Y DEFRONTERAS

DIRECCION REGIONAL DESALUD TACNA

Secretaria


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1.3.1. Organigrama estructural de la direccin de saneamiento bsico

higiene alimentaria y control de zoonosis:

DIRECTOR DE SANEAMIENTO B SICO HIGIENEALIMENTARIA Y CONTROL DE ZOONOSIS

AREA DECONTROL DE

ZOONOSIS

AREA DECONTROL DEVECTORES

AREA DE

SERVICIOS

BSICOS

AREA DE

RESIDUOS

DOMICILIARIOS

DIVISI N DE SERVICIOSBSICOS

DIVISIN DE CONTROL DE

ZOONOSIS Y VECTORES

DE LA DIVISI N DE

VIGILANCIA Y CONTROL DE

ALIMENTOS Y SERVICIOS

AREADE INSPECCIN A

CENTROSRECREACIONALES

AREA DE INSP. AESTABLECIMIENTOS DEELABORACIN DE

ALIMENTOS Y BEBIDAS

AREA DE INSPECCI N A

ESTABLECIMIENTOS DE

SERVICIOS


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1.3.2. Organigrama estructural de la direccin de ecologa, proteccin

del ambiente y salud ocupacional:

DIRECCION DE ECOLOG A, PROTECCI N DELAMBIENTE Y SALUD OCUPACIONAL

VIGILANCIA DERECURSOSHIDRICOS

VIGILANCIA DE

VERTIMIENTOS

VIGILANCIA DEZONAS

COSTERAS

VIGILANCIA YCONTROL DE LA

CALIDAD DEL AIRE

CONTROL YCONTAMINACION

ATMOSFERICA

CONTAMINACION PORRUIDO

VIGILANCIA DEEMFERMEDADESCAUSADAS POR

CONTAMINACIONATMOSFERICA

VIGILANCIA YCONTROL DE

RESIDUOS

PELIGROSOS

VIGILANCIA YCONTROL DE

CEMENTERIOS

VIGILANCIA YDESARROLLO

SOSTENIBLE DE LABIODIVERSIDAD

VIGILANCIA YCONTROL DE LASEXPORTACIONES /IMPORTACIONES

TRANSFRONTERISOS

VIGILANCIA YCONTROL DESUSTANCIASPELIGROSAS

PROGRAMA DEVIGILANCIA YCONTROL EN

SALUD, HIGIENE

PROGRAMA DEVIGILANCIA EN

PREVENCIN DEENFERMEDADES

Y ACCIONOCUPACIONAL

AREA DE PROTECCIONDE RECURSOS

HDRICOS Y DE AGUASCOSTERA

AREA DE PREVENCI N YCONTROL DE LACONTAMINACION

AREA DE PROTECCI NDE PREVENCIN. DE

RECURSOS.NATURALES, FLORA Y

FAUNA

AREA

SALUD OCUPACIONAL


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1.3.3. Organigrama estructural de la direccin de sanidad area

martima y fronteras

DIRECCCI N DE SANIDAD A REAMARTIMA Y FRONTERAS

AREA DETERRESTRE

AREA DEPUERTOS

AREA DE AEROPUERTOS

PUERTO ARICA

PUERTO GRAU

SANTA ROSA

ZOFRA - TACNA

PALCA

TOMASIRI

ESTIQUE

FERROCARRIL

ADMINISTRACIN


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1.3.4. Laboratorio de salud ambiental:

El laboratorio de salud Ambiental brinda soporte analtico a los

equipos de trabajo del DESA , en la ejecucin de las acciones de vigilancia y

control en salud ambiental, mediante el diagnstico de la calidad sanitaria del

agua ( mar , piscinas , potable, residuales, cuencas ) , alimentos , superficiesen contacto con los alimentos ( superficies vivas e inertes ) identificando y

cuantificando los contaminantes biolgicos contribuyendo de este modo a la

adecuada y oportuna toma de decisiones, especialmente en casos de

contingencia y alertas sanitarias. Es en este contexto el laboratorio viene

consolidando la implementacin de un sistema de gestin de la calidad de

acuerdo a la Norma NTP ISO/IEC 17025:2006 con el fin de buscar el

reconocimiento de su competencia. La direccin ejecutiva de salud ambiental

pertenece a la direccin de salud Tacna.

A. Objetivo:

Brindar resultados analticos confiables y eficaces en apoyo alos diferentes programas sanitarios ambientales de la direccin

ejecutiva de salud ambiental.


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B. Funciones:

Brindar soporte analtico cualitativo y cuantitativo mediante

ensayos biolgicos de contaminantes relacionados a las

actividades de identificacin, vigilancia y control de riesgos

ambientales para la salud.

Implementar el sistema de gestin de la calidad

Brindar soporte analtico a solicitud de parte en los ensayos de

su competencia.

Planificar, organizar y monitorear las actividades para

implementar y mejorar el sistema de gestin de la calidad del

laboratorio de salud ambiental.

Implementar el sistema de gestin de la calidad del laboratorio

en base a la poltica y objetivos del laboratorio.

Mantener actualizada la documentacin del sistema de gestin

de la calidad.


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Mantener interaccin permanente con los usuarios del

laboratorio con relacin a los mtodos caractersticos

resultados de los ensayos.

Realizar los ensayos microbiolgicos en muestras de aguas,

alimentos y superficies en contacto con alimentos aplicando

los criterios de calidad para garantizar la confiabilidad de los

resultados de los ensayos que constituyen el soporte tcnico

de las acciones de control y vigilancia en aspectos higiene.

Implementar mtodos de anlisis de acuerdo a las

necesidades de la DESA y en cumplimiento con la normativo

vigente actualmente se viene fortaleciendo el anlisis de

microorganismos patgenos como Salmonel la, E col i y S.

ureus.


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El laboratorio est dividido en 5 reas:

1.3.5. rea de recepcin de muestras:

rea destinada a recepcionar las muestras que ingresan de las

diferentes localidades de Tacna; para su respectivo anlisis microbiolgico,

abarcando muestras derivadas de acciones de vigilancia, control,

fiscalizacin sanitaria, denuncias entre otros.

LABORATORIO DE SALUDAMBIENTAL

rea de recepcin demuestras

rea deesterilizacin y

lavado

rea de preparacin demedios de cultivo

rea de anlisis Microbiolgico

rea de almacn


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Esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado

recepcin de muestras para anlisis microbiolgicos, el cual establece las

condiciones y requisitos de recepcin, que aseguran la representatividad y

caractersticas necesarias que deben reunir las muestras para ser

analizadas, y nos menciona lo siguiente:

Finalidad:

Contribuir a asegurar la confiabilidad y reproductibilidad de los

resultados de los anlisis de agua que se efectuaran en el laboratorio de

Salud ambiental de la direccin ejecutiva de salud ambientalDESA.

Procedimiento de Aplicacin:

Las principales caractersticas para recepcionar las muestras de agua

y alimentos son:

Frascos de vidrio estriles, conteniendo un mnimo de 250 o 500

ml de muestra de agua segn sea el caso. Para muestras dealimentos las bolsas de plstico, estriles deben tener una

capacidad adecuada para que la cantidad de muestra a recolectar

pueda sellarse firmemente tras su llenado.


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Para el caso de superficies vivas los frascos deben contener 100

ml solucin diluyente.

Para el caso de superficies inertes los tubos de ensayo deben

contener 10 ml de agua peptonada tamponada al 0,1 %, con sus

respectivos hisopos estriles.

Deben estar claramente rotulados (cdigo de campo).

El transporte de las muestras debe realizarse en recipientes

refrigerados (coolers) para que el material recolectado se conserve

por debajo de los 10 C.

El tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta la llegada

al laboratorio; para el caso de muestras de agua tratada,

superficies vivas e inertes, no debe pasar ms de 24 horas

mientras que para muestras de alimentos, agua de mar, aguas

residuales, aguas naturales, no debe exceder de ms 6 horas.

Deben presentar la respectiva cadena de custodia (previamente

llenada).


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La cadena de custodia refleja en los documentos en donde se

registra toda la informacin relevante para asegurar la integridad

de la muestra desde la recoleccin hasta el reporte de resultados

por parte del laboratorio. La importancia de contar con este

documento radica en prevenir la falsificacin y/o alteracin de los

datos de campo, as como para definir la cantidad y tipos de

anlisis requeridos, el tipo de pre tratamiento al que ha sido

sometido, la fecha y hora de muestreo, el numero de frascos

remitidos por punto de muestreo, la fecha y hora de remisin, la

identificacin del responsable del muestreo y todo lo relacionado

con la recepcin por parte del laboratorio; para luego asignarle acada una de las muestras un cdigo de laboratorio y

posteriormente ser procesadas en el rea de anlisis

microbiolgico.

Toda la informacin es recopilada a travs de las cadenas de

custodia las cuales son transferidas a la base de datos que seencuentra en el rea de recepcin de muestras para fines

institucionales.


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1.3.6. rea de almacn:

Debido a la demanda que tiene el laboratorio de salud ambiental, es

necesario que tengan un almacn el cual debe abastecer las necesidades

que esta requiera, para su normal funcionamiento y por ende brindar los

anlisis respectivos.

Es un rea destinada a guardar stock de los materiales e insumos

necesarios para el funcionamiento del laboratorio.

Esta rea tambin cuenta con una base informativa que controla el

ingreso y salida de los diferentes materiales de uso comn en un laboratorio.

1.3.7. rea de lavado, control y esterilizacin de materiales:

rea destinada al lavado, preparacin y esterilizacin del material

necesario para el anlisis microbiolgico; para lo cual se requiere uso de

material de vidrio, equipos de esterilizacin a calor hmedo y seco, etc.

Esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado lavado

de material de cristalera y esterilizacin el cual proporciona las siguientes

instrucciones:


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Finalidad:

Reunir todas las condiciones necesarias y de seguridad para poder

realizar actividades de preparacin y esterilizacin de materiales.

Procedimiento de aplicacin:

Descontaminar todo material de vidrio proveniente de incubacin,

antes de someter al proceso de lavado en autoclave por 30

minutos a 121C y a 15 libras de presin.

Sumergir en solucin de Tegol al 0,5 % o solucin desinfectante

de hipoclorito de sodio, todo material utilizado durante ensayos

microbiolgicos antes del lavado.

Utilizar una solucin de detergente neutro (alconox) y dejar

inmerso el material durante 1 hora a temperatura ambiente.

Para esterilizacin a calor seco, colocar el material de vidrio e

instrumentos envueltos en papel kraff en el horno durante 3 horas

a 170 C.


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Control del proceso de esterilizacin:

Para el control del proceso de esterilizacin en el horno se coloca una

cinta indicadora de esterilizacin de calor seco por cada lote de material a

esterilizar, el cambio de color en la cinta indicar que el material ha sido

expuesto a temperatura de esterilizacin, de igual manera se utiliza otra cintapara esterilizacin a calor hmedo.

Control de calidad de material de vidrio:

Para comprobar que se ha realizado un buen lavado de material de

vidrio se aade unas gotas de azul de bromotimol al 0.04 % (ABT) y observar

en cambio en el color. En el caso que el ABT virara al color azul indicar

presencia de lcali; al color amarillo indicar presencia de cido y el color

verde corresponder el neutro. Si la reaccin es neutra, el material se

liberara para su uso, caso contrario se repetir el lavado.

Para comprobar que no existen residuos de grasa en el material de

lavado, tomar de manera aleatoria cualquier pieza y dejar escurrir el agua

observando si la pelcula es contina.


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1.3.8. rea de preparacin de medios de cultivo:

rea destinada a la preparacin y al control de todos los medios de

cultivo para los anlisis microbiolgicos.

En esta rea cuenta con su respectivo procedimiento aprobado

preparacin de medios de cultivo y diluyentes el cual nos proporciona las

siguientes instrucciones:

Finalidad:

Llevar a cabo la preparacin, esterilizacin y controles de esterilidad

de los medios de cultivo y diluyentes.


Para la preparacin de medios de cultivo utilizar recipientes que

tengan el doble del volumen que se va a preparar siguiendo las

instrucciones del fabricante para pesar la cantidad exacta del

medio y proceder a disolverla en agua destilada.

Calentar hasta disolver el medio, con cuidado de no sobrecalentar

e inmediatamente distribuirlo en frascos de vidrio o tubos de


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ensayo y esterilizarlo como mximo dentro de las dos horas

siguientes.

Verificar el pH del medio antes y despus de la esterilizacin

utilizando una cinta indicadora y reajustar con soluciones de NaCl

y HCl si es necesario.

Examinar los medios recin preparados para comprobar el color el

oscurecimiento o posible precipitacin. Si los tubos contienen

campanas Durham, manipular cuidosamente para no formar

burbujas de aire.

1.3.9. rea de anlisis microbiolgico:

En esta rea se evala y analiza los parmetros microbiolgicos de

todas las muestras que ingresen al laboratorio de Salud Ambiental.

Funcin:

Realiza ensayos microbiolgicos en muestras de aguas alimentos y

superficies vivas e inertes en contacto con alimentos, aplicando los criterios

de esterilidad para garantizar la confiabilidad de los resultados de los


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ensayos que constituyen el soporte tcnico de las acciones de control y

vigilancia en aspectos de higiene alimentaria y calidad de agua de consumo

humano.

Implementa mtodos de anlisis de acuerdo a las necesidades de la DESA, y

en cumplimiento con la normativa vigente. Actualmente se vienefortaleciendo el anlisis de microorganismos patgenos como Salmonel la,

Escher ichia Col i, Staph ylo co ccu s ureus.


Cada procedimiento cuenta con un protocolo dependiendo de la

muestra que se va a analizar.

1.4. Objetivos de la prctica:

Objetivo general:

1. Adquirir conocimientos prcticos y tericos en los anlisis

microbiolgicos de muestras de aguas, alimentos, superficies

inertes y vivas ingresadas al laboratorio de la Direccin Ejecutiva

de Salud Ambiental.


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Objetivos especficos:

1. Aplicar los mtodos y/o tcnicas microbiolgicas apropiadas para

el anlisis de aguas, establecidas por la DIGESA NTP ISO / IEC

17025: 2006.

2. Determinar la calidad microbiolgica de las muestras de agua

potable (agua de consumo humano), agua natural, aguas de

piscinas y agua de mar mediante la aplicacin de los

procedimientos tcnicos especficos basados en normas

internacionales y establecidas por la DIGESA-DS N 031-2010-

SA.

3. Determinar la calidad microbiolgica de las muestras de alimentos,

superficies vivas e inertes, segn la aplicacin de la norma

sanitaria, Resolucin Ministerial N 461-2007 / MINSA.

4. Aplicar el procedimiento normalizado para el monitoreo ambiental

(calidad microbiolgica del aire y superficies) del rea de anlisis

microbiolgicos basado en la norma ISO / IEC 17025-1999. tem

5.3


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5. Conocer como recepcionar las muestras que lleguen al

laboratorio de la direccin ejecutiva de salud ambiental segn

procedimiento.


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II. FUNDAMENTO TERICO

2.1. Agua:

El agua es uno de los bienes ms importantes y escasos que tienen

las personas alrededor del mundo, nuestro pas no es una excepcin;

muchas de nuestras poblaciones se ven obligados a beber de fuentes cuya

calidad deja mucho que desear y produce un sin fin de enfermedades a nios

y adultos.

El acceso al agua potable es una necesidad primaria y por lo tanto un

derecho humano fundamental, en este contexto con la finalidad de garantizar

su inocuidad, prevenir los factores de riesgos sanitarios, as como proteger y

promover la salud y bienestar de la poblacin el estado elabor el

Reglamento de los requisitos Oficiales Fsicos, Qumicos y Bacteriolgicos

que deben reunir las aguas de bebida para ser consideradas potables en

(1946), luego en el ao 2000, la Direccin General de Salud Ambiental,

asume la tarea de elaborar el Reglamento de la Calidad del Agua para

Consumo Humano, tarea que el 26 de setiembre del 2010, a travs del D.S.

N 031-2010-SA, se vi felizmente culminada.(MINSA,2010)


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2.2. Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano:

La vigilancia sanitaria del agua para consumo humano es una

atribucin de la Autoridad de Salud, que se define y rige como:

1. La sistematizacin de un conjunto de actividades realizadas por la

Autoridad de Salud, para identificar y evaluar factores de riesgo

que se presentan en los sistemas de abastecimiento de agua para

consumo humano, desde la captacin hasta la entrega del

producto al consumidor, con la finalidad de proteger la salud de los

consumidores en cumplimiento de los requisitos normados en este

Reglamento.

2. Un sistema conducido por la Autoridad de Salud, el cual est

conformado por consumidores, proveedores, instituciones de

salud y de supervisin de mbito local, regional y nacional

3. El establecimiento de prioridades y de estrategias para la

prevencin o eliminacin de los factores de riesgo en el

abastecimiento del agua, que la Autoridad de Salud establezca

para el cumplimiento por el proveedor


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Programa de vigilancia:

La DIGESA y las Direcciones de Salud o las Direcciones Regionales

de Salud o las Gerencias Regionales de Salud en todo el pas, administran el

programa de vigilancia sanitaria del abastecimiento del agua, concordante a

sus competencias y con arreglo al presente Reglamento. Las acciones delprograma de vigilancia se organizan de acuerdo a los siguientes criterios:

1. Registro: Identificacin de los proveedores y caracterizacin de los

sistemas de abastecimiento de agua.

2. mbito: Definicin de las zonas de la actividad bsica del

programa de vigilancia, distinguiendo el mbito de residencia:

urbano, peri urbano y rural, a fin de determinar la zona de trabajo

en reas geogrficas homogneas en cuanto a tipo de suministro,

fuente y administracin del sistema de abastecimiento del agua.

3. Autorizacin sanitaria: Permiso que otorga la autoridad de salud

que verifica los procesos de potabilizacin el agua para consumo

humano, garantizando la remocin de sustancias o elementos

contaminantes para la proteccin de la salud.


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4. Monitoreo: Seguimiento y verificacin de parmetros fsicos,

qumicos, microbiolgicos u otros sealados en el presente

Reglamento, y de factores de riesgo en los sistemas de

abastecimiento del agua.

5. Calidad del agua: Determinacin de la calidad del aguasuministrada por el proveedor, de acuerdo a los requisitos fsicos,

qumicos, microbiolgicos y parasitolgicos del agua para

consumo humano establecidos en el presente Reglamento.

6. Desarrollo de indicadores: Procesamiento y anlisis de los

resultados de los monitoreos de la calidad del agua, del sistemade abastecimiento y del impacto en la morbilidad de las

enfermedades de origen o vinculacin al consumo del agua.

2.2.1. Requisitos de calidad del agua para consumo humano:

Parmetros microbiolgicos y otros organismos:

Segn el Artculo 60 de la norma sanitaria del Reglamento de la

Calidad del Agua para Consumo Humano de la DIGESA DS N 031-2010-

SA.


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Toda agua destinada para el consumo humano, como se indica en el

Anexo 1, debe estar exenta de:

1. Bacterias coliformes totales, termotolerantes y Escher ichia col i.

2. Virus.

3. Huevos y larvas de helmintos, quistes y ooquistes de protozoarios

patgenos.

4. Organismos de vida libre, como algas, protozoarios, coppedos,

rotferos y nemtodos en todos sus estadios evolutivos.

5. Para el caso de Bacterias Heterotrficas menos de 500 UFC/ml a

35C.

Parmetros de calidad organolptica: Segn Artculo 61 del

reglamento N 031-2010-SA.

El noventa por ciento (90%) de las muestras tomadas en la red dedistribucin en cada monitoreo establecido en el plan de control,

correspondientes a los parmetros qumicos que afectan la calidad esttica y


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organolptica del agua para consumo humano, no deben exceder las

concentraciones o valores sealados en el (Anexo 2).

Parmetros inorgnicos y orgnicos: Segn Artculo 62 del


Toda agua destinada para el consumo humano, no deber exceder los

lmites mximos permisibles para los parmetros inorgnicos y orgnicos

sealados en el (Anexo 3).

Parmetros de control obligatorio (PCO): Segn Artculo 63 del


Son parmetros de control obligatorio para todos los proveedores de

agua, los siguientes:

Coliformes totales

Coliformes termotolerantes

Color

Turbiedad

Residual de desinfectante

pH


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En caso de resultar positiva la prueba de coliformes termotolerantes, el

proveedor debe realizar el anlisis de bacterias Escher ichia col i, como

prueba confirmativa de la contaminacin fecal.

2.2.2. Aspectos generales de microbiologa de aguas:

Los microorganismos presentes en los diferentes tipos de aguas,

constituyen una gran variedad de gneros y especies que juegan roles

importantes, por ejemplo, en los ciclos biogeoquimicos, transformando los

diferentes componentes orgnicos e inorgnicos, contribuyendo de esta

forma a la transferencia de energa, en presencia de oxigeno; siendo estos

los iniciadores de la cadena trfica en los cuerpos de aguas naturales.(Lazcano, 2000)

As mismo, la accin metablica de los microorganismos, es aplicada

en los sistemas de bioestabilizacin para la transformacin de la materia

orgnica (DBO) presente en aguas de desechos, contribuyendo de esta

forma a descontaminar las fuentes receptoras de aguas y suelos. (Lazcano,2000)


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Cuando las descargas de desages, principalmente domsticos, son

arrojadas a los cuerpos de agua, los microorganismos all presentes

representan un riesgo potencial para la salud de la poblacin usara,

especialmente cuando estas constituyen fuentes de abastecimiento de agua

de bebida, siendo frecuentes las enfermedades hdricas por consumo de

aguas sin tratamiento, o con tratamientos deficientes, especialmente en la

desinfeccin. (Lazcano, 2000)

El grupo coliforme y principalmente la bacteria Escher ichia col i, es el

indicador de mayor importancia en la calidad sanitaria del agua, y los

mtodos de diagnstico para la deteccin cualitativa o cuantitativa de los

indicadores, debe ser realizada por personal entrenado, a fin de obtener

resultados confiables, que permitan tomar decisiones en caso fuera

necesario, a fin de evitar o minimizar los riesgos epidmicos y/o focos

infecciosos puntuales. (ICMFS, 2000)

Los mtodos usados comnmente en el diagnostico microbiolgico de

aguas se basan principalmente en el tipo de aguas que se trate , as las

aguas con turbiedades excesivas (mayores de 20 NTU) o con presencia de

detritos , materia orgnica u otros elementos, deben analizarse por mtodos


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cualitativos, semi-cuantitativos o por el mtodo de tubos mltiples , para

estos exmenes existen medios de cultivo apropiados para diversos

parmetros analticos y los reportes finales se dan en NMP ( numero ms

probable) por 100 ml de muestra.(Lazcano,2000)

Cuando las muestras de agua corresponden a bajas turbiedades , loms recomendable es usar la tcnica de filtracin por membrana , la que

retiene de acuerdo al tamao de poro ( generalmente se usa el de 0,45 m) a

todos los microorganismos presentes y que colocada en la superficie de un

medio de cultivo lquido o slido selectivo para el tipo de microorganismo a

usar , e incubando a una temperatura y tiempo de incubacin adecuado , se

obtienen colonias las que se pueden contar a simple vista o con la ayuda de

un microscopio estereoscpico .Los resultados se reportan siempre como

UFC (unidades formadoras de colonias) por unidad de

volumen.(Lazcano,2000)

Organismos patgenos:

Representados por virus como los de la hepatitis, poliomelitis, etc

bacterias como el Vibr io cho lerae, Salmonella, Shigel la, Escher ichia col i

enterotoxignico y enteropatognico, Yersinia enterocol i t ica, etc los que


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son eliminados fcilmente con la adicin de cloro quistes de protozoarios

como Giardia intestinal is y Cryptospor id ium parvum los que son

altamente resistentes a la accin de cloro, por lo que su eliminacin debe

realizarse en los procesos de coagulacin y filtracin.

Indicadores de contaminacin fecal:

El concepto del indicador, se ha usado hace mucho tiempo para definir

a un microorganismo o procedimiento que seale el grado de contaminacin

fecal de una fuente y su riesgo potencial en la salud pblica.

Un indicador debe cumplir con los siguientes requisitos:

Debe ser aplicable a todos los tipos de aguas.

Si es un microorganismo, debe estar presente en mayor nmero

que el o los patgenos.

No debe incrementar significativamente en ausencia del patgeno.

La metodologa para el anlisis debe ser rpida y poco costosa.


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Principales indicadores de contaminacin fecal e indicadores

alternativos:

Coliformes totales

Coliformes termotolerantes

Escher ichia col i

Enterococcu s faecalis

Bacterias hetertrofas

Clostr idium perfr ingens

Klebsiel la pneumon iae

Aeromonas sp.

Pseudom onas aeruginosa

2.3. Alimentos:

Alimento es cualquier sustancia natural o sinttica que contenga uno o

varios de los principios que la qumica a catalogado como hidratos de

carbono, grasas, protenas, vitaminas y sales orgnicas. Se define como

alimento a cualquier sustancia que introducida en la sangre, nutre, repara el

desgaste y da energa y calor al organismo, sin perjudicarlo ni provocarle

prdida de su actividad funcional.


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Los alimentos son ecosistemas complejos, los ecosistemas estn

constituidos por el medio ambiente y por los organismos que viven all. El

ambiente de un alimento est compuesto por factores intrnsecos inherentes

al alimento y factores extrnsecos que son externos a l .Se pueden

manipular todos estos factores intrnsecos y extrnsecos para conservar el

alimento, y de este modo puede considerarse la conservacin de alimentos

como la ecologa de crecimiento cero. (Michael P. Doyle, 1997)

Las interacciones mutuas entre los microorganismos por una parte y

las plantas y los animales por otra, son naturales y constantes .Como quiera

que los alimentos que consume el hombre procedan bsicamente de las

plantas y de los animales o de productos derivados de los mismos, resulta

comprensible que dichos alimentos puedan contener microorganismos que

interaccionen con ellos.

En la mayora de casos los microorganismos utilizan nuestros

alimentos como fuente de nutrientes para su propio crecimiento, hecho que,

naturalmente, puede ocasionar su alteracin. Los microorganismos pueden

echar a perder un alimento porque se multiplican en l, porque utilizan

nutrientes, porque producen modificaciones enzimticas y porque le


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comunican sabores desagradables mediante el desdoblamiento de

determinadas sustancias o mediante la sntesis de nuevos compuestos.

(Doyle, 2003)

Adems de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de

contaminacin durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, faunanociva, o por contaminacin cruzada; algunos de los microorganismos

contaminantes pueden ser patgenos y en tal caso, su desarrollo e incluso

su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de

normas de higiene y seguridad, hasta la aparicin de enfermedades

transmitidas por alimentos (ETAs).(Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico

de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico)

En el Per, las enfermedades transmitidas por Alimentos (ETAs)

representan un gran problema en la salud pblica, en especial los grupos

vulnerables (nios y adultos). Desde el ao 1998 se reportaron una serie de

brotes de ETAs en diferentes zonas del Pas, aislndose Salmon ella sp, por

el consumo de mayonesa casera y salsa de rocotos preparados

artesanalmente, en restaurantes tursticos y puestos de venta ambulatoria.

(MINSA)


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2.3.1. Normativa sanitaria de alimentos:

La LEY DE INOCUIDAD DE LOSALIMENTOS Decreto Legislativo N

1062 El Peruano, 28 de junio de 2008 (Ley) 03 de julio de 2008 (Fe de

erratas)

Se cre con la finalidad de establecer el rgimen jurdico aplicable

para garantizar la inocuidad de los alimentos destinados al consumo humano

con el propsito de:

Proteger la vida y la salud de las personas

Reconocer y asegurar los derechos de los consumidores

Promover la competitividad de los agentes econmicos

2.3.2. Aspectos microbiolgicos:

La presencia de microorganismos en los alimentos no significa

necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos

productos. En realidad, si se excepta el reducido nmero de productos

esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, mohos,

bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se

convierten para el consumidor solo despus de que han sido violados los


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principios de higiene, limpieza y desinfeccin. Si los alimentos han estado

sometidos a condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los

mismos y/o la multiplicacin de agentes infecciosos toxignicos, pueden

constituirse en vehculo de transmisin de enfermedades tales como la

salmonelosis o la intoxicacin estafiloccica. (ICMFS, 2000)

El examen microbiolgico rutinario de los alimentos para detectar en ellos

toda una serie numerosa de microorganismos patgenos y de sus toxinas no

es practicable en la mayora de laboratorios .Sin embargo, es imperativo

realizar los anlisis microbiolgicos de rutina correspondientes siempre que

la informacin epidemiolgica o de otro tipo de que se disponga sugiera o

haga pensar en la presencia de un agente patgeno especifico en un

determinado alimento.

Para ellos se utilizan un grupo de microorganismos cuya enumeracin

o recuento se realiza con mayor facilidad y cuya presencia en los alimentos

indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieran

haber introducido organismos peligrosos y/o permitido la multiplicacin de

especies infecciosas o toxignicas. Los grupos o especies utilizadas con

estos fines se denominan microorganismos indicadores y sirven para evaluar


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tanto la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y

sus toxinas, como su calidad microbiolgica.(ICMSF,2Edicion)

Los exmenes microbiolgicos realizados a los microorganismos

indicadores son:

Recuento en placa de bacterias

Bacterias entricas indicadoras

Salmonellas

Shigelas

Escher ichia col i

Vibr io parahemol i t icus

Vibr io cholerae

Staphylococ cus aureus

Clost rid ium botu l inumy Clostr idium perfr ingens

Baci l lus cereus

Estreptococos


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2.3.3. Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos:

El anlisis de superficies vivas e inertes se realizaran en el

establecimiento donde se procesan, elaboran, almacenan, fraccionan o

expenden alimentos y bebidas, sea fbrica, almacn, servicios de alimentos,

quiosco, puesto, comedor, u otro.

Comprende las siguientes operaciones consecutivas, realizadas por

personal capacitado en la materia:

1. Procedimiento para la seleccin de la muestra.

2. Seleccin del mtodo de muestreo.

3. Procedimiento para la toma de muestra.

Procedimiento para la seleccin de la muestra:

El procedimiento para seleccionar las muestras, debe estar en

funcin de los riesgos sanitarios relacionados a las diferentes

etapas de la cadena alimentaria, sea de la fabricacin, de laelaboracin y/o expendio.


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En fbricas de alimentos y bebidas:

Superficies inertes: Se seleccionarn aquellas que estn o

tendrn contacto directo con los alimentos que no sern sometidos

a un proceso trmico posterior u otro que disminuya la carga

microbiana.

Superficies vivas: Se seleccionarn a los manipuladores de

alimentos, con o sin guantes, que estn en contacto directo con

los alimentos que no sern sometidos a un proceso trmico

posterior u otro tratamiento que disminuya la carga microbiana.

En establecimientos de elaboracin y expendio:

Superficies inertes: Se seleccionarn aquellas superficies que

estn en contacto con los alimentos destinados al consumo

directo, como utensilios, vajilla, superficies de corte, menaje,

equipos, entre otros.

Superficies vivas: Se seleccionarn las manos de los

manipuladores, con o sin guantes, que estn en contacto con los

alimentos destinados al consumo directo.


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Seleccin del mtodo de muestreo:

La seleccin del mtodo de muestreo debe estar en funcin de las

caractersticas de la superficie a muestrear.

METODO DE

MUESTREO

SUPERFICIES A MUESTREAR

Mtodo del hisopo

Se utiliza para superficies inertes regulares e

irregulares, tales como tabla de picar, bandejas,

mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos,

cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde,

fajas transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos,

paredes y otros.

Mtodo de laesponja

El mtodo de la esponja se utiliza preferentementepara muestrear superficies de mayor rea.

Mtodo del

enjuague

Se utiliza para superficies vivas (manos) y para

objetos pequeos o para el muestreo de superficies

interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc.


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Procedimiento para la toma de muestra:

Mtodo del hisopo:

Consiste en frotar con un hisopo estril previamente humedecido

en una solucin diluyente, el rea determinada en el muestreo.

Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras se

colocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual

se distribuir uniformemente en la base y en los laterales, de tal

manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea

mayor de 10C, a fin de asegurar la vida til de la muestra hasta

su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de

muestra y la recepcin en el laboratorio estar en funcin estricta

de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y

excepcionalmente las 36 horas.

Se debe registrar la temperatura del contenedor al colocar las

muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las

mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada.


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Temperaturas superiores a 10C invalidan la muestra para su

anlisis.

Mtodo de la esponja:

Consiste en frotar con una esponja estril, previamente

humedecida en una solucin diluyente, el rea determinada en el

muestreo.

Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras se

colocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual








Se deber registrar la temperatura del contenedor al colocar las



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anlisis.

Mtodo del enjuague:

Dependiendo de la muestra, el mtodo consiste en realizar un

enjuague (botellas, frascos, similares) o inmersin (manos, objetos

pequeos) en una solucin diluyente.

Para recipientes (frascos, jarras, otros): Para esto:

a. Vaciar en el recipiente a muestrear una parte de la solucinestril (frasco con 100 mL) y agitar vigorosamente.

b. Regresar la solucin a su frasco original.

c. Cerrar hermticamente el frasco para su traslado.

Para objetos pequeos (piezas de equipos, otros): Se

introduce individualmente cada objeto en el frasco o bolsa con lasolucin estril y agitar vigorosamente.


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1. Con una pinza estril, retirar el objeto pequeo del frasco o

bolsa.

2. Si se muestrea ms de un objeto pequeo de igual naturaleza,

se debe considerar esto en el clculo de resultados.

Conservacin y Transporte de la muestra: Las muestras secolocarn en un contenedor isotrmico con gel refrigerante, el cual








Se deber registrar la temperatura del contenedor al colocar las




anlisis.


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III. MATERIAL Y MTODO

El laboratorio de Salud ambiental de la Direccin Ejecutiva de Salud

Ambiental consta de 4 reas en las cuales en cada una de ellas se emplear

un material y mtodos distintos para lograr los fines especficos de dichas

reas.

3.1. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivos y diluyentes:

Objetivo:

Indicar la metodologa llevada a cabo para la preparacin

esterilizacin y controles de esterilidad de los medios de cultivos ydiluyentes.

Materiales:

Probetas.

Material de vidrio, tubos de ensayo, frascos de vidrio de

Borosilicato.


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Otros materiales, balones, matraces, vasos de precipitacin,

esptulas.

Equipos:

Balanza, con capacidad de 2Kg exactitud 0,01 g

Autoclave

pH metro , con exactitud de 0,1 unidades de pH

Refrigeradora de laboratorio

Agitador

Horno

Bao Mara

Pesado:

1. Para la preparacin de los medios de cultivo y diluyentes se utiliz

nicamente agua destilada o desmineralizada con una calidad

microbiolgica adecuada, se midi los volmenes de agua a

utilizar con probetas graduadas.


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2. Se prepar los medios de cultivo en recipientes que tenan al

menos el doble de volumen del medio que se iba a preparar, para

esto se utiliz materiales de vidrio bien lavados y enjuagados.

3. Se prepar los medios de cultivo y reactivos siguiendo las

instrucciones del medio.

4. Posteriormente se procedi a pesar la cantidad necesaria del

medio deshidratado, luego se cerr el frasco del medio de cultivo.

5. El pesado de medios de cultivo que no se sometieron a

esterilizacin como el Agar XDL se realiz en condiciones de

esterilidad (haciendo uso de agua destilada y frascos previamente

esterilizados).

Disolucin y medicin de pH:

1. Se disolvi la porcin pesada de acuerdo a lo requerido, para esto

se tuvo cuidado de no sobrecalentar, para lo cual se utiliz una lacocina elctrica.


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2. Tras rehidratar el medio, se distribuy en los frascos y se esteriliz

como mximo dentro de las dos horas siguientes.

3. Se verific el pH de cada medio (segn el instructivo de medicin

de pH).

4. El personal responsable de la preparacin de medios de cultivo

registro en el formato de Preparacin de medios de cultivo y

diluyentes (F01-AM-IT-05)

5. Se esteriliz los medios de cultivo y diluyentes al tiempo y la

temperatura indicada.

6. Luego se retir los medios esterilizados de la autoclave tan pronto

cuando la presin de la cmara lleg a cero.

Verificacin de la esterilizacin de medios de cultivo preparados:

1. Se examinaron los medios de cultivo recin preparados para

comprobar el color, el oscurecimiento o posible precipitacin.

2. Se examinaron los tubos recin preparados para determinar la

existencia o no de burbujas de gas.


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3. Posteriormente se realiz la verificacin de calidad de cada lote de

medio de cultivo o diluyente preparado incubando a la temperatura

y tiempo correspondiente a las condiciones usadas durante el

ensayo.

4. El personal responsable registr los datos necesarios en el

formato de preparacin de medios de cultivo y diluyentes.

Mantenimiento de los medios de cultivo preparados:

1. Se mantuvo los medios de cultivo a temperaturas de refrigeracin

de 4 a 8 C y en tiempos indicados en anexo 4 .Se tom las

precauciones de preparar cantidades de medio de cultivo que se

vayan a utilizar dentro de los lmites de tiempo indicados.

2. Los tubos o frascos con medios de cultivo se guardaron a una

temperatura alrededor de 25 C durante no ms de una semana

para que la evaporacin no sea rpida y dar lugar a alteraciones

importantes de la concentracin de los ingredientes.

3. El personal responsable se encargo de colocar una etiqueta en los

medios de cultivo preparados indicando la fecha de preparacin.


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Utilizacin de medios de cultivo:

1. Para esto se fundi los agares solidificados. Se mantuvo fundidos

los agares en bao Mara de 44 a 46 C hasta el momento de

usarlos nunca por un perodo superior a 3 horas.

2. Se temper los tubos y frascos con medio lquido que hayan

estado guardado a bajas temperaturas, mantenindolos a

temperatura ambiente por un lapso de media hora o por un

perodo aproximado de 15 minutos a 44-46C.

3.2. Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos

aguas y superficies vivas para anlisis microbiolgicos:

Objetivo:

Describir el procedimiento para la preparacin de las muestras y de

las diluciones decimales para el anlisis microbiolgico de muestras

de alimentos de acuerdo a lo indicado en la norma ISO 6887-1: 1999


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Resumen:

Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una

distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes

en la porcin de prueba.

Diluyentes:

Agua de peptona buferada.

Solucin diluyente

Equipos y materiales:

Balanzas, con una sensibilidad de 0,01 g

PH- metro, exactitud 0.1 unidad de pH a 25 C.

Homogenizador tipo Vrtex

Refrigeradora

Frascos de dilucin, capacidad de 100 ml autoclavables.

Pipetas graduadas de capacidad de 1 y 10 ml, graduado en

divisiones de 0,1 y 0,5 ml respectivamente.

Tubos con tapa rosca de 16 x 160 mm de dimetro.

Probetas, matraces, esptulas.


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Material de diverso como alcohol 70%, algodn, plumn indeleble.

Preparacin de las muestras:

Se manipul las muestras de tal manera que se trat de evitar todo

riesgo de contaminacin, para ello se tom las siguientes

precauciones:

1. Como no se trabaj en una cabina de bioseguridad, se hizo

siempre cerca de la flama del mechero.

2. Se limpi la superficie del envase de la muestra que ser abierta

con etanol al 70 %.

3. Todos los instrumentos utilizados para tomar la muestra (plantillas,

frascos, pipetas, tubos de ensayo, etc.) que se proporcionaron a

los muestreadores fueron estriles.

4. Se marc cuidadosamente el cdigo de laboratorio de la muestra,

en el frasco recipiente que sern utilizados para analizar las

muestras.


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Preparacin de la suspensin inicial (primera dilucin):

1. Se pes en un recipiente estril, previamente tarado, 10 g o 10 ml

de la muestra; se adiciono 90 ml del diluyente.

2. Para evitar daar los microorganismos, por un cambio de

temperatura, la temperatura del diluyente durante el anlisis fue

aproximadamente el mismo de la temperatura ambiente.

3. Se homogeniz la muestra, con el homogenizador tipo Vrtex.

Preparacin de las diluciones adicionales:

1. Se transfiri, por medio de una pipeta, 1 ml de la suspensin inicial

(primera dilucin) a un tubo conteniendo 9 ml de diluyente estril a

la temperatura apropiada.

2. Se mezcl cuidadosamente con un homogenizador durante 5 a 10

segundos, para obtener la dilucin 10-2.

3. Se repiti esta operacin tomando 1ml de la dilucin 10-2. Luego

se utiliz una pipeta estril diferente para cada una de las

diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc. Hasta que se obtuvo el nmero

apropiado de microorganismos.


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3.3. Procedimiento de recuento de bacterias heterotrficas:

Objetivo:

Describir el mtodo de ensayo para calcular el nmero de bacterias

vivas hetertrofas en muestras de agua de acuerdo a lo indicado en el

Estndar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th

edition 9215 B.

Resumen:

El recuento de bacterias heterotrficas en placa, anteriormente

denominado recuento estndar en placa, consiste en agregar unmililitro de muestra o de la dilucin de la muestra a una placa Petri

estril, por duplicado y verter un volumen adecuado de Agar Plate

Count; el cual debe de estar a una temperatura de 45 C a 46C,

luego se realiza la homogenizacin, se deja solidificar e incubar a 35

C por 48 horas .El conteo de las colonias se expresa como UFC/ml.

Materiales:

Agar PlateCount (Agar para Recuento en Placa)


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Composicin:

Peptona de casena 5.0 g

Extracto de levadura 2,5 g

Glucosa 1,0 g

Agar 15,0 gAgua destilada 1L

Se disolvi el medio deshidratado luego se calent hasta su completa

disolucin en forma frecuente, evitando que hierva. Posteriormente se

reparti en frascos, luego se cerr y esteriliz en autoclave durante 15

minutos a 15 lbs de presin y 121 C, el pH final fue de 7,2 0.2 a25C.

Agua de dilucin (solucin tampn de fosfato):

Para preparar el agua de dilucin de tampn de fosfato, se necesit la

preparacin de soluciones Stock A Y B.

Solucin Stock A:Se disolvi 34g de fosfato mono potsico (fosfato

di hidrogeno de potasio) KH2PO4 en 500ml de agua destilada luego

ajustamos el PH a 7,2 con hidrxido de sodio (NaOH) al 1N y se


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complet al volumen a un litro con agua destilada. Posteriormente

autoclavamos por 15 minutos a 121C.

Solucin stock B:Disolvimos 81,1g de cloruro de magnesio (MgCl2

6H2O) en un litro de agua destilada. Se autoclav por 15 minutos a

121C.

Se agreg 1,25mL de la dilucin Stock A y 5 ml de la solucin Stock B

a un litro de agua destilada .Distribuimos en frascos en cantidades

adecuadas 9 0,2 ml o 90 2ml y se autoclav por 15 minutos a 121

C.

Equipos y Materiales:

Incubadora de aire caliente a 35 C 0,5 C.

Frascos con agua de dilucin, con una capacidad de 100 ml

autoclavables.

Pipetas de 10 ml

Placas Petri de vidrio 100 x 15 mm esterilizable.


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Diluciones de muestra:

1. Las diluciones se realizaron de forma que el nmero de colonias

en una placa sea 30 a 300 colonias .Por ejemplo si se sospecha

que el recuento de hetertrofos en placa alcanzara 3000 se

prepararn placas con diluciones 10-2

.

2. Para realizar diluciones, se utiliz una pipeta estril, la cul se

cambio para cada dilucin que se prepar, en algunos casos que

hubo contaminacin se sustituy por otra esterilizada.

Plaqueo:

1. Se licu el Agar Plate Count con mucho cuidado evitando que

hierva, se mantuvo el medio lquido en un bao de agua entre 44 y

46C hasta que lleg el momento de usarlo.

2. Se Limit el nmero de muestras a ser plaqueadas a una serie,

de manera que no transcurran ms de 20 minutos(preferiblemente 10 minutos) entre la dilucin de la primera

muestra y adicin del medio a ltima placa de la serie.


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3. Se verti de 15 a 20 ml del medio licuado mantenido de 44 a 46 C

en cada placa Petri levantando suavemente la tapa de la placa lo

suficiente para agregar el agar.

4. Se evit el vertido del medio fuera del envase o en el borde de la

placa, cuando se verti el agar de frascos o tubos que han sidomantenidos en agua, se sec con un papel toalla y se flameo el

cuello del frasco antes de verter el agar. Una vez aadido el medio

a todas las placas, se mezcl cuidadosamente el medio lquido

con la porcin de muestra previamente colocada en la placa con

cuidado de no proyectar la mezcla contra el borde, girando

primero la placa y en una direccin y despus en direccin

opuesta, o haciendo girar la placa en forma de ocho varias veces.

Se dej solidificar la placa durante 10 minutos e invirtindose y se

coloc en la incubadora.

5. Con los controles, se comprob la esterilidad del medio y de los

blancos de agua de dilucin preparando con ellos placas fluidas

en cada serie de muestras .Se prepararon controles adicionales

para determinar la contaminacin de las placas y del ambiente.


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Incubacin:

Se incub a 35 C x 48 horas.

Recuento de colonias:

1. Inmediatamente despus de la incubacin, se procedi a contartodas las colonias de las placas seleccionadas.

2. Consideramos solo las placas que tuvieron entre 30 y 300

colonias, aunque hubo casos en que el exceso de

microorganismos sobrepasaban estos valores y se tuvieron que

adecuar para el clculo del recuento bacteriano por mililitro,multiplicando el nmero promedio de colonias de las dos placas

seleccionadas perteneciente a la misma dilucin por el inverso de

la dilucin utilizada reportar UFC/ ml.

3. En casos en que ninguna de las placas de una muestra se obtuvo

colonias, se report como un recuento inferior.

4. Cuando aparecieron colonias expansivas en la placa, se tom por

criterio como una colonia cuando hubo: cadenas de colonias que


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3.4. Procedimiento de Monitoreo Ambiental:

Tiempo y temperatura de incubacin:

Las placas conteniendo el PCA fueron expuestas durante 15 min

luego se cerraron e incubaron a 35C por 48 horas, para

mesfilos.

Para el caso de mohos y levaduras utilizamos placas con Agar

Sabourand, exponindolas por un tiempo de 15 min, de igual

forma se cerraron e incubaron a 22 C por 5 das.

Frecuencia de realizacin de los controles:Semanal.

rea a monitorear para la toma de muestras:

Sala de microbiologa: mesa 1, mesa 2 y mesa 3.

Lmite de tolerancia:

1. Para una exposicin durante 15 minutos de las placas se permitir

hasta 15 colonias.


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2. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de

colonias (ufc) por placa.

Acciones correctivas a ejecutar en caso de sobrepasarse el lmite

de tolerancia:

En algunos casos en que se sobrepasaron del lmite se tom medidas

correctivas limpiando y desinfectando dichas reas con el personal

encargado, cerrando las ventanas en algunas ocasiones para evitar

ms contaminacin y una verificacin hasta que el lmite de tolerancia

se cumpla.

3.5. Procedimiento de anlisis para la deteccin de Salmonel la spp:

La deteccin de Salmonella, requiri de 5 etapas sucesivas:

a. Enriquecimiento no selectivo.

b. Enriquecimiento selectivo.

c. Siembra en placa de medios slidos selectivos y diferenciales.d. Estudio de las caractersticas bioqumicas de las colonias

sospechosas, en los medios adecuados.


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Los pasos a) hasta c) se refirieron al aislamiento, y el d) a la

identificacin. El paso a) tiene como fin la revitalizacin de las

Salmonelas daadas por las diferentes condiciones de tratamientos

industriales o de almacenamiento. El paso b) es de enriquecimiento

selectivo y sirvi para favorecer el crecimiento de las salmonellas en

un ambiente que puede contener gran nmero de bacterias diferentes

de ellas mismas. El paso c) permiti la visualizacin de las colonias

sospechosas, por su aspecto caracterstico. El paso d) se refiri a la

identificacin bioqumica.

Medios de Cultivo, reactivos y suero:

Medio de pre-enriquecimiento no-selectivo: agua peptonada

tamponada.

Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport-Vassiliadis

con soya (Caldo RVS).

Segundo medio de enriquecimiento selectivo: Caldo Muller-

Kauffmann tetrationato con novobiocina (Caldo MKTTn), en


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nuestro caso no contamos con este caldo pero trabajamos con el

Caldo Selenito Cistina (CSC).

Medio slido selectivo:

Primer medio: Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Agar XLD).

Segundo medio: Agar Verde Brillante Rojo de Fenol Lactosa

segn Kauffmann

Medios y reactivos para las pruebas bioqumicas:

Agar Nutritivo.

Agar Hierro Tres Azcares azucares (agar TSI).

Agar rea (Christensen).

Medio L-Lysina Descarboxilasa.

Reactivo para Voges Proskauer (Reactivo VP).

Reactivos para la Reaccin de Indol (Reactivo de Kovack).

Agar Nutritivo semi-slido.

Solucin salina


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Pre-enriquecimiento no-selectivo:

Se incub la suspensin inicial a 37 C 1C, por 18 horas.

Enriquecimiento Selectivo:

1. De la suspensin inicial obtenida, se transfiri 0, 1 ml a un tuboque contena 10mL de caldo Rappaport Vassiliadis (RV) y 1 ml a

un tubo conteniendo 10 mL del Caldo Selenito Cistina.

2. Se incub el caldo Rappaport Vassiliadis (RV) a 41.5 C 1C

por 24h 3h y el caldo Selenito Cistina a 37 C 1C por 24h

3h. Se tuvo que tener cuidado de la temperatura mxima deincubacin permitida, no debi exceder de 42,5C.

Plaqueado e identificacin:

1. Del cultivo obtenido del medio RV, luego de la incubacin por 24h,

se inocul por medio de un asa, en la superficie de una placa Petri

conteniendo el primer medio selectivo (agar XLD) de manera que

se pudo obtener las colonias.


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2. Se procedi de la misma manera con el segundo medio selectivo

usando un asa de siembra y placa Petri.

3. Del cultivo obtenido en el caldo Selenito Cistina, se repiti el

procedimiento.

4. Se invirtieron las placas obtenidas y se incubaron a 37C para el

primer medio selectivo. Se siguieron las instrucciones del medio

para el segundo medio selectivo.

5. Despus de la incubacin por 24h se examin las placas y se

observaron la presencia de colonias tpicas de Salmonel la y

colonias atpicas qu podran ser Salmonella .Se marc su

posicin en la base de la placa.

6. Segn la bibliografa del procedimiento nos menciona las colonias

tpicas de Salmonella.

7. Las colonias tpicas de Salmonella en agar XLD tienen un centronegro y una zona ligeramente transparente debido al cambio de

color del indicador.


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cultivo sin inocular. Un segundo control negativo, control

del cultivo, para demostrar la aparicin de flora

competitiva en varios medios o mostrar que esta no

Salmonella no crecer en los medios selectivos usados

para el anlisis. Este control se prepar inoculando el

medio inicial con una cepa no Salmonellay se sigui el

mismo procedimiento que para las muestras de prueba.

3. Las placas de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) se

prepararon un da anterior al aislamiento ya que las

placas recin preparadas pueden inhibir el crecimiento

de Salmonella. Las placas se almacenaron de 4 a 5C y

se mantuvieron a temperatura ambiente antes de su uso

para evitar la condensacin de humedad en la superficie.

4. Se pic ligeramente el centro de una colonia sospechosa

en la placa de agar selectivo para evitar la transferencia

de: Salmonellano viable que pueden estar situadas bajo

o adyacentes a una colonia sospechosa de Salmonella.


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Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones:

Se utiliz el mismo procedimiento de preparacin y dilucin de

muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.

Inoculacin:

1. Se transfiri, por medio de una pipeta estril 0,1 mL de la

suspensin inicial (dilucin 10-1), a cada una de las dos placas

con Agar Baird Parker (superficie del agar previamente secada).

2. Se repiti el procedimiento para las siguientes diluciones.

3. Se prepar duplicados usando 2 placas grandes o seis

pequeas.

4. Se extendi el inculo rpida y cuidadosamente sobre la

superficie de la placa con agar, usando una esptula de

Digralsky, se procur no tocar los lados de la placa. Se dej

secar las placas cerca de 15 minutos con las tapas hacia arriba a

temperatura de laboratorio.


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Nota 1.- Las colonias tpicas son negras o grises, brillantes y

convexas (1 mm a 1,5 mm de dimetro despus de la incubacin por

24 horas y 1,5 mm a 2,5 mm de dimetro luego de la incubacin por

48 horas) y rodeada por una zona clara. Despus de incubar por lo

menos 24 horas puede aparecer un anillo opalescente en esta zona

clara, en contacto inmediato con las colonias.

Nota 2.- Las colonias atpicas tienen el mismo tamao como las

colonias tpicas y pueden presentar una de las siguientes

morfologas:

a) Colonias negro brillante con o sin un borde blanco estrecho, lazona clara est ausente o escasamente visible y el anillo

opalescente est ausente o fuertemente visible.

b) Colonias grises sin zonas claras. Las colonias atpicas estn

formadas principalmente por cepas contaminantes de

Staphy lococcus coagulasa-positiva, por ejemplo, productoslcteos, camarones y menudencias de pollo. Estas son menos

frecuentes en otros productos.


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Nota 3.- Otras bacterias no pertenecientes al gnero

Staphy lococcus pueden dar colonias con apariencia similar a

colonias Staphy lococcus. El examen microscpico de una

coloracin Gram, antes de la confirmacin ayudara a la

diferenciacin de otros gneros que nos sean Staphy lococcus.

Confirmacin (Prueba de la Coagulasa):

De la superficie de cada colonia seleccionada, se removi un inculo

con un asa estril y se transfiri a un tubo de infusin de cerebro

corazn.

1. Se incub a 37C por 24 horas.

2. Aspticamente se aadi 0,1 mL de cada cultivo a 0,3 ml de

plasma de conejo en tubos de 13 x 100 mm e incubamos a 37C.

3. Agitando el tubo, examinamos la coagulacin del plasma

despus de 4 a 6 horas de incubacin, y, si la prueba es negativare-examinamos a 24 horas de incubacin.


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4. Se consider la prueba de coagulasa como positiva si el volumen

de cogulo ocupa ms de la mitad del volumen original del

lquido.

5. Como control negativo, para cada lote de plasma, aada 0,1mL

del caldo de infusin de cerebro-corazn a la cantidadrecomendada de plasma de conejo e incubar sin inoculacin.

Para que la prueba sea vlida, el plasma de control no debe

mostrar signos de coagulacin.

Clculos:

Los clculos se efectuaron segn lo indicado en El instructivo de

anlisis para recuento de Staphylococcus aureus, el cual

menciona:

Caso General:

Clculo del nmero "a" de Staphy lococcus coagulasa-positivaidentificados para cada placa seleccionada.


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inocul con un asa el agua de triptona, previamente calentado a

45C. Se incub los tubos inoculados en bao de agua a 45C por

48 horas.

Prueba para la produccin de Indol e interpretacin:

Se aadi 0,5mL del reactivo de Kovacs en tubos que

contenan agua de triptona inoculado, mezclando bien y

examinando despus de un minuto.

Para cada dilucin se cont el nmero de tubos con un color

rojo en la fase alcohlica, indicando la presencia de Indol (tubos

positivos).

Interpretacin final:

Por cada dilucin, se cont el nmero, total de tubos en la cul

se observ la formacin de indol, (tubos positivos).

Reporte:

Los resultados obtenidos, se expresaron en NMP de Escher ichia col i ,

1 gramo o mililitro. Los resultados para cada muestra se transcribieron


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al registro interno de resultados que luego se archiva.

Control de Calidad:

Para el control de calidad utilizamos solo un control negativo, el

control fue preparado colocando un tubo con el medio de cultivo sin

inocular.

3.8. Procedimiento de anlisis de coliformes fecales por filtro

de membrana:

Resumen:

La prueba consiste en hacer filtrar volmenes de agua

adecuados, con ayuda de una bomba de vaco, a travs de una

membrana de nitrocelulosa de 47mm de dimetro, con una

porosidad de 0.45 pm; la cual es colocada en una placa Petri

conteniendo el caldo mFC, se incubara a una temperatura de

44.5 C 0,2C por 24 horas.

Esta tcnica permite examinar volmenes muy variables de

agua y ofrece un resultado directo de la concentracin de


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bacterias Coliformes (por el recuento de colonias), en lugar de

un estimado estadstico, como es el caso de Tubos Mltiples.

Medios de Cultivo:

Caldo M-FC Composicin:

Triptosa 10,0 g

Proteosa, peptona NO3 Polipeptona 5,0 g

Extracto de Levadura 3,0 g

Cloruro sdico, NaCI 5,0 g

Lactosa 12,5 g

Sales biliares N 3 o mezcla Sales biliares 1,5 g

Azul anilina 0,1 g

Agua destilada 1000 mL

Preparacin:

Se disolvi 37 gr del medio deshidratado en un litro de agua

destilada (estril), que contena 10mL de cido roslico al 1%

en solucin 0,2N de NaOH. Se calent evitando la ebullicin y

el sobrecalentamiento. El pH final fue de 7,4 0,2. No se

autoclav el medio. Se guard el medio de lquido a 4C dentro


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en cantidades adecuadas de 90 2mL y autoclavamos por 15

minutos a 121C

Caldo EC Composicin:

Triptosa o tripticasa 20,0g

Lactosa 5,0g

Mezcla de sales biliares N 3 1,5g

Di potasio hidrogeno fosfato K2HPO4 2,75g

Potasio di hidrgeno fosfato, KH2PO4 2,75g

Cloruro de sodio 5,0g

4-rnetylumberiferil-B-D-glucoronido (MUG) 0,05gAgua destilada 1 L

Preparacin:

Se disolvi 37g de medio EC - MUG en un litro de agua

destilada. Se distribuyeron 10mL, en tubos de ensayo provisto

con tubos Durham invertidos. Se esteriliz en autoclave durante

15 minutos a 121 C.


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2. Las muestras se recolectaron en frascos estriles de 250

ml, de boca ancha con tapa rosca.

3. Las placas de caldo M-FC, estuvieron preparadas, antes

de iniciar el proceso de anlisis, as, mismo se marc cada

placa con el cdigo de la muestra.

4. Para preparar las placas de cultivo, se siguieron los

siguientes pasos: Se coloc una almohadilla absorbente en

la placa Petri y se agreg de 1,8 a 2mL de medio M-FC,

hasta saturar la almohadilla. Se elimin cuidadosamente de

la placa de cultivo el posible exceso de lquido.

5. La muestra, se agit vigorosamente varias veces, para

asegurar una buena homogenizacin.

Filtracin de la Muestra:

1. Al comienzo de cada serie de filtraciones, se utilizunidades de filtracin estriles (mediante autoclave), se

evit la interrupcin de una serie de filtracin en para lo cual

tenamos 3 filtros y al momento de cambiar a otra muestra


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y se colocaron en bolsas de plstico impermeables y luego

sumergirlas en un bao de agua, donde se incubaron a

44,5C durante 24 hrs.

6. Las placas se fijaron bajo la superficie del agua para

mantener la temperatura necesaria se situaron los cultivospreparados en el bao de agua antes de transcurrir 30

minutos de la filtracin.

Recuento:

Se contaron todas las colonias de diferentes matices de color

azul. En caso de que no hubo colonias tpicas se contaron las

atpicas las cuales eran de tonos grises a cremosas.

Verificacin de Coliformes Fecales:

Se seleccion 5 colonias azules tpicas, con una asa de

inoculacin, se repic cada colonia en un tubo con medio EC,incubamos a 44,5C 0,2 por 24 hrs 2 hrs.

La incubacin se llev a cabo en un bao de agua caliente,


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En el caso que se utilizaron diluciones, se aplic la siguiente

frmula:

Coliformes fecales/100 mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100

Vol. de muestra filtrado x Dilucin

3.9. Procedimiento de anlisis de coliformes totales, fecales y E. coli

para alimentos, aguas y agua de mar.

Resumen:

La metodologa de anlisis se basa en 2 etapas:

La prueba presuntiva consisti en colocar volmenes

determinados de muestra de agua en una serie de tubos

conteniendo caldo lauril sulfato que luego fueron incubados a 35

0.5C durante 24 - 48 horas.

La prueba confirmativa para la determinacin de coliformes

totales, consisti en inocular los tubos positivos de la prueba

presuntiva en el caldo verde brillante bilis, incubarlos a 35 0.5

C por 48 horas, en el caso de coliformes fecales y


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Esche r i c h i a co l i , se sembr en caldo EC-MUG para muestras

de alimentos y slo en caldo EC para las dems muestras de

agua, los tubos se incubaron a 44.5 0.2 C por un tiempo de 24

horas.

Para el caso de muestras de agua de mar utilizamos por cada

muestra 5 tubos con medio A1 de doble concentracin y 10 tubos

con medio A1 de simple concentracin, se inocul volmenes de

10ml, 1ml, y 0,1ml respectivamente de cada 5 tubos y se incub en

bao Mara a 44.5C por 24 horas pasado este tiempo se cont los

tubos positivos y negativos y se dej incubar por 24 horas ms para

as poder determinar la densidad de coliformes fecales a travs de la

tabla del NMP.

La formacin de gas en los tubos de Durham as como la

presencia de fermentacin y turbiedad en los tubos, se

consider como reaccin positiva de coliformes. Los

resultados se expresaron en trminos de Nmero Ms Probable

(NMP) de microorganismos.


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Medios de cultivo:

Caldo Lauril Sulfato(CLS)

Caldo Verde Brillante Bilis lactosa (BRILLA)

Caldo EC

Caldo A1

Agua de dilucin

Equipos y Materiales:

Incubadora Bao Mara a 44,5 0,2 C.

Incubadora a 35C.

Frascos de dilucin, capacidad de 100mL, autoclavables.

Pipetas de 10mL.

Tubos de ensayos de 18 x 150mm (para medios de

concentracin simple) y 20 x 150 mm (para concentracin doble).

Tubos (campanas) Durham.

Probetas, matraces, esptulas, vasos de precipitacin.

Asas de siembra.


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Dilucin de la muestra:

1. Recepcionadas las muestras, se procedi a preparar las

diluciones respectivas, el nmero de procedencia de agua

superficial o natural.

2. Se agit vigorosamente varias veces para asegurar una

buena homogenizacin, se transfiri con una pipeta estril un

volumen de 10 ml de la muestra a un frasco con 90mLde

agua de dilucin. De esta manera se obtuvo la primera

dilucin (10-1).

3. Se homogeniz el frasco que contena la dilucin (10-1), con

una nueva pipeta estril, se transfiri 10 ml a un nuevo

frasco de dilucin, teniendo as la segunda dilucin (10 -2).Se

continu con este proces hasta realizar todas las diluciones,

dependiendo del grado de contaminacin de la muestra.

4. Se orden los frascos conteniendo las diluciones, en

secuencia decreciente de concentracin (de mayor a Menor

dilucin).


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Prueba presuntiva:

Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial

(AT):

1. Se prepar una batera con series de cinco tubos conteniendo

10mL de CLS de concentracin doble y series de cinco tubos

con 10mL de CLS de concentracin simple; sta serie

dependi del nmero de diluciones que se hayan realizado de

la muestra. Se coloc los tubos en gradillas y se codific

anotando el nmero asignado a la muestra, y dilucin a

inocular. Para agua de consumo humano se utiliz 10 tubosde 10mL de CLS a doble concentracin.

2. Se agit vigorosamente el frasco con la ltima dilucin

efectuada y con una pipeta transferimos 1mL de la dilucin en

cada uno de los tubos con CLS de concentracin simple

correspondiente a dicha dilucin.

3. Se procedi de la misma forma, transfiriendo 1mL de la

muestra ms diluida a la ms concentrada, utilizando para


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ello la misma pipeta.

4. Transferimos tambin 1mL de la muestra original a cinco

tubos con CLS de concentracin simple y 10 ml. en cinco

tubos con CLS de doble concentracin.

5. Se incub los tubos a 35C. Despus de 24 horas

examinamos y separamos los tubos con CLS positivos,

aquellos que presentaron formacin de gas en el tubo

Durham (fermentacin) y turbiedad. Se anot los resultados.

Todos los tubos positivos pasaron a la siguiente fase, la

prueba confirmativa.

6. Se re-incub los tubos negativos por 24 horas ms. Se realiz

la segunda lectura a las 48 horas. Nuevamente separamos y

anotamos los resultados de los tubos positivos y pasamos a

la prueba confirmativa. Los tubos negativos no se tomaron en

cuenta y se descartan.

Para el caso de muestras de agua de mar (AM):

Se trabaj con 5 tubos de medio A1 de concentracin doble, a los


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cuales agregamos 10 ml de la muestra, luego otros 5 tubos de

medio A1 de simple concentracin a las cuales agregamos 1ml y

por ltimo se agreg 0,1ml a otros 5 tubos de concentracin

simple, luego incubamos en Bao Mara a 44,5C por 24 horas y

pasado este tiempo se realiz la lectura y se separaron los tubos

positivos de los negativos de igual manera y se volvi a incubar

por otras 24 horas ms a los tubos a los tubos negativos,

separamos y anotamos los resultados de los tubos positivos y

pasamos a la prueba confirmativa.

Prueba confirmativa:

Coliformes Totales:

Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial

(AT):

1. Se coloc en gradillas, los tubos conteniendo el medio

BRILLA, atemperamos previamente durante 30 minutos a

temperatura ambiental, codificamos cada tubo con el nmero

asignado a la muestra y con la dilucin inoculada.


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2. Se agitaron los tubos positivos de la prueba presuntiva para una

completa homogenizacin antes de ser inoculados a los tubos

con el caldo BRILLA.

3. Con un asa de siembra estril, se transfiri una o ms asadas

de un cultivo positivo de CLS a un tubo con el medio BRILLA.

4. Se repiti el mismo procedimiento para todos los tubos

presuntivos.

5. Se incub los tubos inoculados a 35 0.5C por 24 3 horas,

6. Se retir los tubos de la incubadora luego del perodo deincubacin, agitamos suavemente para observar la produccin

de gas y procedimos a realizar la lectura, consideramos positiva

toda formacin de gas en los tubos- Durham (Fermentacin) y

turbiedad en los tubos. Se anotaron los resultados. Todos los

tubos positivos pasaron a esterilizacin para ser descartados.

7. Re-incubamos los tubos negativos por otras 24 3 horas.

8. Se realiz la segunda lectura, nuevamente separamos y


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anotamos los resultados de los tubos positivos. Los tubos

negativos no se tomaron en cuenta.

9. Con los resultados obtenidos de las dos lecturas calculamos el

NMP.

Coliformes Termotolerantes (Fecales):

1. Se coloc en gradillas; los tubos c

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