informes de microbiologia primera unidad 1 7
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PRÁCTICA N°1
RECUENTO EN PLACAS
ESQUEMA EXPERIMENTAL
• Tomamos 1 ml de muestra (agua potable) y lo llevamos a un tubo de ensayo que contiene
9 ml de solución salina fisiológica (SSF).
• Luego tomamos 1 ml de la solución de concentración 10 -1 y lo llevamos a otro tubo de
ensayo conteniendo 9 ml para obterner una solucion de concentración 10-2.
• Finalmente tomamos 1ml de la solución al centésimo (10-2) y lo colocamos en una placa
petri con agar PCA.
Muestra de agua
potable
Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al tubo de
ensayo
9 ml de SSF + 1 ml
de muestra
Concentración 10 -1
9 ml de SSF
Concentración 10 -1
Tomamos 1 ml de muestra y lo
llevamos al tubo de ensayo
9 ml de SSF 9 ml de SSF + 1 ml
de muestra (10 -1)
Concentración 10 -2
Placa petri con agar PCA
• Sembramos, incubamos a 37 ºC por 24 - 48 horas y observamos
los resultados
RESULTADOS
• Número UFC en la placa : 51
• Dilución de la muestra : 10-2
• Recuento : 51 x 102 UFC/ml
COMENTARIOS
Es una técnica sencilla que consiste en obtener una suspensión de la mezcla de
microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir
colonias aisladas.
Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estériles, flameando la boca de los tubos
antes y después de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.
La presición del recuento aumenta con el número de colonias, ya que disminuye el erro debido
al muestreo.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento del método de recuento en placa?
Consiste en contar colonias que se desarrollan después de cierto tiempo en el medio de
elección presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra.
El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de
microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo.
Existen dos métodos para el recuento de bacterias viables en placa, siendo el de uso más
frecuente el método de incorporación o recuento estándar en placa .
Concentración 10 -2
Este método consiste en sembrar cajas de petri con 1 ml de muestra (y de sus diluciones) y
agregar de 10 a 12 ml de agar nutritivo estéril fundido (teniendo la precaución de dejarlo enfriar
hasta 44-46 grados). Se mezcla rápidamente y, una vez solidificado el agar, se incuban las
placas durante 7 días a 20 grados C.
El segundo método es de siembra en placa por extensión y consiste en en extender sobre la
superficie del agar en la placa, un volumen no mayor a 1 ml de la dilución correspondiente.
2. ¿Por qué, para el recuento de bacterias viables, se escogen las placas que
han
desarrollado entre 30 y 300 u.f.c.?
Para obtener resultados estadísticamente significativos es necesario contar placas que
contengan entre 30 y 300 colonias. Para que ello sea posible, en el momento de la siembra
debe tenerse una idea aproximada del número de bacterias presentes en la muestra a fin de
realizar las diluciones adecuadas.
Cuando se desconoce totalmente la muestra problema es conveniente realizar la máxima
cantidad de diluciones posibles.
3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las siembras por incorporación y
(Incorporación)
(Extensión)
superficie?
SIEMBRA POR INCORPORACIÓN
VENTAJAS DESVENTAJAS
Menor error en el recuento Dificultad para subcultivar colonias.
Mejor aprovechamiento de nutrientes por
parte de los microorganismos.Difícil visualización de colonias
Se puede utilizar para el recuento de
organismos anaerobios.
La temperatura del agar puede afectar a
ciertos microorganismos
SIEMBRA POR SUPERFICIE
VENTAJAS DESVENTAJAS
Menor cantidad de muestra a procesar Mayor error en el recuento
Facilidad para subcultivar colonias.En aerobiosis pueden crecer aerobios
estrictos y facultativos
Fácil visualizaciónBajo aprovechamiento de nutrientes por parte
de los microorganismos.
No se afectan las células termosensibleSe corre el riesgo que otros microorganismos
entren en el medio de cultivo y contaminen la
muestra
4. ¿Por qué se util iza el termino “unidades formadora de colonias” (u.f.c.)?
UFC: Una unidad formadora de colonias es simplemente una célula o grupo de ellas, que, al
ser depositadas sobre un medio nutritivo, dan lugar a una colonia. Esta es definida en
bacteriología como la masa celular visible al ojo humano que se forma de un origen
común. Así, el término ufc no es estrictamente cuantitativo.
5. ¿Por qué el método de recuento en placa, no nos permite determinar el total
de la
población viable de bacterias presentes en una muestra de alimento?
Debe tenerse en cuenta que las bacterias que desarrollan en el medio de cultivo elegido, son
aquellas que pueden utilizar los nutrientes disponibles y que además se adaptan a las
condiciones de oxígeno, potencial redox, pH, temperatura y periodo de incubación. No existe
un medio nutritivo ni una combinación de temperaturas y tiempos de incubación que aseguren
la recuperación de todas las bacterias viables de una muestra de alimento.
Las bacterias en una muestra de alimento pueden encontrarse aisladas o en agrupaciones (de
a pares o en cadenas) o asociadas a partículas. Por ello cada colonia que desarrolla puede
estar originada por uno o más organismos y el resultado de su recuento se expresa como
unidades formadoras de colonias por unidad de volumen
PRACTICA Nº 2
RECUENTO POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
ESQUEMA EXPERIMENTAL
• De una muestra de agua potable, se tomaron 3 muestras de 1 ml las cuales se
depositaron en 3 tubos de ensayo que conteniendo 9 ml de caldo BRILLA, para obtener
una concentración de 10-1
• Luego se tomó 1 ml de muestra de agua potable y se mezcló con 9 ml de solución
salina fisiológica (SSF) en un tubo de ensayo, para obtener una concentración de 10-1
Se toma 1 ml de
muestra
Agua potable
9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo
Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al tubo de
ensayo
Concentración 10 -1
Concentración 10 -1
• Se tomaron 3 muestras de un mililitro cada una y se depositaron cada una de las
muestras en un tubo de ensayo con 9 ml de caldo BRILLA, para obtener una
concentración de 10-2.
• De la muestra de solución salina fisiológica (10 -1) se tomó 1 ml el cual se depositó en
un tubo de ensayo que contenía 9 ml de solución salina fisiológica para obtener una
concentración de 10-2.
Muestra de agua
potable 9 ml de SSF + 1 ml
de muestra
9 ml de SSF
9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo
Se toma 1 ml de
muestra
Concentración 10 -1
Concentración 10 -2
Tomamos 1 ml de muestra
9 ml de SSF + 1 ml
de muestra
9 ml de SSF
Concentración 10 -2
Concentración 10 -1
• Finalmente se tomaron 3 muestras de 1 ml de la concentración de SSF (10 -2) y se
depositaron cada una en un tubo de ensayo que contenía 9ml de caldo BRILLA, para
poder así obtener una concentración final de 10 -3 y poder aplicar la técnica de recuento
del número más probable.
RESULTADOS
9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo
Concentración 10 -3
Se toma 1 ml de
muestra
Concentración 10 -2
Concentración 10 -3
Concentración 10 -2
Concentración 10 -1
3 01
• De la tabla del Número más probable, la combinación 3,1,0 corresponde a :
COMENTARIOS
• Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento, acidez
(detectada por un indicador colocado en el medio) y aparición de gas en la campana de
fermentación (campana de Dürham), independientemente de su cantidad. La producción de
gas se pone también de manifiesto por el desprendimiento de pequeñas burbujas que
atraviesan el medio al agitar suavemente el tubo. La ausencia del gas al cabo de 48 h
(± 3 h) se considera como prueba negativa.
• En este caso por la formación de gas y enturbiamiento, se consideraron los tubos e
concentración 10-1 y 10-2 como positivos mientras que los tubos de concentración 10-1
salieron negativos. Siendo el resultado final 3 / 1 / 0 lo que en la tabla del número más
probable nos da 40 bacterias/gr. de muestra
• En la muestra se detecto la presencia de coliformes totales ya que estos fermentan la
lactosa y producen ácido y gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas.
• Este método esta basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de
bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El
método es popular aunque poco exácto.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué otras formas conoce, para realizar el método del NMP?
Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando
una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la
determinación de presencia o ausencia en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particulares de microorganismos presentes en muestras. Por lo tanto, un requisito importante
de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es)
en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del
patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.
40 bacterias/gr. de muestra
Este número es calculado a partir de la observación del crecimiento, tanto con la aparición de
turbidez como con la formación de gas, en cultivos en caldo duplicados, inoculados con
porciones de un ml de diluciones decimales de la muestra. Las cifras que representan
resultados positivos con crecimiento en tres diluciones sucesivas, suelen denominarse número
significativo.
Existen diversas formas de realizar este método, en la práctica se realizaron diluciones
consecutivas (10-1, 10-2, 10-3) de las 1 ml de muestras en 9 ml de agua pectonada (1%) en
tres tubos, de los cuales se tomo para cada caso 1 ml de dilución y se le agregó a otros tres
con caldo BRILA a concentración normal. Otra forma es transferirse de la muestra original 10
ml a los tres primeros tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILA doble concentrado, 1ml a los
tres siguientes y 0.1 ml a los tres restantes; ambos a concentración normal.
La muestra puede ser diluida ser seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de caldo.
Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Se puede dividir la placa petri en
cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor
de dilución a ser inoculado:
Transferir 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco
veces por cada dilución:
Permitir que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa. Invierta la placa e
incube a 25°C por 7 días.
Las muestras a analizar no solo son liquidas, muchas veces son sólidas, en estos casos suele
agregarse 10 g de muestra en 90 g de agua, se agita y al sedimentarse se trabaja con el
sobrenadante, a partir de este se podrá realizar las diluciones o trabajar directamente como el
procedimiento antes mencionado.
En algunos ocasiones realizar tres diluciones consecutivas no es suficiente, por lo que es
conveniente realizar las diluciones necesarias hasta obtener resultados mas
2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método de NMP?
VENTAJAS:
• La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a
un proceso (selectividad).
• Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos
diversificados.
• Determina solo organismos vivos y activos metabólicamente.
• Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de
esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.
• Determina cargas microbianas baja, pero también pueden emplearse para determinar
cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.
• Presenta ventajas frente a otros métodos para el caso de muestras como polvos
insolubles.
• Preferible para microorganismos que presentan crecimiento lento o han sido sometidos
a condiciones adversas.
• Es posible enumerar microorganismos anaeróbicos utilizando medios prereducidos,
cubriendo con vaselina.
DESVENTAJAS:
• No detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro, sólo permite
microorganismos viables.
3. ¿Qué otras formas de lectura, permiten determinar tubos posit ivos en el
método
de NMP?
• Por pruebas presuntiva y prueba confirmativa done existe formación de gas.
• Formación de ácido.
• Cambio de color (Verde brillante a verda celestino (verde nilo)).
• Cambio de aspecto (transparencia a turbidez).
PRACTICA Nº 3
RECUENTO POR MEMBRANA FILTRANTE
ESQUEMA DE TRABAJO
RESULTADO
El análisis del agua con el filtro mil poros se realizo con la muestra de agua potable. Se observó
que hubo formación de colonias rosadas o sea hay presencia de coliformes y como el número
de colonias fue bastante, el cual no se podía contar entonces por teoría se considera que es
mayor a 2000 UFC / 1 ml.
COMENTARIOS
Es un método utilizado cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45
mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa
del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia
previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de
acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).
Para hacer la lectura se debe de contar las colonias en las membranas. Los resultados se
deben expresar como unidades formadoras de colonias (u.f.c.) por mL o por 100 mL de agua,
considerando el volumen filtrado y el factor de dilución.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es el fundamento del método de la membrana fi lt rante?
Este método de determinación de coliformes se basa en la filtración de un volumen dado de
muestra a través de una membrana de ésteres de celulosa o de otra sustancia. Todas
las bacterias de la muestra quedan retenidas en la superficie de la membrana, que a
continuación se incuba en medios de cultivo apropiados y temperaturas adecuadas.
El número de coliformes presentes en la muestra se calcula en función del número de colonias
y del volumen filtrado.
2.- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del recuento por el método de la
membrana fi lt rante?
VENTAJAS:
• Posibilidad de estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra.
• Rapidez en la obtención de resultados con respecto al método clásico.
• Economía de personal y material
DESVENTAJAS
• No puede utilizarse con aguas muy turbias
• Su empleo no esta indicado cuando la muestra de agua contiene poco número de
coliformes y gran número de microorganismos no coliformes capaces de multiplicarse
en el medio, ya que éstos últimos se extienden sobre toda la superficie de la membrana
e impide el crecimiento de las colonias de coliformes.
3.- Porqué se dice que el método de la membrana fi lt rante, es útil para
determinar la eficacia de los desinfectantes util izados en la industria de
alimentos.
El método de la membrana filtrante es útil por que nos va permitir determinar que desinfectante
utilizar y que cantidad agregar a un producto después de analizarlo y así de esa
manera se podrá determinar la eficacia que tiene como desinfectante.
La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras de
alimentos a través del método de membrana filtrante es imprescindible para determinar el
origen de la contaminación y seguir el curso de la acciones correctivas a aplicar. Gracias al
filtro por membrana se pueden utilizar gran cantidad de muestra para realizar los análisis y
optar por un desinfectante adecuado.
PRACTICA Nº 4
RECUENTO EN TUBO DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTORES
ESQUEMA DE TRABAJO
Tomamos como muestra agua potable de la cual extremos 1 ml de muestra y lo llevamos a un
tubo de ensayo que contiene 9 ml de solución salina fisiológica (SSF) para
obtener una solución de concentración 10-1.
• Luego tomamos 1 ml de la solución de concentración 10 -1 y lo llevamos a otro tubo de
ensayo conteniendo 9 ml de ssf para obtener una solución de concentración 10-2.
• Calentamos los medios de cultivo ( agar SPS y agar agua) hasta se fundan.
• Luego colocamos en 2 tubos de ensayo limpios 1 ml de cada muestra de concentración 10-
1 y 10-2 respectivamente. Luego procedemos a verter los medios de cultivo ( agar SPS y
agar agua) en cada tubo.
Muestra de agua
potable
Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al tubo de
ensayo
9 ml de SSF + 1 ml
de muestra
Concentración 10 -1
9 ml de SSF
Concentración 10 -1
Tomamos 1 ml de muestra y lo
llevamos al tubo de ensayo
9 ml de SSF 9 ml de SSF + 1 ml
de muestra (10 -1)
Concentración 10 -2
• Se deja solidificar y luego se lleva a incubar a 37 ºC por 3 días.
• Se hace lectura contando la aparición de colonias negras, las cuales indican la presencia
de anaerobios sulfito-reductores.
RESULTADOS
El número de colonias negras encontradas en el tubo de 10 -1 fue de 50, mientras que el
encontrado en el tubo de 10-2 fue 1, a cada uno de estos números se le multiplico por el inverso
de la dilución (10 y 100 respectivamente). De lo anterior podemos decir que en la dilución de
10-1 se encontró un mayor número de bacterias.
AGAR SPS
AGAR AGUA
Concentración 10 -2
Concentración 10 -1
COMENTARIOS
Este método nos permite determinar el número de microorganismos viables presentes en
alimentos, es útil particularmente útil para el recuento de microorganismos anaerobios,
tales como los clostridios sulfito-reductores.
CUESTIONARIO
1. ¿ Qué otros microorganismos se pueden enumerar mediante el método de
recuento en tubo?
El recuento en tubo es una técnica empleada para el análisis de muestra que supone una
concentración de microorganismos pequeña. Es una estimación de la densidad de bacterias en
el alimento; tiene como base estadística la probabilidad de obtener tubos con cultivos positivos
conforme es menor el volumen de la muestra inoculada.
Algunos microorganismos que se pueden enumerar mediante el recuento en tubo son :
• Clostridium botulinum
• Clostridium argentinense
• Clostridium butyricum
• Clostridium baratii
2. ¿ Cuál es la importancia de enumerar microorganismos anaerobio en una
muestra de alimento?
Es común en el análisis diario de alimentos llevar a cabo el recuento de microorganismos
anaerobios, sobre de los sulfito-reductores, como es el caso del Clostridium botulinum, el cual
es el de mayor peligrosidad para la salud.
La importancia de del recuento o la enumeración de organismos anaerobios es que cuando el
número de microorganismos es significativo, puede indicar una incipiente alteración del
alimento y en algunos casos, riesgos reales o potenciales de intoxicación.
NÚMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO
Tubo (10 -1) 500 ufc/ml
Tubo (10 -2) 100 ufc/ml
3. ¿ A qué se debe el color negro de las colonias que aparecen en el medio de
cult ivo?
El recuento de anaerobios sulfito-reductores se realiza en medio sólidos que contienen dos
tipos de sustancias: una inhibidoras de la flora acompañante y otras diferenciales para
distinguir las colonias pertenecientes a este grupo de microorganismos. Un medo muy utilizado
es el agar SPS (agar sulfito-polimixina-sulfadiazina). En este medio, las sustancias inhibidoras
principales son la polimixina y la sulfadiazina. Los productos que sirven para la diferenciación
son el sulfito sódico y el citrato férrico.
Los microorganismos anaerobios sulfito-reductores reducen los sulfitos y forman sulfuro de
hierro, sustancia que precipita y da un color negro a las colonias.
PRÁCTICA N°5
INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
Esquema de trabajo
Enriquecimiento no selectivo
Se pipeteó 25 ml de agua y se vertió en 225 ml de caldo lactosado, luego se incubo a 37 °C x 8 h.
Enriquecimiento selectivo
Se lleva 1 ml de la muestra anterior a 10 ml de caldo selenito y a 10 ml de caldo tetrationato verde brillante al que se le añadió 0.1 ml de solución yodo yodurada.
Se incuba a 37°C por 24h.
Aislamiento en medios sólidos selectivos
caldo selenito
caldo tetrationato verde brillante.
RESULTADOS
• En la práctica se detecto la presencia de salmonellas por la formación de colonias
transparentes , lo cual nos indicaba que la muestra estaba contaminada.
• En el caso de la salmonella el resultado fue: Lactosa - , glucosa +, H2S + y gas -.
Se siembra cada cultivo en agar SS y agar VRBA ó Mac Conkey por estría.
Se incuba a 37 °C por 48 horas, luego se hace lectura
En agar SS, las colonias incoloras y transparentes corresponden a las salmonellas y en agar VRBA las colonias transparentes son Lactosa -
En agar SS, las colonias rojas corresponden a las shigelas y en agar VRBA las colonias rojas son Lactosa +
IDENTIFICACIÓN PRELIMEINAR
(Bioquímica presuntiva)
Se tomó una colonia de la placa anterior y se lo estrío en la superficie en un tubo que contenía TSI (Tres azucares hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa), luego se lo incubo a 37°C y luego se hizo la lectura.
G
L
S
GLUCOSA +
H2S +
LACTOSA -
• El color negro que se formo indica la presencia de H2S, ya que este reacciona con el citrato
de hierro y esto da el sulfuro de hierro que es de color negro.
• En general Salmonella es negativa a las pruebas de lactosa y sacarosa, así como
generalmente producen H2S, pero existen variantes atípicas con reacciones positivas a
lactosa o no descarboxilación de lisina
COMENTARIOS
Por lo general, se investiga la presencia o ausencia de salmonella en los alimentos y no se
hace recuento. La presencia es ya suficientemente significativa y cualquiera que sea su número
y el serotipo al que pertnezcan, conlleva al decomiso del alimento.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué alimentos que se consumen en nuestro medio, están en relacionados
con
Salmonella?
• Carnes frescas y productos derivados
• Picadillos, embutidos, carnes curadas,(jamón, tocino).
• Carne de aves
• Tortas
• Pasteles elaborada con huevos
• Productos lácteos como leche fresca o fermentada, helados, quesos.
2. ¿Cúal es la importancia del enriquecimiento no selectivo en el aislamiento de
Salmonella?
Salmonella typhi
3. ¿Cuál es la importancia del enriquecimiento selectivo en el aislamiento de
Salmonella?
4. De modo general, ¿Cuáles son los pasos para el aislamiento e identif icación
de
Salmonella?
PRÁCTICA N°6
INVESTIGACIÓN DE Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus EN
ALIMENTOS
Esquema de trabajo
Colocar 25 ml o 25 g de la muestra en 225 ml de APA al 0.5% de NaCl ó en APA al 3% de NaCl. Luego se incuba a 37°C por 12 horas.
APA
Después de incubar y sin agitar el frasco, se transfirió una asada de inóculo a partir de la película (crecimiento superficial) a dos placas de agar TCBS. Se estrió en 4 cuadrantes.
Bioquímica presuntiva
Se incuba a 37°C por 24 horas y luego se hace lectura.
Agar TCBS
Las colonias con el centro de color verde azuladas (sacarosa negativa) pequeñas, de bordes regulares y filantes, indican la presencia de vibrio parahaemolyticus.
Las colonias de color amarillo (sacarosa positiva), grandes, de bordes regulares, aspecto cremoso, ligeramente planas, con centros opacos y periferie translúcida, indican la presencia de vibrio cholerae.
Se tomó una colonia de cada placa anterior y se lo estrío en la superficie en un tubo que contenía TSI (Tres azucares hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa), luego se lo incubo a 37°C y luego se hizo la lectura.
G
L
S
GLUCOSA +
SACAROSA +
LACTOSA +
GLUCOSA +
SACAROSA -
LACTOSA -
vibrio parahaemolyticus
vibrio cholerae
RESULTADOS
VIBRIO
vibrio parahaemolyt icus vibrio cholerae
Lactosa –
Sacarosa -
glucosa +
H2S -
gas -
Lactosa +
Sacarosa +
glucosa +
H2S -
gas -
• Estos dos vibrios son en general glucosa +, el vibrio cholerae, metaboliza la sacarosa por lo
que produce acidez y esto hace que cambie a color amarillo, mientras que el vibrio
parahaemolyticus no lo degrada, manteniendo así el color rojo, siendo sacarosa -.
• En ninguno de los dos se observa la formación de gas (formación de burbujas) o la
presencia de un anillo negro (presencia de H2S).
COMENTARIOS
Estos dos microorganismos son bacilos Gram negativos fermentativos pertenecientes a la
familia Vibrionaceae, con implicación en diferentes procesos gastrointestinales. Vibrio
parahemolyticus (halófilo, facultativamente anaerobio), constituye un claro riesgo en alimentos
marinos que no han sufrido un tratamiento térmico previo al consumo, siendo su hábitat las
aguas litorales, peces y mariscos de aguas templadas. La manipulación inadecuada y los
hánitos de consumo previamente mencionados son factores conducentea a la aparcición de
enfermedades.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué alimentos en nuestro medio están relacionados con V. cholerae y V.
parahemolyt icus?
V. parahemolyticus
Alimentos crudos de origen marino; pescado de agua salada, mariscos, crustáceos y productos de la pesca.
V. cholerae
• Todo tipo de aliementos
• Verduras de tallo corto
• Agua contaminada
2. ¿Cuáles son las formas de contaminación de los alimentos con V. cholerae y
V.
parahemolyticus?
El V. cholerae puede sobrevivir en los alimentos y en el agua el tiempo suficiente para
transmitir la enfermedad, además de sobrevivir en alimentos refrigerados con actividad de agua
elevada. Una vez ingerido el alimento, las células de V. cholerae se multiplican en le intestino
delgado y producen la enterotoxina, la cual determina que el revestimiento intestinal segregue
grandes cantidades de fluido que se excreta en forma de diarrea acuosa.
El V. parahemolyticus causa gastroenteritis debido al consumo de mariscos crudos o
insuficientemente cocidos, o mariscos apropiadamente cocidos contaminados después de su
cocción.
3. ¿Cómo explica el color que toma las colonias de V. cholerae y V.
parahemolyt icus
en el agar TCBS?
El agar TCBS contiene un indicador que es el azul de brotimol, el cual se torna amarillo cuando
el medio se encuentra ácido y verde cuando el medio es alcalino.
Para el caso de V. cholerae, el indicador se torno amarillo debido a que hubo producción de
ácido, mientras que para V. parahemolyticus se mantuvo en su color verde.
4. De modo general, ¿ Cuáles son los pasos para el aislamiento e identif icación
de V.
cholerae y V. parahemolyt icus?
PRÁCTICA N°7
DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Y CONSERVADORES QUÍMICOS EN
ALIMENTOS
Esquema de trabajo
Embeber un disco en Bisulfito de sodio
Colocar el disco con bisulfito de sodio en el centro de una placa conteniendo agar común, con la ayuda de una pinza estéril.
Bisulfito de sodio
Discos
Sembrar cada uno de los cultivos (salmonella, klebsiella y B. subtilis) con una sola estría en tres zonas diferentes desde el borde del disco hasta el borde de la placa. (Este procedimiento se sigue para ambas placas)
salmonellaKlebsiella
B. subtilis
Con bisulfito de sodio
RESULTADOS
Con bisulf ito de sodio
SalmonellaNo pudo desarrollarse, el bisulfito tiene efecto sobre este microorganismo (lo inhibe),
por lo cual decimos que la salmonella no es resistente a este conservante.
klebsiellaSi se pudo desarrollar, el bisulfito permitió que se desarrolle, de esto podemos decir
que este microorganismo es resistente a este conservante.
B. subtil isSi se pudo desarrollar, el bisulfito permitió que se desarrolle, de esto podemos decir
que este microorganismo es resistente a este conservante.
COMENTARIOS
• De la practica se puede concluir que la Salmonella es susceptible a la inhibición por
presencia de bisulfito de sodio.
• El liquido (bisulfito de sodio) embebido del disco depositado el medio de cultivo, difundió
en el agar y causó su acción inhibitoria.
• En el caso de Klebsiella y B. subtilis, no se notó ningún signo de alteración de crecimiento.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia de determinar la presencia de antibióticos y
conservadores químicos en alimentos.
La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes tipos de
microorganismos (bacterias, levaduras y mohos). El problema del deterioro microbiano de los
alimentos tiene implicaciones económicas evidentes, tanto para los fabricantes (deterioro de
materias primas y productos elaborados antes de su comercialización, pérdida de la imagen de
marca, etc.) como para distribuidores y consumidores (deterioro de productos después de su
adquisición y antes de su consumo). Se calcula que más del 20% de todos los alimentos
producidos en el mundo se pierden por acción de los microorganismos. Por otra parte, los
Se incuban las 2 placas a 37 °C por 24 horas y luego se hace la lectura
Con Bisulfito de sodio
alimentos alterados pueden resultar muy perjudiciales para la salud del consumidor. La toxina
botulínica, producida por una bacteria, Clostridium botulinum, en las conservas mal
esterilizadas, embutidos y en otros productos, es una de las substancias más venenosas que
se conocen (miles de veces más tóxica que el cianuro). Las aflatoxinas, substancias producidas
por el crecimiento de ciertos mohos, son potentes agentes cancerígenos. Existen pues razones
poderosas para evitar la alteración de los alimentos. A los métodos físicos, como el
calentamiento, deshidratación, irradiación o congelación, pueden asociarse métodos químicos
que causen la muerte de los microrganismos o que al menos eviten su crecimiento. En muchos
alimentos existen de forma natural substancias con actividad antimicrobiana. Muchas frutas
contienen diferentes ácidos orgánicos, como el ácido benzoico o el ácido cítrico. La relativa
estabilidad de los yogures comparados con la leche se debe al ácido láctico producido durante
su fermentación. Los ajos, cebollas y muchas especias contienen potentes agentes
antimicrobianos, o precursores que se transforman en ellos al triturarlos.
Los organismos oficiales correspondientes, a la hora de autorizar el uso de determinado aditivo
tienen en cuenta que éste sea un auxiliar del procesado correcto de los alimentos y no un
agente para enmascarar unas condiciones de manipulación sanitaria o tecnológicamente
deficientes, ni un sistema para defraudar al consumidor engañandole respecto a la frescura real
de un alimento.
Las condiciones de uso de los conservantes están reglamentadas estrictamente en todos los
paises del mundo. Usualmente existen límites a la cantidad que se puede añadir de un
conservante y a la de conservantes totales. Los conservantes alimentarios, a las
concentraciones autorizadas, no matan en general a los microorganismos, sino que solamente
evitan su proliferación. Por lo tanto, solo son útiles con materias primas de buena calidad.
2. Explique otro método usado para determinar la presencia de antibióticos en
los alimentos.
3. ¿Cuáles son los antibióticos y conservadores químicos más usados en
alimentos?
Antibióticos
Con la excepción de la nisina (E-234) todos los demás antibióticos quedan reservados en la
Unión Europea al uso médico, prohibiéndose taxativamente su utilización como conservantes
alimentarios. Esto es así para evitar la aparición de cepas bacterianas resistentes y la posible
alteración de la flora intestinal de los consumidores. El uso de antibióticos en medicina
veterinaria está también reglamentado para que no puedan llegar al consumidor como
contaminantes de la carne o de la leche.
Conservadores Químicos
Conservador Concentración efectiva Usos
Alcoholes variable Cosmética
Äcido propionico y propionatos 0,32%Agente antifúngico en panes,
tortas, queso
Acido sórbico y sorbatos 0,2%Agente antifúngico en quesos,
mermeladas, jugos y tortas
Esteres del ácido p-
hidroxibenzoico: metil, etil,
propil, butil y heptil ésteres
(parabenos o ésteres del PHB)
variableIndustria farmacéutica,
cosmética, alimentaria
FormaldehídoCosmética: productos de
enjuague como shampoo
Acido benzoico y benzoatos 0,1%
Agente antifúngico en
margarina, sidra, bebidas
gaseosas.
Diacetato de sodio 0,32% Agente antifúngico en panes
Acido láctico variable
Agente antimicrobiano en
queso, manteca, yogur y
pickles.
Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppmAgente antimicrobiano en
frutas secas, uvas, melazas
Nitrito de sodio 200 ppmAgente antimicrobiano en
alimentos curados, pescado
Cloruro de sodio variable
Previene el deterioro
microbiano en carnes,
pescado, etc
Azúcar variable
Previene el deterioro
microbiano en mermeladas,
jugos, jaleas,etc
Ahumados variable
Previene el deterioro
microbiano en carnes,
pescado, etc
