DIAGNOSTI

CO

VIROLO

GICO

Acción citopáticaSe denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican.Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar.En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular.El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados.Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.

Cultivos celulares. Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura.Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa.Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro.Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases.Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.

Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solodentro de células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso dehospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se usancultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar. Como lamayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente simpleestudiar los virus bacterianos y por esta razón se dispone de un crecimientodetallado de la multiplicación de estos virus.En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puedeser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseabledisponer de hospedadores más manejables. En 1907 el biólogo estadounidenseRoss Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir,pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollode los cultivos de tejidos y mas adelante el de los cultivos celulares (líneascelulares). Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos ocultivos celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente lainvestigación sobre los virus.

Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se debenutilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Loscultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de losvirus,constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento ypropagación de la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por célulasprovenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios decultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH,aireación y humedad controladas.Dentro de éstos, los más usados son los cultivosen monocapa, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos,cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares enmonocapa consisten en una capa de células que crecen adheridas a la superficiedel recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejidooriginal u otra monocapa con un agente que dispersa las células (una enzima o unagente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren ymultiplican. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efectocitopático (EC) y mediante pruebas complementarias.

No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que unlaboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bienin vitroen cultivos primarios, cepas ylíneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de lamisma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmónfetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano yespecie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastantesensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero nopermitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que lospasajes sucesivos de una línea hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, comosucede con Hep-2 en relación a VRS.

Entre los sistemas de cultivo más utilizados tenemos:a)Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. Lamayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñónembrionario humano (REH).b)Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en laproducción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materialestóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su númerocromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.

c)Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n)número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumoresmalignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñónde mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también detejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanasmalignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y aveces también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneascelulares existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón), BHK21(fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epiteliode rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitosde ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-A31(fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunosejemplos de lineas celulares son:

HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo.Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y ocasionalmentePARAINFLUENZA.LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomiendapara el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsinacristalina al medio.MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Serecomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están lascélulas Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas sonlas líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento decitomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humanoembrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como elherpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc.En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que sequiera evidenciar.

http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/05/cuerponegri2.jpg

Detección de ácidos nucleicos

El método mas utilizado para detección de acidos nucleicos es la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR, que es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que utiliza una ADN polimerasa y oligonucleótidos cebadores, primers, para producir luego de varios ciclos, millones de moléculas del fragmento seleccionado a partir de una sola copia. Los productos de PCR pueden ser detectados por tinción con bromuro de etidio y electroforesis en geles de agarosa.Esta técnica permite detectar mínimas cantidades de ácidos nucleicos en muestras clínicas y por lo tanto ha significado un gran avance con respecto a los métodos convencionales.