tema 18.- análisis espermático. dilución y conservación seminal

Tema 19.- ANLISIS ESPERMTICODILUYO-CONSERVACIN SEMINAL

INSEMINACIN ARTIFICIAL

Conjunto de Tcnicas que nos permiten aplicar, en la hembra, el material espermtico en el momento ptimo, en el lugar adecuado, con vistas a obtener una fecundacin, y sin el concurso directo de macho

Metodologas

Diluyoconservacin

Tcnicas aplicacindosis

Pruebas laboratoriales

valoracin

Mtodos

Recogida Espermtica

Tema 19. Reproduccin y Fundamentos ObsttricosEvaluacin de la calidad seminal:

cundo?

por qu?

Predecir su fertilidad

Evaluarlo en el proceso de conservacin

Siempre tras la recoleccin

En la evaluacin reproductiva del animal joven

En la evaluacin reproductiva del semental durante su vida reproductiva

Cuando existe sospecha o certeza de problemas de fertilidad

En un examen compro-venta

En la evaluacin reproductiva obligatoria: exportacin de sementales,reproductores calificados

Determinar la capacidad del esperma para tolerar los procesos deconservacin seminal (refrigeracin/congelacin)

Tema 19. Anlisis espermtico

Fertilidad semental = % de gestacin% de nacimientos

Fertilidad de la hembra

Manejo reproductivo

Evaluacin espermtica Fertilidad del semental

Baja calidad seminal Subfertilidad

Alta calidad seminal Fertilidad

=

?

CONTRASTACIN ESPERMTICA

VALORAR LA CALIDAD SEMINAL

PRUEBAS

VALORACIN GENERAL(macroscpica)

VALORACIN ESPECFICA(microscpica)


CONTRASTACIN GENERAL

Aspecto

Volumen

Concentracin


Movilidad

Morfologa

Integridad del acrosoma

Integridad de membrana

Penetracin ovocitos

CONTRASTACIN ESPECFICA

Pruebas de contrastacin = Valor predictivo

Fiabilidad : calidad seminal = fertilidad

Repetibilidad

Eficacia: rpidas y baratas

No hay una prueba nica

motilidadPatrn rutinario morfologa

integridad del acrosomaintegridad de membrana


CONTRASTACIN GENERAL

Aspecto

Volumen


Concentracin

Cmaras de recuento celular

Espectrofotmetro(% Absorbancia % Transmitancia = spz/ml)

Contador electrnico de partculas

Cmaras de recuento celular (Hemocitmetro)

Brker

NeubauerThomaBrkerTrk Brker-TrkFuchs-Rosenthal

Partculas contadas

Superficie contada (mm2) x profundidad de la cmara (mm) x dilucinPartculas por lvolumen=

Spz/ml = X spz x factor de dilucin x 4 Spz/ml = X spz x factor de dilucin x 025

1 mm

02

005

(01 mm)


VOLUMEN CONCENTRACIN

Especie Raza Edad y peso del animal Alimentacin Mtodo de recogida. Rgimen sexual Grado de excitacin poca del ao

inflamacin glnd. sexuales

orquitis crnicahipoplasia testicular

falta de estimulacinprocesos patolgicos


MOVILIDADMOVILIDAD

Masal

Individual

Progresin espermtica

0 a 5

%

sin contraste fases10 xgota sobre porta

contraste fases10 xgota plana

%contraste fases10 xgota plana


MOVILIDAD

Analizador automtico de imgen

Caractersticas movilidad

Sistema CASA

(Computer Assisted Motility Analysis)

VCL (mm/s): velocidad curvilnea

VSL (mm/s): velocidad rectilnea

VSL:VCL

VAP (mm/s): velocidad media

VSL:VAP

LIN (%): ndice de linealidad

STR (%): ndice de rectitud

WOB (%): ndice de oscilacin de la cabeza

ALH (mm): amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza

BCF (Hz): frecuencia de batido del flagelo


Swim-up

Spz viables

spz no viables

Medio: STL

Diluyente del esperma

200 g-10 min

Seleccin espermtica


Spz viables

spz no viables Diluyente del semen

BoviPure al 45%EquiPure

BoviPure al 90%EquiPure

Gradiente de Densidad

700 g-15 min

100 g-10 min

Seleccin espermtica


MORFOLOGA


MORFOLOGA

Cabeza

Tracto Intermedio

Cola

Gota citoplasmtica

en gota plana

40x 60x

contraste de fases


MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico

Espermatozoide normal:

1. Vista dorsoventral

2. Vista dorsoventral

3. Vista lateral

Clulas germinales prematuras:

1. Mononucleada

2. Multinucleadas


Anomalas de la cabeza:

1. Macrocefalia

2. Microcefalia

3. Vacuolas nucleares o defecto crter

4. Cabeza cnica

5. Cabeza piriforme

6. Cabeza constricta

7. Cabeza degenerada


Epermatozoides fragmentados:

1. Cabezas sueltas

2. Fragmentados a nivel del annulus


Anomalas de la pieza intermedia:

1. Aplasia segmental de la espiral mitocondrial

2. Distribucin desigual de mitocondrias

3. Espiral mitocondrial engrosada

4-6. Pieza intermedia doblada

7. Piezas intermedias/cabezas dobles

MORFOLOGA

Gota citoplasmtica


1. Proximal

2-3. Distal


Colas enrolladas:

1. Alrededor de la cabeza

2. Sin incluir la cabeza

3. Sin incluir la cabeza

Colas dobladas:

1-4. Pieza principal.

5. Segmento intermedio.

6. Pieza principal y segmento intermedio

Causa de las anomalas morfolgicasTema 19. Anlisis espermtico

La edad

La carencia de ciertos aa esenciales

La carencia de Vit A

La estacin del ao

Influencias trmicas

El reposo sexual prolongado

Ciertas enfermedades hereditarias (hipoplasia)

Trastornos generales

Manejo inadecuado del semental

Insuficiencia tiroidea

Enfermedades infecciosas de los testculos y de las glndulas sexuales accesorias

INTEGRIDAD DEL ACROSOMA



en gota plana60x 100x

contraste de fases


N. Acrosoma ntegro

1. Defecto acrosmico en vista dorsoventral

2. Defecto acrosmico en vista dorsoventral

3. Defecto acrosmico en vista lateral

N

INTEGRIDAD DE MEMBRANA

contraste de fases

40x 60x 100x

en gota plana

Endsmosis celular (HOS Test/HOST)(Hypoosmotic Swelling Tes)

Resistencia osmtica (ORT) (en verraco)


Eosina

Tripn azul

Nigrosina

Rosa Bengala

Marrn Bismarck

Violeta de genciana

Fuchsina

Carboxifluorescena

Ioduro de Propidio

Naranja de Acridina

Bisbenzimida (Hoechst)

Bromuro de etidio

Totales: un colorante

Dobles: varios colorantes

TINCIONES FLUORESCENCIACONVENCIONALES



Tincin eosina-nigrosina(nigrosina= colorante de fondo)

spz teido = spz muerto

spz incoloro = spz vivo

Tincin Hoechst


spz incoloro = spz vivo

Tincin Ioduro Propidio-Carboxifluorescena(IP= naranjas C= verdes)

spz teido = spz vivo


spz incoloro = spz moribundos


en gota plana

60x 100x

fluorescencia


SEMEN PURO

DILUCIN PURA

DILUYOCONSERVACIN

Tema 19. Diluyoconservacin seminal

DILUCIN Y CONSERVACIN ESPERMTICA

DILUYOCONSERVACIN

SEMEN FRESCO

SEMENCONGELADO-DESCONGELADO

SEMEN REFRIGERADO


Volumtrico Temporal

DILUCINAumento del rendimiento

del eyaculado

x


MEDIOS DE DILUCIN CONDICIONES

BIOLGICAS

Presin osmtica adecuada

Equilibrio inico

Capacidad tampn

Fuente de energa

shock a frigore Proteccin

congelacin

SANITARIAS

ECONMICAS

Muestras aspticas

Fcil preparacin

Barato


MEDIOS DE DILUCIN COMPOSICIN

Sustratos energticos: hexosas (fructosa, glucosa, manosa, sacarosa, )

Reguladores de Presin osmtica: azcares sencillos (hexosas)

Reguladores de pH: sulfatos, fosfatos, citratos, PIPES, HEPES, TRES, TIS, MoPS

Reguladores del Equilibrio inico: iones libres (Cl-, Ca++ , estimular la movilidad // EDTA Na+ -quelante, disminuir la movilidad-)

Antibiticos:penicilina, estreptomicina, neomicina, sulfamidas

Protectores de membrana:yema de huevo; fosfolpidos de soja; leche desnatada

Crioprotectores: extracelulares (dextrano); intracelulares (glicerol; DMSO)


Composicin de diluyentes para Refrigeracin Congelacin de esperma Canino

(Morton, 1988)

TRIS (g) 3

cido Ctrico (monohidratado) (g) 1,7

Fructosa (g) 1,25

Yema de huevo 20 % (v/v)

Sulfato de Neomicina (g) 0,1

Agua destilada (ml) 92

Glicerol (ml) 8


Sistema tampn

Regulador presin osmticaFuente de energa

Protector de membrana

Antibitico

Crioprotector

Composicin de diluyentes para Refrigeracin de esperma Ovino (Evans

y Maxwell, 1990)

Citrato sdico (g) 2,37

Glucosa (g) 0,80

Yema de huevo (ml) 20


TRIS (g) 3,63

cido ctrico (monohidratado) (g) 1,99

Fructosa (g) 0,50

Yema de huevo (ml) 14



Sistema tampn



Sistema tampn



DILUYOCONSERVACIN

Temperatura

Obtencin

Refrigeracin

Congelacin

37-38 C

15 C

5 C

-79 C-100 C

-196 C

Shock a frigore

Fenmenos de congelacin


DILUYOCONSERVACIN

Temperatura Congelacin

15 C

5 C

prdida de motilidad

incremento de la permeabilidad de la membrana

reduccin de la actividad metablica

alteraciones del acrosoma

Temperatura Refrigeracin

-79 C-100 C Deshidratacin celular // Formacin de cristales


Tiempo

10

T

e

m

p

e

r

a

t

u

r

a

(

C

)

-80

Hielo Extracelular

salida de agua intracelular

Clula deshidratada conpoco o ningn hielo intracelular(funcional despus descongelacin)

Clula conhielo intracelular(muerta despus descongelacin)


Velocidad de CONGELACIN

Rpida Lenta

Formacin de hielointracelular

Efecto solucin

ptimaptima

CRIOPROTECTORES

EXTRACELULARES INTRACELULARES

DextranoGlicerolDMSO1-2 Metanodiol


REFRIGERACIN15 C 5 C

Reguladores PO Reguladores pH Iones Energa Antibiticos

Reguladores PO Reguladores de pH Iones Energa Antibiticos Protectores membrana

T

Dilucin final:

Envasado (ml):

Duracin:

Conservacin:

: 0,2 C/min

despus de recoger el eyaculado

tubos (100); Pajuelas (0,25-0,50); ampollas vidrio(0,5-1)

6-12-24-72 h 72 h- 6 das

cmaras de refrigeracin


CONGELACIN

Reguladores pO Reguladores pH Iones Energa Antibiticos Protectores membrana Crioprotectores

Envasado (ml):

Duracin:

Conservacin:

pellets (0,1); Pajuelas (0,25-0,50); ampollas vidrio (0,5-1)

tanques de Nitrgeno lquido (-196 C)

ilimitada

Mtodos estticos

CO2 slido (-79 C)

Vapores N lquido (-100 C)

Mtodos dinmicos Biocongeladores

N lquido(-100 C)


CONGELACINT

38 C

Obtencin

final parcial

Dilucin

5 C Dilucin

final

Envasado

5 C

Congelacin

bioplanner

-100 C

Almacenamiento

-196 C


DESCONGELACIN

Lenta

Rpida

5 C - 45 sg

37 C - 30 sg45 C - 15 sg65 C - 6 sg

Soluciones descongeladoras


tema 18.- análisis espermático. dilución y conservación seminal

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