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Tema 19.- ANLISIS ESPERMTICODILUYO-CONSERVACIN SEMINAL
INSEMINACIN ARTIFICIAL
Conjunto de Tcnicas que nos permiten aplicar, en la hembra, el material espermtico en el momento ptimo, en el lugar adecuado, con vistas a obtener una fecundacin, y sin el concurso directo de macho
Metodologas
Diluyoconservacin
Tcnicas aplicacindosis
Pruebas laboratoriales
valoracin
Mtodos
Recogida Espermtica
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Tema 19. Reproduccin y Fundamentos ObsttricosEvaluacin de la calidad seminal:
cundo?
por qu?
Predecir su fertilidad
Evaluarlo en el proceso de conservacin
Siempre tras la recoleccin
En la evaluacin reproductiva del animal joven
En la evaluacin reproductiva del semental durante su vida reproductiva
Cuando existe sospecha o certeza de problemas de fertilidad
En un examen compro-venta
En la evaluacin reproductiva obligatoria: exportacin de sementales,reproductores calificados
Determinar la capacidad del esperma para tolerar los procesos deconservacin seminal (refrigeracin/congelacin)
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Tema 19. Anlisis espermtico
Fertilidad semental = % de gestacin% de nacimientos
Fertilidad de la hembra
Manejo reproductivo
Evaluacin espermtica Fertilidad del semental
Baja calidad seminal Subfertilidad
Alta calidad seminal Fertilidad
=
?
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CONTRASTACIN ESPERMTICA
VALORAR LA CALIDAD SEMINAL
PRUEBAS
VALORACIN GENERAL(macroscpica)
VALORACIN ESPECFICA(microscpica)
Tema 19. Anlisis espermtico
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CONTRASTACIN GENERAL
Aspecto
Volumen
Concentracin
Tema 19. Anlisis espermtico
Movilidad
Morfologa
Integridad del acrosoma
Integridad de membrana
Penetracin ovocitos
CONTRASTACIN ESPECFICA
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Pruebas de contrastacin = Valor predictivo
Fiabilidad : calidad seminal = fertilidad
Repetibilidad
Eficacia: rpidas y baratas
No hay una prueba nica
motilidadPatrn rutinario morfologa
integridad del acrosomaintegridad de membrana
Tema 19. Anlisis espermtico
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CONTRASTACIN GENERAL
Aspecto
Volumen
Tema 19. Anlisis espermtico
Concentracin
Cmaras de recuento celular
Espectrofotmetro(% Absorbancia % Transmitancia = spz/ml)
Contador electrnico de partculas
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Cmaras de recuento celular (Hemocitmetro)
Brker
NeubauerThomaBrkerTrk Brker-TrkFuchs-Rosenthal
Partculas contadas
Superficie contada (mm2) x profundidad de la cmara (mm) x dilucinPartculas por lvolumen=
Spz/ml = X spz x factor de dilucin x 4 Spz/ml = X spz x factor de dilucin x 025
1 mm
02
005
(01 mm)
Tema 19. Anlisis espermtico
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VOLUMEN CONCENTRACIN
Especie Raza Edad y peso del animal Alimentacin Mtodo de recogida. Rgimen sexual Grado de excitacin poca del ao
inflamacin glnd. sexuales
orquitis crnicahipoplasia testicular
falta de estimulacinprocesos patolgicos
Tema 19. Anlisis espermtico
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MOVILIDADMOVILIDAD
Masal
Individual
Progresin espermtica
0 a 5
%
sin contraste fases10 xgota sobre porta
contraste fases10 xgota plana
%contraste fases10 xgota plana
Tema 19. Anlisis espermtico
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MOVILIDAD
Analizador automtico de imgen
Caractersticas movilidad
Sistema CASA
(Computer Assisted Motility Analysis)
VCL (mm/s): velocidad curvilnea
VSL (mm/s): velocidad rectilnea
VSL:VCL
VAP (mm/s): velocidad media
VSL:VAP
LIN (%): ndice de linealidad
STR (%): ndice de rectitud
WOB (%): ndice de oscilacin de la cabeza
ALH (mm): amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza
BCF (Hz): frecuencia de batido del flagelo
Tema 19. Anlisis espermtico
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Swim-up
Spz viables
spz no viables
Medio: STL
Diluyente del esperma
200 g-10 min
Seleccin espermtica
Tema 19. Anlisis espermtico
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Spz viables
spz no viables Diluyente del semen
BoviPure al 45%EquiPure
BoviPure al 90%EquiPure
Gradiente de Densidad
700 g-15 min
100 g-10 min
Seleccin espermtica
Tema 19. Anlisis espermtico
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MORFOLOGA
Tema 19. Anlisis espermtico
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MORFOLOGA
Cabeza
Tracto Intermedio
Cola
Gota citoplasmtica
en gota plana
40x 60x
contraste de fases
Tema 19. Anlisis espermtico
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MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico
Espermatozoide normal:
1. Vista dorsoventral
2. Vista dorsoventral
3. Vista lateral
Clulas germinales prematuras:
1. Mononucleada
2. Multinucleadas
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MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico
Anomalas de la cabeza:
1. Macrocefalia
2. Microcefalia
3. Vacuolas nucleares o defecto crter
4. Cabeza cnica
5. Cabeza piriforme
6. Cabeza constricta
7. Cabeza degenerada
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MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico
Epermatozoides fragmentados:
1. Cabezas sueltas
2. Fragmentados a nivel del annulus
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MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico
Anomalas de la pieza intermedia:
1. Aplasia segmental de la espiral mitocondrial
2. Distribucin desigual de mitocondrias
3. Espiral mitocondrial engrosada
4-6. Pieza intermedia doblada
7. Piezas intermedias/cabezas dobles
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MORFOLOGA
Gota citoplasmtica
Tema 19. Anlisis espermtico
1. Proximal
2-3. Distal
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MORFOLOGATema 19. Anlisis espermtico
Colas enrolladas:
1. Alrededor de la cabeza
2. Sin incluir la cabeza
3. Sin incluir la cabeza
Colas dobladas:
1-4. Pieza principal.
5. Segmento intermedio.
6. Pieza principal y segmento intermedio
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Causa de las anomalas morfolgicasTema 19. Anlisis espermtico
La edad
La carencia de ciertos aa esenciales
La carencia de Vit A
La estacin del ao
Influencias trmicas
El reposo sexual prolongado
Ciertas enfermedades hereditarias (hipoplasia)
Trastornos generales
Manejo inadecuado del semental
Insuficiencia tiroidea
Enfermedades infecciosas de los testculos y de las glndulas sexuales accesorias
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INTEGRIDAD DEL ACROSOMA
Tema 19. Anlisis espermtico
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INTEGRIDAD DEL ACROSOMA
en gota plana60x 100x
contraste de fases
Tema 19. Anlisis espermtico
N. Acrosoma ntegro
1. Defecto acrosmico en vista dorsoventral
2. Defecto acrosmico en vista dorsoventral
3. Defecto acrosmico en vista lateral
N
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INTEGRIDAD DE MEMBRANA
contraste de fases
40x 60x 100x
en gota plana
Endsmosis celular (HOS Test/HOST)(Hypoosmotic Swelling Tes)
Resistencia osmtica (ORT) (en verraco)
Tema 19. Anlisis espermtico
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Eosina
Tripn azul
Nigrosina
Rosa Bengala
Marrn Bismarck
Violeta de genciana
Fuchsina
Carboxifluorescena
Ioduro de Propidio
Naranja de Acridina
Bisbenzimida (Hoechst)
Bromuro de etidio
Totales: un colorante
Dobles: varios colorantes
TINCIONES FLUORESCENCIACONVENCIONALES
Tema 19. Anlisis espermtico
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Tema 19. Anlisis espermtico
Tincin eosina-nigrosina(nigrosina= colorante de fondo)
spz teido = spz muerto
spz incoloro = spz vivo
Tincin Hoechst
spz teido = spz muerto
spz incoloro = spz vivo
Tincin Ioduro Propidio-Carboxifluorescena(IP= naranjas C= verdes)
spz teido = spz vivo
spz teido = spz muerto
spz incoloro = spz moribundos
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INTEGRIDAD DEL ACROSOMA
en gota plana
60x 100x
fluorescencia
Tema 19. Anlisis espermtico
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SEMEN PURO
DILUCIN PURA
DILUYOCONSERVACIN
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
DILUCIN Y CONSERVACIN ESPERMTICA
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DILUYOCONSERVACIN
SEMEN FRESCO
SEMENCONGELADO-DESCONGELADO
SEMEN REFRIGERADO
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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Volumtrico Temporal
DILUCINAumento del rendimiento
del eyaculado
x
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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MEDIOS DE DILUCIN CONDICIONES
BIOLGICAS
Presin osmtica adecuada
Equilibrio inico
Capacidad tampn
Fuente de energa
shock a frigore Proteccin
congelacin
SANITARIAS
ECONMICAS
Muestras aspticas
Fcil preparacin
Barato
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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MEDIOS DE DILUCIN COMPOSICIN
Sustratos energticos: hexosas (fructosa, glucosa, manosa, sacarosa, )
Reguladores de Presin osmtica: azcares sencillos (hexosas)
Reguladores de pH: sulfatos, fosfatos, citratos, PIPES, HEPES, TRES, TIS, MoPS
Reguladores del Equilibrio inico: iones libres (Cl-, Ca++ , estimular la movilidad // EDTA Na+ -quelante, disminuir la movilidad-)
Antibiticos:penicilina, estreptomicina, neomicina, sulfamidas
Protectores de membrana:yema de huevo; fosfolpidos de soja; leche desnatada
Crioprotectores: extracelulares (dextrano); intracelulares (glicerol; DMSO)
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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Composicin de diluyentes para Refrigeracin Congelacin de esperma Canino
(Morton, 1988)
TRIS (g) 3
cido Ctrico (monohidratado) (g) 1,7
Fructosa (g) 1,25
Yema de huevo 20 % (v/v)
Sulfato de Neomicina (g) 0,1
Agua destilada (ml) 92
Glicerol (ml) 8
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
Sistema tampn
Regulador presin osmticaFuente de energa
Protector de membrana
Antibitico
Crioprotector
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Composicin de diluyentes para Refrigeracin de esperma Ovino (Evans
y Maxwell, 1990)
Citrato sdico (g) 2,37
Glucosa (g) 0,80
Yema de huevo (ml) 20
Agua destilada (ml) 100
TRIS (g) 3,63
cido ctrico (monohidratado) (g) 1,99
Fructosa (g) 0,50
Yema de huevo (ml) 14
Agua destilada (ml) 100
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
Sistema tampn
Regulador presin osmticaFuente de energa
Protector de membrana
Sistema tampn
Regulador presin osmticaFuente de energa
Protector de membrana
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DILUYOCONSERVACIN
Temperatura
Obtencin
Refrigeracin
Congelacin
37-38 C
15 C
5 C
-79 C-100 C
-196 C
Shock a frigore
Fenmenos de congelacin
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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DILUYOCONSERVACIN
Temperatura Congelacin
15 C
5 C
prdida de motilidad
incremento de la permeabilidad de la membrana
reduccin de la actividad metablica
alteraciones del acrosoma
Temperatura Refrigeracin
-79 C-100 C Deshidratacin celular // Formacin de cristales
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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Tiempo
10
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
(
C
)
-80
Hielo Extracelular
salida de agua intracelular
Clula deshidratada conpoco o ningn hielo intracelular(funcional despus descongelacin)
Clula conhielo intracelular(muerta despus descongelacin)
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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Velocidad de CONGELACIN
Rpida Lenta
Formacin de hielointracelular
Efecto solucin
ptimaptima
CRIOPROTECTORES
EXTRACELULARES INTRACELULARES
DextranoGlicerolDMSO1-2 Metanodiol
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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REFRIGERACIN15 C 5 C
Reguladores PO Reguladores pH Iones Energa Antibiticos
Reguladores PO Reguladores de pH Iones Energa Antibiticos Protectores membrana
T
Dilucin final:
Envasado (ml):
Duracin:
Conservacin:
: 0,2 C/min
despus de recoger el eyaculado
tubos (100); Pajuelas (0,25-0,50); ampollas vidrio(0,5-1)
6-12-24-72 h 72 h- 6 das
cmaras de refrigeracin
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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CONGELACIN
Reguladores pO Reguladores pH Iones Energa Antibiticos Protectores membrana Crioprotectores
Envasado (ml):
Duracin:
Conservacin:
pellets (0,1); Pajuelas (0,25-0,50); ampollas vidrio (0,5-1)
tanques de Nitrgeno lquido (-196 C)
ilimitada
Mtodos estticos
CO2 slido (-79 C)
Vapores N lquido (-100 C)
Mtodos dinmicos Biocongeladores
N lquido(-100 C)
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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CONGELACINT
38 C
Obtencin
final parcial
Dilucin
5 C Dilucin
final
Envasado
5 C
Congelacin
bioplanner
-100 C
Almacenamiento
-196 C
Tema 19. Diluyoconservacin seminal
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DESCONGELACIN
Lenta
Rpida
5 C - 45 sg
37 C - 30 sg45 C - 15 sg65 C - 6 sg
Soluciones descongeladoras
Tema 19. Diluyoconservacin seminal