Dilución y conservación de Dilución y conservación de

semensemen Tecnología ReproductivaTecnología Reproductiva

Dr. Jaime Ruiz Béjar

Dilución de semenDilución de semen Consiste en mezclar el semen con sustancias Consiste en mezclar el semen con sustancias

llamadas dilutores.llamadas dilutores. Propósitos:Propósitos:

Aumentar el volumen del eyaculado para poder Aumentar el volumen del eyaculado para poder inseminar el mayor número de hembras inseminar el mayor número de hembras posibles.posibles.

Mantener fértiles y motiles a los Mantener fértiles y motiles a los espermatozoides el mayor tiempo posible.espermatozoides el mayor tiempo posible.

Propiedades de los dilutoresPropiedades de los dilutores Aumentar el volumen del eyaculado. Aumentar el volumen del eyaculado. Contener sustancias nutritivas, capaces de mantener Contener sustancias nutritivas, capaces de mantener

con vida a los espermatozoides con vida a los espermatozoides No contener sustancias toxicas para los No contener sustancias toxicas para los

espermatozoides.espermatozoides. Tener la misma presión osmótica que el semen.Tener la misma presión osmótica que el semen. Tener un PH neutro. Debe actuar como sustancia buffer.Tener un PH neutro. Debe actuar como sustancia buffer. Prevenir contra el shock frío.Prevenir contra el shock frío. Contener sustancias anti-bacteriales.Contener sustancias anti-bacteriales. Ser económicos y fáciles de reparar.Ser económicos y fáciles de reparar. Contener sustancias que favorecen la congelación de los Contener sustancias que favorecen la congelación de los

espermatozoides. espermatozoides.

Dilutores más usadosDilutores más usados

CITRATO – Yema de huevo.CITRATO – Yema de huevo. Dilutor a base de leche.Dilutor a base de leche. Dilutor a base de agua de coco. Dilutor a base de agua de coco. Dilutor TRIS – Yema de huevo.Dilutor TRIS – Yema de huevo.

DILUTOR YEMA CITRATODILUTOR YEMA CITRATO

Se prepara de la forma siguiente:Se prepara de la forma siguiente: Se disuelve 2.5 gr. de citrato de sodio Se disuelve 2.5 gr. de citrato de sodio

químicamente puro en 100 cc de agua químicamente puro en 100 cc de agua destilada.destilada.

Se toma 80% de la solución preparada y se Se toma 80% de la solución preparada y se le agrega 20% de yema de huevo.le agrega 20% de yema de huevo.

La preparación de ambos dilutores es para La preparación de ambos dilutores es para semen fresco o refrigerado, cuya duración semen fresco o refrigerado, cuya duración hábil, en refrigeración es de 2 a 3 días. hábil, en refrigeración es de 2 a 3 días.

Preparación del dilutor yema citratoPreparación del dilutor yema citrato

Solución madre

Citrato de Na al 2,9% + 1gr. Glucosa se completa hasta 100 cc de agua bidestilada.

•80% solución madre

•20% yema de huevo

•Sustancias antimicrobiales (penicilina 500 a 1000 UI/cc de dilutor, estreptomicina 500 a 1000 μg/cc de dilutor, sulfanilamida 5 mg/cc de dilutor).

Para semen fresco (15-25ºC) hasta 6-15 horas.

Para semen refrigerado (4 – 5 ºC) hasta 24-36 horas.

Dilutor TRIS – Yema de huevoDilutor TRIS – Yema de huevoSe prepara de la siguiente forma.Se prepara de la siguiente forma.Pesar los siguientes ingredientes:Pesar los siguientes ingredientes:Tris ( hidróximetil amino metano):Tris ( hidróximetil amino metano): 3.605 gr.3.605 gr.ácido cítrico:ácido cítrico: 2.05 gr.2.05 gr.Fructosa.Fructosa. 1.48 gr.1.48 gr.

Se disuelve estos 3 ingredientes en agua bidestilada, Se disuelve estos 3 ingredientes en agua bidestilada, enrasando a 100enrasando a 100 cc. En una probeta graduada.cc. En una probeta graduada.Se toma 80% de la solución y se le agrega 20% de yema de Se toma 80% de la solución y se le agrega 20% de yema de huevo. Ejemplo necesitamos preparar 50 cc de dilutor:huevo. Ejemplo necesitamos preparar 50 cc de dilutor:

El 80% de 50 cc = 80*50/100 = 40 cc.El 80% de 50 cc = 80*50/100 = 40 cc.El 20%(yema de huevo) de 50cc. = 20*50/100 El 20%(yema de huevo) de 50cc. = 20*50/100

= 10 cc.= 10 cc.Todos estos ingredientes son colocados en una probeta y Todos estos ingredientes son colocados en una probeta y enrasados en agua bidestilada a 100 cc. Esta solución enrasados en agua bidestilada a 100 cc. Esta solución también se le llama solución madre o buffer TRIS.también se le llama solución madre o buffer TRIS.

Preparación de dilutor yema trisPreparación de dilutor yema tris

Solución madre

Tris (hidrometil amino metano) 3,605 gr.

Ac. Cítrico 2,024 gr.

Fructosa 1,488 gr

Penicilina 100 UI

Estreptomicina 100 μg

Completar a 100cc con agua bidestilada

Preparación de dilutor yema trisPreparación de dilutor yema tris

Para semen congelado dividir solución madre en A y B.

A B

Solución madre 67,2% 67,2%

Yema de huevo 20,0% 20,0%

Agua bidestilada 12,8% -----

Glicerina ------ 12,8%

La solución A en forma lenta se agrega por las paredes de la probeta.

Luego la solución B se divide en 4 partes y se vacía al semen cada 15 minutos.

Dilutor a base de leche Dilutor a base de leche

Se puede utilizar leche entera, descremada Se puede utilizar leche entera, descremada u homogenizada. Para su uso se calienta u homogenizada. Para su uso se calienta la leche entre 92 y 95 grados centígrados la leche entre 92 y 95 grados centígrados durante 10 minutos en Baño María, luego durante 10 minutos en Baño María, luego se filtra para separar la nata y la espuma, se filtra para separar la nata y la espuma, y cuando alcanza una temperatura de 32 y y cuando alcanza una temperatura de 32 y 34 º C ya puede ser usado como dilutor. 34 º C ya puede ser usado como dilutor.

Dilutor con LecheDilutor con Leche

AA B B

LecheLeche 100%100% 80%80%

Yema de huevoYema de huevo ------------ 15%15%

GlicerinaGlicerina ---------- 5% 5%

La solución A se agrega en forma lenta a temperatura La solución A se agrega en forma lenta a temperatura corporal (37ºC).corporal (37ºC).

Luego la solución B se divide en 4 partes y se agrega cada 15 Luego la solución B se divide en 4 partes y se agrega cada 15 minutos.minutos.

Agentes AntibacterialesAgentes Antibacteriales

El semen recién colectado normalmente trae alta El semen recién colectado normalmente trae alta carga bacterial, aun cuando previo a la colección carga bacterial, aun cuando previo a la colección se haya limpiado el orificio prepucial. Las bacterias se haya limpiado el orificio prepucial. Las bacterias compiten con el semen por nutrientes, alterando el compiten con el semen por nutrientes, alterando el pH. Por lo cual para evitar los efectos nocivos es pH. Por lo cual para evitar los efectos nocivos es conveniente añadir antibióticos, de los cuales los conveniente añadir antibióticos, de los cuales los más usados son.más usados son. Penicilina.-Penicilina.- Se emplea en cantidades de 500 a 1000 Se emplea en cantidades de 500 a 1000 unidades internacionales por cc de dilutor.unidades internacionales por cc de dilutor.Estreptomicina.-Estreptomicina.- Se emplea en cantidades de 500 a Se emplea en cantidades de 500 a 100 microgramos por cc de dilutor.100 microgramos por cc de dilutor.Sulfamilamida.-Sulfamilamida.- Se utiliza en dosis de 5 mg por cc Se utiliza en dosis de 5 mg por cc de dilutor. de dilutor.

Precauciones a tener en cuenta al Precauciones a tener en cuenta al

hacer la diluciónhacer la dilución Es necesario contar con un ambiente de laboratorio limpio y Es necesario contar con un ambiente de laboratorio limpio y

que ofrezca condiciones de higiene adecuadas.que ofrezca condiciones de higiene adecuadas. Debe evitarse la incidencia de los rayos del sol sobre el Debe evitarse la incidencia de los rayos del sol sobre el

eyaculado porque los rayos ultravioleta matan a los eyaculado porque los rayos ultravioleta matan a los espermatozoides.espermatozoides.

El instrumental de vidrio debe ser estéril y completamente El instrumental de vidrio debe ser estéril y completamente seco.seco.

El semen y el dilutor deben mezclarse a una misma El semen y el dilutor deben mezclarse a una misma temperatura de 25 a 30 °C.temperatura de 25 a 30 °C.

El agregado del semen debe hacerse en forma suave. El agregado del semen debe hacerse en forma suave. Debe agregarse el semen al dilutor por las paredes de la Debe agregarse el semen al dilutor por las paredes de la

probeta que contiene el dilutor y no al revés.probeta que contiene el dilutor y no al revés. La tasa de dilución debe estar de acuerdo con las La tasa de dilución debe estar de acuerdo con las

características seminales estudiadas previamente. características seminales estudiadas previamente.

Agregado dilutor “A”Agregado dilutor “A” Previamente preparadoPreviamente preparado

Dilutor ADilutor A

Semen frescoSemen fresco

Baño maríaBaño maría

Agregado dilutor “B”Agregado dilutor “B” En tres proporcionesEn tres proporciones

Técnicas de conservaciónTécnicas de conservación La IA nos ofrece una serie de ventajas sobre el La IA nos ofrece una serie de ventajas sobre el

servicio de la monta natural, dentro de estas la más servicio de la monta natural, dentro de estas la más importante es la que se refiere a la conservación del importante es la que se refiere a la conservación del semen.semen.

En la actualidad solo se utiliza el método de En la actualidad solo se utiliza el método de conservación por conservación por congelacióncongelación debido al avance de debido al avance de la tecnología en cuanto a envases de semen la tecnología en cuanto a envases de semen congelado, instrumental necesario para la congelado, instrumental necesario para la inseminación y los tanques criogénicos de inseminación y los tanques criogénicos de diferentes tamaños que permiten la conservación diferentes tamaños que permiten la conservación de las dosis de semen y la posibilidad de llevar la de las dosis de semen y la posibilidad de llevar la inseminación a lugares de difícil acceso.inseminación a lugares de difícil acceso.

Ventajas de la congelaciónVentajas de la congelación

Permite almacenar el semen por varios años, Permite almacenar el semen por varios años, conservando la misma potencialidad en cuanto conservando la misma potencialidad en cuanto a la fertilidad que cuando se congeló, a la fertilidad que cuando se congeló, posibilitando el uso aún después de muerto el posibilitando el uso aún después de muerto el toro donador.toro donador.

Mediante el uso del semen congelado se logra Mediante el uso del semen congelado se logra solucionar el problema de las distancias, de tal solucionar el problema de las distancias, de tal manera que permita adquirir y usar el semen manera que permita adquirir y usar el semen de los mejores toros probados del mundo.de los mejores toros probados del mundo.

Procedimiento para congelar el semen Procedimiento para congelar el semen usando el dilutor tris yema de huevousando el dilutor tris yema de huevo

Preparación de la solución buffer TRIS - yema de huevo, Preparación de la solución buffer TRIS - yema de huevo, se preparan 2 dilutores de la siguiente manerase preparan 2 dilutores de la siguiente manera

Dilutor ADilutor A Dilutor BDilutor B

Solución buffer TRIS Solución buffer TRIS 67.2 %67.2 % 67.2%67.2%

Yema de huevoYema de huevo 20.0 %20.0 % 20.0%20.0%

Agua bidestiladaAgua bidestilada 12.8%12.8% --

Glicerina Glicerina -- 12.8%12.8%

Total dilutorTotal dilutor 100.0%100.0% 100.0%100.0%

Procedimiento para congelar el Procedimiento para congelar el semen usando el dilutor tris yema semen usando el dilutor tris yema

de huevode huevo Se prepara la solución buffer en cantidad suficiente Se prepara la solución buffer en cantidad suficiente

calculando el Nº de dosis a preparar y la cantidad calculando el Nº de dosis a preparar y la cantidad de dilutor necesario, de la siguiente manera.de dilutor necesario, de la siguiente manera.

Nº de dosis = Nº de dosis = V x [ ] x % motilidad x % de vivos V x [ ] x % motilidad x % de vivos

Nº de espermatozoides por dosisNº de espermatozoides por dosis

Donde:Donde:VV :volumen de semen colectado/cc.:volumen de semen colectado/cc.[ ][ ] :concentración de espermatozoides en :concentración de espermatozoides en

millones / cc.millones / cc.%de motilidad%de motilidad :motilidad expresada en unidades.:motilidad expresada en unidades.%vivos %vivos :%de vivos expresados en unidades.:%de vivos expresados en unidades.Nº de spz/dosisNº de spz/dosis :25 a 30 millones. :25 a 30 millones.

Congelamiento de pajillas de Congelamiento de pajillas de semensemen

Congelamiento de pajillas de Congelamiento de pajillas de semensemen

•Refrigeración 2-3 horas a 4-5 °C (Ambientación).

•Colocar las pajillas sobre la rejilla metálica.

•La temperatura en la rejilla debe ser de 0 °C.

•Se va introduciendo la rejilla dentro de la caja de tecnopor, la temperatura debe bajar 20 °C/minuto hasta llegar a – 140 °C (7 minutos).

•Si el descenso no es a 20 °C/minuto hay que aplicar electricidad (5-10 segundos).

•Al llegar a – 140 °C se introducen la rejilla hasta el fondo de la caja para llegar a – 196 °C.

Almacenamiento de la dosisAlmacenamiento de la dosis Introducir las varillas de aluminio y los globets (tubitos de Introducir las varillas de aluminio y los globets (tubitos de

plástico) dentro del nitrógeno líquido.plástico) dentro del nitrógeno líquido. Usando la pinza de plástico o madera depositar las pajuelas en Usando la pinza de plástico o madera depositar las pajuelas en

los globets y luego estos colocarlos en las varillas de aluminio; los globets y luego estos colocarlos en las varillas de aluminio; en estas condiciones las dosis de semen congelado deben ser en estas condiciones las dosis de semen congelado deben ser rápidamente pasadas a las canastillas de almacenamiento en rápidamente pasadas a las canastillas de almacenamiento en el tanque criogénico, previamente abastecido de nitrógeno el tanque criogénico, previamente abastecido de nitrógeno líquido.líquido.

Es importante verificar antes de almacenar el semen la Es importante verificar antes de almacenar el semen la motilidad espermática, la cual debe estar entre 60 y 70 % motilidad espermática, la cual debe estar entre 60 y 70 % para esto se debe descongelar una pajilla, sacándola de la caja para esto se debe descongelar una pajilla, sacándola de la caja con nitrógeno líquido y colocándola en una cubeta con agua a con nitrógeno líquido y colocándola en una cubeta con agua a 38 – 40 °C por 10 a 12 segundos; sacar la pajilla y cortar por 38 – 40 °C por 10 a 12 segundos; sacar la pajilla y cortar por el extremo correspondiente colocando una gota de semen en el extremo correspondiente colocando una gota de semen en una lámina portaobjetos para observar a unos 200 – 400 una lámina portaobjetos para observar a unos 200 – 400 aumentos si la motilidad es adecuada guardar las dosis de aumentos si la motilidad es adecuada guardar las dosis de semen. semen.

Manejo del tanque de Manejo del tanque de

almacenamiento de la dosisalmacenamiento de la dosis Ejercer un estricto control del contenido de nitrógeno Ejercer un estricto control del contenido de nitrógeno

líquido, el que nunca debe bajar de su nivel normal. Este líquido, el que nunca debe bajar de su nivel normal. Este control debe efectuarse mediante una varilla graduada en control debe efectuarse mediante una varilla graduada en pulgadas o en centímetros. El chequeo debe hacerse cada pulgadas o en centímetros. El chequeo debe hacerse cada 2 a 3 semanas y cuando el nivel este 4 a 5 pulgadas se 2 a 3 semanas y cuando el nivel este 4 a 5 pulgadas se procede al rellenado del tanque con nitrógeno líquido.procede al rellenado del tanque con nitrógeno líquido.

Guardar el tanque en un lugar fresco y seguro, de Guardar el tanque en un lugar fresco y seguro, de preferencia en un lugar con llave cuidar que este siempre preferencia en un lugar con llave cuidar que este siempre con la tapa bien puesta para evitar que se derrame o con la tapa bien puesta para evitar que se derrame o evapore el nitrógeno, con lo cual puede deteriorarse todo evapore el nitrógeno, con lo cual puede deteriorarse todo el semen por efecto de la descongelación.el semen por efecto de la descongelación.

Cuando debe ser transportado es necesario fijarlo bien Cuando debe ser transportado es necesario fijarlo bien para evitar balanceo o choque.para evitar balanceo o choque.

Determinar la localización del semen que se va a usar Determinar la localización del semen que se va a usar antes de abrir el tanque; sacar la pajilla que se necesite e antes de abrir el tanque; sacar la pajilla que se necesite e inmediatamente tapar el tanque .inmediatamente tapar el tanque .

Manipulación adecuada de la PAJILLAManipulación adecuada de la PAJILLA

No exponer la pajilla de semen a temperatura No exponer la pajilla de semen a temperatura ambiente por mas de 20 segundos; nunca ambiente por mas de 20 segundos; nunca levante la canastilla con los portapajillas a levante la canastilla con los portapajillas a una altura que sobrepase el cuello del tanque una altura que sobrepase el cuello del tanque por mas de 40 segundos, si necesita más por mas de 40 segundos, si necesita más tiempo para su trabajo, devolverla al fondo por tiempo para su trabajo, devolverla al fondo por 15 segundos, para restablecer la temperatura 15 segundos, para restablecer la temperatura a la del nitrógeno líquido.a la del nitrógeno líquido.

Usar en lo posible guantes o pinzas de madera Usar en lo posible guantes o pinzas de madera o plástico al manipular el semen, así evitara o plástico al manipular el semen, así evitara quemarse las manos con el nitrógeno líquido. quemarse las manos con el nitrógeno líquido.

Descongelación de la pajillaDescongelación de la pajilla

Disponer de una cubeta con agua a una Disponer de una cubeta con agua a una temperatura de 38 a 40 ºC. temperatura de 38 a 40 ºC.

Pasar la pajilla rápidamente del tanque al Pasar la pajilla rápidamente del tanque al recipiente con agua caliente. recipiente con agua caliente.

La pajilla debe descongelarse en la cubeta por La pajilla debe descongelarse en la cubeta por espacio de 10 a 12 segundos, luego por las cuales espacio de 10 a 12 segundos, luego por las cuales debe ser extraída y secada con una franela o debe ser extraída y secada con una franela o papel higiénico.papel higiénico.

Cargar la pistola de inseminación con la pajilla y Cargar la pistola de inseminación con la pajilla y cortar el extremo libre para luego cubrir la pajilla cortar el extremo libre para luego cubrir la pajilla y el cuerpo de la pistola con la funda plástica. y el cuerpo de la pistola con la funda plástica.

Realizar la inseminación de la vaca. Realizar la inseminación de la vaca.

Generalidades sobre tanque y Generalidades sobre tanque y pajillas pajillas

El tanque contiene pajillas de diferentes toros y razas por El tanque contiene pajillas de diferentes toros y razas por lo que estos deben estar debidamente identificadas. Se lo que estos deben estar debidamente identificadas. Se deben mantener un inventario constante de la existencia deben mantener un inventario constante de la existencia de las pajillas, con la finalidad de mantener un plan de de las pajillas, con la finalidad de mantener un plan de trabajo sin inconvenientes.trabajo sin inconvenientes.

De preferencia se recomienda tener en cada canastilla De preferencia se recomienda tener en cada canastilla del tanque, semen de un solo toro.del tanque, semen de un solo toro.

La presentación del semen congelado en la actualidad solo La presentación del semen congelado en la actualidad solo es en pajilla de 0.5 y 0.25 cc. De capacidad. Este semen es es en pajilla de 0.5 y 0.25 cc. De capacidad. Este semen es envasado en pajillas y pajuelas cuyos extremos son envasado en pajillas y pajuelas cuyos extremos son taponados con alcohol polivinílico (polvo fino de colores taponados con alcohol polivinílico (polvo fino de colores variados) que tiene la propiedad de que al entrar en variados) que tiene la propiedad de que al entrar en contacto con el semen diluido se endurece e contacto con el semen diluido se endurece e impermeabiliza los extremos de las pajuelas. La impermeabiliza los extremos de las pajuelas. La congelación se realiza utilizando nitrógeno líquido.congelación se realiza utilizando nitrógeno líquido.

Mellisho E., E. Flores (2004) Criopreservación de semen ovino en el Perú. Visión veterinaria, ISSN 680-9335, Nº. 37, 2004

Congelamiento de semen en Pellets

EQUIPOS PARA HACER LA EQUIPOS PARA HACER LA INSEMINACION ARTIFIFCIALINSEMINACION ARTIFIFCIAL

EQUIPOS PARA HACER LA EQUIPOS PARA HACER LA INSEMINACION ARTIFICIALINSEMINACION ARTIFICIAL

TERMO DE NITROGENOTERMO DE NITROGENO

INSEMINACION ARTIFICIAL INSEMINACION ARTIFICIAL EN EL VACUNOEN EL VACUNO

RESULTADO DE LA RESULTADO DE LA INSEMINACION ARTIFICIALINSEMINACION ARTIFICIAL