ANLISE FSICA E QUMICA DO CIDO ACETILSALICLICO

FACULDADE ESTCIO DE S

MICROBIOLOGIA BSICA

XIII Encontro de Qumica da Regio Sul (13-SBQSul)

Meios de Cultivo e Tcnicas de SemeaduraGuilhermina Brites1, Inz de Lima Gonalves2, Paulo Ricardo de Souza Moraes31,2,Acadmicas do Curso de Farmcia da Faculdade de Estcio de S.3.Professor da Disciplina de Microbiologia da Faculdade Estcio de S.Palavras-Chave: Microorganimos, Cultivo, Crescimento, Semeadura.1. Introduo

Microbiologia o ramo da biologia que estuda os microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e procariontes, como as bactrias, fungos e vrus.2. Meios de cultivo:

O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.2.1 - Agar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos.

2.2 - gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

2.3 - Agar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas. base do meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos.

2.4 - gar CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus.

Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. INTERPRETAO

Cor original do meio: azul claro.

Colnias lactose positiva: cor amarela.

Colnias lactose negativa: cor azul.

2.5 - Agar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos.

Lactose positiva colorao avermelhada

Lactose negativa colorao inalterada

Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus.

2.6 - gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos.

2.7 - Meio de Rugai - Este meio utilizado para identificao presuntiva das principais espcies de Enterobactrias. Sua finalidade principal a triagem bioqumica de colnias isoladas nos meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidasenegativa. Em um nico tubo a leitura possvel verificar 9 reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentao da glicose em profundidade e da sacarose na superfcie do meio, produo de gs sulfdrico (H2S), gs em glicose, utilizao do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da uria e no tampo do tubo, um desenvolvimento de colorao avermelhada que indica a formao de indol.

2.8 - LWENSTEIN JENSEN

A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis) INTERPRETAO : Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colnias amarelas

Negativo: ausncia de crescimento.

3. Tcnicas de Semeadura e isolamento de Microorganismos

Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obteno de uma cultura pura (colnias isoladas de um nico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material).

Finalidades do isolamento: Identificao de um microrganismo. A simples observao de caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos microrganismos. Para isto, lanamos mo da anlise de uma srie de caractersticas destes, como: caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas caractersticas est na dependncia do microrganismo que se pretende identificar.

Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.Repique: Consiste na transferncia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.4.Mtodos de Isolamento e IdentificaoA identificao da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrio de suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e antignicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado faz parte de uma populao mista, indispensvel o seu isolamento, no sentido de obteno de cultura pura.

5.Mtodos de Inoculao 5.1 - Semeadura em Meio Slidos:

5.2 - Semeadura em Tubos de Ensaio (em meios inclinados) Esgotamento de ala

5.3 - Tcnica utilizada para obteno de crescimento bacteriano e/ou para a observao de propriedades bioqumicas da bactria. A semeadura , geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo (pode tambm ser chamada de estriamento.5.4 - A semeadura tambm pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Esta tcnica realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como poderemos utiliz-la para observar funes metablicas de algumas bactrias.5.5 - Em Picada: Esta tcnica de semeadura utilizada para que se possa observar funes metablicas de alguns microrganismos (bactrias) que so submetidas a anlise microbiolgica.

5.6 - Semeadura em Placas de Petri (em superfcie): O material a ser semeado dever conter poucos microrganismos porque o inculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colnia formada na superfcie de um meio slido originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o nmero, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inculo for obtido a partir de meio slido (inculo pesado), este poder ser diludo em salina estril ou ser utilizada a tcnica de esgotamento adequada.

5.7 - Estrias Mltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazendo estrias sucessivas at o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactrias existentes na amostra. Quando o material muito denso, a ala dever ser flambada.

5.8 - Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou colnias isoladas (aps diluio) utiliza-se o mtodo de espalhamento em placa. Consiste em espalhar o material (suspenso bacteriana na maioria das vezes) com o auxlio de um swab (para obteno de tapete uniforme) ou ala de Drigalski (para obteno de colnias isoladas aps diluio), fazendo a semeadura por toda a superfcie da placa de Petri a ser utilizada nesta tcnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfcie da placa seja semeada, evitando regies sem semeadura. Recomenda-se que faa o procedimento de semeadura com o swab em trs direes distintas, com a ala em toda a superfcie rodando a placa.

6.Tcnica para semeadura em superfcie (meios slidos):6.1 - O inculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluio da cultura em meio slido feito da seguinte maneira:

Retiramos o inculo do tubo com a ala j flambada e fria.

Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapu com a placa.

Colocamos o inculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir atravs de nestriamento (que poder ser contnuo ou descontnuo). O estriamento poder se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a ala duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na ala. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactrias, o que dificultar o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, aps termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a ala, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a ala na ltima estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levandoa a seguir para incubao na estufa, com a tampa voltada para baixo.

Flambar a ala utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.7. Tcnica para semeadura em meios lquidos:Segurar a ala com a mo direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a ala flambada na posio vertical e dever ficar atrs da chama para proteo do operador).

Retirar a rolha de algodo do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que dever estar na mo esquerda) utilizando-se o dedo mnimo da mo direita. A ROLHA DEVER PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MNIMO, AT O FINAL DA OPERAO.

Flambar a boca do tubo, e retirar o inculo com a ala fria.

Flambar novamente a boca do tubo e fechar.

Pegar o tubo onde se ir realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar.

Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar.

Esterilizar a ala, identificar o tubo semeado e levar para incubao em estufa. 8.Tcnica para semeadura em meios semi-slidos:Retirar o microrganismo do meio slido ou lquido com o auxlio de uma ala em agulha j flambada e fria.

Abrir o tubo que contm o meio semi-slido e semear o microrganismo atravs de picada at mais ou menos 1/3 ou do tubo.

Fechar o tubo, identificar e levar para incubao.

Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.8 - Colorao de GRAM:8.1 - Tecnica de GRAM Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min.

Escorrer excesso do corante e lavar.

Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min.

Escorrer excesso do corante e lavar.

Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s.

Escorrer excesso do corante e lavar.

Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s.

Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar.

8.2.Materiais: Laminas

Cristal violeta

Lugol

ter acetona

Fucsina

Bico de pulsen. 9. Colorao de Ziehl-Neelsen9.1 - Tcnica:Cobrir os esfregao com fucsina de Ziehl.

Aquecer at a emisso de vapores (No deixar o corante secar). Esperar 5 minutos;

Lavar com gua corrente;

Descorar com lcool (97%), cido clordrico (1%);

Lavar em gua corrente;

Corar com azul de metileno por 1 minuto;

Lavar e secar; Observar ao microscpio as lminas coradas;

Como se apresentam os BAAR.9.2 - Materiais :a)meio de cultura para microbactria

b)colnias de microbactrias

c)capela de fluxo laminar

d)bico de pulsen

e)Fucsina de Ziehl

f)lcool(97%)Acido Cloridrico(1%)

g)Azul de Metileno

h)microscpio.9.3 - MateriaisAgar Sangue(AS)

Agar Thyer Martin Modificado(TMM)

Agar Chocolate(AC)

Agar Cled-Cystine Lactose Electrolyte Deficient

Agar MecConkey(MC)

Agar Salmonela-Shigella(SS)

EstufaTubosAgradecimentosPrimeiramente a Deus, em segundo a Faculdade Estcio de S e em terceiro lugar, ao Professor Paulo Ricardo de Souza Moraes.RefernciasPreparo de Materiais em microbiologia,Meios de cultura usados no laboratrio, tcnicas de semeadura e Coloraes. Prof(a) DrLuciana Debortolide Carvalho