Conceptos bsicos para el trabajo en microbiologa

Laboratorio de Microbiologa Enolgica y Biotecnologa Centro de Estudios Enolgicos EEA Mendoza, INTA -Argentina

Conceptos bsicos para el trabajo en microbiologaBioseguridad Laboratorio Esterilizacin Medios de cultivo Grupos importantes para la enologa

BioseguridadMaterial de apoyo CD Comisin de Acreditacin de Lab. Microbiologa (AAM) (bioseguridad.pdf) Desinfectantes Gabinetes de seguridad biolgica (tipos y procedimientos seguros) Recomendaciones para la implementaciones de HACCP para vinos (IICA) Requisitos para los locales Control microbiolgico embotellado

Bioseguridad y Laboratorio microbiolgicoImportante conocer antes de montar un laboratorio Se trabaja con organismos vivos: microorganismos Grupos de riesgo: Tipo I: escaso o nulo riesgo individual y comunitario. Nivel de Bioseguridad I: diseo y medios de contencin. Lab bsico: mesadas microbiologa (inocuas) y tcnicas apropiadas de

Normas bsicasSeal en la puerta Informar a personal externo. Cerrar puertas durante trabajo. No pipetear con la boca No comer, beber, fumar o guardar comida ni cosmticos No usar la boca para cortar cintas o pegar etiquetas Mantener laboratorio Limpio y ordenado Contar con desinfectantes para mesadas y accidentes Lavarse las manos al abandonar el laboratorio. Inactivar todos los materiales que salen del laboratorio. Usar guardapolvo y no sacarlo del laboratorio.

Instalacin de laboratorioAdecuar el lugar (techos lisos, pisos, tuberas, iluminacin) Habitacin con puerta (corrientes) Mesadas (continua con pared) Fciles de limpiar Servicios (gas, luz, agua) Droguero y almacenamiento (heladera) Bsico: Estufa Autoclave u olla presin Heladera Balanza Equipo de filtracin con vaco Microscopio Flujo laminar (disposicin) Peachimetro y agua destilada

Mas info en: Libro Fugelsang Laboratory Setup pp 303

Campanas de flujo laminarCmaras de area limpia

No protege al operador

HEPA: se recuperan 3 partculas cuando el filtro es sometido a una dosis de 100.000 partculas Considerar procedimientos seguros (recomendaciones AAM-CD)

Decontaminantes y desinfectantesMezclas de alcohol 70% Hipoclorito de sodio + bacterias y hongos - esporas corrosivo metales

Desinfeccin general 1g/L cloro libre (1000 ppm) Soluciones comerciales (50g/L-50.000 ppm) Fenil-fenol 0,1% 1:50 (1g/L desinfeccin general) 1:10 (5g/L inactivacin virus o patgenos). Lisoform

Otros decontaminates y desinfectantes

Inactivacin de material antes de desechar o lavar Autoclave bolsas autoclavables. Sumergir material en Hipoclorito de sodio.

Introduccin a la microbiologa microscopioBinocular Importante oculares Eleccin de buena ptica Epifluorescencia?

TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS

Campo claro

Campo oscuro

Contraste de fase

USOS Y CUIDADOS Modo de enfoque Precauciones Precaucin al enfocar Objetivos secos sin aceite ni agua Cuidado al rotar los objetivos Apagar la lampara cuando no se usa Cuidar la limpieza No limpiar con alcoholes y solo papel tissue Condiciones para guardado Platina semi baja Limpiar objetivos Cubrirlo

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones Qumicos

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosCONTINUO DISCONTINUOAutoclave: 1/2 atm 3/4 atm 1 atm

Autoclave Tindalizacin112 C 30 min 116 C 20 min 121 C 15 min

IMPORTANTE: eliminar vapor qu esterilizo?

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosFlameado Estufa mechero horno elctrico 160-170 C -2 horas 180 C -1 horaQu esterilizo?

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosDiferentes tipos de filtros IMPORTANTE diam poro 0,2 m bacterias 0,45 m levaduras (ojo VBNC) 2 m filtracion no-esteril

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosEsterilizacin de superficies y ambientes U.V. Letal tiempo de exposicin 180-250 nm no penetra Ionizantes placas de petri , termolbiles

Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosCIDAS o ESTATICOS Alcohol otros 70% conc./composicin

Cultivomedios de cultivo temperaturas oxgeno pH otros monitores con y sin inhibidores mesfilos aerobios-anaerobios acidricos Resistentes a cicloheximida

Microorganismos importantes para el vino

Grupos microbianos importantes para la fermentacin Levaduras Bacterias lcticas

S. cerevisiae O. oeni

VINO

Acidos orgnicos, aa, azcares, factores de crecimiento, etc.

MedioGrado alcohlico bajo pH temperaturas de almacenamiento SO2

Microorganismo alterador: es aquel m.o. que no es deseado en un lugar y tiempo determinado. Ej: M.o. benficos M.o. alteradores

Grupos microbianos importantes para control Hongos Levaduras Bacterias lcticas Bacterias acticas Bacterias mesfilas (coliformes, higiene, etc)

Levaduras: distintas especies importancia de algunas no-Saccharomyces Bacterias: eleccin de medios Mtodos especficos para vinos Interpretacin del resultado

Resultados

Expresin e incertidumbre

Origen del m.o. alteradoresTres etapas donde los m.o. pueden entrar al vino y afectar su calidad Equipamiento de bodega higiene Uva alterada acticas hongos Uva daada altera porcentajes Jugo de uva pH > 3,6 favorece S.c. BAL (Lb, Leuc., Ped.) Acticas

Materia prima

Fermentacin

Conservacin

Botella o barrica Factores higiene exclusion de O2 SO2 adecuada dosis calidad insumos (corchos)

Origen del m.o. alteradores

Hongos

Materia prima Baja higiene bodega

Podredumbre

Botrytis cinerea Alternaria Mucor Aspergillus (toxinas) Penicillium (toxinas)Otros

OTA

Bacterias lcticasPicado lctico BAL heterolctico, actico glicerol, etanol diacetilo

Fermentacin lcticaPiridinas (aa lisina y ornitina) Olor Ratn reptrogusto Fructosa Fermentacin mantica (agridulce) acrolena Amargo + fenoles

homoAc.lctico

Polisacaridos extracelulares Aceite

Acidez voltil Gas Turbidez

Aminas biogenas Carbamato de etilo

Bacterias acticas Picado acticoOxidacin del etanol Bacterias acticas Sensibles al SO2 aerobias

Gluconobacter Acetobacter

Uvas daadas

higiene bodega

control de oxigeno

Alteraciones por LevadurasVeloPichia membranifaciens Candida vini Candida krusei

Deuteromycetes

Levadura de velo (ferm y oxida) Oxidan el etanol Osmofilas algunas especies Producen acetaldehido, esteres y acidos voltiles

RefermentacionesPrincipal levadura de contaminacin en mostos concentrados Vinos edulcorados con mostoZygosaccharomyces bailii

Schizosaccharomyces pombe

Saccharomycodes ludwigii

Saccharomyces cerevisiae

Brettanomyces/DekkeraLevadura Ascomyceta FOH completa (lenta) Barricas y botellas Lenta Resistir SO2 (100 mg/L total 16-50 mg/L libre) Resistir 15% etanol

VBNCImportantes en conservacin o crianza y botella Cultivo puede dar negativo Bioluminiscencia Epifluorescencia Tcnicas alternativas alto limite de deteccin no diferencia levaduras de bacterias colorantes no carcinognicos (intercalan en ADN) decontaminacin

Nuevos fluorocromos liberados por la enzima esterasa Citometra de flujo PCR

Citometra de flujo

LASER PMT 1 PMT 2

Resultados representados en 3 dimensiones: * Tamao y estructura (SSC) / fluorescencia (FL1) * Densidad de poblacion = color - Tamao-estructura (SSC) - poblacion

- fluorescencia (FL1) - poblacion

Fin de fase exponencial de crecimiento (OH 5% vol)

2/3 de FA (OH 8% vol)

OH 11% vol

Fin de FA

Diagnostico de fermentaciones

Gewurz 2008 250

200

150

100

50

0 09-oct

11-oct

13-oct

15-oct

17-oct

19-oct

21-oct

23-oct

25-oct

27-oct

29-oct

Testigo

20 g/HLActivador complejo

40 g/HL fosfato diamonico

20

18

0,7 1,1 5,7

1

16

P p l to e m i n a m o uai n n i l o p r l l

14

7,8

12

10

8,3

8

6

11,5 6

4

9,5

2

0 Tmoin 20g/Hl Activateur complexe base de levures inactives zone 1 (levures trs actives) Zone 2 (levures actives) 40 g/Hl phosphate di-ammonique

Zone 3 (levures peu actives)

PCR en tiempo real

Tolerancia microbiolgica Criterio segn tipo de vinoVino filtrado Elevado pH Vino sin filtrar Bajo pH ( 0,5 g/L) Bajo etanol Elevado etanol Concentracin de S02 molecular Temperatura de almacenamiento

Recuento microorganismos residuales en botella 10 x 105/mL 10 x 104/mL 10 x103/mL 100/mL 10/mL 1/mL

Posibilidad de comercializacin Vinos dulces Vinos secos % riesgo alteraciones 100% 100% ++++ ++++ ++++ +++ + ( comercializacin local) ++++ Tiempo de tranquilidad Conservacin varias semanas 1 a 2 meses Varios mesesexportacin Zona segura Zona segura Zona segura

100/botella 130/L 10/botella

3 meses 4 meses Zona segura

Seminario envasado de vinos 1980

IMPORTANCIAIDENTIFICACIN del m.o. alterador Condiciones para el crecimiento Origen Deteccin

Metabolismo Incidencia Control

PREVENCION

Microorganismos contaminantes importantes para el vino

Conocer Controlar Prevenir