manual de microbiologia 1

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

manual de prácticas

laboratorioMICROBIOLOGÍAGENERAL

María de los Angeles Aquiahuatl RamosMaría de Lourdes Pérez Chabela

Casa abierta al tiempo UNIDAD IZTAPALAPA

DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]

Rector GeneralDr. Luis Mier y Tetón Casanueva

Secretario GeneralDr. Ricardo Solís Rosales

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa

RectorDr. José Lema Labadie

SecretarioMtro. Luis Javier Melgoza Valdivia

División de Ciencias Biológicas y de la SaludDirector

Dr. J. Gerardo Saucedo CastañedaSecretario Académico

M. en C. Arturo L. Preciado López

Departamento de Biotecnologíajefe del Departamento

Dr. J. Mariano García Garibay

ISBN 970-31-0141-0

Primera Edición: 2004Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa

Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F.

Impreso y hecho en México


Casa abierta al tiempo

. ><,• - ? . ' - ' " - '-',

w

de los Angeles Aquiahuatl RamosMaría de Lourdes Pérez Chabela

laboratorioMICROBIOLOGÍAGENERAL



Agradecemos al Director de la División de Ciencias Biológicas y de laSalud Dr. Gerardo Saucedo Castañeda por todo el apoyo para la publica-ción de este manual de prácticas del laboratorio de ,¡ —*: :: ^GENERAL

Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografías.

Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodríguez por su ayuda en eldiseño de las figuras.

A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enri-quecieron este trabajo.



índice7

9

1214151516

2022222324

2830313132

3638383940

4648494949

54565757

PRESENTACIÓN

RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE

PRÁCTICA # 1Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivoPreparación del material de vidrio y medios de cultivoEsterilización de materiales y medios de cultivoPreparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivoPrueba de esterilidad de materiales

PRÁCTICA # 2Preparación, fijación y coloración simple de frotisPreparación de frotisFijación del frotisTinción simpleObservación al microscopio

PRÁCTICA # 3Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivasTinción diferencial de GramTinción selectiva de endosporasTinción negativa para observación de cápsulasObservaciones al microscopio

PRÁCTICA # 4Métodos de cultivo y aislamiento de bacteriasTécnica de estría cruzadaSiembra en tubos con caldo y agar nutritivoSiembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivosCondiciones de incubación

PRÁCTICA # 5Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongosSiembra de hongosDescripción macroscópica de levaduras y mohosDescripción microscópica de levadurasDescripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva

PRÁCTICA # 6Pruebas de diferenciación bioquímicaTécnica de Inoculación en cajas de PetriTécnicas de Inoculación en tubosEvaluación de actividades metabólicas

o•o

o

ntAao•o

manual de prácticas del ?>l~ ' T" ; Ir fX {, f * 4#% „* } ':"'-, ;': ; \ f *í ," *' " J-' <-'" ̂ o < ,



(O

a

64666768

747677

828484

909292

97

101

PRÁCTICA # 7Métodos de cuantificación de microorganismosTécnica turbidimétricaTécnica de cuenta directa en cámara de NeubauerTécnica de dilución y siembra en placa

PRÁCTICA # 8Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbianoEfecto de la TemperaturaEfecto del pH

PRÁCTICA # 9Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbianoEfecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacteriasEfecto de la desecación

PRÁCTICA # 10Curva de crecimiento bacterianoInoculación e incubación del cultivoTratamiento de las muestras

BIBLIOGRAFÍA GENERAL

Anexo 1PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES

105 Anexo 2PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

115 Anexo 3ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS



La Microbiología, es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas dela Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie vanLeeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de LuisPasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismoscomo actores de una gran diversidad de procesos.

Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en-fermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde laantigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos deproducción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entreotros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves-tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.

El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno seinicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en suscaracterísticas morfológicas, nutricionales de crecimiento, control y que ad-quiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio.

Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo delos microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir alprincipio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglasgenerales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiantedeberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismosy garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.

Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiaricegradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias yhongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teóricotrimestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de lascarreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial im-partidas en la UAM-Iztapalapa.

En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar lacomprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios yProcedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se com-plementan con figuras y esquemas.

Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resulta-dos en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se inclu-yen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debeiá resolver con-sultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual.

También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparaciónde soluciones y colorantes (anexo 1) y de medios de cultivo (anexo 2), necesa-rios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) defotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicas dediferenciación microbiana.

o•o

iIIo•o

manual de prácticas del



Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de laUAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu-ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/semana.

Dra. Ma. de Los Angeles AqulahuatlDra. Ma. de Lourdes Pérez Chabela

i

ao



RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!*Reglas de laboratorio

1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarseantes de abandonar el laboratorio.

2. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.

3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio.Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.

4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.

5. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavarmeticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por brevesperiodos.

6. Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberárealizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación deaerosoles.

7. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajoque se realiza.

Procedimientos de laboratorio

1. Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfec-tante que se le proporcionará para este fin.

2. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como desus cuadernos o prendas de vestir.

3. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicaráel profesor.

4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.

5. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato alprofesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar lacalma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:

a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersiónb. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas

manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**

a•o



c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a laeliminación de materiales contaminados.

Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio

1. Bata de laboratorio limpia y con botones

2. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio

3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas.

iDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]


oo

o

Preparación y esterilización de materialesy medios de cultivo



Objetivos introducción

Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam-generales de las técnicas de estéril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podidozación de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad dedios de cultivo de uso común en Mi- hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físi-crobiología. Observará el efecto de co y químico. o

trol de la contaminación microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y este-en el laboratorio. rilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es

un método de eliminación total de todo tipo de organismo y queasegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientrasque la desinfección es un proceso que solamente elimina formasvegetativas de los microorganismos.

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos demayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza lasenzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejem-plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en hornoa 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principal-mente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo dematerial de vidrio y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cul-tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el másrecomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua apresión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja aesta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc-ción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resis-tentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor comolas soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan porfiltración en membranas estériles de 0,2 mieras de diámetro y parael caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gasescomo oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficiesgeneralmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestosquímicos en forma líquida como: los fenoles, compuestoscuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído,alcoholes, halógenos y detergentes.

Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso,los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la este-rilización pero sólo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenolesy compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para ladesinfección de superficies pero son muy corrosivos. Losdetergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra espo-ras bacterianas y algunos virus por lo que sólo son desinfectantes.

1 3

m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l - * . . ' . ; . , ' - . * . , : ; . . . ? . ::* ' , < ; >•<* . , - r - r . r - - "* • ' \



(Oa 1 potenciómetro

1 horno de calor seco

Materiales

7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita9 cajas de Petri de vidrio3 pipetas de 1 o 2 mL3 pipetas de 10 mL1 pipeta Pasteur3 matraces Erlenmeyer de 250 mL1 parrilla de calentamiento con agitación1 autoclave

1 mechero Fisher1 incubadora a 35°C1 hisopo estéril, algodón y gasapapel manila o estraza para envolverCaldo nutritivo (Anexo 2.1)Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 )Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7

Procedimiento

El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en ladesinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesariospara el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudian-te aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante aguacorriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningúnotro medio.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para lostubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre losque finalmente se les colocará un capuchón de papel.

4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en unpotenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivocon tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.

14



Iao•o

5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hastaebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tuboscon tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto seesteriliza en el autoclave.

6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustarel pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto;cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que setaparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.

7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas,dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir aguadestilada.b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia-les en la canasta del autoclave y colocarla dentro.c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vaporde agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente laescala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento mo-viendo la perilla de control al nivel medio o bajo.e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutosf. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayudade guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás paraevitar quemaduras por la salida del vapor.

Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo

1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que elmedio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperaturaaproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sinsentir un calor excesivo.

3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en lascajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.

4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado-samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.

5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

115

manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L



Prueba de esterilidad de materiales

1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubaciónajustada a 30 °C durante 24-48 horas.

2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez,nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formaciónde colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.

3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minutoen el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire".

(0CQ0 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en

área aséptica".

5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control".

Resultados

A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo(AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.

B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimientoregular y (+++) crecimiento abundante.

C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como elmanejo de los materiales.



Cuadro 1

Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.

MEDIODE CULTIVO

AGARNUTRITIVO

MÍNIMODE SALES

PAPA DEXTROSAAGAR

Abierta al aire Abierta en áreaaséptica

Control

atAa«

1)

Cuestionario

¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales seaplica cada uno?

2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo serelacionan estos procedimientos con la pasteurización?

17




• oo

Preparación, fijación ycoloración simple de frotis



Objetivos

Que el alumno aprenda las técnicasde preparación de frotis, de fijacióny coloración más utilizadas en el es-tudio microscópico de cultivosbacterianos, obtenidos de mediossólidos y líquidos. Que identifique lasprincipales formas bacterianas y laimportancia de las tinciones simplesen la caracterización morfológica deestos microorganismos.

Introducción

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, serequiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campooscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio deuso más común es el de campo claro, en el que la observación de célulasvivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el pasode una gran cantidad de luz.

La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se preparahaciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfi-cie transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos.De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos deestudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:simple, diferencial, negativa y selectiva.

Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar resi-duos del medio, que al quemarse darán interferencias en las obser-vaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmentecon calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferen-tes colorantes sintéticos derivados de anilina.

Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car-gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:

Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* +(Cromoforo)

ci-

Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si lacarga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias sonteñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y seadhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas nega-tivas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul demetileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observa-ción de forma, tamaño y arreglo de las células.

o•o

o

Iao•o

21




Materiales

1 Probeta de 100 mL1 Vaso de precipitados de 100 mL1 mechero1 asa de siembra5 PortaobjetosPiceta con agua destiladaMicroscopio compuesto de campo claroAzul de metileno alcalino (Anexo 1.2)Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7)Fenol al 2% (Anexo 1.9)

(0CQ Aceite de inmersióno

Procedimiento

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp.,Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis decada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno.

El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación.

Preparación de frotis

1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).

2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despuésacercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducirel asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.

4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente enun área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotisal aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más.

5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de aguadestilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones delpaso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.

Fijación del frotis

1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer estoen zonas alejadas al mechero).

22



2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaiá el frotis rápida-mente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.

3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que nohubo sobrecalentamiento.

Tinción simple

1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.

2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con aguadestilada.

3. Dejar secaral aire

Marcar el área por debajo del portaobjeto

CULTIVO SÓLIDO CULTIVO LIQUIDO

|

iao•o

Coloque 1 o 2 gotas de agua Colocar 1 o 2 asadas de medio decultivo con asa estéril

Con asa estéril tomar unamuestra de la colonia ymezclarla con el agua

Distribuir en la zona marcada

Dejar secar al aire Dejar secar al aire. Repetir losprocedimientos anteriores dos veces

Pasar rápidamente sobre laflama del mechero

Fijar con 2 gotas de alcohol, ydejar secar al aire

Figura 1. Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos




Observación al microscopio

1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.

3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-mente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gotade aceite de inmersión sobre la preparación.

4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso deaceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Resultados

A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos enel cuadro de resultados.

B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.

24



Cuadro 2Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos

Cultivo: Líquido

Aumento total:

Forma: (cocos, bacilos, etc.)Agolpamiento de las células(solos, pares, cadenas, etc.)

Tamaño:

Cultivo: Sólido

Aumento total:

Forma: (cocos, bacilos, etc.Agrupamiento de las células(solos, pares, cadenas, etc.)

Tamaño:

Escherichla coll Streptococcus sp.

0)

(0t(0a

Cuestionario

1. Investigue cuáles son las estruauras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. Deejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.

2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se debenponer varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis?

25




3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite deinmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?

4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?

ao

5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis?

6. Bibliografía consultada

Referencias bibliográficas

• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.

• johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings PublishingCompany, Inc. USA.

• Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.CRC Press, 1989.

• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.



z

' - s Í ' , - ' -

\ 0

Tinción diferencial de Gram ytinciones selectivas



Objetivos

Que el estudiante clasifique algunasespecies bacterianas en Gram positi-vas o Gram negativas de acuerdo a latinción de Gram. Que observe estruc-turas bacterianas especiales, como lasendosporas y cápsulas con tincionesselectivas. Que comprenda la impor-tancia que tienen estas tinciones parala caracterización e identificación delas bacterias.

introducción

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es unade las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifi-ca los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas yGram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el coloran-te primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero lacombinación con el colorante es más permanente en los gram positivos.

Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disol-vente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo demicroorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina deaquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tantocompletamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy di-fícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorantellamado secundario, como la safranina. Este colorante no modificael color de los microorganismos que habían retenido el color prima-rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados.

Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en lacomposición química y estructura de las paredes celulares, que faci-litan la retención o eliminación del colorante primario después delproceso de decoloración.

Otras tinciones que permiten obtener mayor información son la negativay la selectiva. La tinción negativa facilita las observaciones de lamorfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto delcalor así como de estructuras especiales, como la cápsula de algu-nas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálix esuna estructura externa a la célula, formada de polisacáridos opolipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la dese-cación y la fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezclade las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en elmicroscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que apa-recen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en unfondo obscuro.

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas comolas endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que supresencia, forma y localización son importantes criterios de clasifi-cación taxonómica.

Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunasespecies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su de-tección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés.

manual de prácticas del arabio m:



Materiales

1 Probeta de 100 mL1 Vaso de precipitados de 100 mL1 Parrilla de calentamiento1 Mechero5 Portaobjetos1 Piceta con agua destiladaCristal violeta (Anexo 1.3)Safranina (Anexo 1.8)Lugol (Anexo 1.5)Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6)

en Verde de malaquita (Anexo 1.4)Tinta chinaFenol 2% (Anexo 1.9)Aceite de inmersiónMicroscopio compuesto de campo claro

Procedimiento

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp.,Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.

El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinciónde Gram.

También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinciónnegativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.

Tinción diferencial de Gram

a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto

b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante

c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.

d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua.

e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya mástintura.

f) Inmediatamente lavar con agua.

g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.

h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejarsecar al aire.

iDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]


Tinción selectiva de endosporas

a) Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2).

b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.

c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.

d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) y eliminarel colorante con agua destilada.

e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.

f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire.

ta"O

(a) (b)

(e)

Figura 2. Tinción selectiva de endosporas bacterianas

Tinción negativa para observación de cápsulas

a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota delcultivo líquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del micro-organismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.

b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de45° sobre la muestra.


I

31



10ao

c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.

d) Dejar secar al aire.

(a)

(d)

Figura 3. Técnica de tinción negativa

Observaciones al microscopio

1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota deaceite de inmersión sobre la preparación.

3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el excesode aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.

Resultados

A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.

B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

32



Cuadro 3Descripción microscópica de cultivos baaerianos

Descripción del cultivo: (líquidoo sólido, edad del cultivo, etc.)

Aumento total:

•o

Io

cu

ttia•o

Forma: cocos, bacilosAgolpamiento de las células

Tamaño:

Reacción de Gram

TINCIÓN DE ENDOSPORAS


Aumento total:

Badllus subtills Streptococcus sp

Forma: cocos, bacilosAgrupamiento de las células

Tamaño:

TINCIÓN DE CÁPSULA


Aumento total:

Klebsiellasp. Streptococcus sp

Cuestionario

1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos detinción diferencial.

33




2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

3. ¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma impor-tancia que para las bacterias? ¿Por qué?

4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificul-tades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?

5. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.¿Qué tipo de información se obtiene?Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.



• Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings PublishingCompany, Inc. EEUUA.

• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.México.

• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by FrancésPouch Downes and Keith Ito, 2001.

• Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,USA. CRC Press, 1989.

j• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.



^ í - w'íV

^

Métodos de cultivo yaislamiento de bacterias



Objetivos Introducción

Que el alumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratoriotes técnicas de aislamiento en me- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar susdios de cultivo sólido para la obten- actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa deción de cultivos puros de bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensablesQue el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer,cultivo de uso general, diferencialesy selectivos para el cultivo de dife- Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidosrentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conserva-

ción, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es im-portante recordar que la inoculación de los microorganismos en losmedios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cercadel mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitanla presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.

Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos apartir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en lasque hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobarla pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están forma-dos por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables paraconocer las características morfológicas, propiedades de tinción,actividad bioquímica, patogeniddad, sensibilidad a antibióticos eidentificación de las especies microbianas.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos dedilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líqui-dos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana quese separa daiá origen a una población que formará una colonia ca-racterística, visible a simple vista.

La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es prácticapara el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo deinterés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente seobtendrán las bacterias dominantes.

Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mé-todos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que con-tienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones desales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer elcrecimiento del microorganismo de interés y se conocen como se-lectivos o de enriquecimiento.

En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componen-tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe-cies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan lossustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modifi-cación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen comomedios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización eidentificación de especies bacterianas.

•o

ii8.•o

manual de prácticas del LABORATORIO ÍJ£ MICROBIOLOGÍA GENERAL _tDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]


Materiales

3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB(Anexo 2.3)2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo2.5)2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3)1 tubo con agua destilada estéril2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)1 Mechero

tú 1 Asa d e inoculación0 1 Parrilla d e agitación

1 Autoclave

Procedimiento

El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia colí, Staphylococcusaureus, Pseudomonasfluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp.

También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la quepracticarán la técnica de aislamiento por estría cruzada.

Técnica de estría cruzada

a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asapreviamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a ladosobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).

b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja yenfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.

c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estríasen el segundo cuadrante como en el caso anterior.

d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no sedeberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple).

Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo

1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agarnutritivo inclinado.

2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado enforma recta (Figura 5).

.



•oo

Icua0)

Figura 4. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa

(a)

(b)

Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados y por picadura(b) en tubos solidificados en forma recta.

Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos

1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parteun cultivo puro diferente por estría simple.

2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestraproblema.

39




Condiciones de incubación1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada,

seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra deesta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.

2. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en quese distribuyen a lo largo del tubo.

ResultadosA. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5.

ce0 B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.

40



Cuadro 4Morfología colonial de cultivos bacterianos

Aislamiento por EstríacruzadaForma:Color:Tamaño (mm):Borde-.Superficie:Aspecto:Elevación:Luz transmitida:Luz reflejada:Consistencia:

Siembra en mediosselectivos y diferenciales:

Microorganismo 1:Forma:Color:Tamaño (mm):Elevación:Luz transmitida:Luz reflejada:Consistencia:

Escherichla col i

MEDKDEMB

Streptococcus sp

MEDÍ

(íj0110

MUESTRA PROBLEMA

MEDIO fMÍNIMO

o

(0

a•o

Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios

Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoideBorde: entero, lobulado, aserradoSuperficie: lisa o rugosaAspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosaElevación: convexa, plana, hundidaLuz transmitida: translúcida, opacaLuz reflejada: brillante, mateConsistencia: dura, blanda, mucoide

41




Cuadro 5Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo

Tubos inclinados deAgar Nutritivo

w \y w w

Crecimiento: arborescente,filiforme, rizoide, disperso,puntiforme

Color:

ultivo en tubo deCaldo Nutritivo

Crecimiento: superficiecomo película, como sedi-mento, turbidez en todoel tubo

Color:

Tubos rectos deAgar Nutritivo

r~\

Crecimiento: en forma depelícula superficial, a lolargo de la picadura,solo en el fondo

Color:

i-DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]


Cuestionario

1. ¿Que es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos?

2. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110 y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedadesresponsables de su función como medios selectivos o diferencíales?

O

|o

II

3. ¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-cias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?

4. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinadoy en tubos con agar solidificado en forma recta?


manual de prácticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL _kDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia [email protected]



• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.

• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by FrancésPouch Downes and Keith Ito, 200.

• Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, NewYork, New York, USA.

• Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.

• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.Ed. (1991).



Métodos de cultivo ydescripción morfológica de hongos



5

(0£ao"O


Que el alumno aprenda las técnicas Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bac-de cultivo y manipulación de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmó-tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos.te conozca las principales caracterís-ticas morfológicas (macroscópica y Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicosmicroscópicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son

absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-lulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongosdimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dosformas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta-les como la temperatura.

Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribui-das en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando unacubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu-cen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota unaprotuberancia o yema de la célula madre que posteriormente sesepara como célula individual.

El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifasramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongospresentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de losZygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conocecomo hifas cenocíticas.

El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, porfragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abun-dantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifasaéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripciónde las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio declasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisioneso phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.

Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de lascuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas yanimales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficiosque proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoríason saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienenuna gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentestipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes debiodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos debiorremediación.

47

manual de práct icas del



Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentoscomo: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversasespecies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y quepueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas).

Materiales

4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo2.8)3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA2 matraces Erlenmeyer de 250 mL

m 1 Probeta de 100 mL0 1 Vaso de precipitados de 100 mL

1 Mechero Fisher5 Portaobjetos y cubreobjetos1 Aguja de disección1 Asa de siembraCinta adhesiva transparenteMicroscopio óptico de campo claroAceite de inmersiónAutoclaveIncubadora a 30 °CAzul de lactofenol (Anexo 1.1 )

Procedimiento

El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, RhizopusoliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae.

El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, abase de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.

Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica larealizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.

Siembra de hongos

1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo conaguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.

2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con mediode Czapek-Dox.

3. Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula-ción de bacterias.

4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a28-30 °C durante 3-5 días.

48



Descripción macroscópica de levaduras y mohos

1. Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.

2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características delmicelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color deesporas, cambios en el medio de cultivo, etc.

Descripción microscópica de levadurast

1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno.

2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.

Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva

1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos.

2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de lacolonia.

3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en elcentro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejorposible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.

4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y40X.

5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos,esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.

Resultados

A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cadauno de los microorganismos y colorearlos.

B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.

C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica.

i•o

4 9

m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l : -. ,-*: v : i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ? - - , v . : : ' - í " < t f *



(Omo

conidias

conidióforo

Aspergillus niger

conidióforos

conidias O•10

Penicillium roqueforti

conidióforos

10 \im

conidias

10 ^m 10 \im

Aspergillus flavus

esporangióforo

100

porangiosporas

25 Jim

Rhizopus oligosporus

® Saccharomyces cerevisiae

conidiasconidióforos

10 ¿un

Trichoderma viride10

conidiasOOOOooooooooo

OOOOOO

Penicillium chrysogenum

Figura 6. Descripción microscópica de estructuras de reproducción asexual de algunas especies de hongos.



Cuadro 6Descripción morfológica de hongos

liliillilltllillliilllliiilliilliii

Descripción macroscópica

en PDA

•o

o

i;olor y tamaño:

Aspecto:

Textura:Descripción microscópica:

Aumento total:

Micelio con o sin septos

Tamaño:Estructuras de reproducción

Tamaño:Clasificación (phylum):Descripción macroscópica

en medio Czapek-Dox:

Color y tamaño:

Aspecto:

Textura:Descripción microscópica:

Aumento total:

Micelio con o sin septos

Tcmaño:Estructura de reproducción

Tamaño:Tipo de esporasTamaño:

51




Cuestionario

1. ¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos?

2. Elaborar un cuadro comparativo de caraaerísticas morfológicas, nutridonales y sensibilidad a antibióticos dehongos y baaerias. Mencione las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas baaerianas.

3. Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras.

4. Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos deutilización benéfica.



• Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.

• Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económi-ca, UNAM. México.


52



¿fe*

Pruebas de diferenciación bioquímica



Objetivos

Que el alumno realice algunas prue-bas bioquímicas en medios de cultivocon sustratos específicos que permiti-rán demostrar actividades metabólicasde bacterias y levaduras. Que el estu-diante comprenda la importancia de laspruebas bioquímicas para la caracteri-zación e identificación de estosmicroorganismos.

introducción

El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en losseres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de ener-gía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en losquimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de losfotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientesescenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, soncatalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de lacélula por lo que se conocen como endoenzimas, hay tambiénexoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célu-la para catalizar reacciones fuera de ésta.

En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de losmicroorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, consustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de car-bono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento.

La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de car-bono y energía. Al entrar a la célula, la glucosa será oxidada enforma incompleta (fermentación) o completa (respiración) depen-diendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticasde los microorganismos.

En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de gluco-sa y liberan ácidos orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicascomo productos metabólicos; mientras que las bacterias y levadu-ras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38 ATP/mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas puedenser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condicionesde oxigenación.

Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivocon indicadores de pH, para detectar la producción de ácido o álca-li; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes,sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes activida-des metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos(glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminoácidos y urea, la pro-ducción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas,reductasas, amilasas, lipasas, etc.

Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacterias ylevaduras tienen características coloniales y microscópicas muy si-milares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos o delevaduras morfológicamente similares pertenecen a una mismaespecie. Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferen-ciación e incluso su identificación, cuando el número de pruebases suficientemente amplio.

t(0a•o

55




Materiales

1 Gradilla1 Parrilla de agitación1 Probeta de 100 mL.3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL3 Vasos de precipitados de 250 mL.1 Mechero1 Asa de siembra2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 )2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de

fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo0 de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol

(Anexo 2.9 ).2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)(Anexo 2.11)2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro)solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificadosen forma inclinada (Anexo 2.10 )2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en formarecta (Anexo 2.15 )2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados enforma recta (Anexo 2.17 ).Peróxido de hidrógeno 30 %ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1).

Procedimiento

El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslellasp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema.Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.

Técnica de Inoculación en cajas de Petri

1. Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón.

2. En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes.

3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular.

4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas.

56



Técnicas de inoculación en tubos

1. Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularánmezclando una asada de cada uno de los microorganismos.

2. Los tubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo(Figura 5).

3. Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta)

4. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas.

Evaluación de actividades metabólicas

1. Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidón por el crecimiento y aparición de zonasclaras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a lascajas y observar la aparición de zonas claras sobre el medio que se coloreará de azul como indicativo deprueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dejó sin inocular.

2. En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar-almidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas quesignifican una prueba de catalasa (+).

3. Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen losmismos medios de cultivo pero sin inocular

4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio y agregar unas gotas de solución de TCA(ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio.

5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción degas en la campana de Durham

Resultados

A. Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece unpoco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-)

B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en lapráctica

C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas

D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismoproblema.


57

MMI



Cuadro 7Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica

MEDIO DE CULTIVO

Agar Almidón

Escherichla cotí Saccharomycescerevislae CULTIVO PROBLEMA

Crecimiento:

Color del medio con elugol:

Hidrólisis de almidón:

Prueba de catalasa:Aparición de burbujas alagregar peróxido dehidrógeno:

Reacción de catalasa:

Gelatina Nutritiva:

Crecimiento:

Licuefacción del medio:Formación de nubosidadal agregar TCA al 5%:Hidrólisis de gelatina:

Agar Nutritivo Blando: r\

Crecimiento: superficial,en la parte media,en el fondo:Crecimiento en la picaduraMovilidad:

58



Caldo rojo de fenol r\ r\ r\ r\

1011011Gluc Lac Sac Man

r\ r\

Gluc Lac Sac Man

r\ r\ r\9TI|

aGluc Lac Sac Man

Crecimiento:

Color del medio:

Ácido:

Gas:

Leche tornasolada(Litmus Milk)

ÁddO:Álcali:

Sin cambio:Reducción:Peptonización:Coagulación:Gas:

Caldo Urea

Crecimiento:Color:

Hidrólisis de urea:

59




€«i

íí

mo

Medio TSI

Crecimiento:

Cambio de color:

Producción de H2s:

Producción de gas:

Fermentación del azúcar:

Medio de citrato deSimmons

r\

Crecimiento:

Cambio de color:Utilización de citrato:

Cuestionario

1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las derespiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente?¿Porque?



2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivoutilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas ycuáles son endoenzimas?

!0)

ttiao>•o

3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resul-tados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente laglucosa?

4. ¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en lasuperficie?


manual de prácticas del LABORATORIO PE f¥li€il€>B¡€IL0CI¡Á GENERAL




• McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,Lippicont, Williams & Wilkins.

• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by FrancésPouch Downes and Keith Ito, 2001

• Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,1989.

• Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.Ed. (1991).



Métodos de cuantificaciónde microorganismos



a•o

introducciónobjetivos

Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa)Que el alumno conozca algunas de de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos elas técnicas de cuantificación direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación deta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.más utilizadas. Que compare las ven-tajas y desventajas de cada una en La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utili-función de la información que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración,recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa

y errores en la cuantificación.

El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido yeconómico, aun que no se pueden distinguir las células viables y noviables. Se puede calcular el número de microorganismos en una mues-tra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestraque sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que laobservación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1-5/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumende muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3).

Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición delaturbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativa-mente rápida y que se basa en la capacidad de las célulasmicrobianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como eltamaño de las células en una población es casi constante, el gradode dispersión es proporcional a la concentración de células pre-sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por célulasviables o no viables.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, esla de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo es-pecíficos para la población de interés. Esta técnica se basa en lasuposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o ensu superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en con-secuencia el número de colonias que se observarán a simple vistaserá igual al número de bacterias viables o unidades formadoras decolonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución.

Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproxi-mada del número total de microorganismos, dependiendo del me-dio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones deincubación que favorezcan el crecimiento de todos losmicroorganismos. También pueden presentarse problemas relacio-nados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inocula-ción de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores sies que las células no se separan bien y valores elevados si la tomade las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concen-trado por gravedad los microorganismos.

65




Materiales

6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )10 Pipetas de 1-2 ml_ estériles10 Tubos con 9 mL de ssi (solución salina isotónica= 0.89%NaCI)1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssiVasos de precipitados1 Parrilla de agitación1 espectrofotómetro

w 1 cámara de Neubauerg I pipeta Pasteur

Fenol al 2% (Anexo 1.9)1 Varilla de vidrio doblada en L1 Microscopio compuestoSafranina (Anexo 1.8)

Procedimiento

El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL

El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número decélulas totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadorasde colonias (UFO por dilución y siembra en placa.

Técnica turbidimétrica

1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.

2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm)

3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar laaguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.

4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% detransmitancia.

5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave ymedir el valor de %T.

6. Calcule la absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100)

7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.).

66



o

I8.4)

Técnica de cuenta directa encámara de Neubauer

1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-das (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mLde solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.

2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secarcon papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.

3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipetaPasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejarque la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de lapoblación microbiana.

4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivoseco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.

5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a suvez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado.

6. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que selocalicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza acontar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites delos cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho delcuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce lasposibilidades de contar la misma célula dos veces.

7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso decontar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:

a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar elnúmero de células por mL.

b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de lasesquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células.Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promediopor cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104 para reportar el número de células por mL.

c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células delos cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número decuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promediopor 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104

para reportar el número de células por mL.

67

m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l ' ' - -.*;.:* "<< rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: \ *C --'. -\ '*:. -•'•«' :' **< \.



(OCQü

8. El factor de 104 por el cuál se debe multiplicar el número de células por cuadro grande (C1) es porque estecuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1mm).

# células/cuadro C1 (25cuadros C2) = # células/ 0.1 mm3 X 104 = # células/mL

9. En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección comosigue:

# células/mL en la muestra diluida X (factor de dilución) = # células/ mL en la suspensión original.

1 mm—1 mm 1 mm

::::::::i:E2

1 mnri0.2 mrri

Cuadro 1 (10X)Cuadro 2 (40X)

Figura 7. Cuenta en cámara de Neubauer

Técnica de dilución y siembra en placa

1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 105 hasta 10"9 en condiciones estériles (Figura 8). Se colocarán encajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las últimas tres diluciones.

2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada.

3. Dejar absorber el líquido durante 10 minutos

4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días parahongos filamentosos.

5. Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de colonias seaentre 30 y 300.

68



6. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias por dilución yeste número se multiplicará por el inverso de la dilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-ner la número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original.

1 mL

Cultivo bacteriano

1 mL

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-3 io-4 io-5 io-6 io-7

O.lmL X O . l m L

0)

£(6

a•o

Figura 8. Técnica de dilución y cuenta en placa

Resultados

A. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálcu-los hechos para cada metodología.

B. Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizadapor cada equipo. Discutir en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías decuantificación.

69




Cuadro 8Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas

(0ao

MICROORGANISMO

Escherichia colí

Saccharomycescerevisiae

Turbidez (D.O.) Cuenta en cámara de Neubauer(# células totales/mL)

Cuenta viable en placa(# UFC/mL)

Cuestionario

1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para lacuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno?

2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células.

70



3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificaciónrealizadas.

1(0

£tia•o

4. Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de constituyentes celularespara la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas.


71




cúü


Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.

• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings PublishingCompany, Inc. USA.

• Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.Prentice Hall. España.

• Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.México.

72



I " O»

ai*

Efeao del pH y la temperatura enel crecimiento microbiano



Objetivos

Que el estudiante conozca el efectodel pH y la temperatura como paráme-tros de control del crecimiento micro-biano. Que el alumno comprenda laimportancia de estos factores físico-químicos en la selección de pobla-ciones microbianas en los diferentesambientes en que se encuentran ylos mecanismos de adaptación a ni-vel celular y metabólicos que handesarrollado.

introducción

Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, yaque éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual quesobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi-ficar en tres grupos:

a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad.

b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc-tos tóxicos.

c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especiescoexistentes.

Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los habitatextremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienenpropiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales si-tios. En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos ylas interacciones entre poblaciones adquieren mayor importanciaen la selección de las poblaciones que se encontrarán.

Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratoriocon mayor frecuencia, además de los nutrimentales son losfisicoquímicos como: la temperatura y pH.

Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento quelos caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de creci-miento. También hay límites de temperatura, la temperatura míni-ma en las que son metabólicamente inactivos y una temperaturaarriba de la cuál el crecimiento ya no es posible llamada tempera-tura máxima.

De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, los microorganismosse dividen en psicrófilos (<0°C-20°C), mesófilos (20-40°C), termófilos(40-80°C) e hipertermófilos (80-110°C). La mayoría de hiper-termófilos son arqueas como Methanococcus ¡Qneus. Las diferen-cias entre la temperatura óptima de crecimiento y los intervalos detemperatura entre los cuales es posible el crecimiento de bacteriasy arqueas determinan la separación espacial en la naturaleza deestos dominios de microorganismos.

La concentración de iones hidrógeno del medio afecta directamente alos microorganismos y enzimas, e influye también en la disocia-ción y solubilidad de moléculas que requieren. Sin embargo, algu-nos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones deacidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen apH tan ácido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para produ-cir ácido sulfúrico y son llamado acidófilos.

0)

(6ttia0)"O

75




Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don-de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunasbacterias entéricas y cianobacterias. En general los hongos son más tolerantes a la acidez que las bacterias.

Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que almodificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.

Materiales

2 Cajas de Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo2.6) a jus tado a pH 7.0

fió 2 Cajas de Petri con m e d i o de Papa Dextrosa Agar a justa-0 do a pH 5.0

2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-do a pH 9.022 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación (Bioxon) ajus-tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH5.0 sin amortiguar4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH9.0 sin amortiguador4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19)4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH5.0 con amortiguador4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH9.0 con amortiguador1 Asa de inoculación3 pipetas de 1.0 mL. estériles1 mechero FisherEspectrofotómetroMicroscopio estereoscópicoSoluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10

Procedimiento

El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., unasuspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberánetiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará.

Efecto de la Temperatura

1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas dehongos en cada sección.

2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacerlas observaciones macroscópicas.

76



3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana.

4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.

5. Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48 horas. Medir la D.O.

Efecto del pH1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH

(5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.

2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizandosoluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10.

3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculaciónajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.

4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas y medir la D.O.

5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas dehongos.

6. Incubar las cajas de Petri a 30 °C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas.

7. Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico.

Resultados

A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).

B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas.

ia•o

7 7

m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l . v> - v<;\ -:1; ^>1 ̂ ' ! ' ' S ^ ' n u ' , : ^ ; : < ? ' • ' : : ; . ^ ' : , ' ' i v> .



ao

Cuadro 9Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano

PAPA DEXTROSA AGAR

Aspergí I Ius níger

Morfología de la coloniaa las 72 horas

Morfología microscópicaa la semana

Penidllium roquefortí



CALDO .MICROINOCULACIÓN

Escherlchla col i

15°C

Crecimiento a las24-48 horasAbsorbancia (D.O.)

Pseudomonas

fluorescens


Lactobadllus sp.


TEMPERATURA

30°C

A

45°C

r\

78



Cuadro 10Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano

PAPA DEXTROSA AGAR

Aspergí/fus n/ger



Penidlllum roquefortlMorfología de la coloniaa las 72 horas


CAtDO .MICROINOCULACIÓN

Escherichia col!

lili ¡111

IIff

Con amortiguador Sin amortiguador

Crecimiento a las24-48 horasAbsorbanda(D.O.;

Pseudomonasfíuorescens

Crecimiento a las24-48 horasAbsorbancia(D.O.)

Lactobadllus sp.

Crecimiento a las24-48 horasAbsorbanda(D.O.)

PH5.0

r\

i

PH7.0

r\

PH9.0 PH5.0 PH7.0 PH9.0

79




Cuestionario

1. ¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su tempera-tura óptima de crecimiento?

(0

ffl 2. ¿Como influyó el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? ¿Que diferencias se observaron en los mediosde cultivo amortiguados y sin amortiguar?

3. Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos ypsicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.

4. Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y lascondiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas.



•Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.

• Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España.

• Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of DeterminativeBacteriólogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

80



Efecto de la actividad de aguaen el crecimiento microbiano




Que el estudiante conozca las res- El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para lospuestas de crecimiento de diferen- microorganismos, un factor crítico es la disponibilidad de agua líquidates cultivos microbianos, frente al más que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total deestrés osmótico causado por la adi- agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la acti-ción de azúcares, la adición de NaCI vidad de agua (aw).y la desecación. Que el alumno com-prenda el efecto de estos factores Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorga-sobre la actividad de agua y los me- nismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos delcanismos de adaptación que han de- soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el aguasarrollado los microorganismos. pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La

actividad de agua en términos termodinámicos proporciona unamedida de agua libre y es definida por la ecuación

a -Po nt +n2

Donde P- la presión de vapor de la solución y Po es la presión de vapordel agua pura, n1 y n2 son el número de moles de soluto y solventerespectivamente. Así, si la concentración de soluto aumenta la aw

disminuye, para agua pura la aw es igual a 1.0.

La mayoría de microorganismos solo toleran pequeños disminuciones enla aw y al igual que con otros factores ambientales, hay notablesexcepciones de microorganismos que toleran o incluso requierenactividades de agua reducidas como: las bacterias halofílicas, hon-gos xerofíticos y las levaduras osmófilas. Las bacterias halófilas queviven en ambientes salinos son las que mejor toleran la disminu-ción de la aw independientemente del soluto utilizado para reducir-la, mientras que en las otras la tolerancia varía en función del solutoque se utiliza para disminuirla.

Estas propiedades de disminución de la aw en soluciones es la base dealgunos sistemas de conservación de alimentos, por ejemplo: elsalado del pescado o en la adición de elevadas concentraciones deazúcares en mermeladas.

manual de prácticas del tjmcmKtomo PE f¥t¡Clt€IB¡0L€lGÍA SEüEff AL .



Materiales

1 asa de inoculación1 Espectrofotómetro3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v)3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v)3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa

S 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% desacarosa6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 5 % NaCI6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10 % NaCI36 tubos de ensayo vacíos y estériles5 pipetas de 1mL estériles

Procedimiento

El profesor proporcionará cultivos líquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de trescajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularán por equipo tres de los microorganismos.

Efecto de la presión osmótica yactividad de agua (aw) en hongos y bacterias

1. Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos.

2. Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada unode los medios.

3. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C y los tubos de caldo a 35°C durante 48 horas y hacer las observa-ciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfología de los cultivos en cajas yen tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas.

Efecto de la desecación

1. En series de seis tubos de ensayo vacíos y estériles, con una pipeta estéril, colocar una gota de una suspen-sión de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubouna gota de una suspensión de esporas de Aspergillus niger

2. Cerrar los tubos y dejarlos a la temperatura ambiente durante una semana

3. En dos tubos de cada cultivo agregar 3 mL de caldo nutritivo estéril.

84



4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas.

5. Observar si hay crecimiento o no.

6. Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, después de dos y tres semanas en los tubos restantes.

Resultados

A. Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).

B. Medir la absorbancia de los tubos de cultivo en un espectrofotómetro.

C. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en lapráctica

Cuadro 11Efecto de la presión osmótica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias

ao•o

0.990) = 0.970)

CEPA

Staphylococcus sp.

Crecimiento a las24 horas

Densidad óptica:

Escherichia coli

Crecimiento a las24 horasDensidad óptica:

Baclllus subtílis

Crecimiento a las24 horasDensidad óptica:

Sacarosa10%

NaC11%

A

Sacarosa30%

A A

Nací 5%

r\

Sacarosa60%

r\ A

0.940)

NaCI 10%

A

r\

85




Cuadro 12Efecto de la presión osmótica y actividad de agua en el crecimientos de hongos

mo

(aw = 0.990) ( ^ = 0.970) ( ^ = 0.940)

CEPA

Sacharomycesrouxll

Morfología de la coloniaa las 72 horas:

Morfología de la coloniadespués de una semana:

AspergíIIus nlger



Penlcllllumchrysogenum



Sacarosa10%

Nací 1 % Sacarosa30%

Nací 5% Sacarosa60%

NaC110%

86



Cuadro 13Efeao de la desecación en la recuperación de cepas microbianas de bacterias y hongos

Escheríchla col!

Crecimiento: superficial,depósito:

Absorbanda (D.O.):

Badilus subtilis

Crecimiento: superficial,depósito:

Absorbanda (D.O.):

AspergíIIus nlger

Crecimiento: superficialdepósito:

Absorbanda (D.O.):

SEMANA 1

.1r\<J

! / • • • :

r\ r\<J

\J

r\ r\<J

>

KJ

i.;./->

r\ /^\

r\

**1

r\ r\

U

0)

II

Cuestionarlo

1. Definir brevemente los términos: osmófilo, halófilo, xerófito.

manual de prácticas del LABOItJITOlIlCI OE ¡VfiCHOBiOLd&iA



0)

o

2. ¿Cuáles son las hipótesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas?

3. Explique ¿cuál es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservación de alimen-tos? ¿Que es la plasmoptisis? ¿Que es la plasmólisis?

4. ¿Que relación hay entre la aw y la humedad relativa ?

5. ¿Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias?



• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings PublishingCompany, Inc. USA.

• Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.



88



1O

O

O ^

Curva de crecimiento bacteriano



Objetivos

Que el estudiante conozca las fasesde una curva de crecimiento en uncultivo en lote de Escherichla colLQue el alumno aprenda a calcularparámetros cinéticos (/*, td) caracte-rísticos de las especies bacterianas.

introducción

El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinadapor factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorioóptimas, es posible predecir una curva de crecimiento característica decada especie microbiana.

Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco,experimentará un periodo de adaptación al medio y condicionesde cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dan-do lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividiren 4 partes:

3

ú

ouOí

3

B

tiempo

A) fase de retardo, de adaptación o fase lag, B) fase de crecimientoexponencial o fase log, C) fase estacionaria y D) fase de declina-ción o muerte. La forma de cada porción de la curva y el tiempo deduración de cada fase dependerá de: la especie de microorganis-mo, la preparación del inoculo, la composición química del mediode cultivo y las condiciones ambientales de incubación.

Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sinte-tizando nuevos componentes, durante la fase exponencial losmicroorganismos que se dividen por fisión binaria lo hacen a inter-valos regulares, finalmente el crecimiento de la población dismi-nuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento denutrimentos o la acumulación de productos residuales tóxicos has-ta que la población disminuye.

En general las bacterias crecen con mayor rapidez que losmicroorganismos eucarióticos y los eucarióticos pequeños se desa-rrolla más rápidamente que los grandes.

El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de creci-miento, debido a la ganancia energética que se obtiene de cada vía

•o

titesao•o

91

manual de prácticas del I O £



catabólica de obtención de energía. Así, los microorganismos fermentadores crecerán mas lentamente quelos respiradores.

Materiales

1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de mediolíquido (Anexo 2.18)2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de soluciónsalina isotónica estéril6 Pipetas de 10 mL estériles16 Pipetas de 1 mL estériles1 Potenciómetro1 Mechero Fisher1 Espectrofotómetro y celdas1 Gradilla16 Tubos con 9 mi de solución salina isotónica estéril1 Varilla doblada en "L"12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2)

Procedimiento

El profesor inoculará Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes deiniciar la práctica, que se utilizará como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concen-tración de glucosa.

Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los méto-dos turbidimétrico y el de diluciones y siembra en placa (práctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano.

Inoculación e incubación del cultivo

1. Inocular en condiciones estériles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejocon 10 mL de un cultivo de Escherichia coli

2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con unapipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponderá al tiempo cero(t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas deincubación se tomarán 6 mL

3. Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35°C

Tratamiento de las muestras

1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm. Leer el valor de la densidadóptica (Figura 9).

92



2. En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 mL del cultivo en un matrazErlenmeyer con 99 mL de solución salina isotónica (ssi) estéril. Del matraz con la muestra diluida, hacer unaserie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estéril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestrascada vez que se haga una nueva dilución.

3. Enseguida inocular 0.1 mL de las últimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuirla muestra con una varilla de vidrio doblada en "L".

4. Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48horas.

5. Cuantificar el número de UFC/mL de Escherichia colL

10 mL

t(0ao•o

055(5)

(6)

Figura 9. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una curva de crecimiento.

93




ü

Resultados

A. Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14.

B. El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independientesiempre será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa

a. Una gráfica de D.O. contra el tiempo

b. En la gráfica a) identificar las fases de crecimiento y duración

c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# deUFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento

d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la fórmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempode generación de Escherichia co/í con la relación td= In2/fi

Cuadro 14Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un

cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa

Tiempo de muestreo (h)

0

0.5

1

2

3

4

6

Turbidez (D.O.) UFC/mL

94



Cuestionario

1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren encada una de las etapas de crecimiento?

!a

2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag en lacurva de crecimiento. ¿Que condiciones la incrementaría?

3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica


95






• Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent, B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc.


ao

96



oo



Brooks, G.F., ButelJ.S., Morse, S.A. 1999. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorialel Manual Moderno. 16a. Edición.

Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.

Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza,España.

Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.Prentice Hall. España.

Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent., B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie.Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc.

Manual de Medios de Cultivo. Bioxon.

Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.México.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 (4th Edition) Edited byFrancés Pouch Downes and Keith Ito. American Public Health Assosiation.

Practical Handbook of Microbiology. 1989 William M O'Leary (Ed), Cornell Medical College, New York,New York, USA. CRC Press.

Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated(APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater. Ed. (1991).

|

£tia•o

99

m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l / ^ K / f - u v ^ Y ;-: i - ; - ; : " . ' " ; " , : ' ' *



100



0

0'J$fF*F

Preparación de solucionesy colorantes



1. Azul de lactofenol

Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales)en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de áci-do láctico y 40 g de glicerol. Posteriormente di-solver 0.05 g de azul de metilo.

2. Azul de metileno alcalino

Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL dealcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mL desolución de hidróxido de potasio al 0.01%

3. Cristal violetaEste colorante se prepara en dos partes,

a. Solución a: en un vaso de precipitados de 50mL colocar 10 mL de alcohol etílico y disolver1 g de cristal violeta. Solución b: en otro vasose disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en

40 mL de agua destilada.

b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a)y b)

c. Guardar la mezcla en un frasco ámbar enobscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papelWhatman No. 1 antes de utilizarlo.

4. Verde de malaquitaDisolver 5.0 g del colorante verde de malaquitaen 100 mL de agua destilada.

5. Solución de lugolEn un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 deyoduro de potasio en 20 mL de agua destilada yenseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo,mezclar completamente y aforar con agua desti-lada.

6. Solución decolorante alcohol-acetonaColocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alco-hol etílico y 20 mL de acetona, mezclar perfecta-mente.

7. Alcohol al 70%

8. SafraninaEn un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL dealcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Afo-rar con agua destilada

9. Solución de Fenol al 2%En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g defenol cristales y disolver con un poco de agua pocoa poco, después aforar con agua destilada.

10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo

PH

2.83.64.45.26.06.87.68.49.210

K2HPO4

0.2 M (mL)

0.30.60.91.11.31.51.9---

Ácido Cítrico0.1 M (mL)

1.71.41.10.90.70.50.1---

Ácido Bórico0.2 M (mL)

-------

1.71.31.0

NaOH0.2 M (mL)

------

0.30.71.0

Caldo Nutritivo(mL)

8.08.08.08.08.08.08.08.08.08.0


103



104

:\.k



oo *

**0

Preparación de medios de cultivo



1. Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias

ingredientesPeptona de caseínaNaCIExtracto de carnePH

<g/L)5.08.03.0

6.5-7.0

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicadob. Ajustar el pHc. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de roscad. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

2. Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes

ingredientesPeptona de caseínaNaCIExtracto de carneAgarPH

(g/t)5.08.03.015.0

6.5-7.0

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar.b. Ajustar el pHc. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minutod. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutose. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

3.Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacteriaspoco exigentes.

ingredientes (g/L)Glucosa"(NH4)2SO4

MgSO4«7H2OK2HPO4

FeSO4-7H2ODH

Medio 1.10.05.02.02.00.1

6.5-7.0

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa.b. La glucosa debeiá disolverse en recipiente separado de las sales.c. Ajustar el pH en el medio de sales.d. Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullición durante 1 minuto.e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos las dos soluciones.f. Dejar enfriar a 40°C y cerca del mechero mezclar las soluciones.g. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

manual de prácticas del \ - ".": \¿ ¿ ?í Va\O :*T:

107



4. Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identifica-ción y diferenciación de enterobacterias.

IngredientesPeptona de gelatinaLactosaSacarosaK2HPO4

EosinaAzul de metilenoAgar

<g/L)10.05.05.02.00.4

0.06513.5

(0

ca a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Calentar a ebullición durante 1 minutoc. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutosd. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

5. Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificación deestafilococos.

ingredientes (g/L)Extracto de levadura 2.5Peptona de caseína 10.0Gelatina 30.0Lactosa 2.0D-Manitol 10.0NaCI 75.0K2HPO4 5.0Agar 15.0pH final 7.0

a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Calentar a ebullición durante 1 minutoc. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutosd. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

6. Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos.

IngredientesGlucosaExtracto de papaAgarPH

(g/L)20.04.015.05.6

a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Ajustar el pHc. Calentar a ebullición durante 1 minutod. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutose. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.



7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio sólido complejo de uso general para el aislamiento dehongos

Ingredientes (g/L)Glucosa 20.0Extracto de papa 4.0Rosa de bengala 0.03Agar 15.0pH 5.6

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agarb. Ajustar el pHc. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minutod. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutose. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

8. Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes.

(0

a•o

IngredientesSacarosaNaNO3

KH2PO4

MaSO4-7H2OKCIFeSO4-7H2OAgarPH

<g/u30.02.01.00.50.50.0115.05.6

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. Ajustar el pHb. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minutoc. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutosd. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.

9. Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas defermentación

IngredientesAzúcarKH2PO4

K2HPO4

Extracto de levaduraRojo de fenolpH final

(g/L)20.09.19.50.1

0.016.8-7

a. Disolver cuidadosamente las sustanciasb. Ajustar el pHc. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de roscad. Colocar un tubo de Durham invertidoe. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

109




10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización de citrato en enterobacterias

IngredientesCitrato de SodioK2HPO4

NH4H2PO4

MgSCy7H2ONaCIFeSCy 7H2OAgarAzul de bromotimolPH

(g/U2.01.01.00.25.0

0.0115.00.087.0

(0CQ0 a. Disolver cuidadosamente las sustancias

b. Ajustar el pHc. Calentar a ebullición durante 1 minuto.d. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutosf. Dejar solidificar el medio en forma inclinada.

11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros delgénero Proteus de Salmonella yShlgella

IngredientesUreaKH2PO4

K2HPO4

Extracto de levaduraRojo de fenolpH final

<g/U20.09.19.50.1

0.016.8

a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

12. Medio SIM. Medio semisóiido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos deEnterobacterias y que detecta la producción de sulfuras, indol y movilidad de las mismas.

Ingredientes (g/L)Peptona de caseína 20.0Peptona de carne 6.1Sulfato de hierro y amonio 0.2Tiosulfato de sodio 0.2Agar 3.5pH final 7.3


110



13. Agar almidón. Para determinar actividad amilolítica

ingredientes (g/UAlmidón 10.0Peptona de caseína 5.0NaCI 8.0Extracto de carne 3.0Agar 15.0pH 6.5-7.0

a. Disolver cuidadosamente las sustanciasb. Ajustar el pHc. Calentar a ebullición durante 1 minuto.d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de susmúltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo

ingredientes (g/L)Leche descremada deshidratada 100Polvo de tornasol 0.75


15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basaen la formación de sulfuros y fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa.

ti

t(8aoT3

ingredientesMezcla de peptonasNaCILactosaSacarosaDextrosaSulfato de amonio férricoTiosulfato de sodioRojo fenolAgarpH final

(g/L)20.05.010.010.01.00.20.2

0.02513.07.3

a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Calentar a ebullición durante 1 minuto.c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutose. Dejar solidificar el medio en forma inclinada.

111




16. Medio de gelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas

IngredientesPeptona de gelatinaExtracto de carne de resGelatinapH final

(g/U5.03.0

120.06.8

a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

QQ

17. Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisóiido complejo de uso general para determinar movi-lidad de bacterias

IngredientesPeptona de caseínaNaCIExtracto de carneAgarPH

(0/L)5.08.03.03.5

6.5-7.0

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicadob. Ajustar el pHc. Calentar a ebullición durante 1 minutod. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de roscae. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos

18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentracionesde sustrato carbonado. (1-20 g/L)

IngredientesGlucosaPeptona de caseínaExtracto de levaduraK2HPO4

PH

(g/L)10.02.00.50.56.5

a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado.b. Agregar la cantidad de glucosa correspondientec. Ajustar el pHd. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

112



19. Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos de Lactobacilos y otrosmicroorganismos utilizados en ensayos microbiológicos.

ingredientesExtracto de levaduraMezcla de peptonasDextrosaKH2PO4

Polisorbato 80PH

<g/U20.05.010.02.00.16.5

•oo

{a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. wb. Ajustar el pH oc. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

113

manual de prácticas del * > > ,



114



• ; •; --

Atlas de pruebas bioquímicas



116



CITRATO DE SIMMONSa: negativo, b: y c: positiva

USINA DESCARBOXILASAa: negativo, b:, c: y d: positiva

TRIPLE AZÚCAR HIERROa: negativo, b: ácido/ácido

c: ácido/alcalino con gas

PRODUCCIÓN DE GAS EN CAMPANA DE DURHAMa: negativo, b: positivo con gas, c: positivo sin gas

SULFURO INDOL MOHLIDADa: sin inocular, b: microorganismo no móvil,

c: microorganismo móvil

LECHE TORNASOLADAa: negativo, b:, c: y d: positiva

AISLAMIENTO DE Rhodotorulasp.



Manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología General, se terminó de imprimiren el mes de junio de 2004 en la Sección de Talleres Gráficos del Departamento de Publica- }** -> ¿0ciones de Rectoría General de la Universidad Autónoma Metropolitana. Se tiraron 1000 ejem- *> # ^ #npiares sobre papel gráfico bond de 60 kgs., en tipos Castle de 11 y 13 pts., en interiores y de » O * *32 y 17 pts., para portada. Diagramación, formación y portada, diseñados por D.G. LilianaHidalgo Sánchez de Tagle, de la Sección de Textos y Formación del mismo Departamento. kfQ ** 0



N.E. 0534

$17.00

9 789703 101412Manual de prac. lab demicrobiología general,

publicaciones CBS

UAM-Iztapalapa Librería



manual de microbiologia 1

Health & Medicine