laboratorio clinico y nutricion
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Síndrome MetabólicoTRANSCRIPT
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LABORATORIO CLNICO Y NUTRICIN
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EL LIBRO MUERE CUANDO LO FOTOCOPIA
AMIGO LECTOR:
La obra que usted tiene en sus manos posee un gran valor.En ella, su autor ha vertido conocimientos, experiencia y mucho trabajo. El editorha procurado una presentacin digna de su contenido y est poniendo todo su empe-o y recursos para que sea ampliamente difundida, a travs de su red de comerciali-zacin.
Al fotocopiar este libro, el autor y el editor dejan de percibir lo que corresponde a lainversin que ha realizado y se desalienta la creacin de nuevas obras. Rechacecualquier ejemplar pirata o fotocopia ilegal de este libro, pues de lo contrarioestar contribuyendo al lucro de quienes se aprovechan ilegtimamente del esfuer-zo del autor y del editor.
La reproduccin no autorizada de obras protegidas por el derecho de autor no sloes un delito, sino que atenta contra la creatividad y la difusin de la cultura.
Para mayor informacin comunquese con nosotros:
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LABORATORIO CLNICO Y NUTRICIN
Editor Responsable:Dr. Martn Martnez Moreno
Editorial El Manual Moderno
MC. Mara Teresa Gonzlez MarTnezQumico Clnico Bilogo, Facultad de Medicina, UANLMaestra en Enseanza, Facultad de Qumica, UANL
Maestra en Ciencias de los Alimentos, Universidad Autnoma de Barcelona.
Coordinadora Acadmica del rea Bsica, Facultad de Salud Pblica y Nutricin, UANL
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IMPORTANTE
Los autores y la Editorial de esta obra han tenido el cuidado de comprobar que las dosis y esquemas teraputicos sean correctos y compatibles con los estndares de aceptacin general en la fecha de la publicacin. Sin embargo, es difcil estar por completo seguro que toda la informacin proporcionada es totalmente adecuada en todas las circunstancias. Se aconseja al lector consultar cuidadosamente el material de instrucciones e informacin incluido en el inserto del empaque de cada agente o frmaco teraputico antes de administrarlo. Es importante, en especial, cuando se utilizan medicamentos nuevos o de uso poco frecuente. La Editorial no se responsabiliza por cualquier alteracin, prdida o dao que pudiera ocurrir como consecuencia, directa o indirecta, por el uso y aplicacin de cualquier parte del contenido de la presente obra.
Laboratorio clnico y nutricin D.R. 2012 por Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.ISBN: 978-607-448-211-9ISBN: 978-607-448-213-3 versin electrnica
Miembro de la Cmara Nacionalde la Industria Editorial Mexicana, Reg. nm. 39
Todos los derechos reservados. Ninguna parte deesta publicacin puede ser reproducida, almacenadaen sistema alguno de tarjetas perforadas o transmitidapor otro medio electrnico, mecnico, fotocopiador, registrador, etctera sin permiso previo por escritode la Editorial.
Director editorial y de produccin: Dr. Jos Luis Morales Saavedra
Editora asociada: LCC Tania Uriza Gmez
Diseo de portada: LDG Elena Frausto Snchez
Para mayor informacin en: Catlogo del producto Novedades Distribuciones y mswww.manualmoderno.com
Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. ,
Av. Sonora nm. 206,Col. Hipdromo,Deleg. Cuauhtmoc,06100 Mxico, D.F.
(52-55)52-65-11-00
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Nos interesa su opinin,comunquese con nosotros:
Gonzlez Martnez, Mara TeresaLaboratorio clnico y nutricin / Mara Teresa Gonzlez Martnez.
-- Mxico : Editorial El Manual Moderno, 2012.xii, 196 pginas : ilustraciones ; 23 cm.
Disponible en formato electrnicoIncluye ndiceISBN 978-607-448-211-9ISBN 978-607-448-213-3 (versin electrnica)
1. Diagnstico de laboratorio. 2. Bioqumica clnica Manuales de
Laboratorio. 3. Nutricin Manuales de laboratorio. 4. Metabolismo Manuales de laboratorio. I. ttulo.
616.0756-scdd21 Biblioteca Nacional de Mxico
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CONTeNIdO
Agradecimientos .................................................................................. IX
Presentacin ........................................................................................ XI
Captulo 1. Introduccin a la bioqumica clnica ..................................1
Unidades de medicin ..............................................................1
Sistema Internacional de Unidades (SI) ....................................2
Materiales para laboratorio ......................................................3
Calidad analtica en el laboratorio clnico .................................6
Captulo 2. Instrumentos utilizados en el laboratorio clnico ...................................................11
Espectofotmetro ...................................................................11
Electroforesis .........................................................................21
Captulo 3. Recoleccin y manejo de muestras de sangre y orina .............................................................29
Plasma y sangre completa ......................................................30
Obtencin de sangre completa o plasma ................................30
Anticoagulantes ....................................................................30
Obtencin de suero ................................................................32
Recipiente de recoleccin ......................................................32
Recoleccin de muestras de orina ..........................................34
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VI
Laboratorio cLnico y nutricin contenidoLaboratorio cLnico y nutricin contenido
Captulo 4. Introduccin a la hematologa ..........................................37
Hematopoyesis .......................................................................37
Sistema hematopoytico ........................................................38
Catabolismo de la hemoglobina ..............................................43
Medicin de bilirrubina ..........................................................46
Anemia ..................................................................................47
Leucopoyesis .........................................................................50
Granulocitos neutrfilos (PMN) ..............................................51
Granulocitos eosinfilos .........................................................52
Basfilos y mastocitos ............................................................53
Monocitos y macrfagos .........................................................54
Linfocitos ...............................................................................54
Plaquetas o trombocitos ........................................................57
Captulo 5. Indicadores hematolgicos ..............................................63
Serie roja ..............................................................................63
ndices eritrocitarios ..............................................................64
Indicadores de hierro .............................................................67
Indicadores de inmunidad .....................................................71
Reaccin de hipersensibilidad cutnea retardada ...................71
Captulo 6. Protenas ........................................................................75
Protenas plasmticas (PT) .....................................................75
Mediciones de protenas totales en suero (PT) .........................76
Indicadores de protena visceral .............................................77
Protenas de fase aguda positiva ............................................81
Indicadores de protena somtica ...........................................84
Captulo 7. Evaluacin de la funcin renal .........................................89
Urea ......................................................................................89
Creatinina .............................................................................92
Mtodos de laboratorio ...........................................................93
Depuracin de creatinina .......................................................93
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Laboratorio cLnico y nutricin contenidoLaboratorio cLnico y nutricin contenido
VII
Captulo 8. Lpidos.............................................................................95
Colesterol ..............................................................................95
Triglicridos (triacilglicerol) ....................................................95
Fosfolpidos ...........................................................................96
cidos grasos no esterificados ................................................96
cidos grasos libres (AGL) ....................................................102
Perfil de lpidos ....................................................................104
Captulo 9. Pruebas diagnsticas y de control del paciente diabtico ....................................................107
Metabolismo de los carbohidratos ........................................107
Prueba para diagnstico de diabetes ....................................110
Pruebas de control del paciente diabtico .............................114
Fructosamina .....................................................................115
Microalbuminuria (microproteinuria) ...................................115
Glucosuria ...........................................................................116
Captulo 10. Enzimas de inters clnico .............................................119
Enzimologa clnica ..............................................................119
Medicin de la actividad enzimtica .....................................121
Captulo 11. Minerales y vitaminas ....................................................139
Minerales .............................................................................139
Vitaminas ............................................................................146
Captulo 12. Estudio bsico de orina ..................................................165
Funcionamiento del rin ....................................................165
Referencias ........................................................................................179
Anexos ...............................................................................................181
ndice ................................................................................................189
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IX
AgRAdeCImIeNTOs
A las autoridades de la Universidad Autnoma de Nuevo Len y de la Facultad de Salud Pblica y Nutricin, por su apoyo para la elaboracin del presente libro.
A todas las personas que participaron en la revisin, captura de textos y diseo de las pginas de este documento.
A las LN Cynthia Gucciardo Guerra, Mara Elena de Jess Garza Badillo y Anglica Sagrario Chvez Covarrubias, por su apoyo en la edicin y correccin del manuscrito.
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XI
PReseNTACIN
El objetivo de este libro es ofrecer material de apoyo a los estudiantes de la licenciatura en Nutricin, en el rea de nutricin clnica. En este texto los estudiantes podrn encontrar informacin acerca de los fundamentos de bio-qumica clnica.
El libro est dividido en 12 captulos. En el primer apartado se encuen-tran las bases de la bioqumica clnica, tales como las unidades de laboratorio clnico en que se reportan los estudios de los diversos lquidos biolgicos y la transferencia de unidades de medicin del sistema convencional al Sistema Internacional de Unidades (SI). En los dos captulos siguientes se abordan los mtodos y las tcnicas ms actualizadas que se aplican en el laboratorio clni-co. Los nueve captulos restantes se refieren a los indicadores hematolgicos y bioqumicos ms empleados por el nutrilogo en la elaboracin del diagnstico nutriolgico del individuo sano en las diferentes etapas de la vida, incluyendo la interpretacin del estudio bsico de orina.
Asimismo, se presentan los indicadores hematolgicos y bioqumicos utiliza-dos en el diagnstico y seguimiento de las patologas ms frecuentes en nuestro pas, tales como la ateroesclerosis, la diabetes mellitus y la desnutricin.
Al final de cada captulo el lector hallar una serie de ejercicios como apoyo para su aprendizaje y conozca sus avances sobre cada tema. Adems, el texto ha sido reforzado con tablas de valores bioqumicos de referencia de las diferentes etapas de la vida, a fin de que sirvan al lector como consulta en la evaluacin del estado nutricio.
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XII
Laboratorio cLnico y nutricin introduccin a La bioqumica cLnica
De manera paralela a los avances cientficos y tecnolgicos en el manejo, procesamiento, anlisis e interpretacin de datos en la atencin del nutrilogo, surge una mayor preocupacin acadmica por desarrollar los valores de veraci-dad, precisin, certeza, honestidad y responsabilidad profesional. En ese orden de ideas, la presente obra pretende constituirse en una aportacin encaminada a nutrir dichos valores.
ma. Teresa gonzlez martnezPTC-FasPyN-UANL
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Captulo 1IntroduCCIn a la bIoqumICa ClnICa
UNIDADES DE MEDICIN
El Sistema Mtrico Decimal es el ms utilizado por el laboratorio clnico para expresar la concentracin de metabolitos o electrlitos medidos en suero o plas-ma humano. Este sistema se denomina MKS debido a que sus unidades son el metro, el kilogramo y el segundo. Actualmente se utiliza el Sistema Internacional de Unidades (SI). En el cuadro 1-1 se describen las unidades bsicas del SI.
Cuadro 1-1. Unidades bsicas del SI
Magnitud Unidad SI Smbolo
Longitud metro m
Masa kilogramo kg
Tiempo segundo s
Corriente elctrica amperio A
Temperatura kelvin K
Intensidad luminosa candela cd
Cantidad de sustancia mol mol
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SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES (SI)
El Comit Internacional de Pesas y Medidas acept el Sistema Internacional de Unidades (SI) ms tarde la Organizacin Mundial de la Salud en 1977 reco-mend la adopcin de este sistema. La comunidad cientfica y, sobre todo, la comunidad mdica de numerosos pases han adoptado y utilizado estas uni-dades en todas sus publicaciones cientficas. Este sistema tiene dos clases de unidades: bsicas y derivadas.
Mltiplos y submltiplos en el SI
Algunas unidades bsicas del SI pueden tener distintos mltiplos y submlti-plos, cada uno de ellos con un nombre caracterstico que se forma mediante la unin de un prefijo al nombre bsico de la unidad. Los prefijos ms utilizados en el SI de mltiplos y submltiplos se mencionan en cuadro 1-2.
Dos o ms unidades bsicas pueden ser combinadas por multiplicacin o divisin para formar las unidades derivadas del SI.
En el Sistema Internacional (SI) la concentracin de sustancia es expresada en moles/Litro (mol/L).
Formas de expresar concentracin
La mayora de las sustancias bioqumicas se expresan ahora en trminos de peso por unidad de volumen. Una expresin comn de la concentracin en unidades convencionales es la de miligramos por decilitro (mg/dL, mg/% o mg/100 mL), cuya forma encontramos en los reportes de laboratorio clnico.
Otra expresin de la concentracin en unidades del SI son los moles o milimoles por litro (mmol/L), que es una forma ms precisa para expresar la concentracin de sustancia y la cual se utiliza comnmente en publicaciones cientficas o libros de texto.
Cuadro 1-2. Unidades ms utilizadas del Sistema Internacional
Fraccin Prefijo Smbolo
10-110-210-310-610-910-1210-15
decicentimilimicronanofemtopico
dcmmnfp
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Para convertir los valores de mg/L a mmol/L, se debe multiplicar stos por el factor de conversin, de acuerdo con el indicador bioqumico:
Colesterol total: 0.02586Triglicridos: 0.01129Glucosa: 0.055Nitrgeno de la urea: 0.357cido rico: 88.4Creatinina: 59.48Protenas totales: 10Albmina: 10Para convertir los valores de mmol/L a mg/dL, debe dividirse stos entre el mismo factor de conversin en cada caso.
Electrlitos
En el Sistema Internacional de Unidades, los cationes o aniones presentes en el plasma (como Na+, K+, Cl- o Ca++) se reportan en mmol/L .
Enzimas
Para expresar la actividad enzimtica, el SI ha recomendado al Katal, que se define como la cantidad de enzima que cataliza la trasformacin de 1 mol de sustrato por segundo en un sistema analtico.
MATERIALES PARA LABORATORIO
En el laboratorio clnico pueden encontrarse distintos tipos de materiales, tales como vidrio, plstico y porcelana, entre otros.
Vidrio
Este material se caracteriza por su gran resistencia qumica frente al agua, cidos y bases, as como por su estabilidad y transparencia. Existe gran variedad de vidrios con diferentes propiedades. La mayora de los utensilios para laboratorio estn fabricados en vidrio de borosilicato relativamente inerte (96% silicato) y se caracterizan por un elevado grado de resistencia trmica. El vidrio de borosilicato tiene baja concentracin de alcalinotrreos y est libre de contaminantes tales como los metales pesados. Este tipo de vidrio puede calentarse a unos 600C y se ablanda slo hasta 820C aproximadamente. Las marcas comerciales de este tipo de vidrio son Pirex, Kimax y Vycor. Otro tipo de vidrio es el silicato de aluminio, que es seis a diez veces ms resistente que el vidrio de borosilicato convencional y altamente resistente a rajaduras y erosin alcalina. La marca comercial ms conocida de artefactos hechos de este material es Corex.
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Plstico
Los utensilios de plstico pueden ser de uso mltiple, como probetas, matraces o vasos de precipitado, o como material de desecho, tales como puntas de pipeta, placas de petri o cubetas de espectrofotmetros.
Los utensilios de plstico usados en el laboratorio estn hechos de monme-ros orgnicos polimerizados, con distintas propiedades fsicas y qumicas. Las poliolefinas (formadas por polietileno o polipropileno) son notables por su fuerza y resistencia a altas temperaturas. La ventaja del plstico frente al vidrio son su resistencia a roturas y a la esterilizacin en laboratorio, as como su ligereza.
Cuando se emplean utensilios de plstico debe tenerse presente el tipo de material del que estn hechos, ya que muchos de ellos pueden ser atacados por disolventes orgnicos y cidos o bases fuertes y algunos de ellos no soportan temperaturas elevadas.
Porcelana
Este material es utilizado con menor frecuencia que los anteriores en el labora-torio clnico. Sin embargo, resiste altas temperaturas y los artefactos elaborados con l estn vidriados totalmente o en su parte interna para evitar la adherencia de partculas en sus paredes.
Material volumtrico
Se utiliza para las mediciones y transferencias exactas de volumen, las cuales son tcnicas bsicas en los anlisis de laboratorio. Estas mediciones se realizan mediante matraces volumtricos, pipetas, buretas, probetas y dispensadores, entre otros.
La Oficina Nacional de Patrones (ONP) establece los lmites de tolerancia o mximos errores permitidos clasificndolos de la siguiente manera: Clase A los que se certifican por exactitud y los Clase B, que son menos exactos pero igualmente precisos. En el laboratorio clnico se utiliza la Clase A.
Todo el material volumtrico est calibrado para ser utilizado de forma determinada y a una temperatura estndar, la cual en promedio es de 20C (el volumen ocupado por una determinada masa de lquido vara con la tem-peratura).
Existen diferentes instrumentos volumtricos con distintos tipos de cali-bracin.
Los instrumentos calibrados para verter, como las pipetas y las buretas, ostentan las siguientes siglas:
vert extd
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Al realizar la calibracin de este material se ha tomado en cuenta la canti- dad de lquido que permanece adherido a la pared del vidrio debido a la humectacin.
Los instrumentos calibrados para contener, como los matraces aforados, no suministran el volumen correspondiente, porque una cantidad de lquido permanece adherida a la pared del vidrio. Este tipo de material suele osten- tar las leyendas cont, IN, TC. En este tipo de material es importante tomar en cuenta el error de paralelaje ya que la superficie de un lquido con-tenido en un tubo estrecho (pipeta, bureta) presenta una marcada curvatura o menisco.
La lectura del menisco debe realizarse de la siguiente manera:
En las soluciones transparentes se lee la parte inferior del menisco.1. En las soluciones coloreadas se lee la parte superior de la columna lquida.2. Al medir mercurio, se lee la parte superior del menisco.3.
Matraces aforadosEstos utensilios se utilizan principalmente en la preparacin de disoluciones valoradas o de concentracin conocida y para diluir muestras hasta un volu-men fijo.
Los ms comunes tienen capacidades de 25, 50, 250, 500 y 1 000 mL y es-tn calibrados para contener el volumen del lquido especificado a 20C cuando estn llenos del fondo al menisco de calibracin (figura 1-1).
PipetasEstos instrumentos se utilizan para transferir un volumen determinado de lquido. En sus paredes se hallan grabadas la capacidad y la temperatura a la que deben utilizarse; presentan bandas de color en la parte superior como cdigo para el volumen, precisin y tiempo de espera.
Existen diferentes tipos de pipetas, aplicables a diversas funciones. Entre stas pueden citarse:
Pipetas aforadas (volumtricas). Di-seadas para medir un solo volumen de lquido y con una sola lnea de aforo. Son las ms exactas de su tipo.
Pipetas graduadas. El volumen total de su capacidad totales divide en mililitros y en dcimas o centsimas de mililitro.
La primera regla para el uso de las pipetas manuales es que nada debe aspi-rarse dentro de la pipeta por la boca, sino que debe emplearse un bulbo de goma u otro elemento para llenar la pipeta. Figura 1-1. Matraz de aforacin aforado.
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MicropipetasComo indica su nombre, son instrumentos utilizados para transferir cantidades muy pequeas de lquidos; por lo general contienen cantidades comprendidas entre 1 y 500 microlitros. En la actualidad las pipetas ms populares son las micropipetas automticas, llamadas tambin micropipetas tipo Eppendorf. stas funcionan mediante un pistn y poseen puntas desechables de plstico para evitar la contaminacin. Las hay de volumen fijo y de volumen variable y algunas de ellas tienen un dispositivo acoplado para expulsar la punta de plstico una vez que ha sido utilizada (figura 1-2).
BuretasEstos artefactos se utilizan principal-mente en la valoracin de disoluciones de concentracin desconocidas y en los mtodos volumtricos.
Las buretas son dosificadores que se emplean para realizar adiciones con-troladas de un lquido y que permiten medir el volumen dosificado. Se utilizan para medir volmenes que requieren poca precisin y del tipo dispensador (TD) (figura 1-3). Figura 1-3. Dispensad or.
Figura 1-2. Micropipetas.
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Dispensadores automticos Su uso es muy frecuente en el laboratorio y sirven para agregar repetidamente un determinado volumen de un reactivo o diluyente a una solucin. Los dispen-sadores estn constituidos por un mbolo, un sistema de vlvula y un extremo para dispensar el lquido.
CALIDAD ANALTICA EN EL LABORATORIO CLNICO
Las caractersticas de un mtodo de laboratorio deben cumplir con los siguientes parmetros de funcionamiento analtico:
Exactitud, precisin.Sensibilidad analtica. Especificidad analtica. Recuperacin, interferencias. Interv alo de linealidad.
Caractersticas analticas
Toda medida cuantitativa es afectada por diversos factores que la desvan de su valor verdadero. Las principales causas de variabilidad analtica se deben a errores sistemticos y aleatorios.
Los errores sistemticos se dividen en cuatro categoras:
Errores de muestreo. Errores de mtodo.Errores de medida.Errores humanos.
Los errores de muestreo son los que ocurren durante la obtencin de la muestra. Los errores de mtodo se deben a las limitaciones propias de ste. Los errores de medida son causados por las limitaciones del equipo y de los instrumentos utilizados para realizarla. Los errores humanos son imputables al personal a cargo del anlisis.
Los errores sistemticos cambian la posicin de la media con un sesgo que puede ser positivo o negativo y afectan la variabilidad de los resultados.
Los errores aleatorios se deben a lecturas incorrectas de los instrumentos, clculos equivocados, cambio de las muestras y uso incorrecto de reactivos o de estndares aplicados errneamente. Estos errores aumentan la variabilidad de los resultados y afectan de manera leve a la media.
Precisin analtica
Durante las evaluaciones de un mtodo deben mantenerse constantes tantos factores como sea posible (por ejemplo, usar el mismo lote de reactivos, los mismos estndares y que intervenga el mismo personal de laboratorio).
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Exactitud analtica
Este factor es una medida de la concordancia entre el valor obtenido para una deter-minacin y el valor real (figura 1-4). Una forma de evaluar la inexactitud analtica de un mtodo es utilizar materiales control con valores asignados, obtenidos median- te mtodos de referencia. En el mercado existen controles comerciales valorados tales como sueros y plasma humano con valores de referencia, entre otros.
Es importante considerar que el control (preparado comercial) puede ser igual al producto biolgico que habr de analizarse. Por ejemplo, si el mtodo se realizar en suero, el control debe ser un suero humano.
Asimismo, deben seleccionarse tres materiales de control con tres valores de concentracin: bajo, normal y elevado. As, si es para un mtodo de glucosa, se utilizan valores como 50, 100 y 150 mg/dL. A continuacin se analiza cada material por triplicado y, una vez obtenidos los resultados, se calcula el valor medio y se compara con el valor asignado.
Sensibilidad y lmite de deteccin analticos
La sensibilidad analtica es una manera de establecer la capacidad de un m-todo para detectar pequeas concentraciones de una sustancia que se analiza. El lmite de deteccin se define como el resultado ms pequeo que puede di-ferenciarse de un blanco adecuado, con una probabilidad de 95%. Este lmite marca el punto a partir del cual puede realizarse el anlisis.
Linealidad e intervalo analtico
El intervalo de linealidad determina el analtico, que se define como el intervalo de concentracin, o de la magnitud que se mide, en el que existe una relacin
Preciso y exacto
Figura 1- 4. Representacin de exactitud y precisin.
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lineal entre el valor real y el obtenido con el mtodo, de forma que ste puede aplicarse sin modificacin. El intervalo de linealidad del mtodo debe ser sufi-cientemente amplio para incluir la mayora de los valores que se obtienen en las muestras de rutina. La linealidad del mtodo se asume en los mtodos que emplean calibraciones a uno o dos puntos, al menos entre el origen y el punto superior de calibracin y esta linealidad se extrapola generalmente a un valor de concentracin especificado por el fabricante del reactivo (figura 1-5).
Recuperacin
La recuperacin demuestra la capacidad para medir una sustancia pura cuan-do se aade una cantidad de sta a uno de los especmenes que se analiza de manera rutinaria.
Especificidad e interferencias analticas
La especificidad de un mtodo representa su capacidad para medir nicamente el componente o los componentes que pretendan medirse. Las interferencias se refieren a la influencia que ejercen determinadas sustancias, que por s mismas no producen lecturas, sobre la exactitud de un mtodo para determinar otra sustancia (por ejemplo, cido ascrbico para la medicin de glucosa urinaria). La interferencia puede dar lugar a valores ms bajos o ms altos de la sustancia que se analiza.
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0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
00 50 100 150 200
Concentracin de glucosa (mg/dL)
Abs
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Figura 1-5. Representacin de una curva de calibracin.
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EJERCICIO
Introduccin a la bioqumica clnica
Cite las unidades del Sistema Internacional que se utilizan para expresar cantidad de 1. sustancia.
Refiera las unidades del sistema convencional que sirven para expresar cantidad de 2. sustancia.
Anote cules son las unidades convencionales para medir la actividad enzimtica.3.
Escriba las unidades convencionales para medir electrlitos.4.
Describa las caractersticas de un mtodo analtico cuantitativo.5.
Describa la utilidad de un estndar y un control en el laboratorio clnico.6.
Escriba la equivalencia de un micromol y un nanolitro, as como la abreviatura que se 7. utiliza.
Qu caractersticas deben considerarse al seleccionar material de plstico para trabajar 8. en el laboratorio clnico?
Defina la sensibilidad de un mtodo analtico.9.
Defina linealidad e intervalo analtico.10.
REFERENCIAS
Gonzlez de Buitrago J.M. (et al): Bioqumica Clnica. Madrid: Ed. McGraw-Hill Interamericana de Espaa. 1998. pp. 101-108.
Gonzlez de Buitrago J.M: Tcnicas y mtodos de laboratorio clnico, 2 edicin: Espaa: Masson. 2004. pp. 15-22, 25, 34-36.
Kaplan, Laurence A y A.J. Pesce: Qumica clnica. Argentina: Editorial Mdica Panamericana. p. 13.
Morrison Treseler Kathleen: Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico. Mxico: Ed. El Manual Moderno. 1998. pp. 555-556.
Vives Joan, Luis Aguilar, Joseph Luis: Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa, 2 edicin. Espaa: Masson. 2002. pp. 38-41.
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Captulo 2
InStrumEntoS utIlIZadoS En El laboratorIo ClnICo
ESPECTOFOTMETRO
El laboratorio clnico utiliza diferentes tcnicas para cuantificar la concentracin de una sustancia, as como diversos mtodos pticos basados en los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia, llamadas tcnicas espectrofotomtricas. Las ms utilizadas son las de absorcin molecular en el rango de las radiaciones ultravioleta (UV) y visible.
Radiaciones electromagnticas
Estas radiaciones son una forma de energa radiante que presenta propieda-des tanto de onda como de partcula; aun cuando ondas y partculas parezcan incompatibles, debe usarse la dualidad partcula-onda.
La longitud de onda () es la distancia entre dos puntos correspondientes en dicha onda (figura 2-1).
La frecuencia (r) es el nmero de unidades completas de longitud de onda que pasan por un punto fijo en la unidad de tiempo. Las unidades de la fre-cuencia son ciclos/segundo.
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La longitud de onda y la frecuencia se relacionan con la velocidad de la luz mediante la expresin:
r = CN
donde c = Velocidad de la luz en el vaco (2.9976 x 106).
n = ndice de refraccin. Relacin entre la velocidad de la luz en el vaco y su velocidad en el medio en cuestin.
Propiedades de la partcula
La radiacin electromagntica interacciona con la materia mediante un haz de luz como transportador de fotones, de cuyo fenmeno surge el concepto de fotn.
Fotn. Partculas que tienen energa definida y se desplazan en el espacio a la velocidad de la luz.
La energa de un fotn depende de su frecuencia y longitud de onda y se representa por la siguiente frmula:
E = h r = h C
donde: E = Energa del fotn medido en ergs.r = Frecuencia de la radiacin electromagntica medido en ciclos/s.h = Constante de Planck equivalente a 6.62 x 1027 ergs/s. = Longitud de onda.
Como puede observarse en la frmula anterior, la relacin entre la longitud de onda y la energa de una radiacin electromagntica es inversa, de manera que cuanto mayor es la longitud de onda de un haz de luz menor es su energa.
Figura 2-1. Representacin de la longitud de onda ().
Longitud de onda
AmplitudAmplitud
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Si un rayo de luz incide sobre la frontera o superficie lmite entre dos medios, dicha luz puede reflejarse, refractarse o absorberse.
Cuando un haz de luz pasa de un medio a otro, como del aire al vidrio, una parte de la luz incidente sobre la superficie del vidrio se refleja y otra pasa por el vidrio. La luz que penetra en el vidrio se absorbe y se transmite parcialmen-te. La luz que se transmite suele sufrir un cambio de velocidad y de direccin llamado refraccin y conserva su frecuencia caracterstica. Debido a las dife-rentes velocidades dentro del medio, el haz de luz blanca se dispersa en sus colores componentes.
Espectro electromagntico
Este fenmeno cubre un intervalo muy amplio de longitud de onda, como se muestra en el cuadro 2-1.
Las reas del espectro electromagntico comnmente utilizado en el laboratorio clnico son el ultravioleta (180 a 390 nm) y la regin visible (390 y 780 nm).
Interaccin de la luz con la materia
Cuando se produce una interaccin entre un haz de luz y la materia, se produ-cen fenmenos de absorcin o emisin energtica.
Proceso de absorcin
Cuando un tomo que se encuentra en estado de reposo (estado fundamental) interacciona con un haz de luz, absorbe energa y pasa a lo que se denomina estado excitado. Esto involucra alguno de los siguientes procesos:
1. Transicin de un electrn a un mayor nivel energtico.2. Cambio en la forma de vibracin de las uniones covalentes de la mo-
lcula.3. Alteraciones en el modo de rotacin sobre las uniones covalentes.
En las regiones del espectro electromagntico que abarcan de la luz visible a la luz ultravioleta, el proceso de absorcin produce una transicin de un electrn a
Cuadro 2-1. Regiones del espectro electromagntico
Rayos gamma
Rayos X Ultra- violeta (UV)
Luz visible Infrarrojo (IR)
Microondas
Longitud de onda (nm)
< 0.1 1 180 390 780 400 000
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un mayor nivel energtico. La partcula en estado excitado tiende a regresar es-pontneamente a su estado fundamental desprendiendo la energa absorbida.
Los espectros de absorcin caractersticos para cada unin qumica y cada tipo de unin tendrn su propio patrn caracterstico de longitud de onda p-tima de luz que puede absorber. Estos espectros de absorcin son de utilidad para seleccionar la longitud de onda ms adecuada, ya sea para una medida cuantitativa o para fines de identificacin cualitativa.
Espectrofotometra de absorcin
La espectrofotometra reviste gran importancia en el laboratorio clnico y de in-vestigacin bioqumica. Sus principales ventajas son sensibilidad relativamente elevada, realizacin rpida y grado de especificidad relativamente alto. Adems se puede adaptar a los autoanalizadores.
Por lo general, se le emplea de tres maneras:
a) Determinacin de la concentracin de un compuesto mediante la medicin de la absorcin de luz (densidad ptica) a una longitud de onda especfica (espectro de absorcin).
b) Secuencia del curso de una reaccin mediante la medicin de la velocidad de la formacin y la desaparicin de un compuesto que absorbe luz (por ejemplo,NADHH+ absorbe luz a 340 nm, mientras la forma oxidada NAD no absorbe a esa longitud de onda; esto ltimo recibe el nombre de medi-ciones cinticas).
c) Identificacin de un compuesto por su espectro de absorcin caracterstico entre las regiones ultravioleta y visible.
Leyes de absorcin
La espectrofotometra se asocia a dos leyes fundamentales: la de Lambert y la de Beer, las cuales se asocian en una sola, conocida como ley de Beer. Dicha ley establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energa radiante absorbida, o inversamente proporcional al lo-garitmo de la energa radiante trasmitida y otra variable que es el trayecto que el haz de luz recorre a travs de la solucin. Lo anterior puede representarse por la siguiente ecuacin:
A = a b C
donde: A = absorbancia.a = coeficiente de absorcin o absortividad.b = longitud del paso de luz en centmetros.c = concentracin de la sustancia investigada.
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Absorcin y transmisin
Cuando un haz de energa radiante con una intensidad inicial (Io) (luz incidente) incide sobre una cubeta cuadrada (que contiene una solucin de un compues-to) y pasa a travs de esta solucin, absorbe energa radiante a una longitud de onda especfica y el haz de luz que sale despus de atravesar la cubeta (luz transmitida (Is) tiene una intensidad menor (figura 2-2).
Transmitancia (T) se define como la relacin entre la luz transmitida (la que sale de la solucin) y la incidente (la que entra a la solucin). Lo anterior significa que cualquier sustancia que absorba energa radiante tendr una transmisin menor a 1. Para evitar el manejo de decimales se ha recurrido al sistema de porcentaje o multiplicacin por 100.
La absorbancia (A) es el logaritmo negativo de la luz transmitida:
A = 2 log % T
En los aparatos actuales las lecturas de % T son transformadas en absorbancia debido a que la absorbancia no es una cantidad medible directamente, sino que puede obtenerse de los datos de transmitancia por clculo matemtico.
Si se representa grficamente la relacin entre la absorbancia y concentra-cin en un eje de coordenadas, se obtiene una lnea recta y la proporcin es directa. La lnea recta de la grfica representa que a mayor concentracin del compuesto, aumenta la concentracin de energa radiante y es menor la con-centracin de energa trasmitida, lo que significa que obedece a la ley de Beer, en la que la absorcin es igual a la concentracin.
Cuando la concentracin del compuesto en la solucin sobrepasa los lmites de linealidad, la ley de Beer deja de cumplirse y la recta de la grfica asume la forma de una curva (figura 2-3), ya que a altas concentraciones la absorcin no es directamente proporcional a la concentracin. Para poder medir altas con-centraciones se requiere diluir la muestra y despus multiplicar por el factor de dilucin de una sustancia.
T =Luz transmitidaLuz incidente
= Is/l0 = 1
Figura 2-2. Transmitancia de energa radiante a travs de la cubeta.
Luzincidente
Luz transmitida= 1 o 100% T
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Espectrofotmetros
Estos instrumentos miden la absorcin de las radiaciones electromagnticas por las disoluciones. Sus principales componentes son:
1. Fuente de energa radiante.2. Selector de longitud de onda.3. Celda (aqu se coloca un recipiente transparente llamado cubeta, que con-
tiene la solucin que se desea medir).4. Detector de energa radiante.5. Dispositivo para lectura de datos.
Tipos de instrumentos
Los instrumentos que utilizan prismas o red de difraccin como monocroma-dores se denominan espectrofotmetro (figura 2-4).
La luz emitida por la fuente, que va del rango luz visible a ultravioleta, pasa a travs de un monocromador que selecciona la longitud de onda deseada. Una rendija de entrada y salida consigue que el haz de luz sea estrecho; dicho haz pasa a travs de la cubeta, donde se produce el proceso de absorcin. La luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energa radiante en ener-ga elctrica, la cual es registrada en un lector que la traduce en absorbancia, transmitancia (% T) o concentracin de sustancia.
Figura 2-3. Representacin grfica de la linealidad intervalo x - y.
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
00 50 100 150 200
Concentracin de glucosa (mg/dL)
Abs
orci
n
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Al hacer las mediciones, el espectrofotmetro necesita contar con un blanco, el cual ajusta el instrumento a 100% de transmitancia o cero de absorbancia. El blanco puede ser agua, reactivos, aire, entre otros. En todas las mediciones realizadas mediante espectrofotometra es indispensable correr un estndar (solucin de concentracin conocida) con las soluciones problema (el suero del paciente). Se puede conocer la concentracin de los problemas mediante la comparacin de los estndares o la lectura de las grficas de absorcin y concentracin (figura 2-3).
Fuentes de energa radiante
stas pueden ser lmparas con filamento de tungsteno, que proporcionan ener-ga radiante en los rangos de luz visible y ultravioleta.
Las lmparas de filamento de yoduro de tungsteno producen luz a longitu-des de onda cortas y emiten energa de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno.
Las lmparas de hidrgeno producen un espectro continuo en la regin (de 220 a 360 nm).
Rendijas. La funcin de las rendijas de entrada es reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.
La rendija de salida tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que causara desviacin de la ley de Beer.
A continuacin se refieren algunos sistemas de seleccin de longitud de onda.
Filtros. Mecanismo sencillo compuesto por un material que trasmite de manera selectiva una longitud de onda deseada y absorbe todas las dems. Son utilizados en los fotmetros o colormetros.
Figura 2-4. Espectrofotmetro.
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Monocromadores. Proporcionan bandas espectrales mucho ms estrechas que los filtros y son los ms utilizados en espectrofotometra.
Cubetas. Recipientes donde se coloca la muestra para la medicin espectro-fotomtrica. Su paso de luz es generalmente de 1 cm; y pueden ser redondas, cuadradas o rectangulares. El material utilizado para las cubetas puede ser vidrio o plstico para leer en la regin visible y de cuarzo en la regin ultravioleta.
Detectores. Estos artefactos utilizan tubos fotomultiplicadores, que son dis-positivos electrnicos que amplifican la seal elctrica para poder registrarla.
Registro. Los instrumentos modernos aportan resultados en lectura digital y proporcionan datos directos en concentracin mediante microprocesadores.
La utilidad del espectrofotmetro es medir las concentraciones de sustratos (glucosa, urea, cido rico, colesterol, triglicridos, etc.), enzimas (ALT, AST, CPK, LPL, etc.) y minerales (calcio, fsforo) en los diversos lquidos biolgicos.
Cromatografa
Las tcnicas de separacin de compuestos ms usadas en el laboratorio clnico son la cromatografa y la electroforesis, procesos mediante los cuales dichos com-puestos pueden ser cuantificados posteriormente mediante diversos mtodos.
Cromatografa. Tcnica empleada para separar o purificar pequeas canti-dades de compuestos muy relacionados presentes en una mezcla. La separacin cromatografa se produce entre dos fases:
Fase mvil . Componente lquido o gaseoso en el cual estn los solutos que se pretende separar.Fase estacionaria . Puede ser un lquido o un slido, por el cual fluir la fase mvil.
Los distintos componentes de una mezcla se separarn en funcin de su dis-tribucin entre la fase mvil y la fase estacionaria, con base en el equilibrio de dichas fases. As, un compuesto que tenga ms afinidad que otro por la fase estacionaria se retrasar en su avance por esta fase y el compuesto que tenga menor afinidad lo atravesar antes.
Cuando todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase esta-cionaria se separan y esto puede ser empleado para identificar o cuantificar los compuestos de la mezcla.
Las tcnicas de cromatografa pueden ser clasificadas con base en las ca-ractersticas fsicas de las fases de acuerdo con el mecanismo fsico que separa los solutos entre las dos fases. Estos mecanismos son adsorcin, reparto, in-tercambio inico, exclusin molecular y afinidad.
En las tcnicas de cromatografa se emplean distintas formas de soportes sobre los que actan las fases de la separacin: cromatografa en capa fina y cro-
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matografa en columna. En este apartado slo se mencionarn algunos tipos de cromatografa, en el cuadro 2-2 se describen algunos tipos de cromatografa.
Cromatografa en capa fina (CCF). La fase estacionaria de esta cromato-grafa es una placa de vidrio o plstico recubierto por una capa fina (de 100 a 500 mm) de gel de slice, gel de poliacrilamida o gel de almidn.
La fase mvil es lquida y est formada por solventes de polaridad determi-nados en funcin de la fase slida estacionaria y se considera una cromatografa lquido/slido. En esta cromatografa de capa fina, en la cual la muestra es arrastrada por el solvente a travs de la placa de vidrio, la separacin ocurre por causa de diferencias de solubilidad, polaridad del solvente, polaridad de la sustancia que interesa separar y la velocidad de difusin.
Cuando el solvente llega al final de la fase estacionaria, sta se saca y se deja secar. El cromatograma aparece en forma de manchas que corresponden a los componentes separados de la muestra (figura 2-5).
Identificacin. Estas manchas pueden identificarse ya sea por patrones o estndares, sustancias de naturaleza conocida con la que se comparan.
Cuantificar. Puede disolverse la mancha raspando la zona y disolviendo el polvo absorbido en la placa y midindola en un colormetro o en un densit-metro de placa.
Triglicridos
AGL
Colesterol
Fosfolpidos
Origen
Figura 2-5. Cromatografa en capa fina.
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Cromatografa en columna. Los mtodos en columna se emplean mediante varios tipos de cromatografa. Se utiliza tanto para cromatografa lquida como para cromatografa gaseosa y con fases estacionarias tanto lquidas como sli-das. Este tipo de cromatografa es de adsorcin si la fase estacionaria es slida y de particin cuando la fase estacionaria es lquida.
Las columnas con que se trabaja estn formadas por un tubo de longitud y ancho variable que lleva empaquetado la fase estacionaria (slido, o un slido asociado a un lquido). La fase mvil es un solvente que se hace pasar a travs de la columna en la cromatografa lquida y un gas en la cromatografa gaseosa.
La muestra se introduce en la fase mvil, donde las fases mvil y estacionaria se encuentran en equilibrio, de manera que la separacin de los componentes de la muestra se lleva a cabo por su distribucin entre las dos fases.
Cromatografa de Intercambio inico
En esta cromatografa la fase mvil es lquida y la fase estacionaria es slida; se realiza en columnas (como soporte) en la que la fase slida se encuentra empa-quetada. La separacin de las sustancias se basa en las diferencias existentes entre las cargas elctricas.
La fase estacionaria es una resina de intercambio inico que posee grupos cargados positivos (aninicas) o negativos (catinicas).
Las resinas son polmeros sintticos de alto peso molecular, altamente inso-lubles, que contienen grupos funcionales inicos (alcalinos o cidos). La funcin de estas resinas con carga en su superficie es intercambiar iones con los de la
Cuadro 2-2. Bases de las diferentes cromatografas
Tipo de cromatografa Fundamento
Cromatografa en capa fina (CCF) Esta cromatografa lleva como fase estacionaria una placa de vidrio o plstico recubierta por una fina capa de poliacrilamida o gel de almidn.La fase mvil es lquida y est formada por solventes de polaridad que van en funcin de la fase slida estacionaria. Se considera una cromatografa lquido/slido.
Cromatografa de intercambio inico Separa las sustancias con bases en las interacciones electrostticas que se producen entre los grupos ionizables de los compuestos que se desea separar y los grupos con carga elctrica se colocan en un soporte slido.
Cromatografa de exclusin molecular Se basa en la separacin de las molculas segn su tamao y su forma. La fase estacionaria es un gel y se realiza en columna.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
Se basa en sistemas impulsores de la fase mvil (lqui-da) con mucha presin. Se realiza en columna.
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fase mvil y los de la muestra. La utilidad de esta tcnica es eliminar los iones no deseados, como purificacin de agua. Su aplicacin en el laboratorio clnico es para eliminar altas concentraciones de cido ascrbico, bilirrubina y cido rico que interfieran en la medicin de glucosa en sangre.
Cromatografa de exclusin molecular. Antes llamada filtracin de geles. La fase mvil es lquida y una fase estacionaria slida que se encuentra en columnas consiste en un gel que presenta poros de un tamao determinado; el ms conocido es el Sephadex (nombre comercial). El fundamento de la se-paracin es la diferencia en el tamao molecular de las sustancias que habrn de separarse.
La fase estacionaria es una dextrona modificada (Sephadex) que contiene poros de diferente tamao y que pueden regularse con exactitud. La sustancia que se desea separar es introducida en la columna y atraviesa la fase slida, de manera que la sustancia cuyo tamao es mayor que el poro del soporte pasa en el gel sin ser retenida y la de peso molecular ms pequeo se ver retardada en su paso en la fase estacionaria en la columna como se puede observar en la figura 2-6.
La muestra se introduce en la columna y comienza a atravesar la fase esta-cionaria, penetrando las partculas pequeas en el gel, por lo que son retenidas. Las partculas grandes no son retenidas.
La muestra comienza a eludir, siendo eluidas primero las partculas de mayor tamao y despus las de menor tamao. Esta tcnica se utiliza para separar inmunoglobulinas, obtener las fracciones de protenas plasmticas del LCR o para separar molculas muy pequeas de soluciones de protenas.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Esta cromatografa tiene ventaja sobre las dems por la velocidad del anlisis y el poder de resolucin.
Emplea instrumentos relativamente complicados que mediante impulsos controlados introduce el solvente.
Figura 2-6. Cromatografa de Exclusin molecular.
Partculas de gel
Molculas que quieren separarse
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Los componentes bsicos en el sistema de separacin son (figura 2-7):
1. Sistema para dispensar el solvente, que provee la fuerza impulsora a la fase mvil (bombas).
2. Sistema para la introduccin de la muestra.3. Columna con fase estacionaria.4. Detector (lmpara ultravioleta fluorescente). 5. Registro.6. Ordenador.
La principal utilidad de la cromatografa HPLC en el laboratorio clnico es que cuantifica frmacos en suero, separa aminocidos en suero y orina, hormonas en plasma y orina, vitaminas A y E en suero, entre otros procesos.
ELECTROFORESIS
Tcnica de separacin en la cual una partcula cargada se desplaza a travs de un medio aplicando un campo elctrico. Los factores que intervienen son intensidad del campo elctrico, carga elctrica, forma y tamao de las partcu-las. Para realizar la electroforesis debe tomarse en cuenta que la densidad de carga de la partcula est en funcin del pH, de la fuerza inica del gradiente de voltaje y de la interaccin con el medio.
Cuando una partcula cargada se coloca en el interior de un campo elctrico, se mover hacia el polo positivo o negativo en funcin de la carga que posea; si la partcula est cargada positivamente (catin), migrar hacia el polo negativo (ctodo).
Figura 2-7. Cromatografa HPLC.
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Existen dos tipos de electroforesis: electroforesis libre y electroforesis de zona.
Electroforesis libre. En sta el campo elctrico se aplica directamente a la solucin. Esta tcnica es compleja y costosa y requiere de un sistema ptico que determine el ndice de refraccin de las protenas en el curso de su emi-gracin.
Electroforesis de zona. En este tipo de electroforesis, las partculas cargadas se colocan sobre un medio estabilizador en el que emigran las fracciones de la muestra que habr de investigarse. Los principales medios estabilizadores o fase estacionaria que se utilizan en el laboratorio clnico son papel filtro, acetato de celulosa, gel de agarosa, gel de almidn y gel de poliacrilamida. Estos medios estabilizadores deben ser inertes es decir, no deben reaccionar con la sustancia que se desea investigar.
La electroforesis de zona es de gran utilidad en el laboratorio clnico en los diversos lquidos biolgicos (suero, plasma, sangre total, orina, LCR), as como para fraccionar protenas totales, lipoprotenas en suero, enzimas, isozimas, hemoglobina e inmunoglobulinas en suero, entre otras.
El instrumento para realizar la electroforesis consta de cubeta de elec-troforesis y fuente de alimentacin.
Cubeta de electroforesis. Consiste en una cmara que contiene los elec-trodos de carga opuesta, situada en dos receptculos que se conectan por un puente salino cuya funcin es permitir el paso de la corriente como se observa en la figura 2-8.
Fuente de alimentacin. Su funcin es aportar la energa para que pueda llevarse a cabo el proceso. Al terminar de fraccionar el compuesto ionizado que se encuentra en el medio estabilizador, es necesario hacer una coloracin de los componentes que se desea visualizar. Los colorantes usados para detectar aminocido es la ninhidrina y para la separacin de lipoprotenas se utiliza el colorante negro sudan 13. Para leer estas fracciones coloreadas pueden utilizarse dos mtodos: por elucin y por densitometra.
Elucin. En este mtodo, cada fraccin se recorta y eluye en un disolvente adecuado al colorante con que se tieron los productos sujetos a investigacin.
Figura 2-8. Cubeta de electroforesis.
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Se obtiene as una solucin coloreada que se cuantifica espectrofotomtrica-mente.
Densitometra. Consiste en la lectura directa del gel que presenta fraccio-nes coloreadas, en la cual se selecciona una longitud de onda que ser la que corresponda al color de las fracciones que habrn de leerse. El densitmetro es capaz de fabricar una grfica de registro del recorrido del haz de luz (patrn electrofortico). En este registro cada fraccin aparece como pico, cuya altura depende de la densidad de la banda que representa concentracin de la sus-tancia (figura 2-9).
La electroforesis se utiliza para medir las fracciones de las protenas del plasma y se reporta en porcentaje como se representa en el cuadro 2-3; sta se basa en las propiedades elctricas que poseen los aminocidos, tales como carga positiva (grupos NH+3) y negativa (grupos COO-) y grupos R cargados (SH, OH). Cuando una protena es colocada en un campo elctrico, es atrada
Figura 2-9. Patrn electrofortico normal.
Cuadro 2-3. Proteinograma electrofortico
Fraccin proteica Porcentaje del total de las protenas sricas
Albmina 52 a 65% de las protenas totales
Alfa1 2.5 a 5.0% de las protenas totales
Alfa2 7.0 a 13.0% de las protenas totales
Beta 8.0 a 14.0% de las protenas totales
Gamma 12.0 a 22.0% de las protenas totales
Transferrina
Ceruloplasmina
Albmina
Patrn normal
Prealbmina
Globulinas
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hacia uno de los polos (el positivo o el negativo), de acuerdo con su carga neta, la cual vara en relacin al pH de la solucin en que se encuentra.
Con un pH (8.6) alcalino, las protenas migran hacia el polo negativo; esta migracin es relativamente rpida y depende de la carga y el peso de la molcula proteica.
Las protenas sufren una separacin caracterstica que puede graficarse por medio de un densitmetro, obteniendo as una imagen a la que se denomina patrn electrofortico de protenas.
Como puede observarse en la figura 2-9, el patrn est constituido por cinco elevaciones, visto de derecha a izquierda, cuyo pico ms grande corresponde a la albmina, que es la fraccin proteica con mayor carga negativa neta. Las otras elevaciones son la prealbmina y las correspondientes a las globulinas alfa, alfa2, beta y gamma.
EJERCICIO
Instrumentos utilizados en el laboratorio clnico
Defina los siguientes trminos:1.
Energa radiante.
Fotn.
Longitud de onda.
Frecuencia.
Absorcin y transmisin.
A qu velocidad viajan las ondas electromagnticas?2.
Cite las regiones del espectro electromagntico y sus rangos.3.
Cules de las anteriores regiones del espectro son las que utiliza el espectrofot- 4. metro?
Escriba la ecuacin de la ley de Beer y Lambert y describa cul es su utilidad en la 5. espectrofotometra.
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Dibuje la grfica que representa las mediciones de absorcin y cmo se interpretan.6.
Cul es la utilidad de un espectrofotmetro en el laboratorio clnico?7.
Cules son los estndares utilizados en estos aparatos?8.
Defina los siguientes trminos:9.
Cromatografa:
Electroforesis:
Cules son las fases de una cromatografa?10.
Refiera las clasificaciones de la cromatografa.11.
Cite cinco utilidades de la electroforesis en el laboratorio clnico.12.
Cite los tipos de lipoprotenas obtenidas por electroforesis y sus cifras normales.13.
Dibuje un patrn electrofortico normal de protenas en suero.14.
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REFERENCIAS
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Murray, Robert K. (et al): Bioqumica de Harper. Mxico. El Manual Moderno. 17 edicin. 2007. p. 613.
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Captulo 3rEColECCIn Y manEJo dE muEStraS dE SanGrE Y orIna
El control de calidad en el laboratorio clnico empieza desde antes de la reco-leccin de la muestra del paciente. La exactitud comienza al obtener la muestra adecuada en el recipiente adecuado y considerando las variables que pueden afectar la medicin (como dieta, medicamentos, ejercicio, hora del da, entre otros).
La sangre es el fluido corporal ms utilizado en el laboratorio clnico. La muestra de sangre puede obtenerse por diferentes procedimientos. De stos, los ms utilizados son:
Puncin cutnea. Puncin venosa. Puncin arterial.
Puncin cutnea. Mtodo de extraccin sangunea utilizado en nios, sobre todo recin nacidos y pacientes geritricos.
La puncin cutnea puede realizarse en la superficie exterior del taln en los lactantes y en la ltima falange del tercero o cuarto dedos de la mano en nios mayores. La puncin no debe realizarse donde exista edema o se haya puncionado anteriormente. Esta prctica se realiza con lancetas desechables.
Puncin venosa. Es el principal mtodo de obtencin de sangre en el labora-torio clnico. Las venas que se eligen generalmente son la vena cubital interna y la ceflica (antebrazo); otros lugares pueden ser la mueca, el tobillo y la mano. Cuando no es posible realizar este tipo de puncin, puede recurrirse a la vena femoral o a la yugular.
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Puncin arterial. En las determina-ciones de la tensin de oxgeno, dixido de carbono y pH se requiere sangre arterial. Las caractersticas de la sangre varan segn se trate de arterial, venosa o capilar, principalmente en su contenido en oxge-no, glucosa, pH y hematocrito.
PLASMA y SANgRE COMPLETA
La sangre es una suspensin de clulas en un lquido llamado plasma que circula por el sistema vascular, formado por vasos sanguneos de diverso calibre.
El plasma, constituido en 50% del volumen total de la sangre (figura 3-1), est formado por 90% de agua, en la que se hallan disueltas diversas sustancias
nutritivas, de recambio metablico o de desecho celular. Estas sustancias son gases, electrlitos, enzimas y derivados del catabolismo celular. El componen-te plasmtico ms abundante est formado por protenas que sintetizan las clulas de los tejidos y son vertidas al plasma mediante mecanismos diversos como exocitosis o recambio celular (figura 3-2). El 50% restante del volumen sanguneo est constituido por clulas que, igual que los componentes plas-mticos, se hallan sometidos a continuos procesos de recambio y renovacin. Estas clulas son de tres tipos: eritrocitos, leucocitos y plaquetas y todas ellas tienen origen en una nica clula pluripotencial (clula madre), situada en el tejido hematopoytico de la mdula sea (vase captulo 4).
OBTENCIN DE SANgRE COMPLETA O PLASMA
Para obtener plasma o sangre completa se requiere el uso de anticoagulan- tes tales como heparina, oxalato, citrato o sales de cido etilendiamino tetra-ctico (EDTA, o sequestrene). Si la sangre completa es centrifugada se obtiene plasma.
ANTICOAgULANTES
Para la obtencin de plasma y sangre completa se requieren anticoagulantes, los que se citan en el cuadro 3-1.
Figura 3-1. Sangre completa centrifugada.
Plasma
Glbulos rojos
Capa leucocitaria- Plaqueta- Glbulos blancos- Reticulocitos
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La mayora de ellos impiden que el calcio intervenga en la coagulacin. El oxalato de amonio o de potasio elimina el Ca++ precipitndolo. El citrato y el EDTA fijan el calcio en forma no ionizada y la heparina evita la coagulacin neutralizando la trombina.
Plasma
AguaProtenasHidratos de carbonoLpidosElectrolitosSales mineralesVitaminasHormonasAnticuerposEnzimas
Clulas
Sangre
Eritrocitos
Plaquetas
Leucocitos
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
Figura 3-2. Componentes de la sangre completa.
Cuadro 3-1. Tubos de vaco y su aplicacin
Muestras Anticoagulante Color del tapn
Accin del anticoagulante
Mediciones
PlasmaPlasmaPlasma
CitratoEDTAHeparina
AzulLilaVerde
Captura calcioCaptura calcioInhibe trombina
Pruebas de coagulacinBiometra hemticaTiempo de protrombina
Suero
Plasma parcial
Yodoacetato
Fluoruro
Gris
Gris
Inhibe la gliceral-dehdo-3-fosfato deshidrogenasa
Inhibe la enolasa
Glucosa, cido lctico
Glucosa
Suero
SueroSuero
Ninguno
NingunoNinguno,
separador de suero
Azul brillante
MarrnGris/rojo
Libre de contami-nantes
Libre de plomoBarrera de gel
Oligoelementos, metales pesados
PlomoQumica
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OBTENCIN DE SUERO
Una vez extrada la sangre, sta sufre un proceso de coagulacin que aparece en forma espontnea entre los 3 y 7 minutos. En esta primera etapa la sangre se transforma en una masa semislida de color rojo llamada cogulo y pos-teriormente aparecen dos fases diferenciadas: el cogulo y la parte lquida es llamada suero con las mismas caractersticas del plasma. La diferencia con el plasma es que no contiene fibringeno ni enzimas de la coagulacin. El suero se obtiene por centrifugacin.
La presencia de algunas molculas en suero o plasma (como la bilirrubina) provoca interferencia en las mediciones colorimtricas por espectrofotometra en las determinaciones de albmina, colesterol o glucosa. Otras interferencias son las concentraciones superiores a 350 mg/dL de triglicridos.
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
La extraccin de sangre puede realizarse con jeringas y mediante el sistema de tubos de vaco, que actualmente es el que se utiliza por ser ms eficiente y seguro.
Sistema de vaco. La recoleccin con jeringa ha sido reemplazada en gran medida por el uso del sistema de vaco (figura 3-3). En el mercado se conoce como sistema de Vacutainer (Becton Dickinson & Co. Paramus).
Los tubos de vaco pueden contener silicn para reducir los riesgos de he-mlisis y evitar que la sangre se adhiera a las paredes; de esa manera se obtiene suero. Existen en este sistema otros tubos con diferentes anticoagulantes, segn la determinacin que habr de realizarse (cuadro 3-1). Es importante considerar diferentes factores en la extraccin de sangre que pueden causar variacin en la medicin analtica. A continuacin se refieren algunos.
Figura 3-3. Sistema de vaco para extraccin sangunea.
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Hora del da. Para evitar variaciones se sugiere realizar la toma de sangre en la maana (entre 7 y 9 am), ya que se presentan cambios importantes a di-ferentes horas del da en sustancias como glucosa, triglicridos y hierro, entre otras horas.
Postura. La postura del paciente tiene un importante efecto en las protenas y las sustancias unidas a ellas (por ejemplo, protenas totales, albmina, lpidos, hierro, calcio, enzimas). Lo ideal para reducir estos efectos es extraer todas las muestras de sangre del paciente o en forma estandarizada (misma posicin).
Estasis. El uso prolongado de un torniquete tambin puede elevar un cierto nmero de resultados. Por ejemplo, la concentracin srica de protenas y de las sustancias fijadas a protenas aumenta por la aplicacin de un torniquete por ms de 60 segundos.
Ejercicio. Los resultados se alteran con muestras de sangre recolectadas despus de realizar ejercicio. Las variaciones bioqumicas que se presentan son aumento de la concentracin de alanina-transaminasa, lactato, creatina-fosfociansa, entre otros.
Hemlisis. Esto puede presentarse por el uso de agujas muy gruesas, hu-medad en la jeringa o mezclado vigoroso de la sangre. La hemlisis causa ele-vacin de la concentracin de las sustancias que sern sujetas a investigacin, ya que las clulas sanguneas contienen sustratos y enzimas (por ejemplo, DHL, colesterol, potasio y hierro, entre otros).
Ayuno adecuado. En la mayora de las mediciones bioqumicas se pide al paciente que acuda con 8 o 10 h de ayuno. En las mediciones de triglicridos se requiere un ayuno de 12 a 14 h. Ayunos muy prolongados (24 h) causan activacin de las vas catablicas. Ciertos alimentos o regmenes dietticos es-peciales pueden influir en las determinaciones en sangre.
Frmacos. La respuesta in vivo frente a un frmaco depende del individuo, de las dosis del medicamento y de la combinacin con otros medicamentos. Es importante conocer los efectos fisiolgicos que provocan y la interferencia qumica.
Tabaquismo. El consumo de tabaco produce un aumento en el plasma de algunas hormonas como el cortisol y la adrenalina, lo que causar un aumento de la concentracin de los cidos grasos circulantes y de neutrfilos y monocitos y tambin se refleja en un aumento de los cidos grasos libres del plasma.
Almacenamiento de la sangre
Deben evitarse las alteraciones en las concentraciones de los sustratos o enzimas que sern medidas durante su almacenamiento. Si el anlisis de la muestra no habr de realizarse el mismo da, sta debe ser refrigerada o congelada, segn los requisitos para su determinacin. Se requiere obtener suero o plasma antes de refrigerar para almacenar.
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RECOLECCIN DE MUESTRAS DE ORINA
general de orina
Para el estudio denominado General de orina se requiere solamente una mues-tra de orina (primera de la maana) previo aseo.
Estudio orina 24 h
Para estudios donde se requiere orina de 24 h es importante que el paciente siga las instrucciones, pues de lo contrario las determinaciones serian errneas.
Para dicho estudio debe cumplirse con lo siguiente:
1. El laboratorio proporciona un frasco especial para el parmetro que habr de determinarse.
2. El paciente elimina toda la orina a primera hora de la maana (por ejemplo, 7:00 am).
3. Desde ese momento y hasta el siguiente da a la misma hora, el paciente recolectar todos los volmenes de orina.
Examen de urocultivo
Para el estudio de urocultivo se requiere una muestra de la maana, previo aseo, para lo cual el laboratorio proporcionar un frasco estril. Es requisito indispensable que el paciente tenga ms de 3 das de no tomar antibiticos, ya que se investiga el nmero de bacterias, as como su gnero y especie.
EJERCICIO
Recoleccin y manejo de muestras de sangre y orina
Describa cmo se obtiene sangre completa1. .
Describa cmo se obtiene suero y plasma. 2.
Describa los tipos de anticoagulante utilizados en el laboratorio, as como su funcin.3.
Cuntos tipos de punciones existen para extraer sangre?4.
Qu factores deben tomarse en cuenta para la extraccin de sangre?5.
Describa las instrucciones para los exmenes de orina de 24 h.6.
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REFERENCIAS
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Gil, Jos Luis: Hematologa sin microscopio. Ed. Masson. Espaa. 2003. pp. 12, 13.Gonzlez de Buitrago J.M: Tcnicas y mtodos de laboratorio clnico. 2 edicin. Masson. Espaa.
2004. pp. 49-54, 62-64.Morn Villatoro, Luis: Obtencin de muestras sanguneas de calidad analtica. Asociacin Mexicana
de Bioqumica Clnica, A.C. Mxico. 2001. Editorial Panamericana. pp. 47, 65, 103, 120.Vives Joan, Luis. Aguilar, Joseph Luis: Manual de tcnicas de laboratorio en hyematologa. 2 edicin.
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Captulo 4
IntroduCCIn a la HEmatoloGa
HEMATOPOyESIS
En las primeras semanas de vida embrionaria aparecen los inicios de hematopo-yesis en el saco vitelino y entre el primer y el tercer mes esta funcin la realiza el hgado y en menor proporcin el bazo, que son rganos hematopoyticos fun-damentales durante la vida fetal. A partir del cuarto mes de gestacin se inicia la hematopoyesis en el esqueleto y al momento del nacimiento es casi total en la mdula sea y va desapareciendo la actividad del hgado y el bazo.
La mdula sea es un rgano que tiene amplia distribucin y que puede dividirse en dos tipos principales: la mdula hematopoytica activa (roja) y la mdula amarilla. En el recin nacido casi toda la mdula sea es roja, pero en el adulto la mdula de los huesos largos se vuelve amarilla, con excepcin de pequeas regiones en las cabezas del hmero y el fmur y en los espacios intertrabeculares de los huesos del esqueleto axial, tales como el esternn, las vrtebras y el hueso iliaco (figura 4-1).
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SISTEMA HEMATOPOyTICO
Este sistema incluye a los tejidos y rganos que intervienen en la produccin, maduracin y destruccin de las clulas sanguneas. stos son:
Mdula sea.Hgado.Bazo.Ganglios linfticos.Timo.Sistema mononuclear fagoctico.
Compartimiento de clulas madre hematopoyticas
El tejido hematopoytico presenta compartimentos celulares jerarquizados. La poblacin celular hematopoytica se clasifica en:
Compartimiento pluripotencial. Clula madre. -
Compartimiento bipotencial.Clulas progenitoras. -Clulas precursoras. -Compartimiento terminal. -Clulas maduras. -
En el compartimiento pluripotencial se encuentra la clula madre o clula stem; se puede definir como la clula que posee una capacidad de automantenimiento que se prolonga durante gran parte de la vida de un individuo.
Huesos distaleslargosFigura 4-1. Hematopoyesis.
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La clula madre desempea un papel esencial, pues todas las clulas sanguneas (eritrocitos leucocitos y plaquetas) proceden de las clulas madre pluripotencial (figura 4-2).
En este primer compartimiento se incluyen clulas progenitoras ms primi-tivas, capaces de dividirse y autoperpetuarse, pero a las que morfolgicamente no es posible diferenciarlas entre s.
En el segundo compartimiento se encuentran las clulas progenitoras y precursores, que pueden ser reconocidas mediante el estudio de la morfologa en un frotis de mdula sea, donde se reconoce a las clulas de cada una de las series: mieloide, eritroide, granuloctica, monoctica y plaquetaria.
Eritropoyesis
Es regulada por el grado de oxigenacin tisular y por la hormona eritropoyeti- na. El grado de oxigenacin tisular depende del nivel de la hemoglobina, el cual es apreciado por el sensor de oxgeno a nivel de la mdula renal, de forma que la hipoxia (disminucin de la presin de oxgeno) provoca la produccin de eritropoyetina.
La eritropoyesis se lleva a cabo en la mdula sea, donde la clula madre (o stem-cell) es una clula pluripotencial con informacin de todas las clulas sanguneas. En la siguiente etapa se convierte en una clula multipotencial que posee informacin de los leucocitos (basfilos, neutrfilos, eosinfilos, monoci-tos), plaquetas y eritrocitos. Despus de estas dos etapas se convierte en clulas progenitoras comprometidas con la sntesis de eritrocitos y tienen dos fases:
Las unidades formadoras eritroides explosivas (BFU-E).Las unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E).
Durante el estadio de maduracin, las clulas progenitoras eritroides (CFE-E ) se convierten en proeritoblastos, que es el primer precursor eritroide reconoci-ble. El proeritoblasto sufre mitosis y forma el eritoblasto basfilo, que debe su nombre a la alta concentracin en el citoplasma de cido ribonucleico (RNA), el cual tiene una afinidad por los colorantes bsicos. La descendencia de la mitosis de los eritroblastos basfilos son los eritoblastos policromatfilos; en esta divisin los eritroblastos policromatfilos empiezan a sintetizar cierta can-tidad de hemoglobina. Cuando las clulas han adquirido casi toda su dotacin de hemoglobina, su citoplasma es eosinfilo y estas clulas se convierten en eritroblastos ortocromticos. Durante su madurez el ncleo es expulsado, for-mndose as el reticulocito (figura 4-3).
El tiempo necesario para la maduracin de un precursor de los eritrocitos es de aproximadamente 6 a 8 das. En la anemia se disminuye el tiempo de expulsin del ncleo, lo que explica que se presenten eritrocitos con tamao superior (macrocitosis) en sangre perifrica y en eritrocitos nucleados (eritro-blastos) en casos extremos.
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Mdula sea Sangre perifrica
Clula madre
Linfocito T
Linfocito B
TimoCFL-Lclulaformadora de linfocitos
CFU-T
CFU-B
CFU-GClula comprometidapara granulocitos
CFU-GMClula comprometidapara granulocitosy mono citos
Mieloma, neutrfilo
Metamielocitoneutrfilo
PromielocitoMieloblasto
Neutrfiloen banda
Neutrfilosegmentado
Monocito
Macrfago
Clula madremultipotencialmieloide(CFU-GEMM)
Monoblasto PromonocitoCFU-Mclulacomprometidapara monocitos
CFU-Eoclulacomprometidapara eosinfilos
BFU-Eclula madreeritroide
BFU-MKclula madretrombo-poytica
CFU-Basclulacomprometidapara basfilos
Mieloblasto Mielocitobasfilo
Basfilo
CFU-MKclula comprometidatrombo-poytica
CFU-Eclulacomprometidaeritroide
Proeritroblasto Eritrocito
Mega-carioblasto
Premega-cariocito
Plaqueta
Mieloblasto Mielocitoeosinfilo
Metamielocitoeosinfilo
Eosinfilo
Clula madrehematopoyticapluripotencial
Figura 4-2. Esquema del origen de las clulas sanguneas.
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Reticulocito. Esta clula es un precursor del eritrocito y llega en esta forma a la sangre perifrica despus de vivir unos das en mdula sea. En esta etapa ha perdido el ncleo y las mitocondrias, pero posee cierta cantidad de RNA en su citoplasma antes de convertirse en eritrocito maduro y al colorearse adquie-re una tonalidad azulada. El recuento de reticulocitos se utiliza como medida del nmero de clulas que libera la mdula a la sangre (eritropoyesis eficaz), constituyendo esto un parmetro para medir la eficacia de un tratamiento con hierro, cido flico o vitamina B12, segn el tipo de deficiencia diagnosticado. Los valores de referencia de los reticulocitos oscilan entre 0.5 y 1.5 % en los adultos y entre 2.5 y 6.5% en los recin nacidos (Aguilar, J.L., 2002).
La cantidad de reticulocitos aumenta cuando la mdula responde a la ane-mia formando eritrocitos a un ritmo superior al normal (8% en adultos). Esta situacin se puede presentar en hemorragias agudas o en hemlisis.
El nmero bajo de reticulocitos en un enfermo anmico es de mal pronstico ya que significa que la mdula sea no tiene los nutrimentos necesarios para la eritropoyesis o se encuentra daada por la accin de agentes infecciosos, frmacos o toxinas.
En el esquema del cuadro 4-1 se describen las caractersticas de las clulas precursoras de un eritrocito durante las diferentes etapas de su maduracin en la medula sea.
Eritrocito. La maduracin del reticulocito por prdida de la sustancia reti-cular basfila da origen al eritrocito maduro. El eritro