MICROBIOLOGIA GENERAL

MICROBIOLOGIA GENERALUNP

I. INTRODUCCIN.- Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).Adems, los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.En los laboratorios de Microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido, se parte de un medio liquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.

II. OBJETIVOS.- Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo. Aprender la clasificacin y uso de los medios de cultivo. Preparar medios de cultivo y soluciones.

III. MARCO TERICO.-El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos.La composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan considerablemente.Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normalesy microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de:1. Un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),2. Determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominadosmedios selectivos.3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:1.Indispensables: Entre los primeros se incluye elagua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc.) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc.)2.Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl),agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Imagen N1.- Medios Solidos A. Clasificacin de los medios de cultivo segn su origen Los medios de cultivos pueden clasificarse en: Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc. Artificiales: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composicin qumica se denomina sinttico o qumicamente definido; puede ser una simple solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgnicos. Un medio no sinttico o complejo es aquel del que se desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo.

B. Clasificacin de los Medios artificiales complejos segn su Finalidad

1. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como el caldo carne y agar carne. 2. Medios especiales: se los clasifica segn su finalidad. a. Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio comn, con el agregado de elementos nutritivos elegidos segn las necesidades. tales como sangre, albmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el agar sangre y el agar chocolate. b. Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban la proliferacin de la flora acompaante. Para esto ltimo se busca establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el agregado de inhibidores. El agar Sabouraud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayora de las bacterias. Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde brillante), los antibiticos, el alcohol fenil etlico y la azida de sodio. Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en los que los microorganismos crecen en libre competencia, vindose favorecidos aquellos para los cuales las condiciones de desarrollo son las ms apropiadas, no llegndose a inhibir totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra as la multiplicacin de los microorganismos que se desea identificar, hasta un nmero suficiente tal que sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados. Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos slidos, se utilizan para sembrar directamente con la muestra incgnita o a partir del medio selectivo para enriquecimiento. c. Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o ms tipos de microorganismos pueden crecer en este medio, algn elemento presente en l permite diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna propiedad bioqumica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este tipo es el agar con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias. Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color blanco grisceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son oscuras y con brillo metlico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con un centro azul y rara vez presentan brillo. En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-diferenciales resultan muy tiles para el aislamiento de un microorganismo separndolo de la flora acompaante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora acompaante.

C. Caractersticas generales de un buen medio de cultivo

Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos. En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y slidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo. En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

D. Constituyentes habituales de los medios de cultivo.-Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin. Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %. Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos. Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

IV. MATERIALES Y REACTIVOS.-

1. 2. 3. 4.1 Materiales y Reactivos

Materiales del Laboratorio Piceta Matraz 250 ml 6 tubos de ensayo Balanza Cocina elctrica Algodn Tubos de fermentacin

Reactivos Agar nutritivo Verde brillante Agar Sabouraud Solucin salina fisiolgica Agua destilada

4.2 METODOLOGA.-

A) Preparacin de agar nutritivo:1. Para la preparacin del caldo nutritivo lo primero que se debe hacer es empezar pesando los diferentes compuestos con los pesos indicados. Los diferentes compuestos que lleva el agar nutritivo son: peptona, extracto de carne, agar.2. Luego de pesar los diferentes compuestos, se pone rpidamente en un matraz ya que se va a disolver con agua destilada, mover hasta que se disuelva por completo todo.3. Una vez disuelto todo en el matraz, se prepara unos tapones a base de algodn para tapar el matraz y as se lleva a bao mara para que se disuelvan por completo el contenido y se esterilice.

B) Preparacin de verde brillante:1. Se realiza el pesado del verde brillante (segn la relacin calculada en el laboratorio).2. Luego se pasa a poner en el matraz y se agrega 30 ml de agua destilada.3. Con la ayuda de una pipeta pasar a verter el contenido en tubos de ensayo.4. Luego introducir en cada tubo una tubo de fermentacin, tratando de que quede en el fondo del mismo y que no contenga aire.

C) Preparacin de Agar Sabouraud:1. Se realiza el pesado del agar sabouraud (segn la relacin calculada en el laboratorio). 2. Luego de pesar los diferentes compuestos, se pone rpidamente en un matraz y se agrega 100 ml de agua destilada.3. Una vez disuelto todo en el matraz, se prepara unos tapones a base de algodn para tapar el matraz y as se lleva a bao mara para que se disuelvan por completo el contenido y se esterilice.

D) Preparacin de Solucin salina fisiolgica (S.S.F):1. Se realiza el pesado de la solucin fisiolgica salina (segn la relacin calculada en el laboratorio). 2. Luego de pesar los diferentes compuestos, se pone rpidamente en un matraz y se agrega 90 ml de agua destilada.4. Una vez disuelto todo en el matraz, se prepara unos tapones a base de algodn para tapar el matraz y as se lleva a bao mara para que se disuelvan por completo el contenido y se esterilice.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES.-

5.1 RESULTADOS.-A) Preparacin del Agar Nutritivo

Preparacin del Agar nutritivo

Para realizar la preparacin de este cultivo se debe tener en cuenta los siguientes clculos y se debe calcular la siguiente relacin:20 gr. --------------------------- 1000mlx-------------------------------- 50ml

La observacin en este caso es que para poder disolver el agar completamente en el agua se necesita poner a bao mara y de paso se esteriliza la preparacin.

B) Preparacin del verde brillante

Tubos de ensayo con Verde Brillante

Para realizar la preparacin de este cultivo se debe tener en cuenta los siguientes clculos y se debe calcular la siguiente relacin:40 gr. --------------------------- 1000mlx-------------------------------- 30ml

La observacin en este caso es que no se necesita un bao mara para la disolucin del verde brillante, si no que con una simple agitacin por un cierto periodo de tiempo, se obtendr una mezcla homognea. Y luego esta preparacin se pone en tubos de ensayos a los cuales se les adiciona tubos de fermentacin.

C) Preparacin de Agar Sabouraud.-

Para realizar la preparacin de este cultivo se debe tener en cuenta los siguientes clculos y se debe calcular la siguiente relacin:47 gr. --------------------------- 1000mlx----------------------------------100ml

La observacin en este caso es que para poder disolver el agar sabouraud completamente en el agua se necesita poner a bao mara y de paso se esteriliza la preparacin.

D) Preparacin de Solucin salina fisiolgica

Para realizar la preparacin de este cultivo se debe tener en cuenta los siguientes clculos y se debe calcular la siguiente relacin:8.5 gr. --------------------------- 1000mlx ----------------------------------- 90ml

La observacin en este caso es que para poder disolver la solucin fisiolgica completamente en el agua se necesita poner a bao mara y de paso se esteriliza la preparacin.

5.2 DISCUSIONES.- El objetivo de del verde brillante es el de poder inhibir el crecimiento de los microorganismos distintos de los del grupo de Coliformes, al tiempo que stos puedan crecer sin restriccin. Con la presencia de la Bilis de buey y del Verde Brillante se consigue la inhibicin de casi la totalidad de los microorganismos Gram-positivos y de los Gram-negativos distintos de los del grupo de los Coliformes. Se ha de sealar que la concentracin de Verde Brillante es crtica para impedir el crecimiento de grmenes anaerobios capaces de fermentar la lactosa a 44C, lo cual, si se produjera, podra falsear los resultados. Debe confirmarse la identificacin por otras pruebas ya que la fermentacin de la lactosa con formacin de gas se interpreta como indicativo de E. coli. La produccin de gas se evidencia con la campana de Durham.TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la Microbiologa, 9 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.As como dice el anterior prrafo, hay algunos medios de cultivo que son exclusivos para cierto grupo de microorganismos y a los que no cuentan con ciertas caractersticas determinadas simplemente no pueden desarrollarse en este medio. Por lo tanto, as queda demostrado lo que se expres en clase, que si bien es cierto los medios de cultivo sirven para el crecimiento y desarrollo de microorganismos, estos medios tambin estn especializados para ciertas clases de estos.

VI. CONCLUSIONES.- Se logr establecer los fundamentos tericos para la ptima preparacin de medios de cultivo. Se aprendi la clasificacin y uso de los medios de cultivo, y se concluye que sin estos medios de cultivo, no se podra experimentar ni estudiar a los microorganismos en el laboratorio. Se concluy que para preparar medios de cultivo y soluciones, se debe tener en cuenta en qu condiciones se est llevando a cabo el experimento, por lo que se debe trabajar con sumo cuidado y mucha precaucin.

VII. RECOMENDACIONES.- Utilizar guardapolvo y guantes para evitar todo contacto con las muestras de cultivos bacterianos. Tener mucho cuidado al momento de pesar la muestra (agar nutritivo, verde brillante, etc.), ya que es necesario mantener la exactitud en estos procedimientos. Utilizar con mucho cuidado la cocina elctrica, para evitar as cualquier incidente con los alumnos. Usar con moderacin y extremo cuidado los reactivos a usar.

VIII. ANEXOS.-

Imagen N1. Pesado de la muestra

Imagen N2 . Se pone el pesado en el matraz

Imagen N3. Se agrega los ml de agua requeridos.

Imagen N4. Se mueve constantemente

Imagen N5. Se prepara el matraz para ser llevado a bao mara

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.-

GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I. y R. DAZ. 2005. Manual prctico de microbiologa. Masson. BarcelonaTORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la Microbiologa, 9 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina. WILEY, J. M.; SHERWOOD, L. M. y WOOLVERTON, C.J. 2008. Microbiologa de Prescott, Harley y Klein. McGraw-Hill. Interamericana de Espaa, S.A.U. Madrid

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