informe de microbiologia ambiental

PRCTICA DE LABORATORIO N 9

2013-IPRCTICA DE LABORATORIO N 9

OBJETIVOS

Determinar por el nmero ms probable de coliformes totales y fecales por la tcnica de tubos mltiples. Recuento de bacterias hetertrofas. Realizar un anlisis microbiolgico a una muestra de agua de la laguna terciaria de CITRAR. Verificar si el agua es apta para riego de de plantas.

FUNDAMENTO TEORICOEl grupo coliforme, presentan mayormente en el sistema digestivo de los animales como tambin en vegetales (semillas) y esparcidas por el suelo, adems, pueden utilizarse como indicadores de contaminacin del agua. El anlisis que se realizo, determino la presencia y ausencia de coliformes fecales y totales en las tres muestras diferentes de agua, como son: Agua residual, agua de pozo y agua mineral; a partir de cultivar estos grupos de microorganismos en agares especficos con implementos adecuados para su identificacin. En la primera muestra mencionada, se obtuvo que el total de muestras analizadas por dilucin, presenten grupos coliforme, mas no se observo lo mismo en las otras muestras de agua mineral y de pozo. La determinacin de grupos coliforme es una forma de identificar el grado de contaminacin por excretas existente en el agua. Grupo coliforme, coliformes fecales, coliformes totales, agar, dilucin, inoculacin, incubacin.El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas caractersticas biolgicas - qumicas especificas, estas caractersticas, propias de cada organismo que integra este grupo muestran que:Son organismos aerobios o anaerobios facultativosSon gran negativosProducen gasFermentan la lactosa a 35C a 48hEstas caractersticas son las relevantes de todos los miembros del grupo coliforme, la bacteria principal de este grupo es la Escherichia Coli. Dela cual deriva el nombre del grupo en general. Estos microorganismos se encuentran de forma continua y general en el sistema digestivo animal, especficamente en el intestino, por ende, es muy obvio encontrarlos en zonas donde haya heces y en restos fecales de animales. A estos se les llaman: Coliformes fecales, que al igual que los coliformes totales, forman parte del grupo coliforme. Coliformes fecales < coliformes totales = grupo coliforme. Estos microorganismos tienen una continua relacin con el medioambiente, puesto que, en los lugares donde habita cualquier tipo de animal, existe coliformes, entonces estarn expuestos a diferentes alteraciones producidas por estas bacterias, como: intoxicaciones y enfermedades digestivas (mayormente).Por otra parte, las bacterias coliformes que la lluvia arrastra, por el suelo, usualmente quedan atrapadas por las rocas y a medida que el agua pasa por las rocas llega a los sistemas de agua subterrnea, sin embargo, los pozos que no estn bien construidos, son una puerta abierta para que estas bacterias contaminen el agua que se bebe.El usar este tipo de anlisis por coliformes resulta mucho mas sencillo y econmico, a comparacin con el de buscar microorganismos especficos. Para la deteccin de estos microorganismos, se utilizan medios de cultivos especficos, en los cuales se les inocula una parte de la muestra a analizar, estos medios garantizan los requerimientos nutricionales del grupo coliforme. Adems, para analizar estos coliformes se plantearon tres fases, la fase presuntiva, la fase confirmativa y la fase complementaria, cada una de ella con una funcin especfica en la identificacin y aislamiento de microorganismos del grupo coliforme delas dems bacterias que estn presentes en la muestra.

MEDIOS UTILIZADOS EN EL EXPERIMENTO:LAURIL SULFATO CALDOMedio recomendado por A.P.H.A. para deteccin y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos.FundamentoMedio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos.La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmticoEs un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompaante.Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se evidencia al utilizar las campanas Durham.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Triptosa20.0Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta la disolucin total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentacin. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.

Lactosa5.0

Cloruro de sodio5.0

Lauril sulfato de sodio0.1

Fosfato dipotsico2.75

Fosfato monopotsico2.75

pH final: 6.8 0.2

SiembraPara recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero ms Probable:a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.Nmerode tubosVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio

310 ml10 mlDoble

31 ml10 mlSimple

30.1 ml10 mlSimple

b.- Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10-1, 10-2y 10-3y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin.Nmerode tubosDilucin dela muestraVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio

310-11 ml10 mlSimple



IncubacinIncubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.Resultados

Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.MicroorganismosCrecimientoProduccinde gas

Enterobacter aerogenesBueno a excelente+

Escherichia coli ATCC 25922Bueno a excelente+

Salmonella typhimurium ATCC 14028Bueno a excelente-

Staphylococcus aureus ATCC 25923InhibidoInhibido

El resultado del nmero ms probable se expresa por 100 ml para muestras fluidas y por gramo para muestras slidas.

Caractersticas del medioMedio preparado: agar claro a claramente opalesco.

CALDO VERDE BRILLANTE BILISEste medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la tcnica del nmero ms probable.FundamentoEn el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Bilis de buey deshidratada20.0Suspender 40 g del polvo deshidratado por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Preparar adems, el medio a doble concentracin. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Lactosa10.0

Peptona10.0

Verde brillante0.0133

pH final: 7.2 0.2

Siembraa.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.Nmerode tubosVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio

310 ml10 mlDoble

31 ml10 mlSimple

30.1 ml10 mlSimple

b.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10-1,10-2y 10-3y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin.Nmerode tubosDilucin dela muestraVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio




c.- Para anlisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2% Caldo Mac Conkey Caldo Lauril Sulfato, utilizando la tcnica del NMP), o a partir de colonias presentes en diferentes medios, que se presume sean coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2% caldo fresco, incubando a 45 +/- 0.5 C y otra en Agua Triptona con incubacin a 35-37 C, para detectar la produccin de indol.Incubacina- Para de coliformes totales: a 35-37 C durante 24 horas.b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 C durante 24 horas.Resultados-Positivo: presencia de gas.Con el nmero de tubos positivos, calcular el nmero ms probable. El resultado se expresa por gramos 100 ml de producto-Negativo: ausencia de gas.MicroorganismosCrecimientoGasIndol#

Escherichia coli ATCC 25922++*+*

Enterobacter spp.++-*

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603++*-*

Salmonella typhimurium ATCC 14028+--

Bacterias no fermentadores de lactosa+-Variable

Staphylococcus aureus ATCC 25923---

Caractersticas del medioMedio preparado: verde esmeralda, transparenteE. C. MEDIOMedio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales.FundamentoEl contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompaante. Este caldo es recomendado por el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975), y por Hajna y Perry (1943), para el recuento de coliformes en alimentos.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Triptena20.0Suspender 37,4 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar hasta su total disolucin. Distribuir en tubos de ensayo que contengan campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.

Lactosa5.0

Sales biliares N 31.9

Fosfato dipotsico4.0

Fosfato monopotsico1.5

Cloruro de sodio5.0

pH final: 6.9 0.2

SiembraPara recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Ms Probable:a.- Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.Nmerode tubosVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio

310 ml10 mlDoble

31 ml10 mlSimple

30.1 ml10 mlSimple

b- Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10-1, 10-2y 10-3y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin.Nmerode tubosDilucin dela muestraVolumen de la muestraVolumen de medioConcentracindel medio




IncubacinIncubar los tubos 24-48 horas a 35-37 CResultadosSe consideran resultados positivos el crecimiento bacteriano y produccin de gas.MicroorganismosCrecimientoProduccin de gas

Enterobacter aerogenesBueno a excelente+

Escherichia coli ATCC 25922Bueno a excelente+

Salmonella typhimurium ATCC 14028Bueno a excelente-

Staphylococcus aureus ATCC 25923InhibidoInhibido

El resultado del nmero ms probable se expresa por 100 ml para muestras fluidas y por gramo para muestras slidas.

METODOLOGA

Materiales a usarse en los experimentos

Placas Petri Tubos de ensayo

2013-1PRCTICA DE LABORATORIO N 9

3

Mechero Bunsen Balanza analtica

Asa de Siembra Tripode

Malla de Asbesto Bao Mara

Pipeta Erlemeyer

Reactivos usados en los experimento

Nombre del reactivo

Muestra de Agua de CITRAR

Caldo Lauril Sulfato de doble concentracin.

Caldo Lauril Sulfato de simple concentracin.

Agua peptonada

Caldo Brilla

Caldo EC.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA: Determinacion del Nmero ms probable de Coliformes Totales y Coliformes fecales para la tcnica de Tubos Multiples. Recuento de Bacterias Heterotrofas

Agua de CITRAR

MUESTRA DE AGUA

Diluciones sucesivas

Agregar 10 ml a cada tubo

10-210-310-410-5

Agregar 1 ml a cada tubo

10-1Caldo Lauril sulfato (doble concentracin)

Agua Peptonada

Caldo Lauril simple concentracin (Por Triplicado)Incubar 24 2horas a 35 0.5 C

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFASO MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES

MUESTRA DE AGUA

Agua de CITRARDiluir 10 ml a cada tubo de ensayo

90ml90ml90ml90ml90ml

10-310-210-110-410-5

Agregar el Agar TSA, Homogenizar15-20 mlIncubar a 35C x 48 horasInvertir las Placas

CONTINUACION DE LOS PROCEDIMIENTOS:

LUNESSembrar 2 asadasGas (-)Prueba NegativaGas (-)Prueba NegativaCaldo EC

PRUEBA CONFIRMATIVA

Tubos Positivos (produccin de gas)Tubos Positivos (produccin de gasy turbidez)

10 mL Caldo Brilla

Incubar44,5 0,2 C24 2horasIncubar35 0,5 C48 3 horas

GAS (+)Calcular valor NMP de los nmeros de tubos positivos en la TABLA (NPM/100mL)GAS (+)Calcular valor NMP de los nmeros de tubos positivos en la TABLA (NPM/100mL)

Recuento de bacterias hetertrofas de las placas con Agar TSA.

OBSERVACIONES/RESULTADOS

Si hay formacin de gas se procede la la siguiente etapa sino se deja incubar 24 horas ms (si a las 24 horas no forma gas a los 48 horas se observa). Tubos positivos

Caldo LST de doble concentracin. Los tres tubos sembrados son positivos con crecimiento de organismos, turbidez del medio, formacin de gas y sedimentacin.

Caldo LST de simple concentracin. Los tres tubos sembrados son positivos con crecimiento de organismos, turbidez del medio, formacin de gas y sedimentacin.

Dilucin 10-1:Tres tubos positivos con presencia de gas, crecimiento de organismos, turbidez del medio y sedimentacin. Dilucin 10-2:

10-2 A: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio, presencia de gas y poca sedimentacin. 10-2 B: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio, presencia de gas y poca sedimentacin. 10-2 C: crecimiento de microorganismos, turbidez del medio y presencia de gas. Dilucin 10-3:

10-3 A: Presencia de gas y turbidez del medio 10-3 B: Crecimiento de microorganismos, turbidez del medio sin presencia de gas 10-3 C: Crecimiento de microorganismos, turbidez del medio sin presencia de gas Dilucin 10-4: 10-4 A: Poca turbidez del medio sin presencia de gas 10-4 B: Poca turbidez del medio sin presencia de gas 10-4 C: Mayor crecimiento de microorganismos turbidez del medio sin presencia de gas Dilucin 10-5: Sin crecimiento ni turbidez del medio, todos tubos negativos. Recuento de bacterias hetertrofas: Incontable: Incontable: 92 colonias: 44 colonias: 31 colonias

Caractersticas de las colonias: Amarillentas con halo color cremoso, otras blancas, forma irregular. PLACAS RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS10-110-210-310-410-5

IncontableIncontable924431

Del tubo 10-3: 92 x 103Del tubo 10-4: 44 x 103Del tubo 10-5: 31 x 103

Como la relacin de estas diluciones consecutivas es menor que 2 se realiza el promedio.Resultado: 56x103 UFC x gr

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Tal y como se esperaba se pudo lograr esta vez un buen resultado en el NMP debido a que esta vez si se realizo un buen trabajo. No es apta para el consumo ya que presenta demasiados coliformes totales y fecales. No es apta para el riego de plantas ya que se pasa del lmite permisible de coliformes. Debe de tratarse ms estas aguas para que sean aptas tanto para el riego como para el consumo humano.RECOMENDACIONES

A la hora de sembrar es preferible estar cerca del mechero de bunsen para as poder evitar alguna contaminacin a la muestra. Realizar de forma correcta las siembras, para evitar errores en los resultados. Seguir las indicaciones del profesor encargado del curso para que el experimento sea un xito. A la hora de las diluciones se debe tener cuidado con no confundir las pipetas utilizadas en cada dilucin. Manejar con cuidado la muestra ya que es muy contaminada, evitar tener contacto con ella.

BIBLIOGRAFIA Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo ll, Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003. Alonso Urmeneta y otros. Manual Prctico de Microbiologa. Raquel Granados Prez, Bacteriologa. Medios de cultivo y pruebas bioqumicas. Micologa General. Parasitologa General Tomo l, Segunda Edicin, Paraninfo, Madrid, 2003.

ANEXOS Galera

Muestras de agua de CITRAR rotulado de a Homogenizacin de la placa petri con dilucin y agar de las concentraciones. TSA.

Sembrando de tubos positivos en caldo Brilla. Crecimiento en Caldo LST (simple Concentracin).

12

informe de microbiologia ambiental

Documents