Normas de Seguridad En El Laboratorio. Material De Laboratorio De Microbiologa Ambiental. Limpieza, Desinfeccin Y Esterilizacin De Material. UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

"Ao de la Promocin de laIndustria Responsable y del Compromiso Climtico"

INGENIERIA AMBIENTAL

TTULO: NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO. MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL. LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.INFORME DE LABORATORIO N1

CURSO: MICROBILOGIA AMBIENTAL BO112

PROFESOR: MARTINEZ VILA, ALVARO MARTIN

ALUMNO: OPE CADILLO, VLADIMIR ALCIDES 20131381B

11 DE ABRIL DEL 2014 LIMA PER

OBJETIVO

A) Conocer las normas de seguridad del laboratorioB) Conocer los principales instrumentos, equipos y material de vidrio usado en un laboratorio de microbiologa para el diagnstico de enfermedades infecciosas.

C) Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de instrumentos, materiales y reactivos en la prctica microbiolgica.

D) Tratamiento de los materiales antes de un apractica en el laboratorio.

E) Familiarizar con los distintos metodos de desinfeccion y esterilizacin de material.

FUNDAMENTO TORICO

NORMAS DE SEGURIDADEl laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos o bromas. Para ello se tendrn siempre presente los posibles peligros asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuacin se exponen una serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio:A) Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto del guardapolvo que deber emplearse durante toda la estancia en el laboratorio. las gafas de seguridad siempre que se manejen productos peligrosos y durante el calentamiento de disoluciones. los guantes deben utilizarse obligatoriamente en la manipulacin de productos.B) Qutese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de accidentes mecnicos, qumicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y sombreros. C) Est prohibido fumar, beber o comer en el laboratorio, as como dejar encima de la mesa del laboratorio ningn tipo de prenda.D) Como regla general no se debe pipetear nunca con la boca.E) El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero como la toma del gas de la mesa.F) Las heridas y quemaduras deben ser tratadas inmediatamente

NORMAS DE TRABAJO

1) Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, adems del equipo especial en caso de prdida o dao, deber responder de ello.2) Al finalizar cada sesin de prcticas el material y la mesa de laboratorio deben dejarse perfectamente limpios y ordenados. 3) El material asignado a cada prctica debe permanecer en el lugar asignado a dicha prctica.

EQUIPOS DE LABORATORIO

En el laboratorio existen materiales que son tiles para cada experimento y que necesitan adecuado tratamiento para su utilizacin en cada experimento. Es importante elegir el equipo adecuado para el trabajo microbiolgico. Los proveedores de equipos cientficos proporcionan una amplia gama de aparatos, materiales de vidrio y tiles de plsticos, pero por desgracia, no todos son adecuados para el uso microbiolgico.

MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL1) MICROSCOPIOLos microscopios ms usados son el ptico de campo claro (hasta 2000 aumentos) y el electrnico (hasta 100 000 aumentos), adems existen otros con fines ms especficos como los microscopios pticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro, el de contraste de fases y el de luz ultravioleta.

Microscopio ptico:

1. Partes:1. Mecnica.2. ptica. 3. Sistema de Iluminacin.

2. Mecnica:

a) Pie.b) Platina (Circular o rectangular fija o mvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren).c) Tubo ptico, revlver.d) Sistema de enfoque: tornillos micromtricos y macromtricos (cremallera).

3. Sistema ptico:

a) Oculares: 05-10-20X.b) Objetivos: 05-10-40-100X.

4. Sistema de iluminacin:

Fuentes de iluminacin: natural y artificial. Espejo: Plano y Cncavo. Diafragma, filtros. Condensador.

i) USO ADECUADO

Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente. (Utilice los objetivos secos para pequeos aumentos).A menor aumento se requiere menor iluminacin, lo cual se consigue bajando el condensador y cerrando parcialmente el diafragma.La observacin de las muestras hmedas, es decir en fresco, se hace con lentes de menor aumento o sea sin inmersin; este queda para las muestras coloreadas y en general para aquellos casos en que se requiere la mxima cantidad de luz.

a. Para la observacin microscpica proceda segn el siguiente orden:

i. Ilumine empleando el espejo cncavo o plano; la eleccin depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros factores.ii. Enfoque de preferencia con la lente de menor aumento que por lo comn tiene un tope inferior que impide la ruptura de las lminas la observar.iii. Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revlver y utilice el objetivo deseado. Para el enfoque preciso, use tornillo micromtrico.iv. Mantenerlos ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.

v. Al terminar la observacin limpie el objetivo con un papel especial para lente o con algodn o un lienzo fino. Si hay impregnacin de aceite utilice alcohol isoproplico en pequea cantidad y seque bien. Las lminas una vez observadas se depositarn en un recipiente apropiado, el que contiene mezcla sulfocrmica.

2) AUTOCLAVEUnaautoclavees unrecipiente de presinmetlico de paredes gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a altapresinparaunaesterilizacinconvapor de agua

Destinado a la esterilizacin con calor hmedo y presin (121C x 15' a 15 Lbs/pulg2 ), se esteriliza: materiales de desecho, medios de cultivo, ropa de sala de operaciones, agua destilada, etc.

Lasautoclavesfuncionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de 103kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121grados Celsius. Un tiempo tpico de esterilizacin a estatemperaturaypresines de 15-20 minutos.

3) HORNO

Destinado a la esterilizacin con calor seco (se llama tambin horno de Pasteur o Poupinel). La temperatura usual es de 180 -160C por 1-2 horas. Se esteriliza material de vidrio e instrumentos metlicos.

Posee untermostatoque controla la temperatura mediante un control digital. Suaislamiento trmicoes de doble pared para mantener elcalory ahorrarenerga: la capa interna posee unaconductividad trmicabaja, y su capa exterior es metlica. Tambin hay un espacio lleno de aire entre ambas capas como refuerzo del aislamiento.

A diferencia de unautoclave, estos hornos no necesitan agua y tampoco deben resistirpresioneselevadas, hacindolos ms seguros para trabajar. Esto tambin los hace ms aptos para ser utilizados en un entorno delaboratorio. Son mucho ms pequeos que las autoclaves, pero su eficacia puede ser similar. Generalmente funcionan con temperaturas ms altas, en comparacin con otros medios. Elcalor secono permite eliminar algunas sustancias como lospriones, que s pueden eliminarse concalor hmedo.

Un ciclo completo de uso consiste en calentar el horno a la temperatura requerida, mantener esta temperatura durante el intervalo de tiempo adecuado, apagar la mquina y dejar el horno cerrado hasta que los objetos se enfren y alcancen la temperatura ambiente. Los modos estndar de funcionamiento de un horno de aire caliente son:

1,5 a 2 horas a 160 C (320 F) 45 min a 1 hora minutos a 190 C (374 F) 30 min a 250 C.

A los tiempos anteriores hay que aadir el tiempo necesario para calentar la cmara antes de comenzar el ciclo de esterilizacin. Si la puerta se abre antes de tiempo, se escapa el calor y el proceso se queda incompleto.

4) ESTUFA O INCUBADORA

Es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecercultivos microbiolgicosocultivos celulares. La incubadora mantiene latemperatura, lahumedady otras condiciones en grado ptimo, tales como el contenido de dixido(CO2) y deoxgenoen su atmsfera interior. Las incubadoras son esenciales para una gran cantidad de trabajos experimentales enbiologa celular, lamicrobiologay enbiologa moleculary se utilizan para cultivos celulares, tanto bacterianoscomo declulas eucariotas.

Proporciona una temperatura que se mantiene fija mediante un termostato; esta temperatura se elige segn el requerimiento del microorganismo a cultivar. Generalmente es de 37C por 24 a 48 horas.

5) REFRIGERADOR O NEVERA

Consiste en un armario aislado trmicamente, con un compartimento principal en el que se mantiene unatemperaturade entre 2 y 6C y tambin, frecuentemente, un compartimento extra utilizado paracongelacina 18C y llamado, apropiadamente,congelador.

Permite conseguir bajas temperaturas y se utiliza con fines de conservacin de grmenes, de medios de cultivos, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a temperatura de O a 4C.

6) CENTRIFUGAEl centrifugado es unasedimentacinacelerada, ya que la aceleracin de lagravedadse sustituye por laaceleracin centrfuga.Aparato de muy diversa capacidad que permite separar una sustancia slida en suspensin del lquido respectivo.Por ejemplo para centrifugar orina o sangre, para obtener el "sedimento urinario o el suero" respectivamente.

7) LA BALANZASe usa en el laboratorio para pesar colorantes, componentes de medios de cultivos,reactivos, etc. Las hay de diferentes tipos segn su aplicacin y sensibilidad.

8) BAO MARA

El bao de Mara es un equipo que se utiliza en el laboratorio para realizar pruebas serolgicas y procedimientos de incubacin, aglutinacin, inactivacin, biomdicos, farmacuticos y hasta industriales. Por lo general, se utilizan con agua, pero tambin permiten trabajar con aceite. Los rangos de temperatura en los cuales normalmente son utilizados estn entre la temperatura ambiente y los 60 C. Tambin se pueden seleccionar temperaturas de 100 C, utilizando una tapa de caractersticas especiales. Los baos de Mara son fabricados con cmaras cuya capacidad puede seleccionarse entre los 2 y los 30 litros.Permite la transmisin indirecta y atenuada de calor, de un lquido sobre una sustancia a travs de un recipiente.Evita el calor directo.

9) AGITADOR MECNICO

Es un equipo de diversos diseos y con frecuencia variable por el nmero de veces que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y lminas excavadas.

Agitador magntico(con o sin calefactor): Es una placa metlica sobre la que se coloca unvaso de precipitadoso recipiente de fondo plano que contiene ellquidoo la disolucin que debe ser agitada. En ella se introduce elimn del agitador, una pequea barra imantada cubierta de plstico inerte. Unmotor elctricobajo la placa produce fuerzas magnticas que ponen en rotacin el imn, provocando el movimiento circular del lquido. La velocidad de rotacin puede ser controlada. Agitador de bandeja: La bandeja posee un movimiento circular mediante un motor que lo controla. Tambin pueden tener movimientos de balanceo o vibraciones. Se emplean para movercultivos celulares. A veces tienen un controltermostticoadicional. El movimiento puede ser orbital o de balanceo.

10) POTENCIMETROAparato destinado a determinar la concentracin de iones H (pH en una solucin). El de mayor aplicacin es el de Beckman.

11) BOMBA DE VACOProduce presin negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable, a travs de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes.

12) CONTADOR DE COLONIAS

Un contador de colonias es un instrumento utilizado paracontar colonias de bacteriaso de otrosmicroorganismosque crecen en una placa de agar.Se utiliza para el recuento de colonias en una placa de cultivo; de una manera ms exacta y con mayor facilidad.

Modo de conteoEstos contadores se utilizan para estimar la densidad de microorganismos en uncultivo lquido. Unadilucinadecuada, o varias diluciones en seriedentro del rango estimado apropiado, se propaga utilizando unatcnica estrilen la placa de agar, que seincubaen las condiciones adecuadas para el crecimiento hasta que aparecen las colonias individuales. Cada colonia marca el lugar donde se coloc un solo organismo originalmente, con lo que el nmero de colonias en la placa es igual al nmero de organismos en el volumen de lquido existente en la placa. Esta concentracin se extrapola a partir de la dilucin practicada sobre el cultivo original, para estimar la concentracin de organismos existentes en ese cultivo inicial.

13) MATERIALES DE VIDRIO:

Tubos de ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas, pipetas, placa Petri, placas de Roux, placas de Brewer, tubos de centrfuga, tubos de vidrio de diversos calibres, pipetas Pasteur, jeringas, frascos, goteros, perlas de vidrio, embudos, micropipeta, etc.

14) OTROS MATERIALES: EN VIDRIO CORRIENTE, MADERA Y PORCELANALminas excavadas de vidrio, lminas portaobjetos y cubreobjetos, termmetros, mechero de alcohol, gradillas, ASA DE KOLLE o asa Bacteriolgica, pinzas de madera, piln y mortero de porcelana.

DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIALDurante las secciones dellaboratorio, se van manipulan diferentes tipos de muestras, los cuales pueden contener agentes infecciosos importantes, que requieren ser eliminados antes de descartar los envases respectivos.Por otro lado, existenmaterialesde laboratorio reusables que requieren posterior a su utilizacin, de una limpieza y esterilizacin apropiada, tal que puedan ser utilizados posteriormente.Es importante recordar que al realizar cualquierprocedimientode limpieza y desinfeccin, se deben tener presente las precauciones universales, los equipos de bioseguridad requeridos y considerar todas las muestras como de altoriesgo.DEFINICION Esterilizacin:Procesoque destruye toda forma de vida microbiana. Un objeto estril (en sentido microbiolgico) est libre de microorganismos vivos. Desinfeccin:Es la destruccin, inactivacin o remocin de aquellos microorganismos que pueden causar infeccin u ocasionar otros efectos indeseables; la desinfeccin no implica necesariamente esterilizacin. Desinfectante: Agente usualmente qumico, que mata las formas en crecimiento de los microorganismos, pero no necesariamente las esporas. El trmino se refiere a sustancias utilizadas sobre objetos inanimados.

LA ESTERILIZACIN

La esterilizacin es un proceso a travs del que se puede lograr la destruccin total de los microorganismos viables presentes en un determinando material. Este procedimiento es de gran utilidad en todo los campos de microbiologa.

El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiologa. La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con diferentes propsitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de medicamentos, cosmticos, alimentos, etc.). Existen diversos mtodos de esterilizacin. La seleccin del mtodo es dependiendo de cada caso o tipo de material.

Clasificacin de los mtodos de esterilizacin:

Principales mtodos de esterilizacin, clasificados de acuerdo al tipo de agente que acta.

1) Agentes fsicosEl calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidacin de su componente celulares.El calor seco que destruye a los microorganismos es considerado en mtodo esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material esterilizarle soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao.

1. Esterilizacin por calorEl calor es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se est utilizando calor seco o calor hmedo. En ausencia dehumedad senecesita unatemperatura msalta, ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorberel calor. Pueden ser dos tipos:

Directa:flameadooincineracinmsutilizadaen la boratorios . Indirecto:airecalienteuhornodePasteurcon temperatura de 160C a 180C por 1 a 2 horas siendo el ms eficaz y seguro el elctrico.

Esterilizacin con calor hmedo:El calor hmedo es la forma de vapor saturado a presin es eficaz para la destruccin de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalizacin y coagulacin de su protena o su sistema intercelular enzima-protena. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua.

Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.

2. Esterilizacin por radiacin:La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de los tomos, estos se desprenden violentamente con tomos adyacentes y se une a ellos, o bien sedes prenden del segundo tomo. La energa liberada se transforma en energa trmica o qumica la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molcula del ADN e impide la divisin molecular y la propagacin de la vida. Las principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas Beta y rayos gamma.

3. Agentes qumicosAlgunas sustancias qumicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos (protenas, membranas, etc.)

CONTROL DEL PROCESO DE ESTERILIZACIN:Todos los procesos de esterilizacin se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores fsicos, qumicos y/o biolgicos, los cuales deben ser colocados encada carga de esterilizacin. Indicadores fsicosEntre los principales indicadores fsicos se encuentran los medidores de presin y los termmetros los cuales permiten constatar las condiciones fsicas dentro de la cmara de esterilizacin. Tambin existen los termgrafos los cuales, adems de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cunto tiempo sta se mantuvo.

Indicadores qumicosLa mayora de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas estn impregnadas con una sustancia qumica que cambia de color cuando el material ha sido sometido al procesode esterilizacin. Este tipo de cintas no soncompletamente confiables debido a que muchas veces slo indican que se lleg a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo sta se mantuvo. Tambin existen cintas diseadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco ms seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilizacin fue el adecuado.

Indicadores biolgicosSon preparaciones de una poblacin especfica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilizacin en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilizacin, en el sitio que se considera que es ms difcil que llegue el vapor y despus del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si despus de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (porejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilizacin no fue satisfactorio. Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar: Tipo de microorganismo Tipo de proceso de esterilizacin Nmero de lote Fecha de expiracin Medio de cultivo utilizado Condiciones de incubacin del indicador despus de aplicado el proceso de esterilizacin Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento. Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.

AUTOCLAVE MICROSCOPIO

HORNO ESTUFA O INCUBADORA

ACENTRIFUGA

AGITADOR MAGNETICO CONTADOR DE COLONIAS