herramientas diagnosticas en el laboratorio clínico
TRANSCRIPT
"Herramientas diagnosticas en el Laboratorio Clínico"
Beatriz Livellara
En el diagnostico de la Hepatitis B Es importante establecer: Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica En Hepatitis crónicas: estratificación del estado de replicación viral Respuesta a tratamiento antiretrovirales y
desarrollo de resistencia Estado de replicación residual. Marcadores subrogantes del ccc-DNA del
HBV
Organización Genómica del VHB
Dienstag JL. Management of Hepatitis B: A Case-Based Approach. Available at:
http://www.meds.com/hepatitis/casebased/dienstag.html
• S – Codifica las proteínas del
AgsHB
• Core –Codifica la proteína
core y el AgeHB
• Polimerasa – codifica a la
enzima ADN polimerasa con
actividad de transcriptasa
reversa
• X – proteina involucrada en la
génesis de CHC,
indispensable para
replicación y propagación
Marcadores Serológicos
HBsAg: Antígeno de Superficie
Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total
Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM
Anti-HBs: Anticuerpo anti-HBs
HBeAg: Antígeno e
Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e
AntiHBs Inmunidad
AntiHBc Exposición
Infección
Replicación
Infección Aguda
HBeAg
Anti HBcIgM
HBsAg ADN
HBV
ADN
HBV
ADN
HBV
Inicio del diagnóstico de Hepatitis B
Solicitar HBsAg y IgG antiHBc
Escenario 1 HBsAg (-)
IgG antiHBc(-)
Sin contacto con HBV Vacunar contra VHB
Escenario 2 HBsAg (+) IgG antiHBc(+)
IgM anti HBc
No reactivo
Infección crónica por HBV
Reactivo
Infección aguda por HBV
Escenario 3 HBsAg (+) IgG antiHBc(-)
Repetir a los 30 días con una nueva muestra
HBsAg (+) IgG antiHBc(+)
CASO CONFIRMADO
HBsAg (+) IgG antiHBc(-)
Caso poco probable de infección por HBV
Estudiar HBeAg/AntiHBe y
carga viral HBV
Resultado NO REACTIVO para
ambos marcadores
Vacunar contra HBV
Escenario 4 HBsAg (-) IgG antiHBc(+)
Realizar anti HBs
Anti HBs (+) Hepatitis B
resuelta
Anti HBs (-) Iniciar Vacunación. Repetir a
los 30 días
Anti HBs (+) Hepatitis B resuelta
AntiHBs (-) Estudiar carga viral HBV posible infeccion oculta
AntiHBc aislado completar esquema de vacunación
Caso confirmado de HBV OCULTA por
HBV
Falso positivo metodológico
Anti-HBc positivo aislado
1. Recuperación de infección aguda
2. Test no sensible para anti-HBs
3. Falso positivo
4. Mutante del HBsAg
5. Niveles no detectables de HBsAg
Infección oculta (OBI)
Infección por HBV oculta
HBV oculta HBcAc + HBcAc -
Perdida HBsAg
Hepatitis aguda
Perdida HBsAg
Aňos depues de
una portacion
cronica
Ac anti HBV
nunca +
Ac anti HBV
Que se pierden
con el tiempo
HBV DNA +
Semin Immunopathol (2013) 35:39–52 DOI 10.1007/s00281-012-0327-7
HBV-ADN en suero <103 copias/ml
Seronegativa
HBsAg negativo
antiHBc negativo
antiHBs negativo
antiHBe negativo
Seropositiva
HBsAg negativo
antiHBc positivo
antiHBs positivo / negativo
antiHBe positivo / negativo
1. Virus
2. Hospedador
HBsAg 1. No se produce
2. Se produce en concentraciones no detectables
3. Se produce una variante no detectable por los métodos convencionales
HBV oculta (OBI)
HBV-ADN en hígado
• HBeAg • Anti HBeAg • HBV-DNA cuantitativo.
Caracterización de una Hepatitis B crónica
HBV-DNA 2 X 10 ⁸ 2 X 10 9 < 2000 2X 10 5- 9 (UI/mL)
ALT N ↑ N ↑
Inmuno Tolerancia
Reactivación Inmuno
Clearence o Eliminación
Titu
lo
VN
Portador Inactivo
Tiempo
antiHBe HBeAg
Historia natural de la infección crónica
Curso serológico
Semanas post exposición
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 años
Título
HBsAg
HBV-ADN
HBsAg +
antiHBc +
HBV-ADN +
Infección crónica
Total anti-HBc
IgM anti-HBc
HBsAg anti HBs HBc IgM HBc total HBeAg anti HBe
Marcadores Moleculares
HBV-DNA cuantitativo - Carga Viral.
Mutantes pre-Core
Mutantes de Resistencia a antivirales
Genotipos de HBV
NAT en banco de sangre
Detección de HBV-DNA cualitativo Aplicaciones: Definición de replicación activa del HBV en pacientes con
patrón compatible con infección crónica Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa) Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral Métodos: comerciales, no comerciales Límites de detección: 5 - 50 copias/ml Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos
comerciales específicos para este objetivo diagnóstico
Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral
Permite detectar y cuantificar la viremia Sólo se utilizan métodos comerciales Estandardización de las unidades de
cuantificación del HBV DNA en UI/ml La alta sensibilidad de métodos como
Taqman permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad analítica de 6 UI/ml)
Usos de DNA-HBV cuantitativo
Diagnostico de estadío
Riesgo de transmisión
Riesgo de progresión
Selección del paciente a tratar
Indica respuesta al tratamiento
Diagnostica resistencia del HBV
Chen CJ, et al. JAMA 2006
Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006
Carga viral y evolución de la infección (REVEAL)
< 300 (No detectable)
300-9,999
10,000-99,999
100,000-999,999
1 Million
Carga Viral inicial
3.6
9.7
2.0 1.0
10.6
RR de cirrosis (n = 3482)
0
2
4
6
8
10
12
Incidencia de HCC (%) (n = 3653)
1.4 3.6
14.9
1.3
12.2
0
5
10
15
20
Secuenciación: Gold Standar
Genotipos (A-H)
Mutaciones:
Pre-core/ promotor del precore
Superficie: escape a la vacuna
Polimerasa: Resistencia a antivirales
Diagnóstico molecular
Patrones de Resistencia
Secuenciación : gold-standard
INNO-LiPA HBV Drug Resistance
Assay
PCR-RFLP para búsqueda de
mutaciones mas comunes
Genotipos HBV
Potenciales diferencias biológicas entre los genotipos de HBV
* Tasa de replicación del HBV
* Eliminación natural del HBeAg.
* Expresión y reconocimiento de los epítopes inmunes.
* Evolución de la enfermedad Hepática
* Patogénesis
* Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocarcinoma
* Sensibilidad a la terapia antiviral.
En el presente :
Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o clearence de los virus ni de la infección viral
La evaluación de la carga viral en diferentes momentos del tratamiento es utilizada como marcador de efectividad de la actividad antiviral y la persistencia de la respuesta
Hasta el momento, no existen marcadores que identifiquen el logro de que el sistema inmune del paciente logra controlar efectivamente la infección viral y el progreso de la enfermedad
El Futuro …. Detección de variantes minoritarias de escape al
tratamiento : impacto de las nuevas tecnologías
(Next Generation Sequencing) que permitirán
detectar poblaciones en % inferiores al 1%
Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán
correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios
con respuesta biológica y sentido clínico de las
mismas.
Detección y cuantificación del ccc-HBV-DNA
HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de ccc-
HBV-DNA
Hepatitis C
Hepatitis C
La enfermedad aguda dura aproximadamente 6
meses
25 % de las personas infectadas eliminan el virus
75 % llegan a desarrollar la enfermedad crónica
La enfermedad crónica se define como que dura
más de 6 meses
Hepatitis C y su efecto sobre el hígado
1 de cada 3 pacientes desarrollan cirrosis grave durante un período de 20 años
La cirrosis conduce a un daño permanente del hígado
Puede conducir a cáncer de hígado
Muerte prematura
(British Liver Trust 2009)
Estructura del virus C
Bicapa lipídica 2
glicoproteínas de
Envoltura E1,E2
Envoltura RNA viral
Proteínas
de la
Cápside
Género: Hepacivirus, Familia: Flaviviridae Tiene 6 genotipos y más de 100 subtipos El HCV no se integra en el genoma del huésped Producción diaria: 1012 viriones Genoma: 9600 nucleótidos
Infección Aguda con Recuperación
Infección Aguda con Progresión a la Cronicidad
Tit
ulo
s anti-HCV
ALT
Normal
0 1 3 4 5 6 1 2 3 4
HCV RNA
Realizar diagnóstico precoz
Derivación precoz para la evaluación del especialista y
oportunidad de un tratamiento temprano
Se podría tener éxito aclaramiento de la enfermedad
(hasta 80 % )
Reducir la transmisión
¿Por qué solicitar el test de HCV ?
Recomendación del Testeo HCV
Drogadictos IV
Aquellos que recibieron factores antes de 1985
Receptores de sangre/organos antes de 1993
Hemodialisados crónicos
Enfermedad hepática
Trabajadores de la salud, emergencias,etc despues de injuria con aguja de un individuo HCV+
Chicos nacidos de portadora HCV+
Basado en el grupo de riesgo
Basado en la exposición
( DOH Get Tested Get Treated Campaign 2009)
HCV
TECNICAS DE DIAGNOSTICO
Serologicas: EIA (screening) RIBA (confirmatoria)
Solicitar anti -HVC
Reactivo
Estudiar ARN-HVC
Detectable No detectable
No reactivo
Caso descartable
por HCV
DIAGNOSTICO POR
BIOLOGIA MOLECULAR
Ensayos :
Cualitativos
Genotipificación
Cuantitativos
Técnicas Moleculares: Indicaciones
en Infección por HCV
• Diagnóstico
Serología indeterminada
Primoinfección asintomática
Recién nacido de madre HCV positiva
Contacto de alto riesgo
Pronóstico y seguimiento de tratamiento
Evaluación indirecta de resistencia
Utilidad Clínica de la Carga Viral
HCV
• Infección aguda: Altos niveles de RNA
antes de la seroconversión
• Evaluación del estado de la enfermedad,
pronóstico (progresión vs estabilidad)
• Monitoreo de la terapia antiretroviral,
iniciación, mantenimiento, falla-resistencia
Detección de Genotipos/Tratamiento
Genotipos (11): Seis (1,2,3,4,5, 6 ) son generalmente tratados Estos difieren entre un 31-34% en la secuencia de sus nucleótidos en el extremo 5’
Subtipos: con letras a,b,c ,etc. Aproximadamente son 100: estos difieren entre 20-23 % en sus bases en toda la longitud de la secuencia genómica
Utilidad: de acuerdo al genotipo hallado, se implementara el tratamiento adecuado
Métodos de Genotipificacion
Secuenciación : gold-standard
INNO-LiPA
PCR-RFLP para búsqueda de
mutaciones mas comunes
Restriction Fragment Length Polymorphism:
RFLP
Una Población Difícil
Anti-HCV positivo
RIBA indeterminado
HCV RNA negativo
¿Falso positivo o expuesto no
virémico? (infección de larga data)
Analizar el patrón de reactividad
Verdaderos (+): c22 y c33 Falsos (+): c100 y NS5
Avanzando en el Diagnóstico Diferencial
Anti-HCV (+)
HCV RNA PCR (+) HCV RNA PCR (-)
ALT Normal ALT Elevada
Seguimiento
(ALT)
Biopsia
Hepática
Viremia Genotipo
RIBA (-) RIBA (+)
Falso (+) Infectado
No Virémico
Seguimiento
(ALT y PCR)
Conclusiones
Los métodos de detección cualitativos prácticamente están en
desuso
Solo los métodos con límite de detección > 15 UI/Ml son utilizables
en el contexto de los nuevos tratamientos
Un resultado detectable no cuantificable, entre el límite de
detección (25 UI/mL) y el límite de detección (15 UI/mL) debe
considerarse positivo para la toma de decisiones sobre
respuesta temprana, suspensión o reactivación post-suspension
del tratamiento
Existen métodos que presentan límites de cuantificación y
detección diferentes
Valores superiores al limite máximo de cuantificación no
requieren diluciones en función de que los nuevos
esquemas plantean requerimientos de disminución de la
carga viral que no están relacionados con el valor inicial
del tratamiento
Se recomienda medir la carga viral con el mismo método y
en el mismo laboratorio en lo posible
Asimismo , se recomienda a los laboratorios que realicen
estos ensayos que estén suscritos a programas de control
de calidad o que tengan acreditadas esta técnica ante
requisitos internacionales (CAP – ISO 15189)
Conclusiones
Muchas gracias!!!!