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BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidiumperuvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez.

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CAPITULO III

ANTECEDENTES

III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.-

El género Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en

prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más

grandes dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y

Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las

especies endémicas Andinas (Quiros 1999).

Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira

(1986), existían 11 especies clasificadas del género Lepidium a la que agrega

Lepidium peruvianum Chacón como una nueva especie.

De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue

domesticada hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier

(1986, citado por Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el

Perú.

La maca parece haber jugado un papel importante en la economía

prehispánica, y durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los

tributos exigidos por el Encomendador (Chacón, 1990).

III.1.1.- CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.

DIVISION : ANGIOSPERMAE

CLASE : DICOTYLEDONEAE

SUBCLASE : ARCHICHLAMYDEAE

Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y BibliotecaCentral UNMSM



ORDEN : PAPAVERALES

FAMILIA : BRASSICACEAE

GENERO : Lepidium

ESPECIE : Lepidium peruvianum Chacón. Sp. Nov. Antes L.

meyenii Walp.

NOMBRE COMUN : MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA,

AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO.

III.1. 2.- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal

en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en

menores altitudes) siendo autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de

5 meses con una floración que dura dos meses. Las flores se abren en series

sucesivas, presentando cuatro etapas: flor cerrada con anteras sin dehiscencia,

flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales

en pleno desarrollo, f lor abierta con estructuras f lorales entrando en

senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8

meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el

ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da

generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos

(Aliaga, 1999).

La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita

como tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de

hipocótilo (Aliaga 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León

(1964), éste es un eje carnoso derivado del hipocótilo cuya parte superior




termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la

inferior es cónica y se alarga en una raíz ancha y fuerte con dos áreas

irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.

Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio

morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero

se pueden encontrar también maca de color rosado, crema-morado, amarillo-

negro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por

los campesinos y el mercado es el color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999).

El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas,

compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase

vegetativa son grandes (10 – 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm)

en la fase reproductiva (Tello y colb. 1992 y Aliaga, 1999).

La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas

1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con

cuatro sépalos, cuatro pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un

ovario súpero bicarpelar y bilocular, con un óvulo en cada lóculo de

placentación axilar. Su fórmula floral es: KC4 4A2-4G2 (León, 1964 y Aliaga,

1995).

El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides

de 2-3 mm de ancho y 4 – 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón,

1998) el color de las semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga,

1999).




III.1.3.- NÚMERO DE CROMOSOMAS

Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8

con 54 – 56 cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células

madres de plantas en floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la

maca es un poliploide disómico del número cromosómico básico del género: n

= 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas.

III.1.4.- DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e

inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden

sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes

(National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia),

estuvo restringido a los departamentos de Junín y Pasco, en las regiones suni y

puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junín; a altitudes

de 4100 – 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de

estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.

Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la

distribución del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de

cultivo de la planta disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778,

Hipólito Ruiz lo circunscribe la región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta

tendencia se mantuvo hasta la década de los ochenta, en la que el área de

cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la década de los 90

esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se

extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la

maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y

Apurímac (Aliaga, 1999).




III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL

La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada

como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras

(National Research Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces

andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto

contenido de aminoácidos esenciales, comparables con los recomendados por

la FAO – OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La

fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el organismo para la

biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales

de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver

apéndice)

III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS.

Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no

tienen una función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos

fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).

Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta

de los depredadores , compet i r v entajosamente con otras plantas, atraer

polinizadores y simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a

los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991).

Las evidencias de una estricta regulación metabólica de estos productos nos

indicaría que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas




III.2.1.- GLUCOSINOLATOS.

Los glucosinolatos son una clase tioglucósidos restringidos a las

dicotiledóneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y

especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la

planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la

planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos

cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa,

conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las Capparales

(Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en

muchas brass icaceas económicamente importantes, como la mostaza,

calabazas, brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes

produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular

que exponen los glucosinolatos almacenados a la acción de las enzimas que los

degradan, las mirosinasas, produciendo isotiocianatos, nitrilos,

cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros factores (Fig 1)

(Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las

hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la

susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados,

(Mithen y col. 1995)

La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies

fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb.,

1981), en 1973, Kjaer puntualizó: “entre el vasto número de productos

secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribución discontinua junto

con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han

adquirido, por razones obvias, una posición prominente en discusiones acerca

de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación y, más

fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos ........




constituyen un grupo con algunas de las características anteriores.”....... “La

complejidad sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por

ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la

posición biológica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales

químicamente bien definido y en constante crecimiento”.

Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de

tioglucósidos en Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia

de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos tóxicos de los

productos de su degradación (Josefsson, 1967), tales como nitr i los,

isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y

Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo

estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de

glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para

mejorar la palatabil idad del cult ivo, como en el caso de la colza, o,

aumentándola como se trata de hacer en brócoli con el glucosinolato

glucorafanina, que al h idrol izarse forma sul furofano con act iv idad

anticancerígena (Quiros, 1999).

Las especies del género Lepidium son usualmente ricas en bencil

isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs

(1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los

productos de los glucosinolatos de maca, los isotiocianatos aromáticos,

bencilisotiocianato y el p-metoxibencil isotiocianato, el último de los cuales

también se encuentra en mashua.

Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen

el mismo núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una

oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste




el carácter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la

actividad biológica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos

resultantes del daño de los tejidos de la planta, (Mithen y colb., 1995). La

naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos

aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los alifáticos

(bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas,

por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por

un catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles

e hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se

diferencian sólo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran

número de glucosinolatos, se usan nombres semisistemáticos, en los que el

nombre de la cadena R es seguido por el sufijo “glucosinolato”,

Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los α- aminoácidos,

Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer,

1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el

carbón α se transforma en el carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981),

aunque solo siete corresponden a aminoácidos proteicos (antes mencionados),

los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente

a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos no proteicos (Chapple, y colb.,

1994 y Larsen, 1981).

Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado

muchas técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de

capa fina, cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio

de los productos de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de

los productos de la degradación enzimática pueden causar resultados erróneos,

(Larsen, 1981).




El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la

producción de α-D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que

nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)

Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en

vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes

ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas

aún no se ha definido su localización celular (Rodman, 1981).

Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de

Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el género Isatis y

reubicando el género Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el

valor taxonómico de estos compuestos.

III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA – GLUCOSINOLATO

Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas

están invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer,

1973), así, sin excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la

planta por esta enzima. Las mirosinasas se encuentran en idioblastos

especializados ricos en proteínas llamados células de mirosina (Rodman, 1981)

que se encuentran en el tejido parenquimático (Bonnes y Rossiter, 1996), éstos

se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por

Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran

separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la

masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).

Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza,

(Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la




familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se

ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger , en la

bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de mamíferos y en los áfidos que

atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas

parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter,

1996).

S – Glu

R – C

NOSO3

H2O mirosinasa

S

R –C + D - Glu

NOSO3

Isotiocianatos nitrilos cianoepitioalcanos tiocianato

FIG. 1.- Hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y

Rossiter. 1996. The Myrosinase – Glucosinolate System, its Organization and

Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208 )

La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede

producir: a) isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un pH normal; b)

nitrilos, cuando la hidrólisis ocurre a pH ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la

mirosinasa se presenta con una pequeña proteína conocida como proteína

epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los

g lucos iona tos que se dan en l a na tu ra leza , l os a l l y l , benc i l , y 4 -

(metiltio)butilglucosinolatos.




MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel

separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de

Rhoeadales, cada especie tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También

encontraron que este patrón variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual

se hicieran los extractos.

Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas

enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo

al órgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta

diferencia.(Bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas

particulares corresponden a condiciones endógenas encontradas en las plantas,

o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el

tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996).

III.2.2.- ALCALOIDES

Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos

secundarios de moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia

económica debido a sus propiedades farmacológicas, las mismas que han sido

usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas

frecuentes en el reino vegetal, habiéndose encontrado cerca de 10,000

alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con f lores,

principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999).

Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o

más átomos de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad

farmacológica (Lock, 1994)

La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los

aminoácidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque




algunos alcaloides se encuentran en varios géneros o aún en una familia, la

mayoría de las especies presentan un patrón único, genéticamente

determinado. Por otro lado su distribución está restringida a determinados

órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins, 1999).

No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la

planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son

amargos, lo cual es considerado universalmente como un carácter repelente.

Todos son biológicamente activos, muchos significativamente tóxicos y otros con

propiedades antibióticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides

son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que pueden ser atacados por

herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no

contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los

organismos vivientes (Lock, 1994).

Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico,

utilizando soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el

extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de

amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes

orgánicos.(Lock, 1994)

Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la

cromatografía de capa fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el

uso de Sephadex LH-20 por elución y la cromatografía líquida de alta

perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variados y el agente

revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicación produce

manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).

La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides




en Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto

alcaloideo de maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación

de la maduración los folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio.

Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoquímico de la planta encontró

3 alcaloides en los extractos metanólico y butanólico de maca de los ecotipos

amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col. obtuvieron cuatro fracciones de

alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994),

detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de polvo de

maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff.

Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha

determinado su estructura.

III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta

y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su

potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas

mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se

cultiva asépticamente en un medio de composición definida y se incuba en

condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).

Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de

Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la

célula es capaz de tener autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en

células somáticas con la observación de la formación y cicatrización de callos en

áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982).

Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron

realizados por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret




1982), quien trabajó con células de palizada, pelos glandulares y pelos de

estambres de Tradescantia; pero aunque logró que las células sobrevivieran

entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento celular, probablemente debido a que

eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió células altamente

diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho después que en

1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que Gautheret

logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en

Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White

demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate

(Dodds y Roberts 1982).

Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de

callos indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos,

por lo que se puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos

nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para

entonces ya se había descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por

Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se estudiaron diversas sustancias

que favorecían el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret

1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de

citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962, Murashigue y Skoog

propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y citoquininas que

permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982).

También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis,

que sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el

principio de la propagación vegetativa determinando cuales eran los tipos de

meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel

aplicó estos principios en la propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).




Muir (1953 – 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los

callos que eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones

celulares, desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y

de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y

cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982).

Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:

a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines.

b) Bioconversión y producción de compuestos útiles.

c) Incremento de la variabilidad genética.

d) Obtención de plantas libres de patógenos.

e) Propagación de plantas.

f) Conservación e intercambio de germoplasma.

III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS

El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante

usado, y la elección de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie

vegetal utilizada. Para la obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de

explante que contenga células nucleadas, y éste se seleccionará en función a

razones prácticas como disponibilidad, facilidad de manipulación,

homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta respuesta puede

variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontogénica y

tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de

incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa

amorfa desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y

Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en

otros desintegrándose a medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este

crecimiento depende de la relación entre la planta de origen, el medio de cultivo,




las condiciones ambientales y el tiempo de incubación; algunos callos crecen

fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fácilmente

en pequeños fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts,

1995), estos callos son los mejores para la iniciación de cultivos celulares.

El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en

tres fases de desarrollo: Inducción, en la que el metabolismo es estimulado

antes de la mitosis; división celular en el que las células del explante revierten a

un estado meristemático; y por ultimo diferenciación celular y expresión de

algunas vías metabólicas que llevan a la formación de metabolitos secundarios

(Dodds y Roberts, 1995).

La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada

por hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su

inducción in vitro en explantes vegetales sin causar estrés, depende de la

introducción de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y

Ochoa, 2000).

Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son:

e l e xplante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y

opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales

inorgánicas, fuentes de carbono y energía, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y

Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, ácidos

orgánicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales.

Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el

tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en

el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los




nutrientes, la gradual desecación del agente gelificante y a la acumulación de

metabolito que pueden resultar tóxicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995).

Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis

semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25°C o más, pero en

realidad este tiempo varía con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts,

1995).

Carhuaz en 1997 (comunicación personal), indujo callos en maca,

utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro

auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 ìM,

concluyendo que el 2,4-D en el rango de 0.1 – 10.0 ìM el regulador más

efectivo para promover la formación de callos, coincidiendo con Gamborg y colb.

(1981), quienes indican un rango óptimo de 1- 5 ìM para la acción del 2,4-D y

con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la kinetina como los

reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas.

III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO

Se l lama hormona o f i tohormona a aquellas sustancias orgánicas

naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los

procesos fisiológicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias

sintéticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento,

y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995).

Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas,

ácido absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son

las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con

poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual




modo el ácido absícico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y

Roberts, 1995).

En la fami l ia Brass icaceae se encuent ran muchas espec ies

económicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos,

incluyendo a Brassica oleracea, B. napus y Arabidopsis thaliana, los

requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con

muchas hormonas, con un ampl io rango de concentraciones, estas

concentraciones y la hormona a ser elegida, así como la respuesta de

crecimiento varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se

utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las

citoquininas la más usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con

más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación auxina:citoquinina más

eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983).

III.3.2.1- AUXINAS

Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por

primera vez por Went en 1926, quien describió la acción elongadora del IAA en

coleóptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las

cuales la más usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintéticas o

reguladores de crecimiento de las cuales las más usadas son el 2,4-D, el NAA y

el IBA (Krikorian, 1991).

Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son

el crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos

en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas

concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4-

D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.




Este regulador es la auxina más efectiva para la proliferación de callos-7 -5

usándose a concentraciones de 10 – 10 M y aún en ausencia de una

citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980).

Además de inducir la proliferación celular, el 2,4-D tiende a suprimir la

morfogénesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de

diferenciación (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea

mas estudiada, la auxina mas usada en la obtención de callos en diferentes

explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y

Altmann, 1994).

III.3.2.2.- CITOCININAS

En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la

promoción de la citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de

ADN, llamándolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el término cinina para

denominar las sustancias naturales y sintéticas que presentaban el mismo tipo

de actividad biológica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia

usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el nombre citocinina para

estas sustancias (Krikorian, 1991).

Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división

celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a

las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la

formación de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).

Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo

compuestos sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y

Roberts, 1995).




Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así

algunos cultivos no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una

auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado

además que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 –25

mg/l) inhiben la formación de callos (Yeoman y Forche, 1980).

En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó

un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro

citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100

µM, utilizando como explantes, la raíz, hoja, peciolo e hipocótilo.

III.3.3.- EL EXPLANTE

Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del

origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen células del

cambium pueden formar callos sin adición de reguladores de crecimiento; pero

la mayoría de los explantes requiere de uno o más reguladores de crecimiento

para iniciar la formación de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta

también depende del estado fisiológico del tejido y del tiempo de escisión,

(Yeoman y Forche, 1980).

Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos

exógenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y

citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995).

III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS

Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos

secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a




programas intensivos de mejoramiento genético y se presentan además

problemas técnicos y económicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).

El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos

secundarios cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede

resultar difícil o económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera

necesario, por el riesgo de sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las

pequeñas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a

los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro

lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas

plantas (Dodds y Roberts, 1995).

La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser

seleccionada para generar compuestos útiles fue introducida en la década de

1970, en la década de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en

cooperación con la industria privada, produjeron shikonina de Lithospermum

erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996).

La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la

planta asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del

uso del cultivo de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios.

En la planta el rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de

la distribución geográfica y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en

su población. Luego de establecer una estrategia de producción in vitro, la

empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la primera producción industrial del

compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de shikonina producida in vitro

(Robert y colb., 1991).




En la década de los noventa el número de compuestos producidos por

cultivo de tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener

compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta

tecnología es la producción comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso

usado en cosméticos (Hara, 1996).

Actualmente existen al menos tres programas de búsqueda de

compuestos con actividad biológica, llevados a cabo por las industrias

farmacéuticas, cada año varios cientos de plantas son colectados y se intenta en

ellas la inducción de callos, con un éxito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los

callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996).

Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto

puro es estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas

han sido publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los

dehidrodiconiferil alcohol glucósidos aislados de cultivos celulares de

Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996).

La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de

reducir el número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a

suspensiones celulares representa una reducción considerable de los niveles de

ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la pérdida completa

de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos

celulares no sean capaces de producir compuestos de interés, por el contrario,

Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que

los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.

Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de

metabolitos secundarios son las siguientes:




• Producción a escala industrial

• Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis

química

• Reducción de los costos de producción a largo plazo

• Eliminación de la dependencia en materia de importación

• Producción continua y controlada de sustancias independiente- mente de los

factores del medio ambiente.

• Precios estables

• Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento

final y de los mercados.

Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la

productividad del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de

los metabolitos secundarios) (Becker, 1987).

III.4.- CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de

mezclas y sustancias, por adsorción selectiva (Microsoft® Encarta® Online

Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en

1903, quien descubrió que los pigmentos de las plantas podían separarse al

filtrarlos con éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio.

Pero el desarrollo de esta técnica empieza realmente en 1931, cuando,

posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las

columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).

Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográficas de

acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografía de columna utiliza sílica,

alúmina y sílica gel; en la cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra




sobre un vidrio o una película plástica, mientras que en la cromatografía de

papel, una muestra líquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras técnicas

cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que permite la separación de

sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica donde un gas

puede ser descompuesto en iones que interactúan con el adsorbente; la

cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño

uniforme, y finalmente, la cromatografía líquida de alto perfomance (HPLC)

donde el adsorbente es líquido, esta técnica es ampliamente usada

actualmente (Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001).

III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las

partículas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia

de un campo eléctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en

interacción con la matriz circundante, la cual actúa como un filtro molecular,

generándose como consecuencia, tasas diferenciales de migración para las

proteínas contenidas en una muestra (Garfin, 1990).

Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de

papel y acetato de celulosa, y se ut i l izaron p rincipalmente para separar

aminoácidos, péptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografía

(Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel,

acetato de celulosa, silicagel, alúmina y celulosa y actuar como tamices

moleculares como son los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida (Hames,

1981, citado por Gálvez, 1990).

El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida

(PAGE), por proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta

resolución (Garfin, 1990).




Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero

de acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N’-metilen-

bisacrilamida. Esta polimerización es catalizada por un sistema generador de

radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que actúa como iniciador,

y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de

radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la

polimerización del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es

la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y

oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la

polimerización (Gálvez, 1990).

Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la

acrilamida y la bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la

concentración de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como

tamiz.

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,

formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para

proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas

de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso

molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre

los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a

que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma

movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante

(SDS – PAGE)(Garfin, 1990).

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,

formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para

proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas




de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso

molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre

los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a

que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma

movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante

(Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium

dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma

que las proteínas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este

caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Gálvez,

1990).

El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en

1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de

geles: un gel de separación y uno de concentración, ambos geles tienen

diferentes porosidades y pH, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo,

donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separación que se halla

inmediatamente debajo y que posee un tamaño de poro más pequeño. Además,

se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad

permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de concentración,

resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).


glucosinolatos en maca peruvian.docx

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